Особливості регенерації хряща колінного суглоба щурів після кріовпливу та застосування низькомолекулярної фракції кордової крові великої рогатої худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

УДК: : 616.72-018.3.003.93.084:57.043:611.018.5.013.8.088.3

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Особливості регенерації хряща колінного суглоба щурів після кріовпливу та застосування низькомолекулярної фракції кордової крові великої рогатої худоби

03.00.19 ? кріобіологія

Іванов Євген Геннадійович

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науко Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України Гулевський Олександр Кирилович, завідувач відділу біохімії холодової адаптації Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Петренко Олександр Юрійович, завідувач відділу кріобіохімії, Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків;

доктор біологічних наук, професор Дєдух Нінель Василівна, завідувач лабораторії морфології сполучної тканини ДУ "Інститут патології хребта і суглобів ім. проф. М.І. Сітенка АМН України".

Захист дисертації відбудеться ?_21__?_____червня_______2011 р. о 13.30_____ годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий ?_20__?___травня_________2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук, професор Розанов Л.Ф.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Оптимізація репарації суглобового хряща після його травматичного пошкодження є актуальним завданням сучасної експериментальної біології та медицини [Слуцький Л. І., 1969; Павлова В. Н. та ін, 1988; Поворознюк В. В, 2003; Cicuttini F. M., 2004; Lee S. K., 2009]. На сьогоднішній день існують різні способи оптимізації репарації травмованого суглобового хряща: вплив хондромодуляторів, застосування клітинних технологій та використання фізичних факторів [Ліла А. М. та ін, 2005; Бур'янов О. А., 2007; Hammond C. L., 2009]. Відомі способи стимуляції, виходячи з аналізу наявних літературних даних, не забезпечують достатнього рівня регенерації хрящової тканини [Малишкіна С. В., 1985; Жигун А..І., 1986; Featherstone H. J., 2009].

Перспективним напрямком регенераторної медицини є використання комплексної терапії, що поєднує в собі дію біологічно активних субстанцій з дією фізичних факторів. Відомо, що в даний час для оптимізації репарації суглобового хряща в разі його травматичного пошкодження як фактор фізичного впливу застосовується кріовплив [Wojtecka-Lukasik E., 2010; Жигун А..І., 1986]. Сучасні дослідження дозволяють стверджувати, що перспективними в комплексному лікуванні травми суглобового хряща є біологічно активні субстанції, отримані з природних джерел, зокрема, низькомолекулярна фракція (до 5кДа) кордової крові (ФКК), яка згідно з раніше опублікованими даними ефективно стимулює регенерацію шкіри та слизової оболонки шлунку [Гулевський О. К. та ін., 2008; Гулевський О. К. та ін., 2009; Гулевський О. К. та ін., 2010]. Ця біологічно активна субстанція, поряд з вже відомими фармацевтичними препаратами: Актовегін (виробник - Nicomed, Австрія) і Солкосерил (виробник - Solco, Швейцарія), отриманими з онтогенетично близького джерела - крові молочних телят, також може володіти стимулюючою активністю відносно регенерації хрящової тканини. Однак, даних щодо стимуляції репарації суглобового хряща після травматичного ушкодження у разі застосування низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові або Актовегіна немає. Можна припустити, що дія біологічно активних речовин, які містяться в низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові, а також застосування кріовпливу на моделі травматичного ушкодження суглобового хряща, буде сприяти його репарації.

Зв'язок дисертаційної роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану ІПКіК НАН України у відділі біохімії холодової адаптації за темою № 21 «Використання низьких температур для виділення біологічно активних компонентів (менше 5 кДа) з кордової крові тварин з метою отримання ранозагоювальних препаратів». № ДР 0105U003917.

Мета і завдання роботи. Вивчити особливості репарації на моделі кістково-хрящового дефекту після кріовпливу, поєднаного з використанням низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові.

Для вирішення поставленої мети були сформульовані наступні завдання:

Задачі роботи.

1. Розробити метод моделювання травматичного міжвиросткового кістково-хрящового дефекту колінного суглоба щурів.

2. Вивчити вплив низьких температур на вміст макромолекул в регенераті хряща експериментальних щурів: компонентів глікозаміногліканів (ГАГ): гіалуронової кислоти, хондроїтінсульфату (ХС) і гепарину; протеогліканових компонентів: гексозаміна і гексуронових кислот, а також білкових компонентів: оксипроліну і тирозину; дослідити вміст в крові іонів кальцію, натрію, калія і С-реактивного білка, а також дослідити структурну організацію виростків і функціональну активність травмованого колінного суглоба.

3. Вивчити вплив низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові на структурну організацію виростків травмованого колінного суглоба; дослідити вміст в регенераті хряща експериментальних щурів компонентів макромолекул ГАГ: гіалуронової кислоти, хондроїтінсульфату і гепарину; протеогліканових компонентів: гексозаміна і гексуронових кислот, а також білкових компонентів: оксипроліну і тирозину; і дослідити вміст в крові іонів кальцію, натрію, калія, С-реактивного білка, ендотеліну, трийодтироніну, паратиреоїдного і соматотропного гормонів і, дослідити функціональну активність травмованої кінцівки.

4. Вивчити поєднаний вплив низьких температур і низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові на вміст в регенераті хряща макромолекул ГАГ: гіалуронової кислоти, хондроїтінсульфата і гепарину; протеогліканових компонентів: гексозаміна і гексуронових кислот, а також білкових компонентів: оксипроліну і тирозину; дослідити вміст в крові іонів кальцію, натрію, калію і С-реактивного білка; дослідити структурну організацію виростків та функціональну активність травмованого колінного суглоба

5. Провести порівняльну оцінку впливу на репарацію хряща низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові та Актовегіну за вище вказаними показниками.

Об'єкт дослідження - репарація виростків хряща колінного суглоба щурів після його травматичного пошкодження.

Предмет дослідження - регенерат суглобового хряща у ділянці кістково-хрящового дефекта колінного суглоба щурів, кріовплив на ділянку травматичного ушкодження хряща колінного суглоба щурів, низькомолекулярна фракція(до 5кДа) кордової крові.

