Розробка засобів діагностики та серологічний моніторинг ринопневмонії коней в Україні
Визначення штаму вірусу ринопневмонії коней, найбільш придатного для використання в діагностичному наборі в якості специфічного антигену. Напрямки проведення серологічного моніторингу ринопневмонії коней у конегосподарствах різних регіонів України.
Рубрика | Сельское, лесное хозяйство и землепользование |
Вид | автореферат |
Язык | украинский |
Дата добавления | 25.07.2015 |
Размер файла | 91,2 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Національний університет біоресурсів і природокористування України
УДК 619:578.824.11:57.083
РОЗРОБКА ЗАСОБІВ ДІАГНОСТИКИ ТА СЕРОЛОГІЧНИЙ МОНІТОРИНГ РИНОПНЕВМОНІЇ КОНЕЙ В УКРАЇНІ
16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія
АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата ветеринарних наук
ГРУБІЧ ПАВЛО ЮЛІЙОВИЧ
Київ 2010
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини Національної академії аграрних наук України
Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник СИНИЦИН Віталій Анатолійович, Інститут ветеринарної медицини Національної академії аграрних наук України, завідувач лабораторії загальної вірусології
Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, доцент Мазур Тетяна Василівна, Національний університет біоресурсів і природокористування України, професор кафедри епізоотології та організації ветеринарної справи
кандидат ветеринарних наук Ситюк Микола Петрович, Інститут ветеринарної медицини Національної академії аграрних наук України, старший науковий співробітник лабораторії епізоотології
Захист дисертації відбудеться “_19_” _травня__ 2010 р. о _1300_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд.65
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № 4, к.28
Автореферат розісланий “_15_” __квітня_ 2010р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради С.В. Міськевич
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Ринопневмонія коней (вірусний аборт кобил або герпесвірусна інфекція) - вірусна хвороба, яка характеризується катаральним запаленням слизової оболонки верхніх дихальних шляхів і кон?юнктиви у коней, а також абортами кобил у другій половині жеребності (Галатюк О.Є., 2005). Інфекційна ринопневмонія коней завдає значних економічних збитків конярству, що складаються із втрати репродуктивної здатності конематок, недоодержання приплоду, вибракування цінних у племінному відношенні коней, а також проведення ветеринарно-санітарних заходів. У природних умовах вірус уражає коней, ослів і мулів незалежно від статі, породи і віку (Юров К.П., 1988; Старчеус А.П., 1999).
У зв'язку з розвитком кінного спорту в останні роки (Україна посідає 14 місце у міжнародному рейтингу) та збільшенням кількості приватних конярських господарств у нашій країні, що займаються розведенням племінних коней, вступом України до Світової організації торгівлі (СОТ) все частіше спостерігається ввіз-вивіз коней з країн СНД та Європи. Наразі стає актуальною проблема запобігання, діагностики й ліквідації ряду інфекцій, до яких сприйнятливі коні (Вержиховський О.М., 2005). Ринопневмонія (РПК) - одна з найпоширеніших інфекційних хвороб у конярстві. У боротьбі з РПК важливе значення має вчасна та надійна діагностика хвороби. Всесвітня організація охорони здоров'я тварин (ОІЕ) рекомендує використовувати для дослідження реакцію нейтралізації як базову у поєднанні з іншими, додатковими, методами дослідження, наприклад ПЛР, ІФА чи РДП (OIE Terrestrial Manual, 2008). Вивчення РПК у плині останнього часу дає можливість стверджувати, що дана проблема є актуальною. В Україні не розроблено жодної тест-системи (діагностичного набору) для виявлення антигенів і специфічних антитіл до вірусу РПК, які б могли застосовуватися у мережі діагностичних ветеринарних лабораторій України. Моніторинг щодо РПК в Україні проводиться обмежено. У той же час серопозитивність в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) в деяких племінних господарствах України становить 58-100 % (Галатюк О.Є., 2003). У зв'язку з цим розробка засобів діагностики РПК є актуальною та своєчасною.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною комплексних досліджень згідно з завданнями державних тематик науково-дослідних робіт Інституту ветеринарної медицини УААН: “Розробити та впровадити методи та засоби діагностики і профілактики респіраторних захворювань коней” (номер державної реєстрації - 0101U000816) на 2001-2005 роки та “Вивчити закономірності перебігу респіраторних хвороб коней та розробити науково-теоретичні підходи для їх діагностики на основі сучасних біотехнологічних методів” (номер державної реєстрації - 0106U000498) на 2006-2010 роки.
Мета і завдання дослідження. Основна мета роботи - розробити засоби діагностики та провести серологічний моніторинг ринопневмонії коней в Україні.
Для досягнення цієї мети були поставлені такі наукові завдання:
1. Визначити штам вірусу ринопневмонії коней, найбільш придатний для використання в діагностичному наборі, в якості специфічного антигену:
- визначити чутливість перещеплюваних культур клітин ВНК 21, Vero та СНЕВ до штамів вірусу ринопневмонії коней EQ Herpes 040 EDV 9601, EHV (W) та Юл;
- випробувати метод очищення та концентрування вірусу ринопневмонії коней;
- вивчити антигенну спорідненість штамів EQ Herpes 040 EDV 9601, EHV (W) та Юл вірусу РПК;
2. Розробити схему гіперімунізації лабораторних тварин з метою отримання діагностичної імунної сироватки крові;
3. Розробити набір діагностиків для виявлення антитіл до вірусу ринопневмонії коней у реакції нейтралізації:
- визначити захисне середовище для вірусу ринопневмонії коней;
- підібрати режим ліофілізації компонентів набору діагностиків;
4. Провести серологічний моніторинг ринопневмонії коней (скринінгові дослідження) у конегосподарствах різних регіонів України.
Об'єкт дослідження - ринопневмонія коней, діагностика, моніторинг.
Предмет дослідження - культури клітин, вірус ринопневмонії коней, методи діагностики ринопневмонії коней, специфічна гіперімунна сироватка крові, сироватки крові коней, набір діагностиків.
Методи дослідження. Вірусологічні (культивування вірусу РПК, штамів Юл, EQ Herpes 040 EDV 9601, EHV (W), у клітинних культурах ВНК 21, Vero та СНЕВ), мікробіологічні (визначення стерильності компонентів набору діагностиків), серологічні (проведення РН, РДП та ІФА при дослідженні сироваток крові тварин), імунологічні (отримання гіперімунної сироватки на кролях, щурах), молекулярно-біологічні (проведення ПЛР), електронна мікроскопія та статистичні (використання програми MS Excel для обробки цифрових даних). ринопневмонія кінь вірус штам
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше вивчена чутливість перещеплюваних культур клітин СНЕВ, BHK- 21 та Vero до штамів EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та Юл вірусу ринопневмонії коней. Встановлено адаптаційну здатність цих штамів у вищенаведених перещеплюваних культурах клітин. Отримана високоспецифічна діагностична сироватка крові лабораторних тварин - кролів та щурів за розробленою нами методикою гіперімунізації. Уперше встановлено антигенну спорідненість штамів EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та Юл вірусу ринопневмонії коней, репродукованих у культурі клітин Vero. Підібрано оптимальне стабілізуюче середовище для ліофільного висушування вірусу РПК (знежирене молоко із сахарозою (5 %) у співвідношенні з антигеном 1:1) та режим ліофільного висушування компонентів набору діагностиків.
