Трихофітія великої рогатої худоби (етіологічна структура, діагностика, селекція штамів та розробка бівалентної вакцини)

Проведені досліди засвідчили, що починаючи з 2-3-ї діб для Trichophyton mentagrophytes і 5-7 діб для Trichophyton verrucosum спостерігали швидке формування міцелію й утворення мікроконідій. З 5 по 15 і з 10 по 20 доби відповідно спостерігали інтенсивне зростання спороношення, яке з 20 по 35 доби досягало найвищого рівня. Потім наставала стабілізація, і в подальшому кількість мікроконідій практично не збільшувалася. Зате помітні зміни спостерігали в їх життєздатності після ліофілізації. Вона значно різнилась у різні періоди розвитку культур вакцинних штамів. Життєздатність мікроконідій у фазі логарифмічного росту (5-10 доби) була нижчою - 36-78 %, ніж в період найбільшого спороутворення (15-25 доба), де вона досягала 91-96 %. Після 25 доби спостерігали її помітне зниження, і на 30 добу вона була в межах 87 %, на 35-79 %, на 40-73 % і на 50 добу - тільки 51 %. Різниця значень наведених показників вірогідна за Р < 0,001; * = 0,01 < P < 0,001 відносно значень відповідних показників до висушування. Це пов'язано з тим, що, незважаючи на збільшення накопичення біомаси культури гриба, іде процес старіння культури, яке, зокрема, виявляється в більш інтенсивній зміні кольору грибниці та появі на її поверхні ділянок росту вторинного міцелію, окремих хламідоспор. Отримані результати подані в таблиці 4.

Таблиця 4. Життєздатність мікроконідій після ліофілізації залежно від віку культури (%) (M±m; n=6)

З'ясувавши, що мікроконідії 15-25 добових культур Trichophyton verrucosum Кн-01 та Trichophyton mentagrophytes ТМЧ найбільш стійкі до висушування, ми визначали їхню оптимальну концентрацію в суспензії для ліофілізації. Кількість живих мікроконідій після сушки визначали шляхом підрахунку колонієутворюючих одиниць у 1 см ³ суспензії (табл. 5).

Наведені дані свідчать, що під час висушування краще зберігалися мікроконідії в концентрації 200-600 х 10⁶ в одному мілілітрі. За цих умов збереженість мікроконідій сягала 84-95 %. Зменшення вмісту мікроконідій у суспензії до 100 клітин знижувало їхню життєздатність (75-80 %). Збільшення концентрації до 700-800 х 10⁶ /см ³ мікроконідій призводило до часткової загибелі спор. Їхня кількість сягала відповідно 72-75 % і 57-60 %. Подальше збільшення концентрації спор у суспензії призводило до загибелі значної кількості спор - 50 % і більше. Різниця значень наведених показників вірогідна за Р < 0,001; * = 0,01 < P < 0,001 відносно значень відповідних показників до висушування.

Таблиця 5. Вплив концентрації мікроконідій в суспензії на їх життєздатність після ліофілізації (M±m; n=6)

На підставі одержаних даних визначено, що для виготовлення сухої, живої, бівалентної вакцини оптимальна концентрація мікроконідій у суспензії для сушки повинна бути в межах 200-600 х 10⁶ /см³. У цих межах життєздатність після висушування зберігали 84-95 % мікроконідій.

Розробка технології виготовлення живої концентрованої ліофілізованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби. Принципова схема виготовлення лабораторних зразків вакцини має такі етапи:

1. Підготовка поживного середовища й лабораторного посуду.

2. Роздільний висів вакцинних штамів та їх інкубація.

3. Роздільне знімання грибниці.

4. Роздільна гомогенізація грибної маси та її стандартизація.

5. Підготовка захисного середовища.

6. Об'єднання гомогенатів культур між собою та захисним середовищем.

7. Фасування вакцини.

8. Ліофілізація вакцини.

9. Укупорка та маркування.

10. Контролювання вакцини згідно з показниками ТУ У.