Методи дослідження: біохімічні, гістологічні, гістохімічні, біомеханічні, рентгенологічні та статистичні методи.

Біохімічними методами був оцінений склад регенерата хряща і крові експериментальних щурів. А саме, в регенераті хряща щурів було кількісно оцінено стан колагенових (оксіпролін), неколагенових (тирозин), протеогліканових (гексуронових кислот і гексозамінів) і ГАГ (гіалуронової кислоти, хондроїтинсульфату та гепарину) компонентів. У крові щурів було кількісно визначено вміст С-реактивного білка, ендотеліну, а також К+, Na+, та Ca²+ і гормонів: соматотропного, паратиреоїдного і трийодтироніну. Гістологічними і рентгенологічними методами були проаналізовані: морфологічний стан хряща колінного суглоба і динаміка усунення дефекту в ході регенерації після механічної травми при використанні кріовплива, низкомолекулярної фракции (до 5кДа) кордової крови та Актовегіна. Гістохімічно було оцінено наявність і порядок розташування компонентів глікозаміногліканового комплексу в хрящової тканині. Біомеханічним методом була оцінена динаміка рухової активності експериментальних тварин.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено стимулюючу дію низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові (ФКК), або у разі комплексного застосування низьких температур і ФКК на репарацію травмованого хряща колінного суглоба щурів та відновлення його функціонального стану.

Виявлено, що під дією низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові, Актовегіна або комплексного використання низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові та низьких температур, має місце прискорення процесу накопичення макромолекул матриксу хряща: ГАГ, протеогліканів, а також колагенових та неколагенових білків.

Вперше встановлено, що низькомолекулярна фракція (до 5кДа) кордової крові або ії комплексне застосування з кріовпливом нормалізують співвідношення основних компонентів матриксу хряща: ГАГ, протеогліканів, а також колагенових та неколагенових білків.

Вперше показано, що введення низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові, або Актовегіна, а також їх комплексне застосування з низькими температурами сприяє нормалізації їоного гомеостазу та гормонального складу, а також зниженню рівня маркерів запалення (С-реактивний білок).

За даними морфологічних досліджень, вперше встановлено, що введення низькомолекулярної фракції (до 5кДа) кордової крові, сприяє зменшенню деструктивних процесів травмованого суглобного хряща.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблений метод моделювання міжвиросткового дефекту хряща колінного суглоба може бути використаний для вивчення і моделювання різних способів ініціації репаративних процесів в колінному суглобі. Показана перспектива створення лікарського засобу на основі низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові. Доведена клінічна перспектива комплексного застосування низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові і кріовпливу для стимуляції репаративних процесів в травмованому суглобі.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно розроблено метод моделювання міжвиросткового дефекту хряща колінного суглоба і виділена низькомолекулярна фракція (до 5 кДа) кордової крові з кріогемолізата кордової крові корів. Здобувачем самостійно спланована і проведена серія експериментів з моделювання міжвиросткового дефекту хряща колінного суглоба і впливу на нього низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові та кріовпливом. У ході виконання роботи здобувачем самостійно отримані всі експериментальні дані, що стосуються біохімічного і морфологічного стану кістково-хрящового дефекту колінного суглоба щурів, а також біохімічного складу крові. Проведене функціональне дослідження травмованої кінцівки. Разом з науковим керівником проф. Гулевським О. К. була сформульована мета, цілі і завдання роботи та проаналізовано отримані в ході виконання експериментальні дані. Роботи, опубліковані в співавторстві, відображають результати загального планування, проведення експериментів і обговорення результатів, при цьому особистий внесок дисертанта полягає:

в роботах [1-7] та [9-13] у виділенні низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові з кріогемолізату кордової крові, моделюванні травматичного дефекту хряща колінного суглоба, вивченні особливостей репарації хряща колінного суглоба біохімічними, рентгенологічними, гістологічними та гістохімічними методами;

в роботі [8] у розробці методу моделювання травматичного ушкодження хряща колінного суглоба щурів;

в роботах [1-2, 6-7, 9, 11] у вивченні впливу низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові і кріовпливу на репарацію хряща колінного суглоба за кількісним вмістом глікозаміногліканів, протеогліканів, колагенових і неколагенових білків, також аналізу структури виростків колінного суглоба експериментальних щурів та дослідження функціональної активності травмованої кінцівки;

в роботах [3, 5, 12] у вивченні впливу низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові і кріовпливу на регенерацію хряща колінного суглоба за кількісним вмістом в крові іонів кальцію, натрію і калію, ендотеліну і гормонів: трийодтироніну, паратиреоїдного і соматотропного, а також рівня запальної реакції (вміст С-реактивного білку);

в роботах [4, 13] отримані дані щодо впливу низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові на репарацію хряща колінного суглоба за оцінкою рівня збереження і відновлення конгруентності, рівнем заповнення дефекту знов утвореною тканиною, а також якісної оцінки порядку розташування та наявності глікозаміногліканового комплексу (ГАГ);

у роботі [14] вивчено біохімічний склад регенерату травмованого хряща після кріовпливу та застосування низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на міжнародних і національних конференціях: щорічній конференції молодих учених ІПКиК НАН України "Холод в біології і медицині" (Харків, 2009), щорічній конференції молодих вчених "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології" (Київ, 2009, 2010), науково-практичній конференції "Біологічно активні речовини: фундаментальні питання здобуття і вживання" (Новий Світ, 2009), щорічній конференції молодих вчених ІПКиК НАН України "Холод в біології і медицині: Актуальні проблеми кріобіології, трансплантології і біотехнології" (Харків, 2010), десятому Українському біохімічному з'їзді (Одеса, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових робіт, серед яких 7 статей у профільних наукових виданнях, 6 тез доповідей у збірниках наукових робіт міжнародних і національних наукових конференцій та 1 патент України.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і переліку цитованої літератури, який включає 216 найменувань джерел, викладених на 23 сторінках. Загальний обсяг дисертації становить 143 сторінки. Робота проілюстрована 58 малюнками.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи власних досліджень. Моделювання механічного пошкодження хряща колінного суглоба щурів здійснювалось за методом [Гулевський О. К. та інш., 2009]. Електричною бормашиною з наконечником у формі усіченого конуса створювали травматичне ушкодження хряща в дистальному відділі стегнової кістки від міжвиросткової ділянці вглиб субхондральної кістки. Висвердлювали дефект в хрящі довжиною вглиб 4 мм і діаметром до 0,7 мм. Кріовплив на травмований хрящ здійснювали одноразово за допомогою струї рідкого азоту [Малишкіна С. В., 1985; Жигун А..І., 1986]. Рідкий азот пропускали через шприц з залізною голкою, яка співпадала в диаметрі з утвореним дефектом, достигав механічного отвіру хряща. Час експозиції рідким азотом становив 15 секунд.