На підставі проведених науково-експериментальних досліджень вперше в Україні розроблено набір діагностиків для реакції нейтралізації, за допомогою якого можна виявляти антитіла до вірусу ринопневмонії коней у сироватці крові, та технічну документацію до набору. Наукова новизна роботи підтверджена патентом України на корисну модель №25282 «Тест-система на основі мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики ринопневмонії коней». За допомогою розробленого набору проведено серологічний моніторинг щодо ринопневмонії коней 12 областей України.
Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи використані при розробці науково-технічної документації на «Набір діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» (ТУ У 24.4-05510830-078:2006), яка затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини України та зареєстрована за номером 02568182/032040 Всеукраїнським державним виробничим центром стандартизації, метрології, сертифікації та захисту прав споживачів. Також матеріали дисертаційної роботи використані при розробці Державного стандарту України «Ветеринарна медицина. Метод лабораторної діагностики ринопневмонії коней», що затверджений Міністерством аграрної політики України. Для проведення широких діагностичних лабораторних досліджень розроблені «Методичні рекомендації по застосуванню мікрометоду реакції нейтралізації в культурі клітин та реакції дифузної преципітації в агаровому гелі для виявлення антитіл до вірусу ринопневмонії коней», що затверджені Методичною радою Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук (протокол засідання №1 від 12.01.08 р.).
Розроблений «Набір діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» використовується для проведення діагностичних досліджень в Інституті ветеринарної медицини НААН України, Державному науково-дослідному інституті з лабораторної діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи Міністерства АП України.
Матеріали дисертації використовуються при викладанні курсу «Епізоотологія та інфекційні хвороби тварин» на факультеті ветеринарної медицини Полтавської державної аграрної академії.
Впровадження в практику ветеринарної медицини «Набору діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» для визначення рівня віруснейтралізуючих антитіл дозволяє вирішити проблему масового серологічного обстеження поголів'я коней на території України, що складає основу заходів по запобіганню, недопущенню поширення та ліквідації інфекційної ринопневмонії коней.
Особистий внесок здобувача. Опрацювання літературних джерел, експериментальні та діагностичні дослідження, аналіз отриманих результатів, їх узагальнення і статистична обробка виконана здобувачем особисто. Обговорення методології та отриманих результатів проведено сумісно з науковим керівником. У роботах, які опубліковані у співавторстві, відображені результати, що отримані при особистій участі здобувача у проведенні експериментів.
Апробація результатів дисертації. Матеріали наукових досліджень викладені й обговорені на: Міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми ветеринарної медицини в свинарстві» (2-4 жовтня 2006р., м. Київ); п'ятій Міжнародній науково-практичній конференції «Біоресурси та віруси» (10-13 вересня 2007р., м. Київ); науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології» (22-25 травня 2007 р., м. Феодосія, АР Крим); Міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми ветеринарної медицини з питань епізоотології, біотехнології та імунології» (03-05 березня 2008 р., м. Полтава); щорічних засіданнях вченої ради Інституту ветеринарної медицини УААН (2005-2009 рр., м. Київ); міжлабораторному засіданні Інституту ветеринарної медицини УААН (4 листопада 2009 р., м. Київ).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, серед яких: 7 статей (із них 3 одноосібних), опубліковані у наукових виданнях, що входять до затвердженого ВАК України переліку; 1 патент України на корисну модель № 25282, «Методичні рекомендації по застосуванню мікрометоду реакції нейтралізації в культурі клітин та реакції дифузної преципітації в агаровому гелі для виявлення антитіл до вірусу ринопневмонії коней», що затверджені Методичною радою Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук, 1 тези доповіді.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 158 сторінках комп'ютерного тексту, складається із вступу, 4-х розділів, висновків, пропозицій виробництву та бібліографічного списку, який включає 221 джерело, з них - 152 іноземних, містить 25 таблиць, 15 рисунків та 12 додатків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Експериментальні дослідження проводили протягом 2005-2009 рр. на базі лабораторії вірусології та діагностики Інституту ветеринарної медицини УААН. Окремі фрагменти роботи виконані у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини Міністерства АП України та у державних і приватних конегосподарствах України.
Дослідження проводили, керуючись принципами гуманного ставлення до тварин відповідно до Міжнародних рекомендацій, з дотриманням біоетичних норм і вимог Міжнародного комітету по науці та вимог статті 26,,Закону України про захист тварин від жорстокого поводження (правила поводження з тваринами, що використовуються в наукових експериментах, тестуванні, навчальному процесі та виробництві біопрепаратів)”.
Для дослідження були використані:
1. Штами герпесвірусу коней першого типу: штам EHV(W), референтний штам отриманий з Університету Кентуккі, США; - штам Юл, референтний штам отриманий з ВІЕВ, Російська Федерація; - штам ЕQ Herpes 040 EDV 9601, отриманий з Університету Іллінойсу, США.
2. Клітинні культури: перещеплювані лінії клітинних культур СНЕВ, ВНК-21 та Vero, отримані з ІВМ УААН.
3. Поживні середовища: гідролізат лактоальбуміну (ГЛА), середовище 199, DMEM, середовище RPMI, м?ясо-пептонний агар і бульйон, середовище Сабуро, тіогліколеве середовище.
4. Лабораторні тварини: кролі породи шиншила, білі миші безпородні, лабораторні щури.
5. Сироватки крові: сироватка крові великої рогатої худоби не консервована, для клітинних культур, виробництва ІЕКВМ, м. Харків; сироватки крові коней (для діагностичних досліджень, отримані з лабораторій ветеринарної медицини та різних конегосподарств України); сироватки крові кролів та щурів (нормальні та гіперімунні, отримані при проведенні дослідів).
Отримання культуральної вірусмісткої суспензії. Культуру отримували у вигляді моношару клітин, вирощених на поверхні скла в матрасах, пробірках та полістиролових плашках. Підтримку клітин перещеплюваних ліній здійснювали періодичними пасажами.
Отримання специфічної діагностичної сироватки. В процесі отримання гіперімунних сироваток крові кролів та щурів використовували суспензію вірусу РПК штамів Юл (ВІЕВ, Москва), EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 (США) з титром, не меншим за 5,0 lgТЦД50, отриману на моношарі клітин СНЕВ, BHK-21, Vero. Гіперімунізацію тварин проводили за розробленими нами методиками.
