Біологічні особливості та фактори підвищення продуктивності коропів любінських внутрішньопорідних типів, їх помісей та гібридів

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РИБНОГО ГОСПОДАРСТВА

ГРИЦИНЯК Ігор Іванович

УДК 639.371.52.03:597

БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ТА ФАКТОРИ ПІДВИЩЕННЯ ПРОДУКТИВНОСТІ КОРОПІВ ЛЮБІНСЬКИХ ВНУТРІШНЬОПОРІДНИХ ТИПІВ, ЇХ ПОМІСЕЙ ТА ГІБРИДІВ

06.02.03 - рибництво

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

КИЇВ - 2008

ДИСЕРТАЦІЄЮ Є РУКОПИС

Робота виконана в Інституті рибного господарства Української академії аграрних наук, Львівській дослідній станції Інституту рибного господарства Української академії аграрних наук та Інституті біології тварин Української академії аграрних наук.

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, професор Янович Вадим Георгійович, Інститут рибного господарства УААН, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, член-кореспондент УААН Єфіменко Михайло Якович, Інститут розведення і генетики тварин УААН, заступник директора;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Соломатіна Валентина Дмитрівна, Інститут гідробіології НАНУ, провідний науковий співробітник;

доктор сільськогосподарських наук Кончиц Віктор Володимирович, Інститут рибного господарства, Білорусь, завідувач лабораторії ставкового рибництва

Захист відбудеться «23» грудня 2008 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.364.01 в Інституті рибного господарства УААН за адресою: 03164, м. Київ, вул. Обухівська, 135.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту рибного господарства УААН за адресою: 03164, м. Київ, вул. Обухівська, 135.

Автореферат розісланий «21» листопада 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук ______________ С.А. Кражан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Продуктивність ставових риб, зокрема коропа, значною мірою залежить від рівня ведення селекційно-племінної роботи, яка забезпечує покращення біологічних і продуктивних якостей риб шляхом удосконалення існуючих та виведення нових порід і внутрішньопорідних типів (Кирпичников В.С., 1973; Катасонов В.Я., Черфас Н.Б., 1986; Катасонов В.Я., Гомельский В.И., 1991; Гринжевський М.В., 2000; Гринжевський М.В., Шерман І.М., Грициняк І.І. та ін., 2006). Цим зумовлена актуальність вивчення біологічних особливостей, насамперед генетичних, імунологічних, фізіолого-біохімічних, виведених в Україні внутрішньопорідних типів коропа з метою розробки науково-практичних основ покращення їх продуктивних якостей: підвищення темпу росту, плодючості, резистентності, адаптативної здатності до несприятливих факторів середовища тощо. Аналіз наявної літератури показує, що біологічні особливості окремих внутрішньопорідних типів українських порід коропа, зокрема любінських рамчастого і лускатого коропів, та їх зв'язок з різними ознаками продуктивності вивчено недостатньо. Наявні в літературі дані про генетичні (Томиленко В.Г., 2000; Тучапский Я.В., 2003), імунологічні (Балахнин И.А., Томиленко В.Г., 1989) і біохімічні (Максимова С.О., Вудмаска І.В., Іваняк В.В., 2001; Пилипець А.З., 2002; Тучапский Я.В., 2003) особливості любінських рамчастого і лускатого коропів фрагментарні і недостатні для широких обґрунтованих узагальнень. У літературі мало висвітлено питання про генетичну структуру і її мінливість, активність клітинної і гуморальної ланок імунітету та активність антиоксидантної системи українських коропів, їх помісних і гібридних форм, про механізми і фактори регуляції цих фізіологічних функцій. Науково-практичну актуальність становить вивчення впливу дефіциту окремих мікроелементів у воді, ґрунті і кормах у західному регіоні України на вказані показники у коропа і його продуктивні характеристики з метою розроблення ефективних способів підвищення продуктивності ставового рибництва та поліпшення якості товарної продукції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Експериментальна частина дисертаційної роботи виконана в 2005-2008 рр. в Інституті рибного господарства УААН і Інституті біології тварин УААН за темами: «Вивчити асоціації молекулярно-генетичних маркерів у різних видів сільськогосподарських тварин, провести оцінку їхньої консолідованості при дії факторів природного відбору за інтродукції у різні еколого-географічні регіони України» (№ держ. реєстрації 0106U004050); «Вивчити генотоксичний вплив середовища і механізми формування цитогенетичних аномалій у різних видів ссавців і риб» (№ держ. реєстрації 0106U004051); «Вивчити породні і вікові особливості обміну речовин, антиоксидантного і імунного захисту у коропа та розробити теоретичні основи підвищення його резистентності і якості м'яса» (№ держ. реєстрації 0106U003059).

Мета і завдання досліджень. Метою даного дослідження було розроблення наукових основ оптимізації використання генофондів коропа різного походження. В експериментальній основі роботи було вивчення біологічних (генетичних, імунологічних, фізіолого-біохімічних) та продуктивних особливостей любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісей з галицьким коропом і гібридних форм з амурським сазаном, визначення впливу на них окремих технологічних і годівельних факторів.

Відповідно до мети досліджень у завдання дисертаційної роботи входило вивчення:

- генетичної структури за використання генетико-біохімічних систем;

- поліморфізму анонімних ланок ДНК з використанням праймерів до мікросателітних локусів;

- цитогенетичних особливостей;

- активності системи гуморального та клітинного імунітету;

- активності антиоксидантної системи;

- біохімічного складу печінки та скелетних м'язів дволіток любінських рамчастого і лускатого коропів, їх помісних і гібридних форм;

- впливу середньої маси цьоголіток любінських рамчастого і лускатого коропів на зимостійкість, енергетичні запаси в тілі риб в кінці вегетаційного періоду та їх використання в енергетичних процесах у зимовий період;

- впливу мікроелементів селену і йоду на ріст, біологічні особливості риб та рибопродуктивність ставів.

Об'єкт дослідження: різновікові групи любінських рамчастого і лускатого коропів, їх помісні і гібридні форми з галицьким коропом і амурським сазаном, коропи іншого генезису.

Предмет дослідження: популяційно-генетична характеристика, активність клітинного і гуморального імунітету та антиоксидантної системи, білковий і ліпідний склад печінки і скелетних м'язів у досліджуваних внутрішньопорідних типів, помісей і гібридів коропа, роль селену і йоду в їх регуляції.

