Удосконалення системи культивування, зберігання та параметрів контролювання виробничих штамів (Pasteurella, Salmonella, Listeria)

1 -- до ліофілізації; 2 -- ліофілізованої культури; 3 -- відновленої на МПБ, Хотінгера; 4 -- відновленої на PL-5.

Культивування ліофілізованих бактерій родів Pasteurella, Salmonella, Listerіa на середовищах Хотінгера не забезпечує повного відновлення резистентності штамів до антибактеріальних засобів; культивування ліофілізованих бактерій зазначених вище родів на запропонованих нами збагачених середовищах (PL-5, SC-5, № 29973) забезпечує відновлення резистентності штамів до антибіотиків.

На закінчення зазначимо, що результати, отримані при проведенні досліджень щодо удосконалення способів підтримання виробничих штамів мікроорганізмів у високоактивному стані на основі вивчення їх біологічних властивостей, свідчать про актуальність даного напрямку досліджень у біотехнології.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації досліджено ефективність існуючої системи культивування, зберігання та параметрів контролювання виробничих штамів бактерій. На підставі вивчення літературних джерел, культурально-морфологічних, біохімічних, серологічних досліджень, вивчення антибіотикорезистентності, а також результатів біологічного експерименту на лабораторних тваринах теоретично й експериментально обґрунтовано: доцільність використання запропонованих засобів і підходів підтримання бактерій у стабільному стані, впровадження нової рецептури поживних середовищ для відновлення життєздатності бактерій, поетапне відновлення життєздатності ліофілізованих культур, використання нових показників біологічної активності штамів.

2. Вивчено вплив ліофілізації на апараті LP-3 за Р -- 4,5 МПа, температури заморожування матеріалу у морозильній камері -- мінус 73 °С, температурі рефрижератора в LP-3 -- мінус 45 °С, терміні висушування -- 20-24 години, з використанням стабілізуючого середовища Файбіча на штами Pasteurella, Salmonella, Listeria. Визначено, що в процесі ліофілізації штамів Pasteurella, Salmonella втрачається в середньому близько 20 %, Listeria -- 20-30 % життєздатних мікробних клітин; в епізоотичних штамів Salmonella з'являються дисоційовані форми (до 5 % R-форм). Рівень ферментативної активності штамів знижується на 50-75 %, LD50 штамів P. multocida, Salmonella підвищується в середньому на 3 lg, окремі штами L. monocytogenes, L. ivanovii втрачають гемолітичну активність. Чутливість штамів до антибактеріальних засобів підвищується в середньому на 25-75 %.

3. Визначено особливості довгострокового зберігання впродовж 10 років бактерій родів Pasteurella і Salmonella: концентрація життєздатних мікробних клітин зменшується в середньому на 10 %, рівень ферментативної активності -- на 12,5 %, вірулентність штамів P. multocida -- на 2,5-7,0 %.

4. Установлено, що застосування поживних середовищ МПБ, Хотінгера не забезпечує повного відновлення біологічних властивостей ліофілізованих штамів бактерій, а саме: кількість життєздатних мікробних клітин збільшується лише на 10 % відносно ліофілізованих культур, але не набуває вихідного рівня; ферментативна активність підвищується на 12,5-25,0 % відносно ліофілізованих культур, але не набуває вихідного рівня; штами P. multocida і Listeria не утилізують сахари у визначений термін. LD50 штамів P. multocida, Salmonella вища в середньому на 2 lg, ніж до ліофілізації; штами L. monocytogenes, L. ivanovii не відновили гемолітичну активність; чутливість до антибактеріальних засобів штамів бактерій була вищою на 20-65 %, ніж до ліофілізації.

5. Запропоновані нові системи культивування, що забезпечують можливість відновлення вихідних біологічних властивостей ліофілізованих культур та накопичення біомаси в 1,5 раза більше порівняно з культивуванням на МПБ: середовища МПБ, Хотінгера з вмістом сироватки крові (5 %) і глюкози (1 %) для культивування виробничих штамів P. multocida; середовища МПБ, Хотінгера зі вмістом глюкози (1 %), середовища 199 (2 %) та печінкової води за Розановим (5 %) для культивування виробничих штамів бактерій роду Salmonella.

