Удосконалення системи культивування, зберігання та параметрів контролювання виробничих штамів (Pasteurella, Salmonella, Listeria)

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

16.00.03 -- ветеринарна мікробіологія та вірусологія

УДК 579.62:57.03.8:15.371

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

УДОСКОНАЛЕННЯ СИСТЕМИ КУЛЬТИВУВАННЯ, ЗБЕРІГАННЯ ТА ПАРАМЕТРІВ КОНТРОЛЮВАННЯ ВИРОБНИЧИХ ШТАМІВ (PASTEURELLA, SALMONELLA, LISTERIA)

Виговська Лілія

Миколаївна

Харків -- 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Ушкалов Валерій Олександрович, Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, директор

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Завгородній Андрій Іванович, Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», заступник директора з впровадження наукових розробок, завідувач лабораторії вивчення туберкульозу;

доктор ветеринарних наук, професор Фотіна Тетяна Іванівна, Сумський національний аграрний університет, проректор з наукової роботи, завідувач кафедри ветсанекспертизи, мікробіології, зоогігієни та безпеки якості продуктів тваринництва

Захист відбудеться « 12 » листопада 2008 р. о 900 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий « 8 » жовтня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор ветеринарних наук, професор А. Ф. Бабкін

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біотехнологічні технології широко використовуються у виробництві продуктів харчування та біологічно активних речовин -- антибіотиків, ферментів, гормонів, імунокоректорів, вакцин, діагностикумів тощо (Прискока В. А., 1998; Шинкаренко Л. М., 2001; Головач Т. М., 2004). Умовою ефективного використання здобутків сучасної біотехнології є наявність виробничих штамів мікроорганізмів (Соломатин В. И., 1974; Фукс П. П., 1997; Ушкалов В. О., 2001).

В Україні комісійну оцінку, державну реєстрацію, підтримання та забезпечення підприємств біологічної промисловості штамами мікроорганізмів для виробництва та контролю якості ветеринарних імунобіологічних препаратів здійснює Національний центр штамів мікроорганізмів (НЦШМ) Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ). Крім того, у НЦШМ проводиться весь обсяг робіт, пов'язаний із паспортизацією штамів, оптимізацією існуючих і розробкою нових способів довгострокового зберігання мікроорганізмів (Головко А. М., 2007).

Євроінтеграційна спрямованість України вимагає дотримуватись міжнародних вимог щодо роботи депозитаріїв штамів мікроорганізмів, і депонування зокрема. Згідно з вищезазначеним у 2004 році було затверджено нові вимоги до інформації стосовно біологічних властивостей штамів, які надходять до депозитарію. Аналіз наявних відомостей про депоновані виробничі штами показав, що паспортні характеристики потребують доопрацювання. Це і стало підставою для виконання наших досліджень. Крім того, відомо, що ліофілізація та довгострокове зберігання в ліофільному стані призводить до деяких змін у біологічних характеристиках штамів мікроорганізмів, що може негативно впливати на якість кінцевого продукту виробництва, зокрема засобів захисту тварин (Аганина Л. А., 1974, Чернецкий Ю. П., 1980). У зв'язку з цим, актуальним напрямком досліджень є оптимізація існуючих та розробка нових способів довгострокового зберігання та підтримання штамів мікроорганізмів на основі вивчення їх біологічних властивостей. Перед нами стояло завдання встановити відповідність властивостей штамів паспортним характеристикам на основі вивчення індивідуальних біологічних властивостей кожного штаму за культурально-морфологічними, біохімічними, патогенними властивостями, визначити чутливість до антибіотиків, підібрати оптимальні середовища для їх культивування, визначити вплив ліофілізації та довгострокового зберігання на біологічні властивості та активність культур.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано згідно з планом науково-дослідних робіт Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів «Підтримання штамів мікроорганізмів у Національному Центрі штамів мікроорганізмів України» (№ 0197U004847 у 1997 р., № 0198U001204 у 1998 р., № 0199U000006 у 1999 р., № 0100U000261 у 2000-2004 рр.), «Удосконалення системи оцінки штамів мікроорганізмів і якості виготовлених з них біопрепаратів» (№ 0197U004846 у 1997 р., № 0198U001202 у 1998 р., № 0199U000007 у 1999 р., № 0100U000261 у 2000 р.), «Розробити методи підтримання та збереження у високоактивному стані колекційних культур мікроорганізмів (бактерій, вірусів, грибів), що знаходяться в установах ветеринарної медицини України з наступним впровадженням їх при промисловому виготовленні біопрепаратів» (№ 0101U000542 у 2001-2004 рр.), «Колекція патогенних для тварин штамів мікроорганізмів Національного центру штамів мікроорганізмів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів» (№ 0106U005235 у 2006 р.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було удосконалення системи культивування, зберігання та параметрів контролювання виробничих штамів мікроорганізмів.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі задачі:

- вивчити біологічні властивості штамів Pasteurella, Salmonella, Listeria з колекції НЦШМ ДНКІБШМ;

- розробити поживні середовища для відновлення біологічних властивостей ліофілізованих штамів Pasteurella, Salmonella, Listeria;

- вивчити вплив довгострокового зберігання в ліофільному стані на біологічні властивості виробничих штамів Pasteurella і Salmonella;

- вивчити вплив ліофілізації на біологічні властивості штамів Pasteurella, Salmonella, Listeria;

- удосконалити методику лабораторної діагностики пастерельозу тварин;

- провести порівняльне вивчення біологічних властивостей епізоотичних культур сальмонел та розробити паспорти для промислово перспективних епізоотичних штамів, що будуть використані у виробництві імунобіологічних препаратів для боротьби з сальмонельозом тварин.

Об'єкт дослідження: система довгострокового зберігання виробничих штамів мікроорганізмів.

Предмет дослідження: культивування, підтримання, зберігання і контролювання стабільності штамів бактерій родів Pasteurella, Salmonella, Listeria з колекції НЦШМ ДНКІБШМ.

Методи дослідження: бактеріологічні (культивування на поживних середовищах, виділення, ідентифікація збудників), імунобіологічні (визначення патогенності, вірулентності, антигенності, імуногенності штамів Pasteurella і Salmonella), серологічний (постановка реакції аглютинації), патолого-анатомічний (патолого-анатомічний розтин, відбір патологічного матеріалу (кров з паренхіматозних органів та серця загиблих тварин)), епізоотологічний (вивчення епізоотичної ситуації), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі результатів вивчення біологічних властивостей виробничих штамів Pasteurella, Salmonella, Listeria отримані нові дані стосовно способів підтримання мікроорганізмів у високоактивному стані, а саме:

· Експериментально обґрунтовано доцільність застосування збагачених поживних середовищ з метою відновлення біологічних властивостей бактерій (культурально-морфологічних, біохімічних, антигенних, патогенних, антибіотикорезистентності), що тривалий час зберігались у ліофільному стані, використання яких, порівняно з середовищами МПБ, Хотінгера, забезпечує повне відновлення вихідних біологічних властивостей.