Методи дослідження: молекулярно-генетичні, цитогенетичні, фізіолого-біохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження біологічних (генетичних, імунологічних, фізіолого-біохімічних) особливостей любінських рамчастого і лускатого коропів, їх помісей і гібридів з галицьким коропом і амурським сазаном, впливу на них окремих технологічних і годівельних факторів. Проведено оцінку генофонду досліджуваних коропів із використанням молекулярно-генетичних маркерів та цитогенетичного аналізу. Виявлено відмінності між досліджуваними внутрішньопорідними типами коропів, їх помісями і гібридами за локусами низки білків та ферментів, за кількістю мікроядер в еритроцитах і лейкоцитах. Встановлено вплив генотипу і умов вирощування (щільності посадки) на активність природних факторів резистентності і антиоксидантної системи в організмі дволіток любінських коропів, їх помісей і гібридів з коропами іншого генезису. Показано вплив генотипу і умов вирощування (щільності посадки) на білковий і ліпідний склад печінки і скелетних м'язів досліджуваних дволіток риб. Встановлено пряму залежність між масою тіла цьоголіток коропа та вмістом білків і ліпідів у печінці і скелетних м'язах, кількісну сторону їх використання в енергетичних процесах у зимовий період. Виявлено стимулюючий вплив селену і йоду на активність антиоксидантної системи і вміст ліпідів у скелетних м'язах дволіток коропа та на ріст риб при підвищенні їх рівня в раціоні.

Практичне значення одержаних результатів. Обґрунтовано використання молекулярно-генетичного і цитогенетичного аналізу з метою підвищення ефективності селекційної роботи в рибництві, вирощування цьоголіток коропа зі збільшеною масою тіла з метою підвищення їх виживання в зимовий період і збільшення вагових кондицій риб на другому році життя, використання селену і йоду у вигляді добавок до раціону коропа з метою стимуляції росту та поліпшення якості м'яса риби як харчового продукту.

Особистий внесок здобувача. Дисертант розробив концепцію дисертаційної роботи, проаналізував наявну літературу за темою дисертації, організував і провів дослідження, проаналізував одержані результати і підготував статті за темою роботи, написав дисертацію.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень, наведені в дисертації, доповідалися на: звітних сесіях Інституту рибного господарства УААН і Інституту біології тварин УААН у 2005-2008 рр.; Міжнародній науково-практичній конференції «Біологічні основи продуктивності та здоров'я тварин» (Львів, 2006 р.); IV Міжнародному конгресі «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 р.); Міжнародній конференції «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007 р.); Міжнародній науково-практичній конференції «Наукове забезпечення інноваційного розвитку аграрного виробництва в Карпатському регіоні» (Львів, 2008 р.); Міжнародній науково-практичній конференції «Інноваційність розвитку сучасного аграрного виробництва України» (Львів, 2008 р.).

Публікації. Результати досліджень опубліковані в фахових наукових журналах, збірниках і науково-технічних бюлетенях університетів і науково-дослідних інститутів. За темою дисертації опубліковано 35 наукових робіт, в тому числі 21 стаття, 7 патентів та 3 тези конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 264 сторінках комп'ютерного тексту, містить 45 таблиць, 1 рисунок, 9 фотографій. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, аналізу і результатів власних досліджень, висновків, пропозицій виробництву, списку використаних джерел, додатків. Список літератури включає 493 джерела, в тому числі 207 робіт іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури за темою дисертації. В розділі розглядаються біологічні і продуктивні особливості коропів та фактори підвищення їх продуктивності. Наведені дані про внутрішньопорідну структуру українських коропів (поліморфізм окремих генетико-біохімічних систем, цитогенетична характеристика). Розглядаються особливості живлення коропів і роль природної кормової бази у забезпеченні їх потреби в білках, ліпідах, мінеральних елементах і вітамінах. Наведені дані про особливості обміну білків і ліпідів в організмі коропів, механізми і фактори їх регуляції, роль селену і йоду в живленні коропів. Розглядаються особливості імунної і антиоксидантної систем в організмі коропів. Огляд літератури завершується обґрунтуванням теми дисертаційної роботи.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

З метою вивчення біологічних особливостей коропів різного генезису у Львівському відділенні Інституту рибного господарства УААН (нині Львівська дослідна станція Інституту рибного господарства УААН) проведено досліди у 4 основних напрямах, схема яких та досліджувані показники наведені в таблиці 1.

Характеристика господарства і схема дослідів. Стави Львівської дослідної станції розташовані у Прикарпатті і живляться водою річки Верещиця, яка впадає в Дністер. Ґрунти в зоні ставів - опідзолені чорноземи на лесових глинах, клімат помірний, кількість атмосферних опадів - 700-800 мм на рік, відносна вологість повітря - 76-82%, середньорічна температура - 9-11°С.

Середня глибина ставів 1,5 м. Жорстка надводна рослинність у дослідних ставах відсутня. З м'якої підводної рослинності переважають рдесник блискучий і кушир, в меншій кількості виявляється рдесник пронизанолистий та вузьколистий, гречка земноводна і мох-фонтиналіс.

Узагальнені дані про основні гідрохімічні показники дослідних ставів наведені в додатках дисертаційної роботи. За класифікацією А.О.Альокіна (1970) вода дослідних ставів належить до гідрокарбонатного класу, групи кальцію другого типу. Вода має слаболужну реакцію: водневий показник води (рН) перебуває в межах 7,0-7,6. У воді вміст біогенних елементів не перевищує нормативні величини.

Біомаса зоопланктону в дослідних ставах у вегетаційний період становила в середньому 10-12 г/м³, біомаса зообентосу - 1,5-4,4 г/м².

Загалом температурний, гідрохімічний і гідробіологічний режими дослідних ставів відповідали біологічним вимогам коропових видів риб.

Дослідження проведені на любінських рамчастих і лускатих коропах, а також на їх помісях з галицькими коропами та амурськими сазанами, а також на чистопорідних амурських сазанах. У генетичних дослідженнях використовувалися також нивківські та несвіцькі лускаті і рамчасті коропи.

За першим напрямом досліджень дволітки любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісі і гібриди, відповідно з галицьким коропом і амурським сазаном вирощувалися в окремих ставах за щільності посадки 2280 екз./га. У годівлі риб використовувався стандартний комбікорм.