6. Модифікація методу Дрігальського з використанням середовищ МПБ, Хотінгера зі вмістом глюкози (1 %), середовища 199 (2 %), печінкової води за Розановим (5 %) забезпечує звільнення від дисоціюючих форм ліофілізованих епізоотичних штамів Salmonella.

7. Розроблено пропис поживного середовища для культивування штамів Listeria (патент на корисну модель № 29973), використання якого забезпечує підвищення рівня накопичення біомаси в середньому в 1,94 раза порівняно з МПБ, в 1,86 раза -- з бульйоном Мартена і в 1,29 раза -- з бульйоном Хотінгера. Модифікація вказаного середовища зі вмістом сироватки крові (5 %) та глюкози (1 %) забезпечує відновлення культурально-морфологічних, біохімічних, гемолітичних властивостей, рівня резистентності ліофілізованих штамів до антибіотиків.

8. У результаті проведених досліджень епізоотичних культур роду Salmonella були відібрані штами №№ 1, 4, 8, 10, 62, які використані при розробці і виготовленні вакцини концентрованої інактивованої проти сальмонельозу тварин «Сальмосан». Під час досліджень визначено, що біологічні властивості епізоотичних штамів-кандидатів у виробничі необхідно вивчати комплексно, враховуючи рівень біологічної активності та стабільність біологічних властивостей штаму.

9. Вивчено біологічні властивості 7 штамів лістерій видів L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, які за своїми культурально-морфологічними, біохімічними, гемолітичними властивостями і чутливістю до антибактеріальних засобів відповідають вимогам щодо тест-культур і можуть бути використані з метою внутрішньовидової типізації виділених штамів лістерій у САМР-тесті та оцінці якості поживних середовищ для культивування лістерій.

10. Дані, отримані в результаті вивчення антибіотикорезистентності штамів, дали підстави включити цей тест до переліку параметрів контролювання рівня життєздатності і активності штамів.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

• Складені та затверджені паспорти нового зразка для виробничих штамів Pasteurella multocida №№ 216, 116, 217, 796, 656, 877, См, F, D, 1231, 396, 06, 2_А, 115, 1718, D-1, D-71, D-90, 1931, Salmonella cholerae suis № 370, Salmonella typhimurium № 371, Salmonella dublin № 373.

• Розроблені паспорти та проведено депонування штамів Listeria monocytogenes №№ 3А, 4В, 5105, 93U017, 92U002; Listeria ivanovii № 92U004; Listeria innocua № 92U005, Salmonella cholerae suis № 62, Salmonella typhimurium № 4, Salmonella dublin № 8, Salmonella typhi suis № 1; Salmonella enteritidis № 10.

• Укладено «Настанову з лабораторної діагностики пастерельозу тварин та птиці», затверджену науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України (протокол № 3 від 20.12.2006 р.).

• Розроблено «Мікробіологічне середовище для накопичення бактерій роду Listeria» (патент на корисну модель № 29973).

• Розроблено «Вакцину концентровану інактивовану проти сальмонельозу тварин «Сальмосан» (ТУ У 46.15.374-99), промислове виробництво якої було налагоджено у 1999 р.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Порівняльна характеристика вакцинних і епізоотичних штамів сальмонел / Л. Виговська, В. Прискока, О. Степанюк, М. Павленко [Текст] // Вет. медицина України. -- 1997. -- № 12. -- C. 18-19. (Здобувачем проведено моніторингові дослідження щодо виділення збудників сальмонельозу, аналіз літератури щодо ефективності вітчизняних протисальмонельозних вакцин, виконано та узагальнено частину експериментальних досліджень).

2. Вакцини і штами в системі профілактики захворювань молодняка сільськогосподарських тварин [Текст] / В. А. Прискока, Т. Г. Михальченко, І. В. Риженко, Л. М. Виговська, О. П. Степанюк // Наук. вісник Нац. аграр. ун-ту. -- К., 1998. -- Вип. 11 : Проблеми ветеринарної медицини. -- C. 142-144. (Здобувачем проведено частину експериментальних досліджень, підбір літературних джерел).