Тест мікронейтралізації вірусу проводили у полістиролових плашках з пласким дном зі штамами Юл, EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 вірусу РПК.
Визначення інфекційної активності вірусу ринопневмонії коней. Титр інфекційної активності вірусу РПК штамів Юл, EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 визначали в перещеплюваній культурі клітин СНЕВ, BHK-21, Vero. Титрування вірусу проводили класичним методом у пробірках та мікрометодом у полістиролових 96-лункових плашках. Титр інфекційної активності визначали за методом Ріда і Менча і позначали в lg ТЦД50/см3.
Для повного виходу вірусу РПК із клітин, отриману при культивуванні суспензію заморожували і розморожували 2-3 рази. Клітинний детрит осаджували центрифугуванням при швидкості центрифуги 3000 об/хв протягом години. Надосадову вірусовмісну рідину досліджували на інфекційну активність. За титр вірусу брали максимальне розведення, в якому спостерігали дегенерацію клітин у 50 % інфікованих культур.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням програми MS Excel на персональному комп'ютері.
Результати ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ досліджень ТА ЇХ АНАЛІЗ
Отримання культурального антигену вірусу ринопневмонії коней та підбір культури клітин для накопичення вірусу. Для вибору перспективної клітинної моделі з метою вирощування вірусу РПК використовували культури клітин: СНЕВ, ВНК-21, Vero. Вірус РПК штамів Юл, EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 культивували у моношарі клітин в однакових умовах до появи специфічних дегенеративних змін у клітинах.
Для адаптації штамів вірусу РПК до різних культур клітин було проведено 5 пасажів кожного із штамів на кожній лінії культур клітин. Після адаптації штамів Юл, EHV(W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 вірусу РПК до культур клітин СНЕВ, Vero та ВНК-21найбільш чутливою до вірусу РПК виявилась культура клітин Vero, у якій ЦПД вірусу РПК проявлялася вже через 60 годин після зараження. Через 48 годин структура моношару порушилася, а клітини округлилися. З'явилися незначні проміжки між ними. Через 72-96 годин можна було спостерігати значні "вікна" між клітинами, які втратили свої типові морфологічні ознаки. Через 96 годин спостерігали повну руйнацію моношару. Клітини зливалися у симпласти.
Дослідження інфекційної активності вірусу РПК.
Нами проведено дослідження інфекційної активності вірусу РПК штамів Юл, EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 при адаптації до перещеплюваних культур клітин СНЕВ, BHK-21, Vero. Результати наведено у табл. 1.
Таблиця 1
Інфекційна активність вірусу РПК при пасажуванні у перещеплюваних культурах клітин СНЕВ, BHK-21, Vero (M±m, n=4)
Штами вірусу РПК |
Титр інфекційної активності в культурі клітин, lg ТЦД50\см3 |
|||||||||
СНЕВ |
BHK-21 |
Vero |
||||||||
5 п |
10 п |
15 п |
5 п |
10 п |
15 п |
5 п |
10 п |
15 п |
||
Юл |
3,66± 0,04 |
5,33± 0,04 |
6,00± 0,10 |
4,50± 0,07 |
6,00± 0,05 |
6,50± 0,07 |
5,33± 0,07 |
6,50± 0,04 |
6,83± 0,04 |
|
EHV (W) |
4,50± 0,07 |
5,66± 0,04 |
6,33± 0,04 |
4,66± 0,07 |
6,33± 0,04 |
6,83± 0,11 |
5,50± 0,04 |
7,00± 0,04 |
7,33± 0,10 |
|
EQ Herpes 040 EDV |
3,88± 0,03 |
5,23± 0,06 |
5,83± 0,14 |
4,33± 0,04 |
5,66± 0,04 |
5,83± 0,07 |
5,00± 0,07 |
6,33± 0,04 |
6,50± 0,04 |
Аналізуючи дані, наведені в табл. 1, та підсумовуючи культивування вірусу РПК у культурах перещеплюваних клітин СНЕВ, BHK-21 та Vero протягом 15 пасажів, можна зробити висновок, що кращі адаптаційні властивості має штам EHV (W), а найбільш чутливою до вірусу РПК виявилася культура клітин Vero.
Очищення і концентрування вірусного антигену. Для одержання концентрованого і очищеного антигену вірусу РПК, з метою використання в РН та РДП, було використано метод осадження його поліетиленгліколем (ПЕГ) із молекулярною масою 6000 Д у концентрації 5,0; 7,5 і 10,0 % та наступним діалізом. Вихідним матеріалом для отримання антигену була суспензія вірусу РПК. У попередніх дослідженнях вдалося отримати вірус РПК (штам EHV (W)) з активністю не нижче 107,33ТЦД50/см3.
До очищення вірусу РПК ПЕГ - 6000, після першого (до діалізу) та другого етапів, проводили визначення вмісту загального білка у вірусмісткій рідині та визначали інфекційну активність вірусу РПК мікрометодом реакції нейтралізації у культурі клітин Vero.
При концентруванні вірусу РПК поліетиленгліколем у концентрації
7,5 % очищення вірусу досягає 85 %. Після очищення і концентрування штамів ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та Юл вірусу ринопневмонії коней ПЕГ - 6000, у концентрації 7,5 %, отримали такі титри інфекційної активності вірусу: 8,0 lg ТЦД50/см3 - шт ЕQ Herpes 040 EDV 9601; 8,33 lg ТЦД50/см3 - шт Юл; 8,5 lg ТЦД50/см3 - шт EHV (W).
За допомогою електронної мікроскопії в очищених препаратах виявлені значні кількості вірусних частинок, що представлені утвореннями, морфологічно типовими для нуклеокапсида вірусу РПК.
Визначення антигенної спорідненості штамів вірусу ринопневмонії коней. Визначення антигенної спорідненості штамів вірусу ринопневмонії коней проводили у реакції нейтралізації в перещеплюваній культурі клітин Vero за методикою, що запропонована В.А. Прискокою із співавторами.
Реакцію нейтралізації проводили, використовуючи 96-лункові полістиролові плашки. Штами вірусу РПК EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та Юл попередньо адаптували до культури клітин Vero. Активність сироваток визначали мікрометодом в реакції нейтралізації із гомологічним вірусом у культурі клітин Vero. Робоча доза вірусу становила 100 ТЦД50/см3. Облік результату реакції проводили по затримці ЦПД вірусу через 7 діб. Використали контролі: культури клітин, токсичності сироватки та дози вірусу.
Негативну сироватку крові отримали від клінічно здорового лабораторного щура. Сироватка крові не містила віруснейтралізуючих антитіл до вірусу РПК.