Таблиця 1. Схема дослідів і методи досліджень

Мета дослідів	Схема дослідів	Методи досліджень
1-й напрям досліджень
Дослідження генетичних, імунологічних і біохімічних особливостей дволіток любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісей і гібридів, відповідно з галицьким коропом і амурським сазаном.	Вирощування в окремих ставах дволіток любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісей і гібридів з галицьким коропом і амурським сазаном. Щільність посадки 2280 екз./га.	Дослідження поліморфіз-му білків і геномної ДНК та цитогенетичних особливостей риб, загального вмісту білків, їх амінокислотного складу і співвідношення окремих їх фракцій, загального вмісту ліпідів, їх жирно-кислотного складу і співвідношення окремих класів та вмісту продуктів ПОЛ і активності антиоксидантних ферментів у скелетних м'язах і печінці, бактерицидної, лізоцимної і фагоцитарної активності сироватки крові.
2-й напрям досліджень
Дослідження генетичних, імунологічних і біохімічних особливостей дволіток любінського рамчастого коропа і амурського сазана та їх помісей і гібридів, відповідно з галицьким коропом і любінським рамчастим коропом.	Вирощування в окремих ставах дволіток любінського рамчастого коропа і амурського сазана та їх помісей і гібридів, відповідно з галицьким коропом і любінським рамчастим коропом за щільностей посадки 1000 і 3000 екз./га.	Дослідження поліморфізму білків і геномної ДНК та цитогенетичних особливостей риб, загального вмісту білків, їх амінокислотного складу і співвідношення окремих їх фракцій, загального вмісту ліпідів, їх жирнокислотного складу і співвідношення окремих класів, вмісту продуктів ПОЛ і активності антиоксидантних ферментів у скелетних м'язах, вмісту окремих ізоформ маркерних білків, кількості Т- і В-лімфоцитів у крові та їх авідності, бактерицидної, лізоцимної та фагоцитарної активності сироватки крові.
3-й напрям досліджень
Дослідження вмісту білків і ліпідів у печінці і скелетних м'язах цьоголіток любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісей і гібридів з галицьким коропом і амурським сазаном з різною масою тіла в кінці вегетаційного і зимового періодів та їх виживання в зимовий період.	Утримання в окремих ставах цьоголіток любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісей і гібридів, відповідно з галицьким коропом і амурським сазаном із використанням в дослідженнях риб масою 20-25, 30-40 та 70-80 г в кінці вегетаційного і зимового періодів.	Дослідження загального вмісту білків і співвідношення окремих їх фракцій методом електрофорезу в поліакриламідному гелі, загального вмісту ліпідів і співвідношення окремих класів методом тонкошарової хроматографії на силікагелі.
4-й напрям досліджень
Дослідження впливу селену і йоду при підвищенні їх рівня в раціоні дволіток коропа на обмін речовин в їхньому організмі, інтенсивність росту і якість м'яса.	Додавання до стандартного раціону дволіток коропа селену (0,3 мг/кг) у вигляді селеніту натрію і селенметіоніну окремо і разом із йодом (5 мг/кг) у вигляді йодистого калію.	Дослідження в скелетних м'язах вмісту селену і йоду, білків і ліпідів, продуктів перекисного окиснення ліпідів, і активності антиоксидантних ферментів.

За другим напрямом досліджень дволітки любінського рамчастого коропа і амурського сазана та їх помісі і гібриди, відповідно з галицьким коропом і любінським рамчастим коропом вирощувалися в окремих ставах при щільностях посадки 1000 і 3000 екз./га. У годівлі риб використовувався стандартний комбікорм.

За третім напрямом досліджень експерименти було розпочато в кінці вегетаційного періоду (25 вересня) 2005 року і закінчено в кінці зимового періоду (26 лютого) 2006 року. У дослідженнях використані зразки печінки і скелетних м'язів цьоголіток різної маси любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісей і гібридів, відповідно з галицьким коропом і амурським сазаном в кінці вегетаційного і зимового періодів. Цьоголітки досліджуваних генотипів вирощувалися в окремих експериментальних ставах у кількості 45 тис. екз./га. Із вирощених цьоголіток формували групи, які відрізнялися за масою тіла. У годівлі цьоголіток впродовж вегетаційного сезону використовувався стандартний комбікорм.

За четвертим напрямом досліджень дволіткам любінського лускатого коропа протягом двох місяців (липень-серпень) згодовували комбікорм з добавкою селену в кількості 0,3 мг/кг у вигляді Na₂SеO₃ (0,66 мг/кг) і селенметіоніну (0,75 мг/кг) окремо і разом із йодом в кількості 5 мг/кг у вигляді KЈ (16,6 мг/кг). У контрольному ставі - годівля без мікроелементів.

Генетичні методи

Дослідження поліморфізму біохімічних маркерів у крохмальному і поліакриламідному гелі. В якості молекулярно-генетичних маркерів при дослідженні генетичної структури любінського рамчастого і любінського лускатого коропів та їх гібридних форм, а також деяких інших внутрішньопорідних типів коропа, вирощуваних в Україні, враховували розподіл алельних і генотипових частот за локусами, що кодують білки і ферменти в крові риб. Загалом, досліджували дев'ять генетико-біохімічних систем: 18 локусів - локус трансферину (TF), локус церулоплазміну (СР), локус гемоглобіну (НВ), два локуси амілази (AМ1, AМ2, К.Ф.3.2.1.1), два локуси естерази (EST, К.Ф.3.1.1.1.), два локуси малатдегідрогенази (MDH, К.Ф.1.1.1.1.), два локуси малік-ензиму (ME, К.Ф.1.1.1.40), два локуси 6-фосфоглюконатдегідрогенази (6-PGD, К.Ф. 1.1.1.43), п'ять локусів лактатдегідрогенази (LDH, К.Ф.1.1.1.27).

Білки розділяли електрофоретичним методом у камерах, виготовлених з органічного скла, з платиновими електродами, в якості джерела струму використовували джерело живлення типу Б5-49, Б5-50 і інші. Електрофорез проводили на холоді.

Залежно від білкового маркера використовували різні буферні системи і підбиралася концентрація гелю (12-16%).

Після проведення електрофоретичного розділення білків робили декілька поздовжніх зрізів блоку і кожний зріз фарбували залежно від мети дослідження.

Генотипи гемоглобіну виявляли за допомогою електрофоретичного розділення білків в крохмальному гелі за системою Портера. Електродний буфер 0,9 М ТЕБ, рН 8,6-8,8. Джерело живлення Б5-50 - перші 30 хв. напруга 120V, сила струму 10 мА, далі 30 хв. сила струму 20 мА, а в кінці - 30 мА. Після розгонки блок знімали, розрізали і типували генотипи.

Генотип трансферину визначали також у крохмальному гелі, у великих камерах. Електродний буфер - літій боратний, рН-6,5. Джерело струму Б5-50: перший етап - 180 V, 15 мА, другий - 220 V і 30 мА, третій - 299 V, 45-50мА.

Церулоплазмін і амілазу визначали разом в одних і тих же буферних системах. Електродний буфер - літій боратний, рН-7,8. Розділення білків проводили у великій камері. Джерело струму Б5-50: перший етап - 150 V, 20 мА, другий - 290 V, 35 мА.