· Розроблено поживне середовище для накопичення біомаси бактерій роду Listeria, застосування якого дозволяє отримувати вдвічі більшу кількість біомаси порівняно з аналогами.

· Встановлено, що зберігання штамів бактерій родів Pasteurella, Salmonella у ліофільному стані за температури + 4 °С забезпечує збереження їх життєздатності впродовж 10 років, при цьому кількість життєздатних мікробних клітин знижується в середньому на 10 %.

· Доведено доцільність використання епізоотичних штамів сальмонел для виготовлення ветеринарних імунобіологічних препаратів, що стало підставою для розробки вакцини проти сальмонельозу тварин «Сальмосан».

Практичне значення одержаних результатів.

· Удосконалено систему підтримання промислових штамів мікроорганізмів у активному стані, яка полягає у визначенні індивідуальних біологічних властивостей штамів, збереженні в ліофільному стані при + 4 °С, застосуванні збагачених поживних середовищ для відновлення біологічних властивостей після ліофілізації та довгострокового зберігання, пасажуванні виробничих штамів на лабораторних тваринах, оцінці рівня біологічної активності штамів на кожному етапі підтримання.

· Розроблено прописи поживних середовищ для культивування бактерій родів Pasteurella, Salmonella, застосування яких забезпечує відновлення вихідних біологічних властивостей після ліофілізації та довгострокового зберігання у ліофільному стані. Середовища за розробленими прописами використовуються на підприємствах біопромисловості, а саме на Дніпропетровській і Сумській біофабриках, Дніпропетровській дослідній станції ННЦ «ІЕКВМ».

· Застосування розробленого середовища для накопичення біомаси бактерій роду Listeria забезпечує накопичення вдвічі більшої кількості біомаси порівняно з аналогами та відновлення біологічних властивостей у ліофілізованих культур.

· Розроблено паспорти на виробничі штами бактерій родів Pasteurella, Salmonella, Listeria.

· Матеріали дисертаційної роботи, а саме відомості про біологічні властивості пастерел, використані при розробці «Настанови з лабораторної діагностики пастерельозу тварин та птиці», затвердженої науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини (протокол № 3 від 20.12. 2006 р.).

· Отримані за нашої участі результати вивчення біологічних властивостей епізоотичних штамів сальмонел використано при розробці нормативних документів та виготовлені вакцини концентрованої інактивованої проти сальмонельозу тварин «Сальмосан» (ТУ У 46.15.374-99).

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проведено аналіз літературних даних за темою роботи; обґрунтовано програму досліджень; виконано наукові програми, які покладені в основу дисертації; виконано експериментальні та аналітичні дослідження; проведено аналіз та узагальнення одержаних результатів; сформульовано висновки та практичні рекомендації.

Вакцину інактивовану концентровану проти сальмонельозу тварин «Сальмосан» розроблено спільно зі співробітниками лабораторії анаеробних інфекцій Інституту ветеринарної медицини УААН під керівництвом доктора ветеринарних наук, професора, члена-кореспондента УААН Риженка В. П., за що висловлюємо щиру подяку.

Поживне середовище для накопичення бактерій роду Listeria розроблено спільно з науковим керівником, доктором ветеринарних наук Ушкаловим В. О., співробітниками ННЦ «ІЕКВМ» кандидатом ветеринарних наук Бабкіним М. В., кандидатом ветеринарних наук Прохорятовою О. В., кандидатом ветеринарних наук Калашнік Н. В., кандидатом біологічних наук Романько М. Є., за що висловлюємо щиру подяку.

«Настанову з лабораторної діагностики пастерельозу тварин та птиці» розроблено у співавторстві з великим колективом авторів з Луганського НАУ, ННЦ «ІЕКВМ», ДНКІБШМ, Дніпропетровської ДС ННЦ «ІЕКВМ», ЦДЛВМ, ІВМ УААН, Сумського НАУ.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на засіданнях Вченої ради ДНКІБШМ у 1997-2007 рр., Всеукраїнській науково-практичній конференції «Хвороби органів травлення новонароджених тварин, діагностика, лікування, профілактика та прогнозування» (м. Київ, НАУ, грудень 1998 р.), Міжнародній науково-практичній конференції «ІЕКВМ -- 80 років на передовому рубежі ветеринарної науки» (м. Харків, жовтень 2002 р.), Міжнародній науково-практичній конференції «Епізоотологія і профілактика інфекційних хвороб ВРХ» (м. Київ, НАУ, березень 2006 р.), ІІ_й Міжнародній науковій конференції «Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування» (м. Львів, жовтень 2007 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, з них 12 опубліковані у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України. Отримано патент на корисну модель № 29973.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 160 сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки, список використаної літератури, додатки. Роботу ілюстровано 22 рисунками і 35 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 224 найменування, у тому числі 36 зарубіжних авторів.

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконано у період з 1997 до 2007 рр. у НЦШМ ДНКІБШМ Міністерства аграрної політики України (м. Київ). Методологічною основою визначення напрямку досліджень були літературні відомості про біологічні властивості бактерій родів Pasteurella, Salmonella, Listeria -- збудників інфекційних захворювань. У роботі використано: 3 виробничі штами сальмонел і 19 -- пастерел, отриманих з колекції НЦШМ; 21 епізоотичний штам сальмонел, виділених від хворих та загиблих тварин різних видів у тваринницьких господарствах України; 7 штамів лістерій, отриманих з Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України, Інституту мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України.

Ліофілізацію проводили на апараті для ліофілізації LP-3 фірми JOAN за Р -- 4,5 МПа, температури заморожування матеріалу в морозильній камері -- мінус 73 °С, температури рефрижератора в LP-3 -- мінус 45 °С, терміні висушування -- 20-24 години. Для стабілізації бактерій в процесах ліофілізації використовували середовище Файбіча.

Морфологію культур вивчали мікроскопічними дослідженнями. Для вивчення форми і будови бактерій їх фарбували за Грамом (Антонов В. Я., 1981).