Для основного досліду використовували гіперімунні сироватки крові у дозі 5 НД50/см3 (п'ять нейтралізуючих доз). Штами вірусу РПК досліджували попарно: Юл - ЕQ Herpes 040 EDV 9601; Юл - EHV (W); ЕQ Herpes 040 EDV 9601 - EHV (W). Облік результатів реакції проводили через 7 діб (за умови адекватних контролів), шляхом обрахунку титру інфекційної активності вірусу з різними сироватками крові. Потім вираховували індекс нейтралізації для кожного з штамів вірусу та проводили визначення антигенної спорідненості за формулою Архетті та Херсфалла
R=v(r1Чr2) Ч100,
де R - антигенна спорідненість, %;
r1= відношення індексу нейтралізації вірусу 2 сироваткою 1 до індексу нейтралізації вірусу 1 сироваткою 2;
r2= відношення індексу нейтралізації вірусу 1 сироваткою 2 до індексу нейтралізації вірусу 2 сироваткою 2;
За результатами основного досліду - перехресного дослідження штамів вірусу ринопневмонії Юл - ЕQ Herpes 040EDV; Юл - EHV (W); ЕQ Herpes 040 EDV 9601 - EHV (W) визначили індекси нейтралізації. Підставивши значення у формулу, визначали антигенну спорідненість:
R1 = v(0,67Ч0,95) Ч100 =80
R1 - антигенна спорідненість штамів Юл та ЕQ Herpes 040 EDV 9601, %
R2 = v (0,94Ч0,64)Ч100 =78
R2 - антигенна спорідненість штамів Юл та EHV (W), %
R3 = v(0,95Ч0,72) Ч100 =83
R3 - антигенна спорідненість штамів ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та EHV (W), %.
Високі відсотки спорідненості штамів ЕQ Herpes 040 EDV 9601, Юл та EHV (W) вірусу ринопневмонії коней вказують на те, що їхні антигенні властивості майже однакові. Для виявлення віруснейтралізуючих антитіл до вірусу ринопневмонії у сироватках крові коней як антиген можна використати будь-який із досліджених штамів вірусу. Це ж стосується і виготовлення набору діагностиків. Але, враховуючи те, що вірус РПК штаму EHV (W) мав вищі титри інфекційної активності у культурі клітин Vero, для виготовлення набору діагностиків доцільно використати саме штам EHV (W).
Розробка схеми гіперімунізації кролів та щурів для отримання специфічної діагностичної сироватки крові. Для отримання позитивної специфічної сироватки крові ми розробили та використали дві схеми імунізації кролів.
За першою схемою застосовували 5-кратне введення вірусовмісної суспензії внутрішньом'язово (на 1-у, 10-у, 17-у, 24-у та 31-у доби), за другою - 7-кратне, з інтервалом у сім діб. Також ми порівнювали вплив різних ад'ювантів при отриманні сироватки крові з нейтралізуючими антитілами.
Кролів масою тіла 2,5-3,0 кілограми розділили на чотири групи - по чотири тварини у кожній. Для імунізації кролів перших трьох груп використовували очищений і концентрований вірус ринопневмонії, розчинений у середовищі ГЛА. Як ад'ювант та імуностимулятор для імунізації тварин першої групи застосовували аеросил (№28), у концентрації 1 % від загального об'єму суспензії. Сюди ж додавали антибіотики гентаміцин (по 0,3 мг/см3) і ністатин (50 од/см3 ). Для другої групи застосували неповний ад'ювант Фрейнда. Для третьої групи використали суспензію, що містила лише вірус РПК, підтримуюче середовище й антибіотики. Тваринам четвертої групи вводили ізотонічний розчин натрію хлориду, як контроль. Через 10 діб після останнього введення антигену від кролів отримували кров. Негативну сироватку крові отримували від дорослих неімунізованих кролів, витриманих на карантині. Сироватку крові отримували за загальноприйнятою методикою. Рівень віруснейтралізуючих антитіл у досліджуваних сироватках крові кролів виявлено у межах:
- до штаму Юл: перша група - 8,5±0,17 log2, що може свідчити про високу імунологічну відповідь організму піддослідних тварин на введення антигену вірусу РПК. У другій групі виявилася менша активність - 7,5± 0,17 log2. Тварини третьої групи виявили досить низьку імунну відповідь - 5,5±0,17 log2. У сироватці крові тварин четвертої групи віруснейтралізуючих антитіл до вірусу РПК не знайдено;
- до штаму EHV(W): у першій групі виявили рівень віруснейтралізуючих антитіл - 8,5±0,17 log2, що свідчить про таку ж високу імунологічну відповідь організму піддослідних тварин на введення антигену вірусу РПК, як і на штам Юл. У другій групі виявилася така ж активність, як і в першій (8,5±0,17 lоg2). Тварини третьої групи виявили досить низьку імунну відповідь - активність сягала 6,0 log2. У сироватці крові тварин четвертої групи антитіл до вірусу РПК не знайдено.
до штаму EQ Herpes 040 EDV 9601: у першій групі виявили рівень антитіл - 5,5±0,17 log2. У другій групі - 4,5±0,17 lоg2. У третій групі виявили найнижчий рівень антитіл, який становив 3,5±0,17 log2. У сироватці крові тварин четвертої групи віруснейтралізуючих антитіл до вірусу РПК не виявлено.
Специфічність досліджуваної сироватки крові перевіряли зі штамами вірусного артеріїту Буцирус та грипу коней штаму А (кінь) 2 (Майамі) 63. Результати наведено у табл. 2.
Таблиця 2
Рівень віруснейтралізуючих антитіл у досліджуваних сироватках крові (M±m, n=5)
Групи |
Специфічність, титр у РН, log2 |
Активність, титр у РН, log2 |
||||
Штам EQ Herpes 040 EDV 9601 |
Штам Буцирус |
Штам А (кінь) 2 (Майамі) 63 |
Штам Юл |
Штам EHV(W) |
||
Перша |
5,5±0,17 |
- |
- |
8,5±0,17 |
8,5±0,17 |
|
Друга |
4,5±0,17 |
- |
- |
7,5±0,17 |
8,5±0,17 |
|
Третя |
3,5±0,17 |
- |
- |
5,5±0,17 |
6,0 |
|
Четверта |
- |
- |
- |
- |
- |
Результати проведення тесту нейтралізації були негативними, що підтверджує специфічність сироватки. Гіперімунна сироватка крові, отримана за розробленою нами схемою, може бути використана для диференційної діагностики та ідентифікації вірусів, виділених при інфекційних захворюваннях коней.
Схема 7-разової імунізації кролів виявилася менш ефективною. У реакції нейтралізації було встановлено, що з усіма штамами збудників ринопневмонії коней досліджувана сироватка крові мала титри в межах:
- зі штамом Юл - 1:128-1:256 або 7,5±0,17 log2;
- зі штамом ЕQ Herpes 040 EDV 9601 - 1:16-1:32 або 4,5±0,17 log2;
- зі штамом EHV(W) - 1:64-1:128 або 6,5±0,17 log2.