Виділення фракції з компонентами молекулярної маси до 5 кДа, із дефібрінованої кордової крові великої рогатої худоби проводилось як описано в роботі [Гулевський О. К.. та інш., 2007] з використанням ультрафільтраційного обладнання фірми «Sartorius» (Німеччина). Фільтрат зберігали при -80С та розморожували при +37⁰С. Проводили етап предфільтрації з використанням фільтраційного модуля Sartopure GF2, який утримує молекули з молекулярною масою більш ніж 100 кДа. Фільтрат піддавали ультрафільтрації з використанням мембранного модуля Vivaflow-200 фірми Sartorius (Германія), який дозволяє отримати фракцію до 5 кДа.

Ліофільну сушку фракції проводили в сублімаційній установці ЛЗ-45. Вмикали компресор та охолоджували касети до температури -30⁰С. Після чого вмикали вакуум-насос. При зниженні тиску до 5 Ч 10-2 мм рт.ст. відбувалося зниження температури продукта от-25⁰С до-50⁰С. На наступному етапі температуру підігріва касет підвищували на 5⁰С через кожну годину, що приводило до підвищення температури продукту. Термін ліофілізації складав 28-30 годин.

Експериментальні тварини були розділені на 7 груп:

група 1 - інтактні щури (норма);

група 2 - щури, з модельованим кістково-хрящовим дефектом, яким вводили фізіологічний розчин та піддавали кріовпливу.

Іншим тваринам після травматичного пошкодженння хряща коліного суглоба протягом всього терміну дослідженння щодобово, внутрішньомґязово вводили:

група 3 - фізіологічний розчин (контроль);

група 4 - фракцію кордової крові (ФКК);

група 5 - Актовегін.

Тваринам груп 6 та 7 також внутрішньомґязово вводили ФКК або Актовегін, але з використанням одноразового кріовпливу на травмований хрящ. ФКК та Актовегін вводили в дозі 1,17 мг на 100 гр. ваги тіла.

Вміст ГАГ оцінювали по концентрації в пробах хондроїтинсульфату, гіалуронової кислоти та гепарину, які визначали за методом [Слуцький Л. І., 1969]. Вміст протеогліканових компонентів оцінювали по концентрації в пробах гексозаміну та гексуронових кислот, які визначали, відповідно, за методом [Boas N. P., 1953] та [Dische Z., 1962]. Вміст колагенових білків оцінювали по концентрації в пробах оксипроліну, який визначали за методом [Stegemann H. та ін., 1967]. Вміст неколагенових білків оцінювали по концентрації в пробах тирозину, який визначали за методом [Слуцький Л. І., 1969].

Біохімічні дослідження крові експериментальних тварин проводились на 7, 14, 21 і 28-у добу. Визначалась концентрація іонів Ca²+, Na+ і K+ за допомогою аналізатора електролітів АЕК-01, ("Квартімед", Росія). Вміст С-реактивного білку в крові щурів визначався як описано [Меньшиков В.В., 1987]. Дослідження концентрації гормонів здійснювались як описано: трийодтироніну - [Robins J., 1987]; паратиреоідного гормону - [Старкова Н. Т., 2002]; соматотропного гормону - [Ebdrup L. et al., 1996]; ендотеліна - [Portsmann T., 1992].

Визначення рухової активності експериментальних тварин за методом [Гацура В. В., 1974]. Рентгенологічні дослідження хряща проводились на 7, 14, 21 та 28 добу з використанням аппарату РУМ-4М. Розрахунок площі дефекту хряща здійснювався по рентгенограмах за допомогою комп'ютерної програми Аdvanced Paint Shop [Гулевський О. К. та інш., 2008].

Гістологічне дослідження було проведено на 14 та 28 добу після моделювання кістково-хрящового дефекта. Для гістологічного дослідження виділяли дистальний відділ стегнової кістки із зоною ушкодження суглобового хряща. Гістологічні зрізи виготовляли на санному мікротомі Reichert і фарбували гематоксиліном та еозином і за Ван Гізоном [Саркисов Д. С. и др., 1996]. Гістологічний аналіз проводили за допомогою світлового мікроскопа Primo Star (Carl Zeiss), Германія з використанням для фотографування цифрової фотокамери Canon Power Short A610 і комп'ютерної програми Axio Vision.

Метахромазію ГАГ в хрящовій тканині досліджували за допомогою гістохімічного методу з використанням толуїдинового синього як описано в роботі [Саркисов Д. С. и др., 1996].

Дослідження виконано на 174 щурах - самцях лінії Vistar масою 290-320 грам. Експерименти проведені у відповідності з "Загальними принципами експериментів на тваринах" схваленими 1 Національним конгресом з біоетики (20.09.01 р., Київ, Україна) та узгоджених з положеннями "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, використовуваних для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1985). Дані статистично обробляли за допомогою програми Microsoft excel 2003 із застосуванням критерію Манна-Уїтні.