Ферменти розділяли шляхом вертикального електрофорезу в поліакриламідному гелі в мікрокамерах. Буфер - трис-цитратний, рН-6,8. Джерело струму Б5-50: перший етап - 120V, 10 мА, другий - 120V, 20мА, третій етап - 120V, 30-35 мА. Гель фарбували на загальний білковий спектр (Кумасі). Досліджували поліморфізм естерази, 6-фосфоглюконат-дегідрогенази, малатдегідрогенази, малікензима, лактатдегідрогенази.

Дослідження поліморфізму анонімних послідовностей ДНК за використання мікросателітних локусів. Аналіз поліморфізму та успадкування алельних варіантів анонімних послідовностей геномної ДНК за низкою мікросателітних праймерів проводився з використанням PCR-ISSR аналізу. При виборі праймерів керувалися тим фактом, що геном коропа містить 9% повторів типу GТ і майже 3% - АС (65000-100000 копій), повторюваність GА при цьому складає до 5000 копій на гаплоїдний набір хромосом (A.K.Wintero, M.Fredhoem, P.D.Tomsen, 1992). Виділення ДНК проводили за допомогою реагентів «Dіаtom DNA Prep 100» та «ДНК-сорб-В». Окрім цього, в досліді використовували матеріал банку ДНК відділу біотехнології та генетики Інституту рибного господарства УААН, виділений з венозної крові тварин сольовим методом від представників окремих порід коропа та його гібридних груп.

Для ампліфікації фрагментів ДНК, фланкованих різноманітними мікросателітними локусами, використовуючи праймери з такими послідовностями: (AGC)₆G, (ACC)₆G, (CTC)₆C, (ACC)₆C, (GAG)₆C. ПЛР проводили в 25 мкл реакційної суміші, складеної із компонентів стандартного набору «GenePak PCR Core».

Для аналізу продуктів ампліфікації використовували 2% агарозні гелі з наступним їх фарбуванням в розчині бромистого етидію. Візуалізацію проводили на трансілюмінаторі в УФ світлі з наступним фотографуванням електрофореграм цифровою камерою. Аналізу піддавалися «мажорні» смуги, що виявлялися в результаті трьох паралельно виконаних реакцій ампліфікації. Взаємне розташування ампліконів проводили з врахуванням довжини пробігу між фрагментами маркерної ДНК в агарозному гелі.

Цитогенетичні дослідження. Цитогенетичні дослідження проводили у мазках крові риб. Краплю периферичної крові розводили фізіологічним розчином (1:1) і на предметних скельцях готували мазки. Клітини лімфоїдних тканин у риб вимивали розчином КСl (0,54%) з міжхребцевих ділянок хребта, потім клітини суспензували і інкубували в цьому розчині при +37°С, протягом 40 хвилин. Фіксували метиловим спиртом і оцтовою кислотою (3:1) протягом 1 години та висушували при кімнатних умовах. Після цього тричі відмивали фіксуючим розчином і витримували в цьому розчині при температурі +9°С протягом доби. Далі готували препарати і фарбували барвником Гімза (Меrсk, Німеччина). Передобробку риб колхіцином не проводили.

Для аналізу клітин використовували бінокулярний мікроскоп фірми Саrl Zeiss Jena при збільшенні у 1000 разів. Цитогенетичні аномалії фотографували за допомогою цифрового фотоапарату Саnоn (Роwеr Shot G6, Great Вrіtaіn). Аналізували частоту зустрічаності наступних цитогенетичних характеристик: еритроцитів із мікроядрами (ЕМЯ), одноядерних лімфоцитів із мікроядрами (ЛМЯ) і двоядерних лімфоцитів (ДЛ) (%).

Результати досліджень опрацювали методами математичної статистики та біометрії. Проводили підрахунок частоти алельних і генотипових варіантів у поліморфних генетико-біохімічних системах. Для характеристики рівня генетичної мінливості обчислювали гетерозиготність для всіх досліджуваних локусів окремо і середню гетерозиготність на локус, генетичні дистанції (Neі M., 1975), відхилення генотипових частот від стану рівноваги відповідно до закону Харді-Вайнберга з використанням комп'ютерних програм «TREES», «ВIOSYS-1», «Statistica» (Swofford D. L., Selander R. B., 1981). Статистичну вірогідність різниць оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Імунологічні методи

визначення кількості Т- і В-лімфоцитів та їх субпопуляцій у крові. Кількість Т- і В-лімфоцитів та їх субпопуляцій у крові визначали методом розеткоутворення (Е-РУЛ і ЕАС-РУЛ). Наявність різних маркерів і рецепторів на поверхні лімфоцитів дозволяє диференціювати їх один від одного. Однією з характерних ознак Т-лімфоцитів тварин є присутність на їх поверхні рецепторів для гетерогенних еритроцитів. В-лімфоцити на клітинній мембрані, окрім власних імуноглобулінів, містять рецептори для Fc-фрагменту і третього компоненту комплементу (С₃). Визначення цих функціональних структур покладено в основу методів визначення кількості Т- і В-клітин крові.

У дослідженнях використовували найбільш вживаний метод (Чумаченко В. Е., 1990). Для визначення кількості Т-клітин у периферичній крові коропа (Е-РУК) використовували наявні в літературі методи (Hunter R.L., Markert C.L., 1957; Новиков Д.К., Новикова В.А., 1976) з урахуванням рекомендацій (Новикова Л.В., Лебедева К.М., Яковлева Э.М., 1981), з врахуванням специфіки досліджуваного об'єкта (лімфоцити коропа) (Новиков Д.К., Новикова В.А., 1976; Чумаченко В.Е., 1990). У процесі виконання роботи було проведено модифікацію методу визначення Т- і В-лімфоцитів у крові коропа, зокрема в якості індикаторних клітин для розеткоутворення використовували еритроцити кози.