Культуральні властивості штамів визначали на рідких, напіврідких та твердих поживних середовищах: сальмонел культивували за температури 37 °С впродовж 18-24 годин, пастерел і лістерій -- 24-48 годин (Антонов В. Я., 1981).

При виготовленні збагаченого середовища для культивування пастерел (середовище PL-5) до готових середовищ МПБ, Хотінгера додавали 5 % кінської сироватки, інактивованої впродовж 30 хв. за температури 45-50 °С, та 1 % глюкози. Середовища витримували 3 доби за температури 37 °С (контроль на стерильність). На вказаних середовищах пастерел культивували при 37 °С впродовж 24-48 годин (Меджидов М. М., 2003, Количев Н. М., 2006). Збагачені середовища для культивування сальмонел (SC-5) готували за такою методикою: до готових середовищ МПБ, Хотінгера додавали середовища 199 -- 2 %, печінкової води -- 5 %, глюкози -- 1 %; стерилізували 30 хв. за 0,5 атм.

До складу середовища для накопичення біомаси лістерій № 29973 введено екстракт пекарських дріжджів (ЕПД), панкреатичний гідролізат казеїну (ПГК), літію хлорид, натрію хлорид, амонійного заліза цитрат і в якості джерела азоту -- гідролізат кільки з вмістом амінного азоту 0,15-0,20 г/%. Збагачували середовище додаванням 5 % інактивованої кінської сироватки та 1 % глюкози.

Біохімічні властивості. При вивченні біохімічних властивостей культур користувались середовищами Гіса з сахарами і багатоатомними спиртами. Рівень біохімічної активності виражали в хрестах (від 1 до 4). Біохімічні властивості лістерій вивчали за допомогою тестів АРІ-Listeria (виробництва фірми «BioMerieux», Франція) згідно з настановою. Для виявлення культур, що гідролізують сечовину, використовували середовище Олькеницького. Визначення присутності індолу та протеолітичної активності бактерій проводили за загальноприйнятими методиками (Антонов В. Я., 1981, Меджидов М. М., 2003).

Антигенну структуру сальмонел вивчали за допомогою реакції аглютинації на склі з О- і Н-аглютинуючими діагностичними сальмонельозними сироватками (Черкаський Б. Л., 1990). Рівень аглютинації позначали в хрестах (від 1 до 4).

Гемолітичні властивості лістерій визначали за наявністю гемолізу на кров'яному агарі і у САМР-тесті зі штамами Staphylococcus aureus ATCC 25923 і Rodococcus equi ATCC 6939 (згідно з ISO 11290-1:2003, ISO 11290-2:2003).

Антибіотикорезистентність штамів визначали згідно «Инструкции по применению дисков для определения чувствительности к антибиотикам» (від 8.07.1986 р., МОЗ СРСР).

Вірулентність штамів вивчали на білих мишах методом титрування і визначення LD50 (Антонов Б. И., 1986).

Імуногенність (ІD50) мікроорганізмів визначали на моделях активного захисту -- білих мишах масою 18-20 г після дворазового щеплення відповідними антигенами (Антонов Б. И., 1986).

Результати експериментальних досліджень оброблені за загальноприйнятими методами статистики (Ашмарин И. П., 1962). При цьому визначали середню арифметичну величину (М), її середньоквадратичне відхилення (у), похибку середньої арифметичної величини (m) та коефіцієнт кореляції (r). Вірогідність різниці середніх арифметичних величин між групами або в порівнянні з вихідними даними визначали за критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Вивчення біологічних властивостей штамів з колекції НЦШМ ДНКІБШМ. У роботі вивчали архівні зразки бактерій родів Salmonella i Pasteurella, ліофілізовані y 1995 та 2005 рр. Визначали властивості вказаних штамів до ліофілізації, у ліофілізованих культур та після 3_х відновлювальних пасажів на МПБ, середовищах Хотінгера і на збагачених поживних середовищах (PL-5, SC-5).

Культурально-морфологічні властивості штамів Pasteurella multocida. Досліджували виробничі штами P. multocida, патогенні для ВРХ, ДРХ і свиней (№№ 216, 116, 217, 796, 656, 877, См, D, F, 1231) та сільськогосподарської птиці (№№ 396, 606, 2-А, 115, 1718, D-1, D-71, D-90, 1931). За морфологією досліджені культури грамнегативні, овоїдної форми, дрібні, розміром 0,5-1,00,5-0,8 мкм.

На МПА культури утворювали типові для виду колонії S-форми. Штами P. multocida №№ 656, 877, «СМ», 396, D-71 утворювали крупні колоній до 4-6 мм у діаметрі. У культур P. multocida №№ 216, 116, 796, F, D, 606, 2-А, 115, 1718, D-90, D-1, 1931 розмір колоній становив 0,5-3,0 мм у діаметрі. Культура P. multocida № 217 вегетувала у вигляді дрібних росинчатих колоній S-форми розміром до 0,5 мм у діаметрі.

Необхідно підкреслити, що при культивуванні на середовищах МПБ, Хотінгера штамів №№ 217, 396, 796, F, D, 1931 відмічалась затримка росту: накопичення бактеріальної маси у 24-годинних бульйонних культурах становило 500-700 млн мікр. кл., на МПА добові культури утворювали дрібні колонії S-форми діаметром 0,2-0,5 мм. Після 2-3 пасажів на вказаних середовищах у більшості штамів проявлявся феномен дисоціації (за Н. М. Количевим, 2007): культури втрачали здатність утворювати колонії на твердих середовищах, росли лише на початку штриха у вигляді слизового тяжа (О_форма).

Для вирішення цієї проблеми дослідним шляхом, враховуючи літературні дані, нами оптимізовано склад середовища і спосіб культивування пастерел. З цією метою до стандартних середовищ МПБ, Хотінгера додавали 5 % кінської сироватки і 1 % глюкози (середовище PL-5). Крім того, у роботі зі штамами ми чергували пасажі на рідких і напіврідких середовищах (ПЖА Хотінгера, який також містив 5 % кінської сироватки і 1 % глюкози), а тверді середовища використовували для спостереження за культуральним станом штамів і виділення чистої культури після пасажів на лабораторних тваринах.

Показники накопичення біомаси добових культур P. multocida №№ 216, 217, 796, 877, 1231 у рідких середовищах (КУО/см3) наведені в таблиці 1.