Використовуючи таку схему, ми виготовили 3 експериментальні серії вакцини для досліджень.

З цією метою, після перевірки біологічних властивостей, використовували селекціоновані високоспороносні штами Кн-01 і ТМЧ. Для цього культури трихофітонів засівали на матраци з твердим поживним середовищем ДНКІБШМ або сусло-агаром, використовуючи по 2 матраци на штам. Культури інкубували за 26±1 °С впродовж 18-21 доби за обов'язкового періодичного контролювання росту культур кожні 3-5 діб. На 21 добу, якщо ріст на матрацах був характерним для культур і контамінації бактеріальною чи грибковою мікрофлорою не спостерігали, асептично знімали верхній шар культури та переносили його в стерильну скляну банку. Кожну культуру знімали в окремий посуд. Потім зняту культуру переносили в стерильний міксер, додавали 300 см ³ стерильного розчину гіпохлориту натрію або фізіологічного розчину та гомогенізували. Гомогенізацію кожного штаму здійснювали окремо. Отриману суспензію фільтрували через ватно-марлевий фільтр у окрему тару. Отриманий гомогенат перевіряли на відсутність бактеріальної й грибкової контамінацій за загальноприйнятими методиками, а також визначали концентрацію мікроконідій у камері Горяєва. Впродовж 5 діб контамінації сторонньою мікрофлорою не було виявлено, спостерігався типовий ріст трихофітонів. Під час підрахунку концентрації мікроконідій у камері Горяєва встановлено, що вона сягала 188±20,3 х 10⁶/см^3.. Далі гомогенати асептично об'єднували в одну ємкість і розводили гіпохлоритом натрію з таким розрахунком, щоб після додавання захисного середовища концентрація мікроконідій у 1 см ³ була в межах 30-60 х 10^6.. Отриманий гомогенат за постійного перемішування фасували в стерильні флакони по 2 см³ і висушували.

Отриману вакцину перевіряли на відсутність бактеріальної й грибкової контамінацій, нешкідливість і концентрацію мікроконідій і живих мікроконідій та за іншими показниками згідно з вимогами НД. У результаті досліджень було встановлено, що вакцина була нешкідливою, не мала сторонньої контамінації, концентрація мікроконідій була 55,6±3,2 х 10⁶, а концентрація живих мікроконідій була 45,0±2,9 х 10⁶, розчинялась за 1,5±0,12 хвилин, масова частка вологи складала 2,7±0,19 %, концентрація водневих іонів - 6,9±0,33. Після отримання позитивних результатів контролю вакцину маркували й пакували. Вакцину зберігали за температури 4-8 °С до використання. За цією технологією виготовили 3 мікросерії вакцини. Препарат було названо "Триходерм".

З метою вивчення стабільності вакцини під час зберігання та впливу температури на життєздатність мікроконідій ми провели 6 дослідів. Упродовж 18 місяців вакцину зберігали за температури 6±2 °С та за 20±2 °С. У дослід узяли флакони трьох серій вакцини із залишковою вологою в середньому 2,6±0,1 %, укупорених під вакуумом. Вихідна життєздатність мікроконідій сягала в середньому 87,7±0,46 %.

У результаті здійснених досліджень установлено, що під час зберігання флаконів з вакциною за температури 6±2 °С відсоток живих мікроконідій у середньому по трьох серіях через 12 місяців становив 82±3,6 %, а через 18 місяців - 81±3,6 %. Зберігання вакцини за температури 20±2 °С призводило до зниження кількості живих мікроконідій через 12 місяців до 42±5,8 %, а через 18 місяців - до 37,5±5,9 %.

Визначення оптимальної імунізуючої дози вакцини для профілактики трихофітії. Досліди щодо визначення оптимальних профілактичних доз вакцини здійснювали на 42 кролях і 20 телятах. З кролів було сформовано 7 груп по 6 голів у кожній. Тварин шести перших груп щепили вакциною "Триходерм" у дозах від 1 до 60 х 10⁶ мікроконідій у 1 см³. Сьома група кролів відігравала роль інтактного контролю. Через 30 діб після другого щеплення провели визначення імуногенності шляхом нашкірного зараження всіх тварин контрольними штамами трихофітонів - С-102 і ТМЧ-К в дозі 2,5 х 10⁶ мікроконідій на 1 см² шкіри.