Гіперімунізацію щурів проводили за першою схемою - 5-разове введення вірусовмісної суспензії. На відміну від кролів суспензію вводили інтраперитонеально. Після дослідження сироваток крові щурів встановлено, що рівень віруснейтралізуючих антитіл до вірусу штамів ЕQ Herpes 040 EDV 9601, EHV (W) та Юл знаходився у межах 6,5-9 log2.
Модифікований мікрометод реакції нейтралізації у 96-лункових полістиролових плашках з одночасним внесенням усіх компонентів реакції. Реакція базується на явищі нейтралізації інфекційної активності вірусу РПК специфічними до нього антитілами, які знаходяться у сироватці крові. Звичайний метод постановки РН у пробірках з культурою клітин потребує значних витрат посуду, реактивів, поживних середовищ, сироваток крові, вірусного діагностичного антигену та робочого часу. При постановці реакції нейтралізації мікрометодом вдається зменшити витрати реагентів та дослідити більшу кількість зразків одночасово. Для діагностики РПК нами запропонована постановка реакції нейтралізації мікрометодом із одночасним внесенням у лунки дослідних зразків і суспензії культури клітин.
Для проведення реакції готували робоче розведення вірусу РПК 100 ТЦД50/см3. В усі лунки планшета для приготування дослідних зразків вносили по 0,05 см3 поживного середовища RPMI. В перший ряд лунок додавали по 0,05 см3 досліджуваної сироватки крові, піпетували 3 рази для змішування і 0,05см3 суміші переносили в наступний ряд лунок. Аналогічно, послідовним переносом сумішей, отримували 2-кратні розведення досліджуваних сироваток крові. До отриманих розведень додавали по 0,05 см3 робочого розведення вірусу РПК і змішували. Одночасно ставили контролі:
- контроль культури клітин;
- контроль токсичності сироваток крові;
- контроль специфічності реакції: робоче розведення вірусу РПК змішували з 2-разовими розведеннями специфічної позитивної гіперімунної сироватки крові; також робоче розведення вірусу змішували з 2-разовим розведенням негативної до вірусу РПК сироватки крові ;
- контроль робочого розведення вірусу РПК: з робочої суспензії готували розведення вірусу так, щоб у лунках було по 100, 10, 1 і 0,1 робочих доз вірусу РПК.
Планшет із приготованими дослідними зразками ставили на 1 годину в термостат при температурі 37±0,5 0С для контакту вірусу РПК з досліджуваними сироватками крові. Потім у кожну лунку додавали по 0,1 см3 підготовленої суспензії культури клітин з концентрацією 500-550 тис. клітин на 1 см3 (коефіцієнт пересіву 1:1) і поміщали для культивування в СО2 -інкубатор.
Облік результатів РН з контролями проводили 5 діб, кожні 24 години, шляхом перегляду під бінокулярним інвертованим мікроскопом. Через 18-24 години клітини, як правило, починають утворювати суцільний моношар, а ЦПД вірусу починає проявлятися через 24 години. При нейтралізації вірусу антитілами культура клітин, виростаючи, утворює суцільний моношар, а де діє вірус - моношар відсутній та помітна значна дегенерація клітин.
Постановка реакції дифузної преципітації. Для постановки РДП використали 1,5 %-й розчин очищеного агару, який розливали по чашках Петрі так, щоб товщина шару досягала 4-5 мм та залишали для застигання агару.
Штампом-пробійником, що має одну центральну та шість трубочок, розміщених по колу на відстані 4-6 мм одна від одної, прорізали лунки в агарі. На одній чашці можна розмістити 4-5 відбитків штампу.
Контрольні ліофільно висушені сироватки крові та вірус ринопневмонії розводили, додаючи бідистильовану воду до об'єму 2 см3.
У центральні лунки вносили по 20 мкл розведеного вірусу ринопневмонії коней, який і був антигеном. В інші лунки вносили розведення досліджуваних сироваток крові (при потребі готували 2-разові серійні розведення), чергуючи їх з 2-разовим розведенням позитивної сироватки. В останній відбиток додатково вносили негативну сироватку крові, як негативний контроль. Всі компоненти реакції вносяться окремими піпетками чи «носиками» дозатора з таким розрахунком, щоб утворився дещо увігнутий меніск і рідина не розтікалася по поверхні агару.
Чашки Петрі закривали і залишали на дві доби при кімнатній температурі (20±2 0С) у затемненому місці з вологістю повітря близько 70 %.
Облік результатів реакції дифузної преципітації проводили щодня, проглядаючи чашки Петрі проти падаючого світла під збільшуючим склом. При позитивному результаті між лунками із дослідною та позитивною сироватками і антигеном утворюється заокруглена лінія преципітації. У випадку, коли позитивні 3 сироватки в одному відбитку, лінія преципітації має вигляд шестикутника із заокругленими кутами. Лінія преципітації між негативною сироваткою та антигеном утворитися не повинна.
Підбір стабілізатора для вірусу РПК та режиму ліофільного висушування компонентів набору діагностиків. З метою виготовлення компонентів набору була проведена робота з підбору стабілізатора для ліофільного висушування вірусу ринопневмонії коней. Випробували чотири різних прописи стабілізатора:
- знежирене молоко + вірусовмісна суспензія (1:1);
- знежирене молоко з сахарозою (5 %) + вірусовмісна суспензія (1:1);
- 3 % КМЦ на фосфатно-буферному розчині + вірусовмісна суспензія (1:9);
- 50 % сахарози, 15 % желатину, 3 % КМЦ і розчин Хенкса до 100 см3 + вірусовмісна суспензія (1:9).
Суспензія, яку брали у роботу, містила вірус РПК штам EHV (W) з титром інфекційної активності 8,0 lg ТЦД50/см3. Режими ліофілізації вірусу РПК відпрацьовували на різних сублімаційних установках.
У першому варіанті ліофілізацію вірусу РПК провели в сублімаційній установці CRYODOS фірми TEL STAR INDUSTRIAL. SL (Франція).
У другому варіанті для сублімаційної сушки використали установку
ТГ-5.2 (VEB Hochvakum Dresden, Німеччина).
До висушування титр вірусного антигену становив 8,0 lg ТЦД50/см3.
Порівняльна оцінка висушування вірусу РПК на різних установках ліофільної сушки наведена у табл. 3.
Таблиця 3
Порівняльна оцінка ліофільного висушування вірусу РПК на різних установках (M±m, n=5)
Середовище висушування |
Титр вірусу РПК, lg ТЦД50/см3 |
||
з використанням установки CRYODOS (1) |
з використанням установки ТГ-5.2 (2) |
||
1 |
5,5±0,06 |
6,0±0,06 |
|
2 |
6,66±0,06 |
7,0±0,03 |
|
3 |
5,83±0,16 |
6,33±0,12 |
|
4 |
6,5±0,07 |
6,83±0,07 |
Як видно із таблиці, ліофільне висушування вірусу РПК з використанням установки ТГ-5.2 є кращим. Для ліофілізації вірусу РПК кращим є стабілізатор за прописом 2: знежирене молоко з сахарозою (5 %) у співвідношенні з антигеном 1:1 при застосуванні другого варіанта ліофілізації.