Результати власних досліджень та їх обговорення.
Вплив низьких температур і низькомолекулярної фракції до (5 кДа) кордової крові на вміст компонентів матриксу хряща щурів після травматичного ушкодження. Як відомо, кількісне відновлення ГАГ, протеогліканових і білкових компонентів матриксу хрящової тканини після травматичного ушкодження хряща колінного суглоба є важливою умовою регенерації хряща. Проведене дослідження в регенераті хряща: компонентів ГАГ, оцінених за кількістю гіалуронової кислоти, хондроїтинсульфату та гепарину, компонентів протеогліканів, оцінених за вмістом гексозаміну та гексуронових кіслот, а також компонентів колагенових та не колагенових білків, оцінених, відповідно, за вмістом оксипроліну та тирозину показало суттеве накопичення всіх цих компонентів в регенераті хряща експериментальних щурів на 28 добу після застосування ФКК, по відношенню до тварин, яким вводили фізіологічний розчин (контроль).

травматичний хрящовий колінний суглоб



Рис. 1 Вміст компонентів глікозаміногліканового комплексу (хондроїтинсульфату та гіалуронової кислоти) у регенераті хряща експериментальних щурів після кріовпливу, ін'єкцій ФКК чи Актовегіна або кріовпливу, поєднаного з ін'єкціями ФКК чи Актовегіна: А - вміст хондроїтинсульфатів; Б - вміст гіалуронової кіслоти;

Вміст ХС зростав в 4,1 раза (рис 1, А), гіалуронової кислоти - в 5,9 раза (рис 1, Б), гепарину - в 2,3 раза, гексозаміну в 2,9 раза, гексуронових кислот - в 1,25 раза, оксіпроліну - в 2,2 рази (Рис 2, А), тирозину - в 2,8 раза відносно контролю (Рис 2, Б).

При застосуванні препарату порівняння - Актовегіну спостерігалась також вірогідна стимуляція накопичення макромолекул хряща, які досліджувались. Однак більш суттєве зростання ряду показників (ХС, гіалуронової кислоти, гексозаміну та оксипроліну) відмічалось при використанні ФКК. Таким чином, використання ФКК або Актовегіну призводило до ініціації метаболічних процесів, забезпечуючих регенерацію хряща щурів, однак, при цьому вміст більшості макромолекул, які досліджувались, на 28 добу не досягає норми.

Для отримання більшого ефекту при використанні ФКК або Актовегіну у разі стимуляції регенерації хряща колінного суглоба, згідно даним С.В. Малишкіної та А.І. Жигуна, доцільно було б поєднати їх із кріовпливом.

Рис. 2 Вміст компонентів колагенових (оксіпролін) та неколагенових (тирозин) білків у регенераті хряща експериментальних щурів після кріовпливу, ін'єкцій ФКК чи Актовегіна або кріовпливу, поєднаного з ін'єкціями ФКК чи Актовегіна: А - вміст оксіпроліну; Б - вміст тирозину;

Аналізуючи експериментальні дані (Рис. 1, А), слід зазначити істотне накопичення компонента ГАГ комплекса - ХС в регенераті хряща при використанні кріовплива поєднаного з ін'єкціями ФКК або Актовегіну. Зокрема, вже на 14 добу спостереження кількість хондроїтинсульфату, відповідно, в 4,3 рази і в 1,6 рази вище, ніж у контролі.

На кінець спостереження вміст ХС в 2,6 та 1,8 рази перевищував контрольний рівень у разі застосування азоту, відповідно, разом з ФКК або Актовегіном. Вміст ще одного компонента ГАГ - гіалуронової кислоти (Рис. 1, Б) при використанні ФКК, чи Актовегіна, поєднаних з кріовпливом, на 28 добу спостереження підвищувався, відповідно, в 1,32 та 1,4 рази в порівнянні з контролем. При використанні ФКК чи Актовегіна, поєднаних з кріовпливом, відмічається суттеве накопичення на 28 добу спостереження ще одного компонента ГАГ комплекса - гепарину (його рівень становив, відповідно, 0,18 мг% та 0,19 мг%, що у 2,5 та 2,7 рази вище, ніж у контролі).

У наступній серії експериментів було вивчено вміст компонентів протеогліканового комплексу матрикса хряща експериментальних щурів: гексозаміну і гексуронових кислот. Вміст гексозаміну в регенераті хряща щурів, які отримували ін'єкції ФКК або Актовегіну сумісно с разовим локальним кріовпливом, вже на 7 добу спостереження досягав норми (0,66 мг%), а в разі застосування Актовегіну - на 14 добу. Вміст гексуронових кислот при застосуванні ФКК чи Актовегіну, поєднаних з кріовпливом, також достовірно підвищувався по відношенню до контроля в 2,1 рази вже на 7 добу експерименту і залишався таким до кінця експерименту.

Динаміка накопичення в регенераті хряща експериментальних тварин колагенових та не колагенових білків, яку оцінювали, відповідно, за вмістом, оксипроліну та тирозину відображена на рис. 2. Підвищення вмісту оксипроліну (Рис. 2, А) під впливом ФКК та кріовпливу, відбувається вже на 7 добу спостереження (в 2,2 рази у порівнянні з контролем).



Рис. 3 Співвідношення компонентів матрикса в регенераті хряща експериментальних щурів на 28 добу спостереження після кріовпливу, поєднаного з ін'єкціями ФКК або Актовегіна.

Під кінець спостереження вміст оксипроліну в регенераті хрящя щурів, які отримували ФКК та кріовплив достовірно не відрізняється від цього показника в хрящі здорових тварин (0,48 мг%), чого не спостерігалось при введенні Актовегіну або в контрольній групі тварин.

Позитивна динаміка накопичення не колагенових білків матрикса хряща (Рис. 2, Б) в групі тварин, які отримували кріовплив та ФКК, або кріовплив та Актовегін, спостерігається протягом усього періоду дослідження і в кінці спостереження в 3,1 рази вище у порівнянні з контролем.

Таким чином, можна зробити висновок, про позитивний вплив ФКК або Актовегіну, поєднаних з кріовпливом на динаміку накопичення ГАГ, протеогліканових та білкових компонентів в регенераті хряща після механічної травми.

Але відомо, що якість регенерації хряща обумовлюється не тільки накопиченням компонентів матриксу в регенераті, але і їх співвідношенням. Встановлено (Рис. 3), що при механічної травмі хряща співвідношення ГАГ, протеогліканових та білкових компонентів матриксу змінюється та не відновлюється навіть наприкінці дослідження, але найбільше профіль їх співвідношення нормалізується при використанні ФКК, або її поєднаного використання з кріовпливом.