3. Виговська, Л. М. Підхід до профілактики сальмонельозу та колібактеріозу молодняка сільськогосподарських тварин та птиці [Текст] / Л. М. Виговська, Т. Г. Михальченко, О. П. Степанюк // Вісник Сумського держ. аграр. ун-ту. -- Суми, 1999. -- Вип. 4. -- C. 35-36. (Здобувачем проведено вивчення епізоотичної ситуації щодо сальмонельозу тварин в Україні, досліджено біологічні властивості виробничих та епізоотичних штамів сальмонел).

4. Порівняльна характеристика вакцинних і епізоотичних штамів сальмонел [Текст] / Л. М. Виговська, О. П. Степанюк, В. А. Прискока, О. О. Салганська // Аграрний вісник Причорномор'я : зб. наук. пр. -- Одеса, 1999. -- Вип. 2 (7) : Ветеринарні науки. -- C. 50-51. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, в узагальненні та оформленні матеріалів).

5. Выговская, Л. Н. Оценка эпизоотических штаммов сальмонелл с целью их отбора для создания инактивированных вакцин [Текст] / Л. Н. Выговская, Н. А. Пархоменко // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х., 2002. -- Вип. 80. -- C. 152-155. (Здобувач провела аналіз епізоотичної ситуації щодо сальмонельозу тварин в Україні, експериментальні дослідження, виконала підбір літературних джерел, брала участь у оформленні матеріалів).

6. Выговская, Л. Н. Реконструкция рецепторного аппарата у эпизоотических культур сальмонелл [Текст] // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х., 2002. -- Вип. 80. -- C. 149-152.

7. Ушкалов, В. О. Етіологічна структура сальмонельозу свиней в Україні та напрямки вдосконалення засобів специфічної профілактики сальмонельозу [Текст] / В. О. Ушкалов, Л. М. Давидовська // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х., 2006. -- Вип. 86. -- C. 354-358. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, в узагальненні та оформленні матеріалів).

8. Вивчення профілів антибіотикорезистентності виробничих штамів бактерій [Текст] / В. О. Ушкалов, В. С. Тиндик, Л. М. Давидовська, О. О. Салганська, М. Є. Романько // Наук.-техн. бюл. Ін-ту біології тварин ; ДНДКІ вет. препаратів та кормових добавок. -- 2007. -- Вип. 8, № 3, 4. -- C. 317-325. (Здобувачем визначено чутливість до антибактеріальних засобів виробничих штамів Pasteurella multocida i Listeria та узагальнено одержані результати).

9. Національний центр штамів мікроорганізмів ДНКІБШМ: стан і перспективи розвитку [Текст] / А. Головко, В. Ушкалов, Л. Акименко, Л. Давидовська // Вет. медицина України. -- 2007. -- № 2. -- C. 35-36. (Здобувач виконала підбір літературних джерел та приймала участь в оформленні матеріалів).

10. Робота зі штамами мікроорганізмів у ДНКІБШМ [Текст] / Л. Виговська, В. Ушкалов, Л. Акименко, О. Салганська, К. Семко // Вет. медицина України. -- 2007. -- № 12. -- С. 17-19. (Здобувач визначала показники біологічної активності виробничих штамів Pasteurella multocida, брала участь в узагальненні та оформленні матеріалів).

11. Виговська, Л. Сальмонельоз тварин та шляхи вдосконалення засобів специфічної профілактики [Текст] / Л. Виговська, В. Ушкалов, О. Салганська // Вет. медицина України. -- 2008. -- № 1. -- С. 10-12. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, в узагальненні та оформленні матеріалів).

12. Дослідження біологічних властивостей бактерій роду Salmonella при тривалому зберіганні у ліофільному стані [Текст] / В. О. Ушкалов, О. О. Салганська, Л. М. Виговська, В. О. Постоєнко // Вет. біотехнологія : бюл. -- К., 2008. -- № 12. -- С. 276-283. (Здобувач провела аналіз наукової літератури, виконала частину експериментальних досліджень, статистичну обробку отриманих даних, брала участь у оформленні статті та підготовці до друку).