Аналогічні дослідження проводили кожні 3 місяці для визначення терміну придатності ліофілізованих компонентів набору діагностиків. Ліофілізований вірус РПК зберігали при температурі 4 єС. Результати дослідження наведено графічно (рис.1).
До 6 місяців зберігання препарату зниження титру не спостерігали. За період з 6-го по 9-й місяці титр вірусу знизився на 0,17 lg. За період з 9-го по 12-й місяці зберігання титр знизився на 0,33 lg, що також є допустимим. При подальшому зберіганні препарату протягом року зниження інфекційного титру вірусу РПК становило 1 lg. Титр вірусу після 24-х місяців зберігання становив 5,5 lg ТЦД50/см3.
Контроль вірусу РПК за допомогою сучасних методів досліджень (електронної мікроскопії, ПЛР та ІФА). Для індикації адаптованого у культурі клітин вірусу та з метою вивчення його морфології проводили електронно-мікроскопічне дослідження методом негативного контрастування. Метод електронної мікроскопії є швидким і ефективним для індикації вірусу ринопневмонії коней, виділеного у культурі клітин. Він дає можливість правильно орієнтуватись у проведенні наступних вірусологічних досліджень та вивченні фізико-хімічних властивостей вірусу.
За допомогою ПЛР, використовуючи відповідні праймери, проведено тестування культурального вірусу ринопневмонії коней, який використовується при виготовленні діагностичного набору для реакції нейтралізації. Методом досліджень був напівгніздовий метод полімеразної ланцюгової реакції, із застосуванням праймерів, специфічних до ділянки гена, що кодує глікопротеїн H (gH). Аналіз результатів ПЛР проводили в 1,5 % гелі агарози з барвником - етідієм бромистим. У досліджуваному матеріалі виявили ДНК вірусу герпесу коней першого типу. Результати, отримані за допомогою ПЛР, можуть бути використані для підтвердження діагнозу, а також науковцями для проведення діагностичних і наукових досліджень.
Для валідації наших досліджень мікрометодом РН та РДП було проведено дослідження 10 сироваток крові в ІФА з використанням набору «Ingenasa» іспанського виробництва. При цьому 6 сироваток крові були позитивними в РН, 4 сироватки - в РДП і 5 сироваток - в ІФА. У сироватках крові тварин з високими титрами антитіл до РПК у РН були виявлені також преципітуючі антитіла в РДП, які збігаються з результатами РН на 80 %. Результати серологічних досліджень в ІФА збігаються на 90 % з результатами РН та на 90 % - з результатами в РДП.
Створення, комплектність та дослідження експериментальних серій «Набору діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації».
З метою розробки засобів лабораторної діагностики ринопневмонії коней, нами, спільно з науковими співробітниками лабораторії вірусології та діагностики Інституту ветеринарної медицини УААН, було виготовлено експериментальні серії «Набору діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації». До складу набору діагностиків входять:
- вірус ринопневмонії коней штаму EHV (W) - 2 флакони по 2,0 см3 (ліофілізований, титр у культурі клітин становить не менше 5,0 lg ТЦД50/см3);
- сироватка, специфічна до вірусу ринопневмонії коней - 2 флакони по
2,0 см3 (ліофілізована, титр якої в реакції нейтралізації із специфічним вірусом становить не нижче 1:64);
- сироватка контрольна (негативна) - 2 флакони по 2,0 см3 (ліофілізована, в реакції нейтралізації не реагує із специфічним вірусом).
З метою дослідження створеного «Набору діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» на відповідність вимогам розробленої науково-технічної документації кожну експериментальну серію набору діагностиків перевіряли комісійно в лабораторних умовах.
За результатами проведених досліджень зроблено висновок, що «Набір діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» відповідає вимогам науково-технічної документації та придатний до користування.
Результати проведення серологічного моніторингу щодо ринопневмонії коней в Україні з використанням розробленого набору діагностиків. Еталонних стандартизованих методів лабораторної діагностики ринопневмонії коней у світі не розроблено. Кожна лабораторія обирає доступний для неї метод діагностики - серологічний, імунологічний чи біологічний за відповідними методиками досліджень. Однак Всесвітня організація охорони здоров?я тварин (ОІЕ) рекомендує використовувати для серологічного дослідження реакцію нейтралізації як базову у поєднанні з іншими, додатковими методами, наприклад ПЛР, ІФА чи РДП.
Для з'ясування серологічного статусу поголів?я щодо ринопневмонії коней нами протягом 2006-2008 років були проведені дослідження сироваток крові коней з різних регіонів України із застосуванням набору діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації (ТУ У 24.4-05510830-078:2006).
Дослідження проводилися в реакції нейтралізації макро- та мікрометодом згідно з інструкцією по застосуванню набору. Паралельно сироватки крові досліджувалися у РДП в агаровому гелі. Дослідили 511 сироваток крові коней, відібраних у різних конегосподарствах та конезаводах 12 областей України. При цьому у конезаводах та іподромах зразки крові у коней відбирали вибірково, не зважаючи на стать, вік, клінічний стан тварин (до 10 % від поголів'я коней у даному господарстві). Узагальнені результати досліджень наведено в табл. 4.
Таблиця 4
Серологічний моніторинг ринопневмонії коней в Україні за 2006-2008 рр
Області |
Кількість досліджених проб |
Результати дослідження |
||
в РН, |
в РДП, позитивних проб |
|||
Дніпропетровська |
29 |
2 |
2 |
|
Харківська |
30 |
0 |
0 |
|
Полтавська |
91 |
7 |
5 |
|
Київська |
76 |
1 |
1 |
|
Хмельницька |
2 |
0 |
0 |
|
Чернігівська |
73 |
10 |
7 |
|
Сумська |
53 |
8 |
7 |
|
Тернопільська |
40 |
9 |
7 |
|
Луганська |
6 |
0 |
- |
|
Донецька |
64 |
0 |
0 |
|
Черкаська |
17 |
2 |
1 |
|
Кіровоградська |
30 |
7 |
4 |
|
Всього |
511 |
46 |
34 |
Отримано 46 позитивних результатів у реакції нейтралізації, при яких титри віруснейтралізуючих антитіл перебували у межах від 2 до 9 log2, та 34 позитивних результати у РДП. За результатами серологічного обстеження видно, що вірус ринопневмонії циркулює серед поголів'я коней в Україні.