Суспензію лімфоцитів для визначення кількості Т- і В-лімфоцитів і їхніх субпопуляцій (Т-хелперів та T-супресорів) отримували із стабілізованої гепарином крові, додаючи до неї суміш 9% водного розчину фіколу («Pharmacia», Швеція) і 38% водного розчину верографіну («Спофа», Чехія) у співвідношенні 16:7. Кількість лімфоцитів підраховували в камері Горяєва, доводячи їх кількість до 1,5-2,5 млн./мл. Еритроцити кози 3-4 рази відмивали забуференим фізіологічним розчином (ЗФР) шляхом центрифугування 10 хв. при 1500 об./хв. З них готували 0,5% розчин ЕБ. Для В-лімфоцитів готували ЕАС-систему (еритроцити сенсибілізовані антитілами і комплементом). Цю систему готували таким чином: до 2 мл 2,5% ЕБ додавали 2 мл розведеної гемолітичної сироватки та інкубували 30 хвилин при 37?С. Потім суміш центрифугували 10 хв. при 1500 об/хв. Відбирали надосад, а до осаду додавали 4 мл ЗФР і знову центрифугували 10 хв. при 1500 об./хв. До цієї суміші додавали 2 мл розведеного комплементу, і знову інкубували та центрифугували у попередньому режимі. Осад зливали і доводили вміст пробірки до 10 мл ЗФР. Пробірки позначали літерами В, Е, Т: в пробірки В вносили 0,1 мл лімфоцитів та 0,1 мл системи ЕАС, у пробірки Е -- 0,1 мл лімфоцитів та 0,1 мл 0,5% ЕБ, у пробірки Т -- 0,1 мл лімфоцитів та 0,1 мл 0,09% розчину теофіліну. Після інкубації та центрифугування проводили фіксацію клітин за допомогою 0,3% глютарового альдегіду, а потім у всі пробірки додавали 0,4 мл Н₂О і центрифугували 5 хв. при 1000 об./хв. Осад ресуспензували та робили мазок. Мазки фіксували метанолом та обробляли фарбою Романовського-Гімза. Розетки підраховували під мікроскопом. Визначали активність розеткоутворення за щільністю рецепторів: 3-5 -- рецептори з малою щільністю; 6-10 -- рецептори з середньою щільністю; розетки у вигляді «морули» -- рецептори з великою щільністю. Число Т-клітин з переважно супресорною активністю (ТФЧ) вираховували шляхом віднімання числа теофілін резистентних Т-клітин (ТФР) від загального числа Т-лімфоцитів. Імунорегуляторний індекс (ІРІ) розраховували як співвідношення теофілінрезистентних Т-клітин до теофілінчутливих, кількість О-лімфоцитів -- за різницею між загальною кількістю лімфоцитів і сумою Т- і В-лімфоцитів.

Визначення бласттрансформації лімфоцитів крові. Якщо тести розеткоутворення дозволяють судити про кількість і співвідношення Т- і В-лімфоцитів, то реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) характеризує їх функціональний стан (Передерий В. Г., Земсков А. М., Бычков Н. Г., 1995). Трансформація лімфоцитів у бласти -- це процес активації малих Т- і В-лімфоцитів, які в стані спокою знаходяться в неактивній формі. Для оцінки функціонального стану лімфоцитів РБТЛ ставлять у присутності різних мітогенів. У наших дослідженнях використовувався фітогемаглютинін (ФГА), який отримують з екстракту квасолі. ФГА, котрий володіє неспецифічною мутагенною дією, викликаючи бласттрансформацію Т-лімфоцитів.

Дослідження показників фагоцитозу. Визначення фагоцитарної активності крові проводили за методикою, описаною В.С. Гостєвим (1950). Як тест-мікроб використовували інактивовану добову культуру лабораторного штаму Staphіlococcus aureus (штам N 209-Р (3:1), в окремих дослідах мікробну тест-культуру E.сoli (штам 1033 F41, S -- форма МПА). Фагоцитарну реакцію нейтрофілів оцінювали за фагоцитарною активністю (ФА), числом (ФЧ) та індексом фагоцитозу (ІФ) (Маслянко Р.П., Олексюк І.І., Падовський А.І. та ін., 2001).

Лізоцимну активність сироватки крові (ЛАСК) визначали нефелометричним методом (Дорофейчук В.Г., 1986), за відношенням до мікробної тест-культури Micrococcus lisodeikticus (штам ВКМ - 109) на ФЕК-56 в кюветах з робочою довжиною 3 мм при довжині хвилі ?=540 нм. Світлопроникність початкової суспензії становила 20%.

Бактерицидну активність сироватки крові (БАСК) визначали фотоколориметричним методом (на ФЕК-56, л=540 нм) за відношенням до мікробної тест-культури E.сoli (штам ВКМ - 125).

Комплементарну активність сироватки крові визначали за методом (Желтова В.О., Чекопило В.И., 1978). Відлік проводили по найменшому розведенні сироватки, при якому спостерігався 100% лізис еритроцитів.

Цей метод ґрунтується на преципітації імунних комплексів, що знаходяться у сироватці крові, високомолекулярним поліетиленгліколем (ПЕГ) з молекулярною масою 6000 Да (Чернушенко Е.Ф., 1978).

Метод полягає у виділенні кислоторозчинної фракції молекул середньої маси з наступною детекцією десятикратно розведеної надосадової рідини при довжинах хвиль 254 та 280 нм (Габриэлян Н.И., Левицкий Э.Р., Дмитриев А.А. и др., 1985).

Біохімічні методи

Вміст продукту ПОЛ-дієнових кон'югатів у плазмі крові визначали в ізопропанолових (1:1) екстрактах (Стальная И.Д., 1997). В ході перекисного окиснення ліпідів на стадії утворення вільних радикалів виникає система спряжених подвійних зв'язків, що призводить до появи максимуму в спектрі поглинання при довжині хвилі 233 нм.

Вміст гідроперекисів ліпідів у плазмі крові та гомогенатах тканин визначали за методом, описаним В. Мирончиком (1984). Метод оснований на спектрофотометричному вимірюванні оптичної густини продуктів реакції з тіоціанатом амонію, сіллю Мора і соляною кислотою після попередньої екстракції ліпідів метиловим спиртом (співвідношення метанолу до об'єму плазми крові -- 13:1).

Принцип методу ґрунтується на активації ПОЛ іонами двохвалентного заліза до рівня, який реєструється електрофотометрично за вмістом реакції кінцевого продукту ПОЛ - малонового діальдегіду з тіобарбітуровою кислотою (Коробейникова С. Н., 1989).

Активність глутатіонпероксидази у плазмі крові, гемолізатах еритроцитів і досліджуваних тканинах визначали за методом, в основі якого лежить порівняльне дослідження ступеня окиснення відновленого глутатіону пероксидом третинного бутилу, який додається до інкубаційної суміші, що містить досліджуваний матеріал (Моин В.М., 1986).

Визначення активності супероксиддисмутази в еритроцитах крові проводили за методом, описаним Е. Дубиніною (1983).

Принцип методу визначення активності каталази оснований на здатності перекису водню утворювати з молібдатом амонію стійкий забарвлений комплекс жовтого кольору (Королюк М. А., Майорова И. Г., Токарев В.Е., 1988).

Вміст загального білка у гемолізатах еритроцитів та плазмі крові визначали за методом Лоурі (Lowry O.H., Rosebragh N.J., Farr A.L. et al., 1951).