13. Прискока, В. А. Варіанти змішаних інфекцій і їх дія на організм тварин [Текст] / В. А. Прискока, Л. М. Виговська, Т. Г. Михальченко // Проблемы и перспективы паразитоценологии : материалы V Межсъезд. конф. паразитоценологов Украины, Луганск, 29-30 окт. 1997 г. -- Х.; Луганск, 1997. -- C. 140. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, в узагальненні та оформленні матеріалів).

14. Виговська, Л. М. Особливості серотипізації штамів сальмонел, циркулюючих на Україні [Текст] / Л. М. Виговська, О. П. Степанюк, О. О. Салганська // Наукова спадщина Луї Пастера і ветеринарна медицина України (до 175-річчя від дня народження Луї Пастера) : наук. ст. конф., Рівне, 5-6 лют. 1998 р. -- Рівне, 1998. -- С. 19-20. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, узагальненні та оформленні матеріалів).

15. Пат. 29973 Україна, МПК (2006) C12N 1/00, C12N 1/20. Мікробіологічне середовище для накопичення бактерій роду Listeria / М. В. Бабкін, О. В. Прохорятова, Н. В. Калашник, В. О. Ушкалов, Л. М. Виговська, М. Є. Романько ; ННЦ «ІЕКВМ». -- № u 2007 06530 ; заявл. 11.06.2007 ; опубл. 11.02.2008, Бюл. № 3. -- 4 с.

АНОТАЦІЯ

Виговська Л. М. Удосконалення системи культивування, зберігання та параметрів контролювання виробничих штамів (Pasteurella, Salmonella, Listeria). -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 -- ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», Харків, 2008.

Дисертація присвячена визначенню ролі рівня біологічної активності виробничих штамів мікроорганізмів для використання їх у ветеринарній біотехнології, удосконаленню системи культивування, зберігання та параметрів контролювання виробничих штамів. Проведено вивчення біологічних властивостей виробничих штамів бактерій родів Pasteurella, Salmonella, Listeria, епізоотичних штамів бактерій роду Salmonella. Встановлено відповідність властивостей штамів до паспортних характеристик на основі вивчення індивідуальних біологічних властивостей кожного штаму за культурально-морфологічними, біохімічними, патогенними показниками, визначено чутливість до антибіотиків; розроблені оптимальні поживні середовища для їх культивування; визначено вплив ліофілізації та довгострокового зберігання на біологічні показники та активність культур.

Ключові слова: колекції, промислово перспективні, виробничі, епізоотичні штами мікроорганізмів, бактерії, ліофілізація, відновлення, збагачені середовища.

Выговская Л. М. Усовершенствование системы культивирования, хранения и параметров контроля производственных штаммов (Pasteurella, Salmonella, Listeria). -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 -- ветеринарная микробиология и вирусология. Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины», Харьков, 2008.

Диссертация посвящена определению роли уровня биологической активности производственных штаммов микроорганизмов при использовании их в ветеринарной биотехнологии, усовершенствованию системы культивирования, хранения и параметров контроля производственных штаммов микроорганизмов. Проведено изучение биологических свойств производственных штаммов бактерий родов Pasteurella, Salmonella, Listeria, эпизоотических штаммов бактерий рода Salmonella. Установлено соответствие свойств штаммов паспортным характеристикам на основе изучения индивидуальных биологических особенностей каждого штамма по культурально-морфологическим, биохимическим, патогенным показателям, определена индивидуальная и серогрупповая резистентность исследованных штаммов бактерий к антибиотикам разных фармакологических групп. Определено влияние лиофилизации на биологические свойства и активность культур. Установлено, что в процессе лиофилизации пастерелл и сальмонелл утрачивается в среднем 20 %, листерий -- 20-30 % жизнеспособных микробных клеток; у эпизоотических штаммов сальмонелл выявляются полиморфные формы (до 5 % R-форм). На 50-75 % снижается уровень ферментативной активности; снижается патогенность (вирулентность) штаммов: LD50 пастерелл и сальмонелл увеличивается в среднем на 3 lg; некоторые штаммы L. monocytogenes, L. ivanovii утрачивают гемолитическую активность. На 25-75 % повышается чувствительность штаммов к антибиотикам. Установлено, что в процессе хранения в течение 10 лет в лиофилизированном состоянии у бактерий родов Pasteurella и Salmonella концентрация жизнеспособных микробных клеток снижается в среднем на 10 %; уровень ферментативной активности -- на 12,5 %, вирулентность штаммов P. multocida -- на 2,5-7,0 %. Экспериментально определено, что применение традиционных питательных сред (МПБ, МПБ Хоттингера, Мартена) не обеспечивает полного восстановления биологических свойств лиофилизированных штаммов бактерий.

