Розробка засобів діагностики та серологічний моніторинг ринопневмонії коней в Україні

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія. - Національний університет біоресурсів і природокористування України, Київ, 2010.

У дисертації викладені результати науково-експериментальних досліджень, на підставі яких уперше в Україні розроблено «Набір діагностиків ринопневмонії коней для реакції нейтралізації» (ТУ У 24.4-05510830-078:2006). За допомогою набору у сироватці крові можна виявляти віруснейтралізуючі антитіла до вірусу ринопневмонії коней.

Вивчена чутливість перещеплюваних культур клітин СНЕВ, BHK-21 та Vero до штамів вірусу ринопневмонії коней EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та Юл. Розроблено схеми імунізації та отримана високоспецифічна діагностична сироватка крові лабораторних тварин. Встановлено антигенну спорідненість штамів вірусу ринопневмонії коней EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 та Юл мікрометодом реакції нейтралізації у перещеплюваній культурі клітин Vero. За допомогою розробленого набору діагностиків проведено серологічний моніторинг щодо ринопневмонії коней 12-ти областей України. Результати досліджень свідчать про наявність у 9 % досліджених коней віруснейтралізуючих антитіл до вірусу ринопневмонії.

Ключові слова: ринопневмонія коней, реакція нейтралізації, культура клітин, набір діагностиків, сироватка крові, серологічний моніторинг.

АННОТАЦИЯ

Грубич П.Ю. Разработка средств диагностики и серологический мониторинг ринопневмонии лошадей в Украине. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология, эпизоотология, инфекционные болезни и иммунология. - Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев, 2010.

В диссертации изложены результаты научно-экспериментальных исследований, на основании которых впервые в Украине разработаны средства диагностики ринопневмонии лошадей, а именно «Набор диагностиков ринопневмонии лошадей для реакции нейтрализации»
(ТУ У 24.4-05510830-078:2006). При использовании разработанного набора проведен серологический мониторинг ринопневмонии лошадей в разных регионах Украины.

Изучена чувствительность перевиваемых клеточных культур СПЭВ, ВНК-21 и Vero к штаммам вируса ринопневмонии лошадей EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 и Юл. В процессе выполнения работы изучена адаптационная способность этих штаммов к вышеуказанным культурам клеток для получения вируса с наивысшим титром инфекционной активности. Установлено, что лучшей чувствительностью к вышеуказанным штаммам вируса ринопневмонии обладает перевиваемая культура клеток Vero. Определены условия культивирования, которые обеспечивают инфекционную активность вируса не ниже 7,0 lg ТЦД_50/см³, при этом наблюдается постепенное нарастание титров с проведением следующих пассажей.

Испытан метод концентрирования и очистки вируса РПЛ с помощью полиэтиленгликоля с молекулярным весом 6000 Д. Концентрирование вируса делает возможным применение реакции диффузной преципитации в агаровом геле для дополнительных исследований при установлении диагноза на ринопневмонию лошадей.

Разработаны и применены разные схемы гипериммунизации лабораторных животных - кролей и крыс с применением адъювантов. Лучший результат получен при использовании для иммунизации вируссодержащей суспензии с добавлением 1% аэросила (кремнозема) в конечной концентрации при 5-кратном введении в 1-, 10-, 17-, 24- и 31-е сутки. При этом получили специфическую диагностическую сыворотку крови с уровнем вируснейтрализирующих антител - 8,5±0,17 log_2.

Установлено антигенное родство штаммов вируса ринопневмонии лошадей EHV (W), ЕQ Herpes 040 EDV 9601 и Юл микрометодом реакции нейтрализации, предложенным соискателем (патент Украины №25282 от 10 августа 2007 года), в перевиваемой культуре клеток Vero с использованием 96-луночных полистироловых планшет, что позволяет сократить расходные материалы и одновременно исследовать большее количество проб. Антигенное родство штаммов Юл и ЕQ Herpes 040 EDV 9601 составляет 80 %, штамов Юл и EHV (W) - 78 %, штаммов ЕQ Herpes 040 EDV 9601 и EHV (W) - 83 %. Полученные результаты дают возможность использовать любой из исследованных штаммов вируса ринопневмонии лошадей для производства набора диагностикумов для реакции нейтрализации, так как они имеют высокий уровень антигенного родства.

При изготовлении стандартных компонентов для диагностического набора испытаны разные защитные среды для вируса ринопневмонии (обезжиренное молоко, сахароза, желатин, КМЦ), а также методы лиофильного высушивания с применением установок CRYODOS (Франция) и ТГ-5.2 VEB Hochvakum (Германия). Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что лучшими защитными свойствами обладает среда, состоящая из обезжиренного молока с добавлением 5 % сахарозы в соотношении с антигеном 1:1, высушенные с применением установки ТГ-5.2 VEB Hochvakum. При хранении лиофилизированого вируса при температуре 4 єС до 6 месяцев снижения титра инфекционной активности не наблюдалось. За период с 6-го по 9-й месяц хранения титр вируса снизился на 0,17 lg. За период с 9-го по 12-й месяц хранения титр снизился на 0,33 lg. При дальнейшем хранении препарата в течение года снижение титра инфекционной активности вируса РПЛ составило 1 lg.

Разработка отечественного диагностического набора дала возможность провести расширенный серологический мониторинг ринопневмонии среди лошадей, принадлежащих конезаводам и частным коневодческим предприятиям 12-ти областей Украины. Результаты скрининговых исследований свидетельствуют о наличии у 9% исследованых лошадей вируснейтрализирующих антител к вирусу ринопневмонии.

Внедрение в производство диагностического набора дает возмозность установления лабораторного диагноза на ринопневмонию лошадей в периферических лабораториях ветеринарной медицины. Для широкого круга специалистов ветеринарной медицины разработаны «Методические указания по применению микрометода реакции нейтрализации в культуре клеток и реакции диффузной преципитации в агаровом геле для выявления антител к вирусу ринопневмонии лошадей».

Ключевые слова: ринопневмония лошадей, реакция нейтрализации, культура клеток, диагностический набор, сыворотка крови, серологический мониторинг.

SUMMARY

The investigation of the diagnostic facilities of the serological monitoring of rinopneumonia of horses in Ukraine. - Manuscript.

The thesis on receiving a scientific degree of the candidate of veterinary sciences by speciality 16.00.03 - veterinary microbiology, epizootology, infectious diseases and immunology. - National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

For the first time in Ukraine there was developed “A set of diagnostics of rinopneumonia of horses on the ground of mechanism of the neutralization reaction” (TU U 24.4-05510830-078:2006).By means of the set of blood serum, it is possible to find out virus neutralized antibodies of the virus of rinopneumonia of horses.

There was investigated the sensitivity of overvaccinate cultures of cells such as: PKE, BHK-21 and Vero to strain of the virus of rinopneumonia of horses EHV (W), EQ Herpes 040 EDV 9601 and Ul. There were also developed the schemes of immunization and there was received a high-avid diagnostic serum of blood of laboratory animals. The antigenic affinity of strains of the virus of rinopneumonia of horses EHV (W), EQ Herpes 040 EDV 9601 and Ul was installed with the help of a micro method of neutralization in over vaccinate culture of Vero cells. The serological monitoring of rinopneumonia of horses by means of development set of diagnostics was led in 12 of areas of Ukraine. The results of researches testify to presence of 9 % of investigated horses virus neutralizing antibodies of rinopneumonia virus of horses.

Key words: rinopneumonia of horses, neutralization reaction, cell culture, set of researches, blood serum, serological monitoring.

Размещено на Allbest.ru