Установлено, що в тварин, щеплених у дозах 1, і 5 х 10⁶ мікроконідій у 1 см³, починаючи з 15 доби після контрольного зараження, з'явились ознаки захворювання на трихофітію. Кролі інших груп витримали контрольне зараження й не захворіли. У 2-й групі (доза 5 х 10⁶ мікроконідій у 1 см³) з клінічними проявами не захворів один кріль із шести, але під час культурального дослідження від нього була виділена культура контрольного штаму T. mentagrophytes. Культуру T. verrucosum від цієї тварини не виділили. Під час мікроскопічного дослідження захворювання також не підтвердилося. Контрольні кролі захворіли з проявами типової трихофітії після зараження обома контрольними штамами. Захворювання контрольних тварин, а також тварин 1-ї та 2-ї груп було підтверджене позитивними результатами мікроскопічного й культурального досліджень. Тривалість клінічного захворювання спостерігалась упродовж 38-50 діб.

У досліді на 24 телятах віком 1-3 місяці сформували 4 групи по 6 голів у кожній. Телят трьох груп імунізували експериментальною вакциною з концентрацією 5, 10 і 20 х 10⁶ мікроконідій у 1см³. Телятам четвертої групи вводили по 1 см³ фізіологічного розчину натрію хлориду. Щеплення робили двічі з інтервалом 12 діб. Через 30 діб після другого щеплення здійснювали нашкірне зараження телят контрольними штамами С-102 і ТМЧ-К. Спостереження проводили впродовж 60 діб після зараження. Результати досліджень наведені в таблиці 6.

Таблиця 6. Визначення профілактичної дози вакцини на телятах

Здійсненими дослідженнями встановлено, що на 15 добу після інфікування у трьох вакцинованих тварин першої групи з'явилися зміни шкіри, викликані T. mentagrophytes. Ще у трьох тварин на 17 день з'явилися зміни шкіри, спричинені T. verrucosum і T. mentagrophytes. Починаючи з 18 доби, ураження шкіри, спричинені T. verrucosum, виявили в двох раніше захворілих тварин. На місці аплікації контрольного штаму T. verrucosum спостерігали переважно одиничні мікотичні вогнища. На місці аплікації контрольного штаму T. mentagrophytes, навпаки - зливні мікотичні ураження. Одужання тварин спостерігали з 50 доби після зараження. У телят другої групи впродовж 16 діб після інокуляції контрольних штамів клінічних проявів захворювання не спостерігали. На 17 добу в одного теляти зареєстрували утворення лупи в місцях інокуляції. Розвитку патологічного процесу в подальшому не відбувалось і з 27 доби теля почало одужувати - лупіння шкіри припинилось, запалення шкіри зникло, вона набула фізіологічного кольору і ділянка ураження почала заростати волоссям. Телята третьої щепленої групи не захворіли. Усі контрольні тварини хворіли з клінічними ознаками трихофітії. Захворювання тварин підтверджували мікологічними дослідженнями. У клінічно хворих тварин діагноз підтвердився мікроскопічними дослідженнями та виділенням заражаючої культури.

Отже, як у досліді на лабораторних тваринах, так і в досліді на телятах, установлено, що доза вакцини, яка здатна утворювати необхідний імунний захист у тварин, не може бути меншою, ніж 10 х 10⁶ мікроконідій (тобто не менше, ніж 5х 10⁶ мікроконідій кожного вакцинного штаму).

Визначення нешкідливості вакцини "Триходерм". Нешкідливість вакцини визначали в дослідах на морських свинках і телятах. Для визначення загальної та місцевої нешкідливості було відібрано 30 морських свинок, які були поділені на три групи по 10 тварин у кожній.