Фракціонування білків проводилося методом електрофорезу в поліакриламідному 7,5% гелі в буферній системі Мауера. Електрофорез проводили при 100 V, доки проби не входили в розділяючий гель, після чого збільшували напругу до 300V протягом 4-х годин. Після закінчення електрофорезу гелевий блок поміщали в 10% розчин оцтової кислоти для згортання білків і відливання компонентів буферу. Фарбування поводили протягом години 0,5% розчином амідочорного. Промивання гелю проводили 2% оцтовою кислотою при трьохкратній заміні розчину протягом трьох діб. Денситометрію проводили на автоматичному аналізаторі фореграм АФ-1 в поліакриламідному гелі (Мауер Г., 1971).

Ліпіди плазми крові екстрагували сумішшю хлороформу і метанолу у відношенні 2:1 за методом Фолча (Кейтс М., 1975) і визначали їх кількість біхроматним методом шляхом використання стандартного набору фірми Lachema (Чехія). Окремі класи ліпідів з ліпідного екстракту виділяли методом тонкошарової хроматографії на силікагелі у системі гексан-діетиловий ефір-льодова оцтова кислота у відношенні 70:30:1 і визначали їх кількість біхроматним методом.

Жирнокислотний склад загальних ліпідів визначали методом газорідинної хроматографії (Немировський В.І., Терещук О.М., Гнатів В.І. та ін., 1984). Метилові ефіри жирних кислот одержували шляхом прямої переетерифікації у 2% Н₂SO₄ в абсолютному метанолі протягом 48 годин і розділяли їх на хроматографі чехословацького виробництва «Chrom-4» з полум'яно-іонізуючим детектором (довжина колонки 2,4 м, ширина - 4 мм, наповнювач поліетиленглікольсукцинат на хромосорбі 60-80 меш, температура випарювача 220°С, температура колонки 183°С, використання Н₂ - 30 мл/хв., N₂ - 15 мл/хв., повітря - 400 мл/хв.) Жирні кислоти ідентифікували, визначаючи їх час після введення і порівнювали з стандартом, в якості якого використовували метилові ефіри відомих жирних кислот.

Статистичну обробку отриманих цифрових даних проводили за комп'ютерною програмою «Excel». Вираховували середні арифметичні величини (М), середню квадратичну помилку (m) і достовірність різниць (Р) між досліджуваними середньоарифметичними величинами.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Генетична структура любінських рамчастого і лускатого коропів, їх помісей і гібридних форм та інших типів українських коропів. Генетичну структуру любінських рамчастого і лускатого коропів та їх помісей і гібридних форм вивчали в двох дослідах шляхом дослідження поліморфізму шести ферментів (естерази, малатдегідрогенази, малік-ензима, 6-фосфоглюконатдегідрогенази, лактатдегідрогенази і амілази) та трьох білків (трансферину, гемоглобіну, церулоплазміну) крові. У першому досліді дослідження проводили на дворічках любінських рамчастих і лускатих коропів та їх помісей відповідно з галицькими коропами і амурськими сазанами, у другому - на дворічках любінських рамчастих коропів і амурських сазанів та їх помісей відповідно з галицькими і любінськими рамчастими коропами. Одночасно для порівняння досліджували поліморфізм цих білків у крові несвіцьких та нивківських лускатих і рамчастих коропів, коропів породи фресинет.

Встановлено, що у риб всіх генотипів лактатдегідрогеназа і амілаза виявилися мономорфними, естераза і малік-ензим представлені двома (А, В), малатдегідрогеназа і 6-фосфоглюконатдегідрогеназа - трьома (А, В, С) алельними варіантами. Отже, найбільш поліалельними генетико біохімічними системами у досліджених коропів виявилися системи малатдегідрогенази і 6-фосфоглюконатдегідрогенази.

Трансферини риб досліджених генотипів представлені п'ятьма алельними варіантами (А, В, С1, С2, D), а гемоглобін виявився мономорфним. Проведені дослідження показали, що за поліморфізмом трансферину сироватки крові любінські рамчасті і лускаті коропи відрізняються між собою за співвідношенням алелей С1 і С2, алеля В, та за наявністю у дворічок любінського рамчастого коропа алеля D, який у дворічок любінських лускатих коропів відсутній (табл.2, 3).

Рівень гетерозиготності і кількості алелей трансферину у любінських коропів і їх помісей і гібридних форм значно різниться між собою: у нащадків міжпорідних і міжпідвидових схрещувань ці показники значно вищі.

генетичний структура короп локус

Таблиця 2. Розподіл генних частот за локусом трансферину у любінських рамчастих і лускатих коропів та їх помісей і гібридних форм у першому досліді (n=35)

Алелі	ЛРК	ЛРК X ГК	ЛЛК	ЛЛК X АС
А	0,000	0,111	0,000	0,100
В	0,222	0,389	0,056	0,350
С1	0,444	0,222	0,389	0,150
С2	0,167	0,111	0,555	0,150
D	0,167	0,167	0,000	0,250
Примітка: ЛРК - любінський рамчастий короп; ГК - галицький короп; ЛЛК - любінський лускатий короп; АС - амурський сазан.

Таблиця 3. Розподіл генних частот за локусом трансферину у любінських рамчастих коропів і амурських сазанів та їх помісей і гібридних форм, несвіцьких рамчастих і лускатих коропів у другому досліді (n=35-45)

Алелі	ЛРК	ЛРКхГК	АС	ЛРКхАС	НРК	НЛК
А	0,300	0,229	0,156	0,186	0,171	0,129
В	0,414	0,300	0,289	0,214	0,457	0,500
С	0,157	0,214	0,378	0,443	0,257	0,329
D	0,129	0,257	0,178	0,157	0,114	0,043
Примітка: ЛРК - любінський рамчастий короп; ГК - галицький короп; АС - амурський сазан; НРК - несвіцький рамчастий короп; НЛК - несвіцький лускатий короп.

Найбільш рухливим виявився алельний варіант трансферину ТА, його частота була найбільшою у любінських рамчастих коропів і становила 0,300. Алельний варіант В переважав у локусі несвіцьких лускатих і рамчастих коропів та любінських лускатих коропів, алельний варіант С переважав у коропово-сазанових гібридів та у любінських рамчастих коропів і несвіцьких рамчастих, і особливо лускатих коропів.

У таблиці 4 наведені дані про генетичні відстані (вище діагоналі, М. Ней, 1972) та індекс ідентичності у досліджуваних коропів і їх гібридів, розрахованими за поліморфними системами.

Таблиця 4. Генетичні відстані та індекс ідентичності, розраховані за поліморфними системами.

Типи риб	АС	ЛРК	КСГ	ЛРКхГК	НЛК	НРК
АС	***	0,035	0,003	0,023	0,039	0,024
ЛРК	0,027	***	0,044	0,009	0,010	0,019
КСГ	0,000	0,036	***	0,028	0,047	0,033
ЛРКхГК	0,015	0,001	0,019	***	0,015	0,028
НЛК	0,032	0,001	0,039	0,007	***	0,010
НРК	0,016	0,011	0,024	0,020	0,002	***
Примітка: АС - амурський сазан; ЛРК - любінський рамчастий короп; КСГ - коропово-сазановий гібрид; ЛРКxГК - помісний рамчастий короп; НЛК - нивківський лускатий короп; НРК - нивківський рамчастий короп.