Таблиця 1 Накопичення біомаси штамів P. multocida на різних поживних середовищах після ліофілізації та зберігання впродовж 10 років (M±m, n=5)

Концентраія мікробних клітин, КУО/см3	Штами Pasteurella multocida
	Життєздатність, млрд мікр. кл./см3
	Рік	216	217	796	877	1231
До ліофілізації	1995	1,80 ± 0,03	1,00 ± 0,02	1,10 ± 0,07	1,82 ± 0,07	1,40 ± 0,07
	2005	1,81 ± 0,09*	1,10 ± 0,05*	1,12 ± 0,05*	1,80 ± 0,10*	1,41± 0,03*
Ліофілізованих культур	1995	1,26 ± 0,07	0,70 ± 0,01	0,77 ± 0,03	1,26 ± 0,03	1,00 ± 0,03
	2005	1,44 ± 0,05*	0,80 ± 0,02*	0,88 ± 0,04*	1,44 ± 0,07*	1,13± 0,05*
Відновлених на МПБ, Хотінгера	1995	1,60 ± 0,08	0,90 ± 0,03	0,90 ± 0,05	1,62 ± 0,08	1,25 ± 0,06
	2005	1,62 ± 0,08*	0,92 ± 0,02*	0,99 ± 0,03*	1,61 ± 0,06*	1,27 ± 0,05*
Відновлених на PL-5	1995	1,78 ± 0,09	1,00 ± 0,01	1,00 ± 0,03	1,80 ± 0,06	1,40 ± 0,04
	2005	1,80 ± 0,10*	1,00 ± 0,02*	1,10 ± 0,04*	1,82 ± 0,08*	1,43 ± 0,05*

Примітка: * -- вірогідно по відношенню до значень показника у 1995 р. (при Р?0,05).

Результати проведених досліджень показали, що середній показник КУО/см3 для 19 штамів P. multocida до ліофілізації у 2005 р. становив 1,3Ч109, після ліофілізації -- 1,1Ч109; у культур, ліофілізованих у 1995 р., до ліофілізації -- 1,32Ч109, після ліофілізації -- 0,98Ч109. Різниця кількості життєздатних бактерій між цими групами культур не перевищує 10 %: культури, ліофілізовані у 2005 р., втратили до 20 % життєздатних клітин, у 1995 р. -- до 30 %. Тобто, за 10 років зберігання культури втратили 8,3-9,4 % життєздатних клітин.

Після 3_х відновлювальних пасажів культур, ліофілізованих у 1995 та 2005 рр. на середовищах МПБ і Хотінгера, накопичення бактеріальної маси відбувалося дещо інтенсивніше, кількість КУО/см3 збільшилась на 20 % (1995 р.) та 10 % (2005 р.) порівняно з аналогічними показниками ліофілізованих культур, але не набула вихідних показників.

Концентрація КУО/см3 у ліофілізованих культур (1995 р., 2005 р.), що відновлювались на збагачених поживних середовищах PL-5 (3_й пасаж), набула того ж рівня, що і до ліофілізації. Отже, застосування поживних середовищ PL_5 дало можливість відновити культурально-морфологічні властивості ліофілізованих штамів P. multocida та запобігти їх дисоціації.

Біохімічні властивості штамів P. тultocida. За паспортними даними штами повинні ферментувати з утворенням кислоти без газу глюкозу, маніт, сорбіт, цукрозу, не ферментувати лактозу і дульцит, відновлювати нітрати в нітрити, не утворювати сірководень. Проведені дослідження показали, що деякі штами при відповідних умовах культивування (після відновлювальних пасажів на середовищах PL-5 або через організм сприйнятливих лабораторних тварин) здатні утилізувати рамнозу, манозу, ксилозу, інозит і дульцит. У результаті дослідження ліофілізованих у 1995 і 2005 рр. культур було встановлено, що ліофілізація пригнічує функціонування ферментних систем пастерел, що проявляється в зниженні рівня ферментації на 50-75 % (на 2-3 хрести) глюкози, маніту, сорбіту, цукрози, тобто тих сахарів, які штами P. multocida утилізують впродовж перших 18-48 годин культивування; втраті здатності розкладати рамнозу, манозу, інозит, дульцит, ксилозу, які утилізуються через 48-72 годин культивування штамів. Розбіжність інтенсивності біохімічної реакції між штамами, ліофілізованими у 1995 та 2005 рр., була виявлена за окремими показниками і не перевищувала 25 % (один хрест). Після 3_х відновлювальних пасажів на середовищах МПБ та Хотінгера ліофілізовані у 1995 та 2005 рр. культури розкладали глюкозу, маніт, сорбіт і цукрозу інтенсивніше на 12,5-25,0 % (один хрест), ніж ліофілізовані культури, що не відновлювалися, але порівняно з вихідними показниками до ліофілізації рівень ферментативної активності культур був досить низьким і становив 25-50 % (1-2 хрести), що вдвічі нижче, ніж до ліофілізації. Здатність утилізувати рамнозу, манозу, інозит, дульцит і ксилозу культури не відновили. Ліофілізовані культури (1995 р., 2005 р.), що відновлювалися на збагачених середовищах PL-5 (3_й пасаж), ферментували глюкозу, маніт, сорбіт, цукрозу, рамнозу, манозу, інозіт, дульцит і ксилозу на тому ж рівні і в ті ж терміни, що і до ліофілізації.

Патогенні властивості штамів P. multocida. У результаті проведених досліджень за ступенем вірулентності для білих мишей штами P. multocida, патогенні для ВРХ, ДРХ та свиней, можна умовно поділити на 4 групи:

- високопатогенні штами №№ 116, 216 -- LD50 для білих мишей становила 0,18 та 0,42Ч104 мікр. кл. відповідно; загибель тварин спостерігали впродовж 3,5 годин після зараження;

- штами №№ 656, 877, Д, СМ -- LD50 становила 0,31-0,63Ч105 мікр. кл.; заражені миші загинули через 18-20 годин;

- штами №№ 796, Ф, 1231 -- LD50 становила 0,45Ч106-0,5Ч108 мікр. кл.; тварини гинули впродовж 24-52 годин;

- LD50 штаму № 217 становила 1,0Ч108 мікр. кл., тварини загинули через
96-120 годин; LD50 культури, ліофілізованої у 2005 р. -- 0,95Ч108 мікр. кл.

Штами P. multocida, патогенні для сільськогосподарської птиці, мали наступні показники вірулентності:

- LD50 штамів №№ D-71, 1718, 606, 1931 становила 0,16-0,5Ч105 мікр. кл., тварини загинули впродовж 24 годин;

- LD50 штамів №№ 115, 2-А, 396, D-90, D-1 становила 0,26-0,75Ч106 мікр. кл., тварини загинули через 96 годин після зараження.