Біохімічний склад сиворотки крові щурів після застосування кріовпливу та низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові. Поряд з дослідженням вмісту компонентів матрикса травмованого хряща експериментальних щурів для з'ясування механізму дії ін'єкцій ФКК, Актовегіна та кріовпливу, або комплексного застосування ФКК, чи Актовегіну з кріовпливом на організменному рівні, було досліджено їх вплив на біохімічний склад крові. При цьому наша увага була зосереджена на показниках, що найбільше відображають стан метаболічних процесів в організмі, а саме: вміст С-реактивного білку, іонів кальцію, гормонів (паратиреоідного, соматотропного, трийодтироніна); маркера ангіогенезу - ендотеліна та іонного гомеостаза, про який судили за вмістом іонів натрію та калію.

Вміст кальцію (який регулює вміст тканьових простогландинів, активність лейкоцитів та підвищений рівень якого свідчить про пригнічення активності паратиреоїдного гормона) [Лаврищева Г. И. и др., 1996; Корж А. А. и др., 1997] в крові щурів, що отримували ін'єкції ФКК або Актовегіну, був достовірно вищим порівняно з контролем на 7 та 14 добу експерименту (Рис. 4, А). При використанні ФКК цей показник досягає норми на 28 добу, чого не відмічалося в інших експериментальних групах. Вміст іонів кальцію найбільш активно відновлювався в крові щурів, що отримували ін'єкції ФКК, тоді як при сумісному застосуванні ФКК та кріовпливу вміст кальцію в крові експериментальних щурів наприкінці експерименту був нижче норми на 17%. Актовегін в обох випадках менше впливає на нормалізацію цього показника.

Вміст іонів калію та натрію в крові експериментальних щурів найбільш повно відновлювався після застосування ін'єкцій ФКК, або кріовпливу, поєднаного з ін'єкціями ФКК чи Актовегіну, і на 28 добу дослідження досягав норми, чого не спостерігалось в контролі.

Рівень С-реактивного білка, що свідчить про интенсивність запального процесу [Меньшиков В. В. и др., 1987; Schoenfeld A. J. et. al., 2010], в крові тварин майже всіх експериментальних груп на 28 добу дорівнював нормі - 6 мг/%. Однак, тільки при застосуванні ін'єкцій ФКК або ін'єкцій ФКК, поєднаних з кріовпливом, вже на 7 добу рівень С-реактивного білку знижувався і практично дорівнював нормі - 6,4 мг% (Рис. 4, Б). При застосуванні Актовегіна такий результат відмічався тільки на 21 добу спостереження.

Вміст паратиреоїдного гормону (у малих дозах застосовується для лікування остеоартрозу, а у великих дозах пригнічує синтез макромолекул матриксу хряща) [Павлова В. Н. и др., 1988; Старкова Н. Т. и др., 2002], в крові тварин, яким внутрішньом'язово вводили ФКК, під кінець спостереження (28 доба) був більш близьким (вище на 25%) до вмісту у здорових тварин, чим при введенні Актовегіну (вище на 56%), або в фізіологічного розчину (вище на 67%).

Вміст соматотропного гормона (який опосередковано впливає на синтез компонентів матриксу хряща, електролітний обмін та диференціровку елементів хрящової тканини) [Chapvil M. et. al., 1967; Лаврищева Г. И. и др., 1996] в крові щурів, яким вводили ФКК, на 28 добу дослідження становив становив 2,18 нмоль/л, що на 34% вище, ніж в нормі.



Рис. 4 Вміст кальцію та концентрація С-реактивного білку в крові експериментальних щурів після кріовпливу, ін'єкцій ФКК чи Актовегіна або кріовпливу, поєднаного з ін'єкціями ФКК чи Актовегіна: А - вміст кальцію; Б - вміст С-реактивного білку; Р<0,05 у порівнянні з контролем.

При введенні Актовегіна протягом всього періоду дослідження (окрім 7 доби спостереження, коли рівень досліджуваного гормона становив 1,27 нмоль/л, що на 16 відсотків нижче, ніж у нормі) відмічається нормалізація вмісту соматотропного гормона в крові щурів, чого не спостерігалось при введенні фізіологічного розчина.

Вміст трийодтиронина (який опосередковано впливає на синтез компонентів матриксу хряща, електролітний обмін та диференціровку хондроцитів хрящової тканини) [Chapvil M. et. al., 1967; Лаврищева Г. И. и др., 1996] в крові щурів, яким вводили ФКК, протягом всього періоду дослідження дорівнював нормі, окрім 21 суток спостереження, коли рівень досліджуваного гормону становив 1,83 нг/мл, що в 1,18 рази вище, ніж у нормі. При введенні Актовегіна протягом всього періоду дослідження вміст трийодтиронина в крові щурів був, в середньому, в 1,32 рази вище, ніж в нормі.

Вміст ендотеліна, який є маркером ангіогенезу в сполучній тканині [Robins R. L. et. al., 1987; Корж А. А. и др., 1997], в крові експериментальних щурів при використанні ФКК дорівнював нормі на 7 та 14 добу спостереження, але на 21 та 28 добу його рівень зростав, відповідно, в 1,13 та 1,17 рази по відношенню до норми. При введенні Актовегіну вміст ендотеліна в крові експериментальних щурів наприкінці спостереження в 1,62 рази вище норми.

В результаті проведених досліджень, можна зробити висновок, що введення ФКК, або Актовегіну, як і поєднане з ними застосування низьких температур ефективно сприяє нормалізації рівня С-реактивного білку, а також позитивно впливає на вміст іонів (кальцію, натрію та калію), гормонів (паратиреоідного, соматотропного та трийодтиронину) та ендотеліну в крові експериментальних щурів.

Морфологічне дослідження кістково-хрящових дефектів після кріовпливу та застосування низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові. В результаті проведення гістологічного аналізу встановлено односпрямованісь процесу регенерації в групі тварин, якім вводили фізіологічний розчин (контроль), та тих, яким вводили ФКК (дослід) (Рис 5).