Наведені у вказаній таблиці дані свідчать про незначні відмінності між амурськими сазанами і коропо-сазановими гібридами (0,003), між любінським рамчастим коропом та його помісями з галіційськими коропами (0,09), між несвіцькими рамчастими і лускатими коропами (0,010). Найбільш генетичні відстані спостерігалися між любінськими рамчастими коропами та амурськими сазанами і їх гібридами (0,039 та 0,047 відповідно). Ці дані свідчать про вплив походження риб на їх генотип і наявність різниці у генетичних відстанях між ними.

Побудована на основі генетичних відмінностей дедрограма показала, що любінські рамчасті коропи разом з їх помісями з галіційськими коропами утворюють загальний кластер з амурським сазаном та коропосазановим гібридом. Найбільша подібність виявлена між несвіцьким рамчастим та лускатим коропами.

Загалом, одержані результати дозволяють зробити висновок, що за досліджуваними генетико-біохімічними показниками подібність і відмінність між генотипом досліджуваних коропів та їх гібридів варіюють від локусу до локусу, а міжпорідні відмінності переважають внутрішньопорідні майже за всіма локусами.

Аналіз поліморфізму анонімних ланок ДНК з використанням праймерів до мікросателітних локусів. Було проведено аналіз дворічок любінських рамчастих і лускатих коропів, галицьких коропів та коропово-сазанових гібридів (любінський лускатий Ч амурський сазан) з використанням праймерів (СТС)₆С, (AGC)₆C, (AGC)₆G, (GAG)₆C, (AСG)₆G), які дозволяють отримати спектр ампліконів з високою відтворюваністю і специфічністю для оцінки міжпорідної диференціації та генетичної гетерогенності популяцій.

Всі досліджені локуси виявилися високополіморфними (число алелей за окремими групами досягало 14), при цьому в більшості груп спостерігається рівновага Харді-Вайнберга, що підтверджує нейтральність вибраних для аналізу локусів. Таким чином, вибрані локуси є найбільш оптимальними молекулярно-генетичними маркерами для подальших популяційних досліджень порід та внутрішньопорідних типів українських коропів.

Так, наприклад, при використанні праймеру (СТС)₆С у любінського лускатого коропа низка ампліконів спостерігалась на ділянці 700-1300 п.н. і утворює специфічні картини спектру (1).

Використання одного праймера дозволяє виявляти 3-10 фрагментів, тоді як при забарвленні бромистим етидієм максимальна кількість фрагментів, які виявляються, не перевищує 7, а частіше варіює від 1 до 5. Менша кількість ампліконів, які можна спостерігати, не впливає на специфічність їх розподілу і на результати досліду.

Такий метод аналізу розподілу фрагментів дозволяє спостерігати лише часті повтори послідовностей ДНК. Виявлені на електрофорезі смуги чітко поділяються на яскраво виражені мажорні і більш світлі мінорні, які характеризуються дещо меншою інтенсивністю і варіюють від помітних до зникаючих на межі спостереження. Деякі з них яскраво флуоресціюють при УФ-опроміненні, інші помітні лише на фотоплівці за збільшення тривалості експозиції гелю.

Через специфіку взаємодії флуоресцентного агенту бромистого етидію з молекулою ДНК, інтенсивність забарвлення смуг залежить від двох параметрів - частоти трапляння фрагменту і його довжини. При однаковій копійності повторюваної послідовності в геномі, коротші фрагменти світяться слабше. Одночасна залежність інтенсивності світіння від кількості копій і розміру амплікону повинна враховуватись при інтерпретації результатів аналізу.

Дослідження поліморфізму ДНК дозволило встановити, що у мікросателітних послідовностях ядерної ДНК наявна висока ступінь внутрішньопорідної консервативності. Всередині груп, особливо в українського лускатого коропа любінського внутрішньопорідного типу, практично відсутня індивідуальна мінливість спектрів. У результаті більшості досліджень ідентичність спектрів ДНК зберігається і в особин однієї породи, взятих з різних господарств. Були виявлені особини у галицького коропа, для яких спектри ампліконів ядерної ДНК дещо відрізнялися - за 1-3 мінорними смугами. Одержано спектри, специфічні для кожного використаного праймеру і ідентичні для всіх досліджених риб.

На підставі дослідження можна стверджувати, що даний метод аналізу повторюваних послідовностей ядерної ДНК цілком придатний для міжпорідного генотипування і аналізу філогенетичних відносин. Методика достатньо проста у виконанні, надійна і не вимагає значних матеріальних витрат.

Слід зазначити, що маркування особин на рівні мінорних фрагментів ампліфікованої ДНК навряд чи доцільне, тоді як порідне маркування на рівні мажорних фрагментів зручне для масового аналізу риб.

Таким чином, використані послідовності мікросателітної ДНК мають високу варіабельність у всіх груп досліджених коропів і можуть бути використані для між- і внутрішньопорідного генотипування.

Цитогенетичні особливості дворічок любінських рамчастих і лускатих коропів та їх гібридних форм. Враховуючи, що питання про вплив генотипу коропів і їх гібридних форм на цитогенетичну характеристику висвітлено значно менше, ніж вплив токсичних чинників, проведено дослідження кількості мікроядер в еритроцитах і лейкоцитах та кількості метафазних пластинок з хромосомними абераціями і двоядерних клітин в еритроцитах галицького коропа, любінських рамчастого і лускатого коропів та гібридної форми останнього з амурським сазаном. Результати цих досліджень наведено в таблиці 5.

З таблиці видно, що найменшу кількість еритроцитів з мікроядрами виявлено у любінських лускатих коропів (2,7±0,3), а найбільшу - у гібридної популяції любінський лускатий короп х амурський сазан (5,0±0,4). Такі ж міжгрупові різниці спостерігаються і в кількості лейкоцитів з мікроядрами. У любінських лускатих коропів виявлено меншу кількість еритроцитів з мікроядрами, ніж у любінських рамчастих (Р<0,01) і галицьких коропів (Р<0,01). Порівняно до амурських сазанів у любінських лускатих коропів виявлено меншу кількість еритроцитів і лейкоцитів з мікроядрами (Р<0,001; Р<0,01), а також меншу кількість двоядерних лейкоцитів. Між любінськими рамчастими і галицькими коропами статистично вірогідні різниці за цими показниками відсутні.