Патогенність ліофілізованих культур P. multocida зменшувалась, що проявлялось у збільшенні показників LD50 у середньому на 3 lg. Зараження штамами №№ 217, 796, 1231 у дозах 0,5Ч109 мікр. кл. не викликало загибелі білих мишей. Показники LD50 ліофілізованих культур, що зберігалися 10 років, нижчі на 2,5-7,0 %, а в середньому на 4,63 %, по відношенню до аналогічних показників у штамів, ліофілізованих у 2005 р. Ліофілізовані у 1995 та 2005 рр. та відновлені на середовищах МПБ, Хотінгера культури виявилися більш патогенними, ніж ліофілізовані культури, що не відновлювалися, але у порівнянні з вихідними показниками до ліофілізації рівень патогенності культур був досить низьким. Вірулентність штамів №№ 217, 796, 1231 не відновилася. Ліофілізовані культури (1995 р., 2005 р.), що відновлювалися на середовищах PL-5, проявляли вихідний рівень патогенності.

Культурально-морфологічні властивості виробничих штамів Salmonella. Досліджували виробничі штами Salmonella cholerae suis № 370, Salmonella typhimurium № 371, Salmonella dublin № 373. За морфологією це грамнегативні палички, рухомі, із закругленими кінцями. Іноді, а в мазках з ліофілізованих культур -- досить часто, зустрічаються бактерії у вигляді стрептококо- чи кокоподібної, овальної форми, розміром 2-4Ч0,5-0,8 мкм.

У результаті проведених досліджень було встановлено, що концентрація життєздатних мікробних клітин (КУО/см3) перед ліофілізацією (1996 р., 2006 р.) для штаму № 370 становила 2,35-2,33Ч109, для штаму № 371 -- 3,89-3,90Ч109, для штаму № 373 -- 3,89-3,90Ч109 мікр. кл.

Визначення КУО/см3 у культур після ліофілізації (1996 р., 2006 р.) показало, що для штаму № 370 цей показник становив 1,85-1,84Ч109, для штаму № 371 -- 3,08-3,10Ч109, для штаму № 373 -- 3,12-3,10Ч109 мікр. кл. Тобто, безпосередньо при ліофілізації культури втратили близько 20 % життєздатних мікробних клітин.

Перевірка показника КУО/см3 у культур (1996 р.), що зберігалися в ліофільному стані 10 років, дала наступні результати: для штаму № 370 цей показник становив 1,6Ч109, для штаму № 371 -- 2,74Ч109, для штаму № 373 -- 2,73Ч109 мікр. кл. Тобто, культури в процесі ліофілізації та зберігання впродовж 10 років втратили близько 30 % життєздатних мікробних клітин. Відновлені після ліофілізації на середовищах МПБ, Хотінгера штами сальмонел мали наступні показники: для штаму № 370 -- 1,90-1,99Ч109, для штаму № 371 -- 3,2-3,3Ч109, для штаму № 373 -- 3,28-3,32Ч109 мікр. кл.; концентрація мікроорганізмів у добових бульйонних культурах підвищилась у середньому на 5 % по відношенню до ліофілізованих культур, але не набула вихідних показників. Після відновлення на середовищах SC-5 культур 1996 та 2006 рр. ліофілізації показники КУО/см3 для штаму № 370 становили 2,35-2,37Ч109, для штаму № 371 -- 3,85-3,90Ч109 , для штаму № 373 -- 3,9Ч109 мікр. кл.; у даному випадку культури повністю відновили здатність до накопичення бактеріальної маси. Цей показник майже зрівнявся у культур, ліофілізованих у 1996 та 2006 рр.

На твердих поживних середовищах до ліофілізації добові культури утворювали колонії S-форми від 1-2 (S. cholerae suis № 370) до 2-5 мм (S. typhimurium № 371, S. dublin № 373) у діаметрі, прозорі, ніжні, сіруватого кольору. Ліофілізовані культури утворювали дрібні (до 1 мм) колонії. Культури, відновлені на середовищах МПБ та Хотінгера, утворювали колонії розміром 0,5-2,0 мм у діаметрі; у відновлених на SC-5 середовищах культур колонії досягали тих же розмірів, що і до ліофілізації.

Визначення біохімічних властивостей показало, що штами типові для виду за біохімічними ознаками. Рівень ферментативної активності ліофілізованих культур був досить низьким -- інтенсивність біохімічної реакції після 24 годин культивування становила 25-50 % від вихідного рівня (1-2 хрести); штами №№ 371, 373 не утворювали сірководню. У відновлених на середовищах МПБ, Хотінгера штамів інтенсивність біохімічної реакції становила 50-75 % від вихідного рівня (2-3 хрести), штами №№ 371, 373 сірководень утворювали досить слабо, із затримкою у 12-24 годин. Після культивування на SC-5 середовищах ці штами повністю відновили рівень ферментативної активності: інтенсивність біохімічних реакцій проходила на тому ж рівні і в той же термін, що і до ліофілізації й становила 3-4 хрести після 24 годин культивування. Розбіжність між інтенсивністю біохімічних реакцій культур, ліофілізованих у 1996 та 2006 рр., була виявлена за окремими показниками і не перевищувала 25 % (1 хрест).

Антигенна структура досліджених штамів відповідала серотипу (за Кауфманом-Уайтом): S. cholerae suis № 370 -- 6,7:c:1,5; S. typhimurium № 371 -- 1,4,(5),12:i:1,5; S. dublin № 373 -- 1,9,12,(Vi):g,p:-. До ліофілізації штами мали високу ступінь аглютинації: титри реакції аглютинації (РА) з відповідними сироватками були максимальними і становили 4 (іноді 3) хрести. Ліофілізовані культури 1996 та 2006 рр., що не відновлювалися, аглютинувались О-комплексними і Н_монорецепторними сироватками на 1-2 хрести; титри РА у штамів, ліофілізованих у 2006 р., за деякими рецепторами були вищими, ніж у штамів, ліофілізованих у 1996 р., але не вище, ніж на один хрест. Культивування на середовищах МПБ, Хотінгера не суттєво вплинуло на аглютинуючу здатність штамів: титри РА у культур за деякими рецепторами були вищими на один хрест, ніж у ліофлізованих культур. Після культивування на середовищах SС-5 аглютинуюча активність штамів 1996 та 2006 рр. ліофілізації відновилась, титри РА становили 4 (іноді 3) хрести.