Рис. 5. Фотовідбиток з гістологічних препаратів. Кісткова і сполучна тканина частково заповнюють ділянку дефекту. Регенерат в зоні кістково-хрящового дефекту щільно контактує з прилеглими тканинами і містить кісткову тканину у ділянці кісткового дефекту і волокнистий хрящ у зоні суглобової поверхні. Введення ФКК (а). Контроль (Б). Гематоксилін та еозин. Ок. 10, об. 10.

Відновлення ушкоджених структур починалося з боку дна дефекту, із субхондральної кістки, проходячи через утворення грануляційної тканини до формування кісткової тканини, хондроїда і волокнистого хряща у різних співвідношеннях.

Однак, у тварин, яким вводили низькомолекулярну фракцію (до 5 кДа) кордової крові, відмічено прискорення формування кісткової тканини у дефекті через 14 діб після виконання травматичного ушкодження у порівнянні з контролем.

Через 28 діб після травми у тварин контрольної групи територія тканин регенерату була меншою за розміри дефекту. Відмічалося утворення кісткової тканину з боку дна дефекту, на поверхні якого виявлявся шар сполучної тканини з хаотично розташованими колагеновими волокнами та нерівномірною кількістю клітин на ділянках (рис. 5 б). Неповна регенерація тканин у зоні виконаного травматичного ушкодження супроводжувалася порушенням конгруентності суглобових поверхонь, розвитком деструктивних змін у прилеглій субхондральній кістці, які проявлялися появою ділянок без клітин, деструктивних щілин. Структурні порушення у суглобовому хрящі були пов'язані деструкцією хондроцитів поверхневої і проміжної зон, втратою глікозаміногліканів, що підтверджувала відсутність метахромазії при забарвленні толуїдиновим синім.

Введення тваринам ФКК сприяло оптимізації репаративної регенерації. Через 28 діб після операції у тварин дослідної групи у зоні дефекту суглобового хряща виявлялися хондроїд та волокнистий хрящ, які щільно контактували з прилеглим хрящем. Товщина знов сформованой тканини відрізнялася у окремих тварин, при цьому поверхня регенерату, яка межувала з суглобовою порожниною характеризувалася рівномірністю, що сприяло збереженню конгруентності суглобових поверхонь (рис. 5 а). У глибоких шарах утвореного хряща містилися округлі клітини з крупними базофільними ядрами, відзначалася тенденція до формування ізогенних груп хондроцитів.

Проте, при гістохімічному дослідженні було виявлено метахроматичне забарвлення при реакції з толуїдиновим синім у знов сформованій хрящовій тканині, що свідчить про наявність молекул ГАГ. Однак, в полярізаційному світлі була відсутня рефракція, що свідчить про відсутність упорядкованих молекул ГАГ. Також не було встановлено характерної для суглобового хряща зональної будови.

Дефект в ділянці субхондральної кістки був заповнений кістковою тканиною пластинчастої структури. У міжтрабекулярних просторах містився червоний кістковий мозок. Поблизу дефекту суглобовий хрящ був з явищами деструкції (наявність клітин-тіней, ділянок без клітин, втрата мета хроматичного забарвлення), а на віддаленні від нього цитоархітектоніка суглобового хряща зберігалася.

Встановлено, що введення ФКК або Актовегіна суттєво впливає на заповнення дефекту в травмованому хрящі щурів новоутвореною сполучною тканиною. Площа дефекту у цих тварин на 28 добу спостереження на 28% та 41%, відповідно, нижче, ніж в контролі (Рис. 6, А). Слід зазначити, що введення ФКК або Актовегина у поєднанні з кріовпливом (Рис. 6, А) також сприяє заповненню дефекту в хрящі новоутвореною сполучною тканиною. Площа дефекту у цих тварин на 28 добу спостереження на 35% та 44%, відповідно, нижче, ніж в контролі. Тоді як площа дефекта хряща у контрольних тварин, більше на 18%, ніж у тварин, травмований хрящ яких зазнав кріовпливу.

На основі отриманих даних можна зробити висновок, що кріовплив достовірно впливає на репаративні процеси в хрящовій тканині експериментальних щурів при поєднаному застосуванні низьких температур з ФКК або Актовегіном. В умовах кріовпливу і лікуванні тварин ФКК мала місце оптимізація регенерації суглобного хряща, однак, площа хондроїда була нижчою.

Функціональне дослідження травмованої кінцівки експериментальних щурів. Інтегрально рівень регенерації хряща колінного суглоба оцінювали за тестом нормалізації рухової активності травмованої кінцівки.



Рис. 6 Площа ушкодження хряща та зміни функціональної активности травмованої кінцівки експериментальних щурів щурів після кріовпливу, ін'єкцій ФКК або Актовегіна, чи кріовпливу, поєднаного з ін'єкціями ФКК або Актовегіна: А - площа ушкодження хряща; Б - зміни рухової активності щурів; Р<0,05 у порівнянні з контролем. А: 1 - кріовплив; 2 - ін'єкція ФКК+кріовплив; 3 - ін'єкція Актовегіна+кріовплив; 4 - контроль (ін'єкція фіз. розчину); 5 - ін'єкція ФКК; 6 - ін'єкція Актовегіна.

Встановлено, що рухова активність експериментальних тварин, яким вводили ФКК або Актовегін, поєднані з кріовпливом вже на 7 добу вище в 1,84 та 1,68 рази, відповідно, у порівнянні з контролем (рис. 6, Б). На 21 добу експерименту спостерігалась нормалізація функціональної активності у тварин, яким вводили ФКК чи Актовегін, або ФКК чи Актовегін, поєднаних з кріовпливом, чого не спостерігалось в контролі. На 28 добу нормалізація рухової активності спостерігається у всіх експериментальних щурів.

У даній дисертаційній роботі встановлено позитивний вплив низьких температур, ФКК, чи Актовегіна, або комплексного застосування кріовпливу з ФКК чи Актовегіном на накопичення в регенераті хряща експериментальних щурів глікозаміногліканових, протеогліканових і білкових компонентів матриксу, на нормалізацію в крові експериментальних тварин рівню маркера запалення - С-реактивного білку, на вміст в крові іонів кальцію, натрію, калію, ендотеліну, гормонів (соматотропного, паратиреоїдного та трийодтироніну), а також на морфологію хрящової тканини, зниження площі дефекту хряща та функціональну активність травмованої кінцівки експериментальних щурів.