Таблиця 5. Частоти цитогенетичних аномалій в еритроцитах крові любінських рамчастих і лускатих коропів і їх гібридних форм, % (M±m; n=35)

Породи і типи риб	ЕМЯ	ЛМЯ	ДЛ
Галицький короп	4,4±0,3	3,7±0,5	1,7±0,4
Любінський лускатий короп	2,7±0,3	2,0±0,3	1,3±0,2
Любінський лускатий короп х амурський сазан	5,0±0,4	4,6±0,6	2,4±0,4
Любінський рамчастий короп	4,6±0,5	3,7±0,9	2,3±0,5
Примітка: ЕМЯ - еритроцити з мікро ядрами; ЛМЯ - лімфоцити з мікро ядрами; ДЛ - двоядерні лімфоцити.

З одержаних результатів випливає, що за досліджуваними генетичними характеристиками найбільш стабільний хромосомний апарат виявився у любінських лускатих коропів, а найменш - у гібридів любінського лускатого коропа з амурським сазаном, що можна пояснити віддаленою гібридизацією цих риб.

Окремий етап дисертаційної роботи становило визначення кількості хромосом у клітинах кісткового мозку дволіток любінських коропів. У трьох коропів вказаного внутрішньопорідного типу було виділено клітини кісткового мозку і проведено індивідуальну оцінку за наявністю серед метафазних пластинок клітин з різною кількістю хромосом. У риби № 14 кількість хромосом становила від 44 до 245, у риби № 15 - від 68 до 133, у риби №16 - від 33 до 90. З цих даних випливає, що у риби № 14 гаплоїдний набір хромосом у любінських лускатих коропів становить від 49 до 52.

Природна резистентність дволіток любінських рамчастого і лускатого коропів, їх помісей та гібридних форм. Продуктивність ставових риб, зокрема коропів, значною мірою залежить від їх резистентності до патогенних факторів середовища. Важливу роль у захисті коропів від патогенних мікроорганізмів відіграють природні фактори резистентності, ключову роль серед яких відіграють бактерицидна і лізоцимна активність сироватки крові та фагоцитарна активність клітин білої крові. З наведених на діаграмі (рис. 1) даних видно, що бактерицидна, лізоцимна і фагоцитарна активність крові у дволіток любінського лускатого коропа була вірогідно вища (Р<0,05-0,001), ніж у дволіток любінського рамчастого коропа. При цьому у дволіток любінського лускатого коропа, порівняно до любінського рамчастого коропа, виявлено більший фагоцитарний індекс і більше фагоцитарне число (Р<0,05). Ці дані свідчать про вищу природну резистентність дволіток любінського лускатого коропа, ніж дволіток любінського рамчастого коропа. Бактерицидна, лізоцимна і фагоцитарна активність, фагоцитарний індекс і фагоцитарне число крові гібрида любінського лускатого коропа з амурським сазаном і помісі любінського рамчастого коропа з галицьким коропом були вищими (Р<0,05-0,001), ніж у чистопорідних любінських рамчастого і лускатого коропів. Ці дані свідчать про підвищення природної резистентності помісних та гібридних форм любінських рамчастого і лускатого коропів внаслідок схрещування їх відповідно з галицьким коропом і амурським сазаном.

Рис. 1. Активність природної резистентності в крові дволіток любінських рамчастого і лускатого коропа, їх помісей та гібридів (M±m, n=4)

Примітка. * - достовірні 0,05; ** - достовірні 0,01; *** - достовірні 0,001 (тут і далі).

Активність антиоксидантної системи в печінці і скелетних м'язах дволіток любінських рамчастого і лускатого коропів, їх помісей та гібридних форм. Стійкість риб до негативних факторів середовища забезпечує антиоксидантна система, яка захищає клітинні мембрани від деструктивної дії вільних радикалів кисню. Вільнорадикальні процеси в організмі риб відіграють ключову роль у патогенезі всіх патологій і дисфункцій. Активність антиоксидантної системи в організмі риб залежить від багатьох факторів, проте вплив генетичних факторів на її активність у риб не вивчено. Проведені дослідження показали, що за вмістом продуктів перекисного окислення ліпідів (дієнових кон'югатів, гідроперекисів ліпідів і малонового альдегіду) у печінці та скелетних м'язах усі вивчені групи дволіток не відрізняються, що свідчить про приблизно однакову інтенсивність перекисних процесів у їх організмі.

Ці дані становлять інтерес у зв'язку з тим, що, активність ключових ферментів антиоксидантної системи - супероксиддисмутази і глутатіонпероксидази в печінці дволіток любінського лускатого коропа була вища (Р<0,05, Р<0,01), ніж у любінського рамчастого коропа, а в помісей і гібридів коропів обох внутрішньопорідних типів вища, ніж у чистопорідних коропів (Р<0,05-0,01). Аналогічні різниці в активності глутатіонпероксидази виявлені в скелетних м'язах любінських лускатого і рамчастого коропів та їх помісей і гібридів. Ці дані вказують на значний вплив генетичних факторів на активність антиоксидантної системи в організмі коропа, а тим самим на їх адаптаційну здатність до дії негативних факторів середовища.

Вміст білків, їх фракційний і амінокислотний склад у печінці і скелетних м'язах дволіток любінських рамчастого і лускатого коропів, їх помісей та гібридних форм. Білки печінки риб відіграють ключову роль у біохімічних процесах, що лежать в основі їх життєдіяльності і продуктивності. Проведені дослідження показали, що за загальним вмістом білків у печінці і їх фракційним складом дволітки любінських лускатого і рамчастого коропів не відрізняються. Одночасно у печінці дволіток гібрида любінського рамчастого і галицького коропів виявлено вірогідно менший вміст фракції, яка відповідає за електрофоретичною рухливістю альбумінам сироватки крові і більший вміст фракції, яка відповідає сироватковим г-глобулінам (Р<0,05), ніж у печінці чистопорідного рамчастого коропа.

Більший вміст останньої фракції білків виявлено також у гібрида любінського лускатого коропа з амурським сазаном, у порівнянні з чистопорідним коропом, що свідчить про зв'язок між підвищеною гетерозиготністю гібридних форм коропа і обміном білків у печінці.

За загальним вмістом білків, їх фракційним і амінокислотним складом скелетні м'язи дволіток любінських рамчастого і лускатого коропів не відрізняються. Проте у скелетних м'язах дволіток помісей любінського рамчастого коропа з галицьким коропом і дволіток гібридів любінського лускатого коропа з амурським сазаном виявлено менший вміст білків, які відповідають за електрофоретичною рухливістю сироватковим в-глобулінам і більший вміст білків, які відповідають г-глобулінам (Р<0,05). Ці дані свідчать, що гібридизація призводить до змін фракційного складу білків скелетних м'язів коропа, не впливаючи на їх амінокислотний склад.

...