Разработаны оптимальные обогащенные среды для культивирования штаммов и восстановления исходного уровня их биологической активности после лиофилизации и длительного хранения в лиофилизированном состоянии. Установлено, что применение питательных сред МПБ, Хоттингера с содержанием сыворотки крови (5 %) и глюкозы (1 %) для культивирования производственных штаммов P. multocida, сред МПБ, Хоттингера с содержанием глюкозы (1 %), 199 среды (2 %) и печеночной воды (5 %) для культивирования производственных штаммов Salmonella даёт возможность восстановить исходные биологические свойства лиофилизированных культур. Применение метода Дригальского и указанных выше обогащенных сред для культивирования сальмонелл обеспечивает освобождение от диссоциирующих форм лиофилизированных культур. Для культивирования бактерий рода Listeria разработана питательная среда, применение которой обеспечивает повышение уровня накопления биомассы в среднем в 1,94 раза в сравнении с МПБ, в 1,86 раза -- с бульоном Мартена, в 1,29 раза -- с бульоном Хоттингера. Применение указанной среды с содержанием сыворотки крови (5 %) и глюкозы (1 %) обеспечивает восстановление культурально-морфологических, биохимических, гемолитических свойств, уровня резистентности к антибиотикам лиофилизированных штаммов. На основании проведенных исследований биологических свойств и способа поддержания бактерий рода Listeria серотипов monocytogenes, ivanovii, innocua разработаны паспорта и проведено депонирование штаммов, что даёт возможность использовать их в качестве тест-культур при оценке качества питательных сред и внутривидовой дифференциации возбудителя (САМР-тест).

При сравнительной характеристике биологических свойств эпизоотических и производственных штаммов сальмонелл установлено, что эпизоотические штаммы имеют более высокие показатели биологической активности (ферментативной, степени агглютинации, LD50, ID50, антибиотикорезистентности), чем производственные. Биологические свойства эпизоотических штаммов-кандидатов в производственные необходимо оценивать комплексно, учитывая при этом уровень биологической активности и стабильность биологических свойств штамма.

Результаты изучения резистентности исследованных штаммов к 53 антибиотикам разных фармакологических групп показали, что это високочувствительный метод, характеризующий уровень биологической активности популяции. Полученные результаты дают основание рекомендовать показатели антибиотикорезистентности как индивидуальные маркеры производственных штаммов бактерий.

Ключевые слова: коллекции, промышленно перспективные, производственные, эпизоотические штаммы микроорганизмов, бактерии, лиофилизация, восстановление, обогащённые среды.

Vygovska L. M. The improvement of system for cultivating, storage and parameters for control of production strains (Pasteurella, Salmonella, Listeria). -- Manuscript.

Dissertation on the competition of scientific degree of the candidate of veterinary sciences after speciality 16.00.03 -- veterinary microbiology and virology. National Scientific Center «Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine», Kharkiv, 2008.

The thesis is devoted to the determination of level role for the collection of production strains for the use of them in a veterinary biotechnology; development of methods for maintenance of collection cultures in the high-activity level. There were studied biological properties of bacteria from the genus of Pasteurella, Salmonella, Listeria, epizootic strains of Salmonella. Also for this strains there were determinated accordance of individual biological properties to the passports, such as cultural, morphological, biochemical, pathogenic, resistance to the antibiotics and influence of freeze drying and long storage (from different pharmacological groups). Optimal mediums for their storage and influence of freeze drying were determinated.

Key words: collection, industrially perspective, production, epizootic strains of microorganisms, bacteria, freeze drying, renewals, enriched mediums.

Размещено на Allbest.ru