Вірулентність (LD50) для білих мишей штамів, які підлягали ліофілізації (1995 р., 2005 р.), становила: для штаму № 370 -- 1,0Ч108 мікр. кл., для штаму № 371 -- 1,0Ч108 мікр. кл., для штаму № 373 -- 2,0Ч108 мікр. кл. Ці значення відповідали паспортним характеристикам штамів. Внутрішньочеревне введення ліофілізованих культур у дозах 5Ч108 мікр. кл. не викликало загибелі лабораторних тварин. Уведення відновлених на середовищах МПБ, Хотінгера культур у дозах 5Ч108 мікр. кл. також не викликало загибелі тварин. Ліофілізовані культури (1995 р., 2005 р.) після культивування на середовищах SC-5 відновлювали патогенні властивості для лабораторних тварин у тих же дозах і в той же термін, що і до ліофілізації.

Роблячи підсумок викладених у цьому розділі досліджень необхідно зазначити, що в процесі ліофілізації культури досліджених штамів втрачали близько 20 % життєздатних мікробних клітин; при довгостроковому зберіганні впродовж 10 років -- близько 10 %. Ліофілізація пригнічує біохімічну та аглютинуючу активності, вірулентність штамів бактерій. У той же час рівень життєздатності та активності бактерій у значній мірі залежить від оптимізованої системи підтримання штамів мікроорганізмів. Підтримання штамів мікроорганізмів у високоактивному стані сприяє забезпеченню якості виготовлених з них засобів специфічної терапії та профілактики інфекційних хвороб тварин. Проте важливе значення має і антигенний склад виготовлених біопрепаратів, що й стало підставою для наших подальших досліджень.

Вивчення біологічних властивостей епізоотичних штамів сальмонел і відбір виробничих штамів. У результаті проведеного нами епізоотичного моніторингу встановлено, що в Україні з 1997 по 2007 рр. найчастіше виділяли S. pullorum -- 39 %, S. gallinarum -- 22 %, S. cholerae suis -- 12 %, S. typhimurium -- 10 %, S. dublin -- 7 %, S. enteritidis -- 6 %, S. typhi suis -- 2 %. Порівнявши дані щодо виділення серотипів сальмонел і переліку набору штамів у специфічних препаратах проти сальмонельозу, ми зробили висновок, що нові вакцинні препарати необхідно створювати з урахуванням циркуляції серотипів сальмонел у регіонах України. З цією метою ми вивчали 21 епізоотичну культуру, виділену в господарствах України з патологічного матеріалу від сільськогосподарських тварин.

За культурально-морфологічними ознаками культури були типові, у культур №№ 250 і 255 були виявлені ознаки дисоціації. Нестабільні штами не придатні для використання у виробництві біопрепаратів, тому ці культури були визнані як неперспективні. В інших культур після ліофілізації також спостерігалась дисоціація (до 5 % колоній R-форми), що взагалі характерно для епізоотичних культур. Для звільнення культур від дисоціюючих форм використовували метод Дрігальського та збагачені середовища SC-5. За біохімічними ознаками культури були типові для роду, інтенсивно ферментували середовища з вуглеводами та спиртами, що супроводжувалось посиленим газовиділенням.

Визначення антигенної структури досліджених штамів (табл. 2) показало, що за О-антигеном 7 культур належали до серогрупи С1 (5 -- S. cholerae suis, 1 -- S. cholerae suis var. Kunzendorf, 1 -- S. typhi suis), 5 до серогрупи В (S. typhimurium), 9 -- до серогрупи Д1 (S. dublin -- 2, S. enteritidis -- 4, і по одній культурі -- S. gallinarum, S. pullorum, S. seremban).

Таблиця 2 Визначення антигенної структури епізоотичних культур сальмонел (n = 5)

Штами	Аглютинуються сироватками О-комплексними	Ступінь аглютинації	Містять О-антиген	Серогрупа	Соматичний О-антиген	Джгутиковий Н-антиген
						Фаза 1	Фаза 2
S. cholerae suis 62	1 i 3	++++	O 7	C1	6,7	с +++	1,2,5,6 +++
S. cholerae suis 58	1 i 3	+++	O 7	C1	6,7	с +++	-
S. cholerae suis 250	1 i 3	++	O 7	C1	6,7	c +++	1,2,5,6++; 5 ++
S. cholerae suis 7	1 i 3	+++	O 7	C1	6,7	c +++	-
S. cholerae suis «Г»	1 i 3	++++	O 7	C1	6,7	c +++	-
S. cholerae suis var. Kunzendorf 19	1 i 3	++	O 7	C1	6,7	-	-
S. typhi suis 1	1 i 3	++++	O 7	C1	6,7	с +++	1,2,5,6 ++
S. typhimurium 632	1 i 2	++++	O 4	B	1,4,(5),12	-	1,2,5,6++++; 2 ++++; 5 ++++
S. cholerae suis 255	1 i 2	++	O 4	B	1,4,(5),12	-	2 ++; 5 ++
S. typhimurium «Б»	1 i 2	++++	O 4	B	1,4,(5),12	-	1,2,5,6++++; 2 ++++; 5 ++++
S. typhimurium 4	1 i 2	++++	O 4	B	1,4,(5),12	і ++++	1,2,5,6 +++; 2 ++++; 5 +++
S. typhimurium 9	1 i 2	++++	O 4	B	1,4,(5),12	i +	1,2,5,6 +; 2 ++++
S. dublin 8	1 і 5	++++	О 9	D1	1,9,12,(Vi)	g ++++; p ++++	-
S. dublin 9	1 і 5	++++	О 9	D1	1,9,12,(Vi)	g ++; p ++	-
S. enteritidis 10	1 і 5	++++	O 9	D1	1,9,12	g ++++; m ++++	1,2,5,6 ++++
S. enteritidis 5	1 і 5	++++	O 9	D1	1,9,12	g ++++; m ++++	1,2,5,6 ++++
S. enteritidis 6	1 і 5	++++	O 9	D1	1,9,12	g ++++; m ++++	1,2,5,6 ++++
S. enteritidis «Ч»	1 i 5	++++	O 9	D1	1,9,12	g++++; m++++	-
S. seremban 251	1 i 5	++++	O 9	D1	1,9,12	-	1,2,5,6 +; 6 ++; 5 ++
S. gallinarum 265	1 i 5	++++	O 9	D1	1,9,12	-	-
S. pullorum 3	1 i 5	+++	O 9	D1	1,9,12	-	-