Надалі проведення серологічного моніторингу та виявлення вірусу сприятиме вчасній локалізації інфекції і попередженню її розповсюдження по господарству та на інші території України.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення, експериментальне обґрунтування та нове вирішення проблеми лабораторної діагностики ринопневмонії коней. Вперше в Україні розроблено та затверджено вітчизняний набір для діагностики даної інфекційної хвороби у реакції нейтралізації. Впровадження набору для індикації антитіл до вірусу ринопневмонії коней в реакції нейтралізації у сироватках крові дає можливість постановки діагнозу на дане захворювання та проведення широких скринінгових досліджень в конярських господарствах України.
2. Визначено чутливість перещеплюваних культур клітин ВНК 21, Vero та СНЕВ до штамів вірусу ринопневмонії коней EQ Herpes 040 EDV 9601, EHV (W) та Юл. Для отримання якісних антигенів підібрано чутливу клітинну культуру (Vero), визначено штам вірусу РПК для використання в наборі діагностиків (EHV (W)) та умови культивування, які забезпечують активність вірусу у титрі не нижче 7,0 lg ТЦД50/см3, причому відмічається поступове зростання інфекційного титру вірусу в процесі проведення пасажів.
3. Випробувана методика концентрування та очищення вірусу РПК на основі використання поліетиленгліколю дозволяє концентрувати вірус у 100 разів та очистити його на 85-87 %. У результаті проведених досліджень вдалося отримати високі титри специфічної сироватки крові та застосувати РДП в агаровому гелі для додаткових досліджень.
4. При дослідженнях у реакції нейтралізації мікрометодом встановлено антигенну спорідненість штамів EQ Herpes 040 EDV 9601, EHV (W) та Юл вірусу РПК, репродукованих у культурі клітин Vero. Так, антигенна спорідненість штамів Юл та ЕQ Herpes 040 EDV 9601 становить 80 %, штамів Юл та EHV (W) - 78 %, штамів ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та EHV (W) - 83 %.
5. Розроблено схему отримання специфічної гіперімунної сироватки крові тварин. Для одержання активної специфічної сироватки до вірусу РПК підібрані донори (кролі та щури). Визначено, що оптимальною схемою гіперімунізації тварин є 5-разове введення вірусовмісної суспензії з додаванням 1 % аеросилу. Інтервал між ін'єкціями становив 7 діб. При цьому отримали специфічну гіперімунну сироватку крові з рівнем віруснейтралізуючих антитіл - 8,5±0,17 log2.
6. Визначене оптимальне середовище висушування (знежирене молоко із сахарозою (5 %) у співвідношенні з антигеном 1:1), режим ліофізації вірусу РПК і діагностичних сироваток крові та умови зберігання ліофілізованих компонентів набору діагностиків.
7. За допомогою розробки «Набору діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» показано можливість діагностики захворювання при виявленні специфічних віруснейтралізуючих антитіл до вірусу ринопневмонії коней. Результати серологічних досліджень 511 сироваток крові коней різних господарств та регіонів України свідчать про наявність віруснейтралізуючих антитіл до вірусу РПК у 9 % досліджених коней.
ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
Розроблено, затверджено та рекомендовано для виробництва:
1. Набір діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації:
ТУ У 24.4-05510830-078:2006 ; Чинні від 08.12.2006: Термін до 08.12.2011.
2. Методичні рекомендації по застосуванню мікрометоду реакції нейтралізації в культурі клітин та реакції дифузної преципітації в агаровому гелі для виявлення антитіл до вірусу ринопневмонії коней.
3. Державний стандарт України «Ветеринарна медицина. Метод лабораторної діагностики ринопневмонії коней».
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Публікації у фахових виданнях
1. Синицин В.А. Розробка технології виготовлення діагностичних імунних сироваток до вірусу ринопневмонії коней для реакції нейтралізації / В.А. Синицин, В.І. Москалюк, П.Ю. Грубіч // Ветеринарна біотехнологія. 2006. № 8. С. 242-246. (Здобувач брав участь у процесі виготовлення діагностичних імунних сироваток та обробив частину одержаних результатів).
2. Грубіч П.Ю. Місце та застосування мікрометоду реакції нейтралізації у діагностиці вірусних інфекцій сільськогосподарських тварин / П.Ю. Грубіч, М.В. Пекний // Ветеринарна біотехнологія. 2006. № 9. С. 60-64. (Здобувач проводив постановку мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики ринопневмонії коней та підготував роботу до друку).
3. Грубіч П.Ю. Відпрацювання постановки мікрометоду реакції нейтралізації для розробки набору діагностиків ринопневмонії коней / П.Ю. Грубіч // Ветеринарна біотехнологія. 2007. № 10. С. 30-35.
4. Діагностика респіраторних вірусних хвороб коней на основі сучасних біотехнологічних методів / М.В. Пекний, В.В. Куликова, І.В. Белендик, П.Ю. Грубіч, Р.О. Капралюк // Ветеринарна медицина. 2007. № 88. С. 171-174. (Здобувач брав участь у діагностиці ринопневмонії коней, обробці отриманих результатів та підготовці роботи до друку).
5. Грубіч П.Ю. Застосування «Набору діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» у процесі проведення серологічного моніторингу щодо ринопневмонії коней в Україні / П.Ю. Грубіч // Вісник Полтавської державної аграрної академії. 2008. Вип. 1. С. 185-186.
6. Грубіч П.Ю. Порівняльна оцінка різних ад'ювантів при отриманні гіперімунної сироватки до вірусу ринопневмонії коней / П.Ю. Грубіч, О.О. Миланко, В.В. Білобров, В.В. Казачкова //Вісник Полтавської державної аграрної академії. 2008. Вип. 2. С. 158-160. (Здобувач брав участь у розробці схеми імунізації тварин, отриманні гіперімунної сироватки крові, обробці результатів дослідження).
7. Грубіч П.Ю. Визначення антигенної спорідненності штамів вірусу ринопневмонії коней у реакції нейтралізації / П.Ю. Грубіч // Ветеринарна біотехнологія. 2009. № 14. С. 91-97.
Патенти
Пат. 25282 Україна, МПК (2006) А61К39/00. Тест-система на основі мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики ринопневмонії коней / А.П. Старчеус, В.А. Синицин, П.Ю. Грубіч (Україна); патентовласник Інститут ветеринарної медицини Української академії аграрних наук. №200611770; заявл. 09.11.2006; опубл. 10.08.2007, Бюл. № 12. (Здобувач проводив постановку мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики ринопневмонії коней та підготував заявку на патент).
Публікації в інших виданнях та матеріалах конференцій
Грубіч П.Ю. Герпесвірус коней першого типу (EHV1) та лабораторні методи діагностики захворювання, що ним викликається / П.Ю. Грубіч // Збірник матеріалів V Міжнародної конференції «Біоресурси та віруси», 10-13 вересня 2007 р., м. Київ. С. 141.