Висновки

В дисертаційній роботі дано теоретичне узагальнення наукової проблеми використання кріовпливу і біологічно-активних сполук для прискорення регенерації хряща колінного суглоба щурів після травматичного ушкодження та знайдене ії вирішення. Представлені експериментальні дані, що стосуються використання кріовпливу та низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові для стимуляції регенерації хряща колінного суглоба щурів.

1. Встановлено, що ін'єкції ліофілізованої, виділеної з кріогемолізата кордової крові великої рогатої худоби низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) або Актовегіна на фоні кріовпливу сприяють вірогідному накопиченню в регенераті хряща експериментальних щурів макромолекул ГАГ: гіалуронової кислоти, хондроїтинсульфата і гепарина; протеогліканових компонентів гексозаміна і гексуронових кислот, а також колагенових (оксипролін) і неколагенових білків (тирозин). При цьому виражена дія досягається при використанні ін?єкцій низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові, або кріовплива, поєднаного з ін?єкціями низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові.

2. Встановлено, що ін?єкції ліофілізованої, виділеної з кріогемолізата кордової крові великої рогатої худоби низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) або Актовегіна на фоні кріовпливу сприяють нормалізіції біохімічних показників в крові експериментальних щурів: іонів натрія, калія, кальція, С-реактивного білка, трийодтироніну, соматотропного та паратиреоідного гормонів, але найзначніший ефект досягається при використанні ін?єкцій низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові, або кріовплива, поєднаного з ін?єкціями низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові.

3. Показано, що співвідношення між ГАГ, протеоглікановими і білковими макромолекулами матриксу хряща експериментальних щурів не відновлюється навіть наприкінці спостереження (28 доба), але найбільш близько до норми це співвідношення відновлюється при застосуванні ін?єкцій низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові, або кріовплива, поєднаного з ін?єкціями низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові.

4. За даними морфологічних досліджень встановлено, що ін?єкції ліофілізованої, виділеної з кріогемолізата кордової крові великої рогатої худоби низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) або локальний дозований кріовплив сприяють заповненню області дефекту гіаліновим та волокнистим хрящем із збереженням конгруентності.

5. Встановлено, що ін?єкції ліофілізованої, виділеної з кріогемолізата кордової крові великої рогатої худоби низькомолекулярної фракції (до 5 кДа), локальний дозований кріовплив або їх комплексне застосування нормалізують на 28 добу спостереження рухову активність травмованої кінцівки експериментальних щурів.

6. За даними комп'ютерного аналізу рентгенограм встановлено, що ін?єкції ліофілізованої, низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові на фоні кріовплива вірогідно зменшують площу кісткового дефекту у ділянці субхондральної кістки експериментальних щурів.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Исследование биологической активности фракции до 5 кДа из криогемолизата крови крупного рогатого скота / [А. К. Гулевский, Н. Н. Моисеева, Е. С. Абакумова, А. Ю. Никольченко, И. И. Щенявский, О. Л. Горина, А. В. Трифонова, Е. Г. Иванов] // Проблемы криобиологии. - 2008. - №4, С. 531-534.

2. Гулевский А. К. Эффект стимуляции метаболизма в хрящевой ткани после механической травмы под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови / А. К. Гулевский, В. И. Грищенко, Е. Г. Иванов // Доповіді національної академії наук України. - 2009. - №9, С. 195-199.

3. Гулевский А. К. Нормализация биохимического состава хрящевой ткани после механической травмы под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) из кордовой крови и крови молочных телят / Гулевский А. К., Грищенко В. И., Иванов Е. Г. // Український біохімічний журнал. - 2009. - № 3, С. 117-121.

4. Гулевский А. К Биохимический состав крови крыс при комплексном лечении механической травмы суставного хряща криовоздействием и введением низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови / А. К. Гулевский, Е. Г. Иванов // Вісник проблем біології ї медицини. - 2009. - №3, С. 119-122.

5. Гулевский А. К. Морфологические изменения в хряще коленного сустава под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови после механической травмы / А. К. Гулевский, Е. Г. Иванов // Світ медицини та біології. - 2009. - №4, С. 14-18.

6. Гулевский А.К. Стимуляция репаративной регенерации суставного хряща под влиянием низкомолекулярной фракции кордовой крови (до 5 кДа) / А. К. Гулевский, В. И. Грищенко, Е. Г. Иванов // Проблемы криобиологии. - 2009. - №3, С. 362-368.

7. Гулевский А. К. Сочетанное влияние низких температур и низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови на восстановительные процессы в хрящевой ткани / А. К. Гулевский, Е. Г. Иванов // Проблемы криобиологии. - 2009. - №4, С. 481-487.

8. Пат. 42133 Україна, МПК G 09 В 23/00. Спосіб моделювання механічного міжвиросткового дефекту суглобного хряща // Гулевський О. К., Іванов Г. В., Іванов Є. Г; заявник ї власник патенту Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України. - № u 2009 00367; заявл. 19. 01. 2009; опубл. 25. 06. 2009, Бюл. №12.

9. Иванов Е. Г. Репаративная регенерация хрящевой ткани после криовоздействия сочетанного с механической травмой под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови // Конференция молодых ученых ["Холод в биологии и медицине - 2009"]: Тезисы докладов. - Харьков, 2009. - С. 22.

10. Иванов Е. Г. Стимуляция метаболизма в хрящевой ткани после механической травмы под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови / А. К. Гулевский, Е. Г. Иванов // Конференция молодых ученых ["Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2009"]: Тезисы докладов. - Київ, 2009. - C. 15.