Антигенна структура деяких культур дещо відрізнялась за Н-антигеном від класичної, наведеної у схемі Кауфмана-Уайта, що проявлялося відсутністю окремих з рецепторів 1-ї чи 2-ї фаз. У культур S. typhimurium №№ 632, 255, «Б» був відсутній рецептор с 1-ї фази Н-антигену; у культур S. cholerae suis №№ 58, 7, «Г», S. typhimurium №№ 255, 9, S. enteritidis «Ч» спостерігалась відсутність одного або декількох рецепторів 2-ї неспецифічної фази Н-антигену. У літературі описані випадки зміни антигенного складу у сальмонел під впливом зовнішніх факторів (Зарицкий А. М, 1988; Соколова Н. А., 2000). Як правило, виробничі штами відбирають серед штамів з повним стабільним антигенним складом (тобто не здатних до реверсії) та високим ступенем аглютинації. Виходячи з цього, для подальших досліджень були відібрані штами S. typhimurium № 4, S. dublin № 8, S. cholerae suis № 62, S. enteritidis № 10 і S. typhi suis № 1. У зазначених культур визначали вірулентність (LD 50) та імуногенність (ІD50).

Штами мали наступні показники LD50 і ID50: S. cholerae suis № 370 --102 та 0,45 млн мікр. кл. відповідно, S. cholerae suis № 62 -- 17 та 0,12 млн мікр. кл. відповідно; S. typhimurium № 371 -- 101 та 0,64 млн мікр. кл. відповідно, S. typhimurium № 4 -- 15 та 0,18 млн мікр. кл. відповідно; S. dublin № 373 -- 200 та 0,75 млн мікр. кл. відповідно, S. dublin № 8 -- 27 та 0,2 млн мікр. кл. відповідно; S. typhi suis № 1 -- 21 та 0,17 млн мікр. кл. відповідно; S. еnteritidis № 10 -- 8 і 0,15 млн мікр. кл. відповідно.

Отже, за результатами вивчення біологічних властивостей було встановлено, що епізоотичні штами більш вірулентні та імуногенні, ніж виробничі. Узагальнюючи результати проведених досліджень необхідно зазначити, що біологічні властивості епізоотичних штамів-кандидатів у виробничі, необхідно визначати комплексно, враховуючи рівень біологічної активності та стабільність біологічних властивостей штаму. У свою чергу стабільність штаму повинні забезпечувати умови зберігання та культивування.

Вивчення біологічних властивостей промислово перспективних штамів лістерій. В останні роки серед обов'язкових досліджень харчових продуктів тваринного походження, що регламентовані міжнародними вимогами, є виявлення збудників токсикоінфекцій, зокрема лістерій. Це обумовило подальші дослідження, спрямовані на вивчення біологічних властивостей та депонування штамів бактерій роду Listeria з метою використання їх як тест-культур для контролю якості поживних середовищ та внутрішньовидової диференціації збудника. До надходження у НЦШМ штами тривалий час зберігались на напіврідкому агарі, що негативно вплинуло на їх біологічні властивості: мікроорганізми втратили здатність вегетувати на середовищах МПБ, Хотінгера, Мартена. У зв'язку з цим, одним із наших завдань було розробити середовище з високими ростовими властивостями для культивування лістерій, стандартне та доступне за вартістю. ліофілізований штам пастерельоз сальмонела

Поживне середовище для культивування бактерій роду Listeria (патент на корисну модель № 29973) має постійний амінокислотний склад, який обумовлює швидкий і стабільний ріст бактерій, відновлення рівня біологічної активності ліофілізованих культур. Панкреатичний гідролізат кільки, який використовується як поживна основа, є продуктом глибокого розщеплення білків із вмістом широкого спектру амінокислот; вміст амінного азоту в даному поживному середовищі доповнює панкреатичний гідролізат казеїну та м'ясо-пептонний бульйон. Унесення гідролізату дріжджів сприяє інтенсивному росту лістерій, тому що він є джерелом вітамінів групи В. При порівнянні ростових властивостей запропонованого нами середовища з аналогами встановлено, що воно майже у 2 рази ефективніше, ніж МПБ, в 1,9 -- ніж бульйон Мартена, в 1,3 раза -- ніж бульйон Хотінгера.

В подальшому вивчали біологічні властивості бактерій роду Listeria, що надійшли на депонування. За морфологією культури були типові для роду. У результаті проведених досліджень було встановлено, що у культур, які підготовлені до ліофілізації, концентрація життєздатних мікробних клітин становила в середньому 1,0-1,1Ч109 мікр. кл. (табл. 3). Кількість КУО/см3 ліофілізованих культур становила 0,75-0,8Ч109 мікр. кл., тобто безпосередньо від ліофілізації культури втратили від 20 до 30 % життєздатних мікробних клітин. Кількість КУО/см3 у відновлених на МПБ ліофілізованих культур становила 0,77-0,85Ч109 мікр. кл. і підвищилася в середньому на 4,3 % по відношенню до ліофілізованих культур, але не набула вихідних показників.

Таблиця 3 Визначення накопичення біомаси бактерій роду Listeria на різних поживних середовищах, КУО/см3 (M±m, n=5)

КУО/см3	Штами
	Життєздатність, млрд мікр. кл./см3
	L. monocitogenes	L. innocua	L. ivanovii
	3A	4B	5105	93U017	92U002	92U005	92U004
До ліофілізації	1,00±0,05	1,05±0,1	1,10±0,03	1,00±0,05	1,05±0,02	1,00±0,1	1,10±0,03
Ліофілізовані культури	0,75 ±0,03*	0,80 ±0,05*	0,80 ±0,05*	0,77 ±0,1*	0,80 ±0,05*	0,80 ±0,02*	0,78 ±0,05*
Відновлені на МПБ	0,77 ±0,03*	0,83 ±0,05*	0,83 ±0,05*	0,80 ±0,1*	0,83 ±0,05*	0,85 ±0,02*	0,80 ±0,05*
Відновлені на Хотінгера	0,80 ±0,03*	0,85 ±0,05*	0,86 ±0,05*	0,85 ±0,1*	0,85 ±0,05*	0,87 ±0,02*	0,83 ±0,05*
Відновлені на ПС № 29973	1,10 ±0,05*	1,15 ±0,01*	1,17 ±0,03*	1,20 ±0,05*	1,13 ±0,02*	1,10 ±0,1*	1,14 ±0,03*

Примітка: * -- вірогідно по відношенню до значень показника до ліофілізації (при Р?0,05).