Методичні рекомендації
Методичні рекомендації по застосуванню мікрометоду реакції нейтралізації в культурі клітин та реакції дифузної преципітації в агаровому гелі для виявлення антитіл до вірусу ринопневмонії коней / В.А. Синицин, В.І. Полулях, Т.О. Сокирко, П.Ю. Грубіч - Київ, 2009. 15 с. (Здобувач застосовував мікрометод реакції нейтралізації та реакцію дифузної преципітації для діагностики ринопневмонії коней).
АНОТАЦІЯ
Грубіч П.Ю. Розробка засобів діагностики та серологічний моніторинг ринопневмонії коней в Україні. - Рукопис.
...Подобные документы
Енергетичне забезпечення м'язової діяльності коней. Рухова гіпоксія і механізми адаптації до неї. Фізіологічна характеристика різних робіт скакових коней. Регуляція і взаємозв'язок фізіологічних функцій. Фізіологічні механізми формування рухових навичок.
презентация [198,1 K], добавлен 11.10.2015Визначення хвороби, економічні збитки від неї, систематика й загальна характеристика збудників. Особливості протікання й клінічного прояву стронгілятозно-параскарозної інвазії коней. Оцінка лікувальної ефективності препаратів при кишкових гельмінтозах.
магистерская работа [355,5 K], добавлен 13.05.2011Короткі відомості про господарство с. Комарівка Борзнянського району. Стан продуктивності кінного господарства за 2002-2004 рр. Підготовка і проведення парувальної компанії. Характеристика потреби коней в поживних речовинах. Плани реалізації продукції.
курсовая работа [59,0 K], добавлен 25.09.2010Сучасний стан конярства в Україні. Склад і структура конепоголів’я господарства. Умови утримання та годівлі молодняку. Технологія вирощування, тренінгу та випробувань коней. Відтворювальні якості поголів’я. Вимоги безпеки праці при догляді за жеребцями.
дипломная работа [483,8 K], добавлен 13.05.2017Серологічний моніторинг лейкозу великої рогатої худоби в Україні і Полтавській області. Розповсюдження ВЛВРХ з урахуванням вікових характеристик поголів'я. Показники крові тварин на різних стадіях перебігу хвороби, профілактичні і протилейкозні заходи.
дипломная работа [162,8 K], добавлен 12.10.2011Происхождение, анатомические и физиологические особенности лошадей, основные типы конституции, телосложение, экстерьер, масти и породы. Характеристика условий содержания коней, их кормление, разведение. Разновидности продуктов коневоводства, их ценность.
курсовая работа [61,9 K], добавлен 28.07.2011Системи утримання коней. Етапи і правила проектування стаєнь. Структура і розміри конярських ферм. Основні будівельні матеріали. Вимоги до вирішення генеральних планів підприємств. Освітленість, вентиляція, опалення, водопостачання скотарських приміщень.
курсовая работа [133,9 K], добавлен 25.02.2015Організаційні форми штучного осіменіння корів і телиць. Годівля великої рогатої худоби та свиней, добовий раціон для дійних корів. Вирощування ремонтного молодняку худоби та птиці. Економічні показники ефективності тваринництва. Утримання коней.
учебное пособие [351,0 K], добавлен 20.07.2011Визначення природно-ресурсного потенціалу та його складові. Поняття та визначення земельно-ресурсного потенціалу. Структура і сучасний стан земель. Деградація земель в Україні. Перспективи розвитку раціонального використання земельних ресурсів України.
курсовая работа [1,6 M], добавлен 14.07.2016Система спостереження за станом земель з метою своєчасного виявлення змін, їх оцінки, відвернення та ліквідації наслідків негативних процесів. Структура, зміст, функції та принципи моніторингу земель, законодавче регулювання порядку його проведення.
презентация [2,9 M], добавлен 18.04.2015Особливості визначення епізоотичної ситуації та аналіз динаміки рівня антитіл у курей АТЗТ "Лисичанська птахофабрика" після щеплення інактивованою вакциною проти МПВІ на фоні циркуляції епізоотичного штаму вірусу. Обґрунтування необхідності вакцинації.
доклад [220,7 K], добавлен 01.02.2010Використання геоінформаційних технологій в сільському господарстві на прикладі СТОВ "Авіатор" та НДГ "Лан" Городенківського району Івано-Франківської області. Використання супутникових даних. Системи спостереження, супутниковий моніторинг посівів.
курсовая работа [648,4 K], добавлен 18.04.2015Загальна характеристика сучасного стану лісового фонду України Особливості правового регулювання охорони та використання лісових ресурсів в Україні. Рекомендації щодо поліпшення використання лісових ресурсів та аналіз наслідків впровадження їх у життя.
реферат [24,1 K], добавлен 04.10.2010Оцінка товарного асортименту засобів захисту рослин та методів їх продажу на ринку України. Підвищення ефективності використання засобів захисту рослин з урахуванням позиціонування та маркетингу. Вивчення рекомендованих норм внесення кожного пестициду.
дипломная работа [962,2 K], добавлен 18.01.2013Фізіологічні основи визначення потреби сільськогосподарських культур в добривах. Вплив різних факторів зовнішнього середовища на ефективність добрив. Складання системи добрив під культури в сівозміні. Розрахунок балансу поживних речовин в ґрунті.
курсовая работа [109,1 K], добавлен 12.05.2015Ріпак як найбільш поширена олійна культура з родини капустяних. Характеристика найбільш небезпечних шкідників ярого ріпаку, етапи та особливості їх розвитку. Захисні заходи по знищенню чисельності найбільш небезпечних видів, визначення їх ефективності.
дипломная работа [1,3 M], добавлен 28.07.2011Застосування ґрунтових твердомірів різних конструкцій для визначення твердості ґрунту при обробці. Конструктивна схема твердоміру, принцип роботи та технологічні параметри. Розрахунок вузлів та деталей на міцність. Техніко-економічна оцінка пристрою.
реферат [813,0 K], добавлен 19.05.2011Вибір типів засобів діагностики і обслуговування агропромислової техніки. Визначення об'ємів робіт по технічному обслуговуванню тракторів та кількості робітників спеціалізованої ланки. Зміст технологічної і діагностичної карт сільськогосподарських машин.
реферат [71,7 K], добавлен 19.09.2010Сучасні поняття про мікотоксикози, види мікотоксинів. Методи визначення мікотоксинів у кормах. Профілактика та лікування свиней за виникнення мікотоксикозів. Моніторинг вітчизняного ринку протимікотиксокозних засобів. Встановлення параметрів токсичності.
дипломная работа [1,5 M], добавлен 30.08.2015Загальна характеристика важливих проблем аграрного сектору економіки України: ризики збільшення виробничих витрат, незавершеність земельної реформи. Аграрний сектор як один з найбільш пріоритетних та стратегічних напрямів розвитку економіки України.
реферат [46,2 K], добавлен 13.09.2014