11. Изучение свойств биологически активных веществ низкомолекулярных фракций до 5 кДа из крови крупного рогатого скота / А. К. Гулевский, Н. Н. Моисеева, А. Ю. Никольченко, И. И Щенявский, Е. С. Абакумова, А. В. Трифонова, О.Л. Горина, Е.Г. Иванов // Научно-практическая конференция ["Биологически активные вещества: фундаментальные вопросы получения и применения - 2009"]: Тезисы докладов. - Новый свет, 2009. - С. 292.

12. Иванов Е. Г. Нормализация биохимического состава крови после механической травмы хряща у крыс под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови / А. К. Гулевский, Е. Г. Иванов // Конференция молодых ученых ["Актуальні проблеми біохімії та біотехнології"]: Тезисы докладов. - Київ, 2010. - C. 13.

13. Иванов Е. Г. Влияние низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови на морфологические изменения в хряще коленного сустава при механической травме // Конференция молодых ученых ["Холод в биологии и медицине: Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии - 2010"]: Тезисы докладов. - Харьков, 2010. - с. 25.

14. Гулевский А. К., Биохимические аспекты репаративной регенерации, стимулированной низкомолекулярными компонентами кордовой крови / А. К. Гулевский, Н. Н. Моисеева, Е. С. Абакумова, О. Л. Горина, А. Ю. Никольченко, И. И Щенявский, А. В. Трифонова, Е. Г., Иванов // [Материалы десятого Украинского биохимического съезда]: Український біохімчний журнал. - Одеса, 2010. - Т. №82, С. 70-71.

Анотація

Іванов Є.Г. Особливості регенерації хряща колінного суглоба щурів після кріовпливу та застосування низькомолекулярної фракції кордової крові великої рогатої худоби - рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19. - Кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2011.

Дисертаційна робота присвячена вивченню особливостей регенерації хряща колінного суглоба щурів після кріовпливу, введення низькомолекулярної фракції кордової крові великої рогатої худоби, або їх комплексного застосування.

У завдання дослідження входило розробити метод травматичного ушкодження хряща колінного суглоба щурів, підібрати умови кріовпливу на хрящ, і вивчити вплив низьких температур або низькомолекулярної фракції кордової крові, а також їх комплексного вживання на накопичення макромолекул матриксу хряща, нормалізацію біохімічного складу крові, відновлення рухової активності та морфологічний стан хряща експериментальних щурів.

Виділення фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби здійснювалося методом ультрафільтрації. Кріовплив здійснювали за допомогою рідкого азоту. Травму хряща завдавали кінцівкою бор-машини.

Встановлено, що вживання низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові або кріовпливу, а також їх комплексне використання сприяє накопиченню в регенераті хряща макромолекул. Показано, що найбільший вплив на нормалізацію співвідношення вивчених макромолекул матриксу хряща надає поєднане вживання кріовпливу і низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові.

Встановлено, що вживання низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові або кріовпливу, а також їх комплексне використання нормалізує гомеостаз основних іонів, маркера запалення - С-реактивного білку та сприяє накопиченню маркера ангіогенезу - ендотеліну.

Показано, що вживання низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові або кріовпливу, а також їх комплексне використання сприяє відновленню морфологічної цілісності та функціональної активності і зменшує площу дефекту в хрящі експериментальних щурів.

Ключові слова: кріовплив, низькі температури, регенерація, низькомолекулярна фракція (до 5 кДа) із кріогемолізата кордової крові, механічна травма хряща, глікозаміноглікани, протеоглікани.

Аннотация

Иванов Е.Г. Особенности регенерации хряща коленного сустава крыс после криовоздействия и применения низкомолекулярной фракции кордовой крови крупного рогатого скота - рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19. - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2011.

Диссертационная работа посвящена изучению особенностей регенерации хряща коленного сустава крыс после криовоздействия, введения низкомолекулярной фракции кордовой крови крупного рогатого скота или их комплексного исспользования.

В задачи исследования входило разработать метод травматического повреждения хряща коленного сустава крыс, подобрать условия криовоздействия на хрящ, и изучить влияние криовоздействия или низкомолекулярной фракции кордовой крови, а также их комплексного применения на накопление компонентов матрикса хряща, нормализацию биохимического состава крови, восстановление двигательной активности, морфологическую целостность и снижение площади дефекта механически травмированного хряща экспериментальных крыс.

Получение фракции (до 5 кДа) кордовой крови крупного рогатого скота осуществлялось методом ультрафильтрации. Криовоздействие осуществляли с помощью жидкого азота. Травматическое поврежедние хряща осуществляли наконечником бор-машины.

Установлено, что применение низкомолекулярной фрации (до 5 кДа) кордовой крови или криовоздействия, а также их комплексное использование способствует накоплению в регенерате хряща гликозаминогликановых и протеогликановых компонентов, а также компонентов коллагеновых и неколлагеновых белков матрикса по отношению к контролю. Показано, что наибольшее влияние на нормализацию соотношения изученных макромолекул матрикса хряща оказывает сочетанное применение криовоздействия и низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови.

Установлено, что применение низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови или криовоздействия, а также их комплексное использование нормализует гомеостаз ионов кальция, калия и натрия и маркера воспаления - С-реактивного белка, стимулирует повышение содержания маркера ангиогенеза - эндотелина, а также гормонов: трийодтиронина и соматотропного, а также снижает концентрацию паратиреоидного гормона по отношению к контролю.

Показано, что применение низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови или криовоздействия, а также их комплексное использование способствует восстановлению морфологической целостности хряща. Наблюдалось заполнение области дефекта волокнистым хрящем, который плотно прилегал к сохранившемуся после повреждения суставному хрящу. Плотность клеток в регенерирующем хряще была выше, чем в контроле. Следует отметить сохранность конгруэнтности в хряще животных, которым вводили ФКК или у получавших криовоздействие.

Установлено, что применение низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови или криовоздействия, а также их комплексное использование нормализует функциональную активность в более ранние сроки, чем при применении Актовегина или физиологического раствора, а также существенно снижает площадь дефекта в хряще экспериментальных крыс.

Ключевые слова: криовоздействие, низкие температуры, регенерация, низкомолекулярная фракция (до 5 кДа) из криогемолизата кордовой крови, механическая травма хряща, гликозаминогликаны, протеогликаны.

...