У відновлених на середовищах Хотінгера культур кількість КУО/см3 коливалася в межах 0,8-0,87Ч109 мікр. кл. і підвищилась у середньому на 7,2 % по відношенню до ліофілізованих культур, що не відновлювалися, але не набула вихідних показників. Після відновлення на середовищі № 29973 кількість КУО/см3 для штамів лістерій становила 1,1-1,2Ч109 мікр. кл.; ліофілізовані культури повністю відновили здатність до накопичення бактеріальної маси; на твердих середовищах (МПА, агар Хотінгера) добові культури лістерій утворювали типові для виду колонії S-форми, діаметром до 1 мм.

Біохімічні властивості лістерій визначали за допомогою систем API-LISTERIA-TEST. Тестування культур проводили до ліофілізації та після відновлення ліофілізованих культур на середовищах МПБ, Хотінгера, середовищі № 29973, збагачених сироваткою крові та глюкозою. Досліджені до ліофілізації культури позитивно реагували у специфічних для кожного серотипу тестах. Ліофілізовані та відновлені на збагачених середовищах МПБ, Хотінгера штами Listeria monocytogenes №№ 3А, 93U017 втратили здатність давати позитивну реакцію з Д-арабіталом та у в-гемолітичному тесті; штам L. ivanovii 92U004 негативно реагував у тестах із ксилозою та в-гемолізу. Відновлені на збагаченому середовищі № 29973 культури позитивно реагували у специфічних для кожного штаму тестах систем АРІ-Listeria.

Результати визначення гемолітичної активності штамів лістерій відображені в таблиці 4.

Таблиця 4 Результати дослідження гемолітичних властивостей штамів Listeria на кров'яному агарі і в САМР-тесті (n=5)

Штами	Гемолітична активність штамів лістерій
	До ліофілізації	Після ліофілізації та культивування на
		МПБ, Хотінгера	середовищі № 29973
	1	2	3	1	2	3	1	2	3
L. monocytogenes 3A	+	+	-	-	-	-	+	+	-
L. monocytogenes 4B	+	+	-	+	+	-	+	+	-
L. monocytogenes 5105	+	+	-	+	+	-	+	+	-
L. monocytogenes 93U017	+	+	-	-	-	-	+	+	-
L. monocytogenes 93U002	+	+	-	+	+	-	+	+	-
L. innocua 92U005	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L. ivanovi 92U004	+	-	+	-	-	-	+	-	+

Примітки: 1 -- ріст на кров'яному агарі; 2 -- в САМР-тесті навколо культури Staphylococcus aureus; 3 -- в САМР-тесті навколо культури Rodococcus equi.

Досліджені до ліофілізації, після ліофілізації та відновлення на збагаченому середовищі № 29973 штами мали наступні властивості: на кров'яному агарі добові культури L. monocytogenes №№ 3А, 4В, 5105, 93U017, 92U002 утворювали типові для виду колонії S-форми, оточені вузькою зоною в-гемолізу; культура L. ivanovii № 92U004 утворювала колонії S-форми, оточені широкою зоною в-гемолізу; культура L. innocua № 92U005 утворювала колонії S-форми, а зона в-гемолізу навколо колоній була відсутня. У САМР-тесті штами L. monocytogenes №№ 3А, 4В, 5105, 93U017, 92U002 утворювали невелике розширення зони гемолізу (до 2 мм) біля штриха S. аureus (позитивний САМР-тест); спостерігалась відсутність змін зони гемолізу поруч зі штрихом R. еqui (негативний САМР-тест). Штам L. ivanovii № 92U004 утворював «стрілкоподібне» розширення (до 5-10 мм) зони в-гемолізу біля штриху R. еqui. Культура L. innocua негативно реагувала в САМР-тесті. Необхідно зазначити, що відновлені після ліофілізації на збагачених середовищах МПБ і Хотінгера штами L. monocytogenes №№ 3А, 93U017, L. ivanovii № 92U004 не проявляли гемолітичної активності; в той же час культури, відновлені на збагаченому середовищі № 29973, були гемолітично активними.

Результати проведених досліджень підтверджують те, що якість штамів мікроорганізмів, які підтримуються в умовах депозитарію, залежить від комплексу застосованих методів та умов зберігання і культивування.

Визначення чутливості бактерій до антибактеріальних засобів. Подальшим етапом наших досліджень було вивчення спектру антибіотикорезистентності досліджених штамів. Дані стосовно спектру антибіотикорезистентності кожного штаму нами використано як одну з характеристик умов зберігання та біологічної активності об'єкту. Нами визначено чутливість штамів до антибактеріальних засобів таких фармакологічних груп: пеніцилінів, цефалоспоринів, глікопептидів; аміноглікозидів, тетрациклінів, левоміцетину, макролідів, лінкозамідів; фторхінолонів, ріфампіцину; нітрофуранів, азолів та полієнових антибіотиків. На підставі отриманих результатів було побудовано антибіотикограми.

У результаті проведених досліджень групової чутливості штамів нами встановлено, що до інгібіторів синтезу клітинної стінки цефалоспоринів грампозитивні бактерії роду Listeria виявилися більш резистентними, ніж грамнегативні бактерії родів Pasteurella і Salmonella. До інгібіторів синтезу білка аміноглікозидів найбільш чутливими були бактерії роду Listeria. До фторхінолонів -- інгібіторів транскрипції і синтезу нуклеїнових кислот найбільш чутливими були бактерії роду Pasteurella. Усі досліджені групи бактерій проявляли вибіркову чутливість до цефалоспоринів і аміноглікозидів, у позитивних випадках штами були чутливими та високочутливими. До фторхінолонів досліджені штами виявилися чутливими та високочутливими.

У подальшому ми визначали чутливість до зазначених вище груп препаратів штамів Pasteurella multocida у межах серогрупи (В). Штами №№ 217, СМ проявляли надчутливість до дії антибіотиків: навколо дисків з антибактеріальними засобами (53) спостерігалась 100 % інгібіція, тобто повна відсутність росту нашарованої культури. У порівнянні зі штамами №№ 656, 877, 116, 216, F, D даної серогрупи штами №№ 217, СМ утворювали дрібні колонії, мали найбільш низький рівень ферментативної активності та вірулентності. Тобто, у даному випадку спостерігалась пряма залежність між рівнем антибіотикорезистентності та іншими показниками біологічної активності штамів у межах серогрупи.

Штам № 796 (рис. 1) за культурально-морфологічними, біохімічними та патогенними ознаками виявився подібним до штамів №№ 217, СМ; у той же час він проявляв найвищу резистентність до антибіотиків серед штамів серогрупи В.

Рис. Рівень резистентності до антибіотиків штамів P. multocida №№ 796, ...