Тварин 1-ї групи було щеплено підшкірно, 2-ї групи - в м'язи стегна. Тваринам 3-ї групи замість вакцини вводили внутрішньом'язово такий же об'єм фізіологічного розчину натрію хлориду в м'язи стегна. Щеплення робили двічі з інтервалом 14 діб, для кожної ін'єкції використали по 0,5 см ³ вакцини й фізіологічного розчину відповідно. Згідно з даними щодо контролю вакцини в 0,5 см ³ розчину було 18 х 10⁶ мікроконідій вакцинних штамів T. verrucosum Кн-01 і T.mentagrophytes ТМЧ, що становило потрійну профілактичну дозу.

Під час щеплення, упродовж 3 діб після нього та на 7-й день після щеплення оглядали місця ін'єкції вакцини та візуально оцінювали загальний стан тварин. Отримані результати засвідчили, що в деяких морських свинок, як після підшкірної й внутрішньом'язової ін'єкції вакцини, так і після внутрішньом'язової ін'єкції фізіологічного розчину, виникали незначні локальні реакції в місці ін'єкції (припухлість, почервоніння), які зникали впродовж 5-7 діб.

Нешкідливість вакцини досліджували також на 25 головах великої рогатої худоби. Було створено дві групи по 10 голів кожна для щеплення та контрольну групу з 5 голів. Усім тваринам вакцину вводили внутрішньом'язово в ділянку правої або лівої сторони шиї дворазово по 3 см ³ (потрійна імунізуюча доза) з інтервалом 14 діб. Контрольним телятам вводили внутрішньом'язово в ділянку правої або лівої сторони шиї фізіологічний розчин кухонної солі по 3 см ³.

Тварин усіх груп досліджували під час щеплення, упродовж 3 діб після нього та на 7-й день після щеплення - оглядали місця ін'єкції вакцини та візуально оцінювали загальний стан тварин. Два заключних дослідження здійснювали відповідно через 14 діб після щеплення.

Упродовж 30 діб (час досліду) за результатами клінічного огляду щеплених тварин не було встановлено змін загального стану. У більшості тварин змін у місці інокуляції вакцини також не відзначено, хоч у восьми тварин були виявлені зміни в місці ін'єкції, що виявлялося підвищенням місцевої температури. У двох з них виявили набряк у місці ін'єкції з м'якою консистенцією. Ці зміни виникли винятково після другого щеплення й зберігалися максимум три дні. Болю або сверблячки під час пальпації не виявляли. На заключному огляді (16 діб після другого щеплення) місця ін'єкції вакцини були непомітними. У контролі ні змін загального стану, ні змін в місці інокуляції фізіологічного розчину не спостерігали.

Отже, введення потрійної дози вакцини лабораторним тваринам і телятам не спричиняли патологічних змін в місці введення чи розладу загального стану, що свідчить про нешкідливість препарату для тварин.

Визначення профілактичної ефективності вакцини. Профілактичну ефективність щеплення досліджували шляхом прямого експериментального зараження вірулентними штамами T. verrucosum С-102 і T. mentagrophytes ТМЧ-К. З цією метою використали 27 морських свинок. Інфікуюча доза становила 2,5 х 10⁶ мікроконідій/см² шкіри. Зараження здійснювали нашкірним способом через 65 діб після другого щеплення. Спостерігали за тваринами впродовж 33 діб.

Після контрольного зараження 10 морських свинок щеплених внутрішньом'язово, спостерігали такий перебіг. Від 6 до 21 доби у восьми тварин зафіксовано тільки почервоніння й припухлість на місці інокуляції контрольних штамів. Дві морські свинки прореагували утворенням кірок і лупи та легких струпів на місці інфікування. Найвища стадія вияву клінічних ознак хвороби спостерігалася між 18 та 21 добою після інфікування. Через 5 діб струпи зникли в однієї тварини, а кірки й лупа відокремилися та зникли в неї до кінця спостереження. До кінця досліду тільки в однієї морської свинки були кірки й лупа, шкіра інших тварин у місцях інокуляції контрольних штамів заростала волоссям. Зміни шкіри в інших місцях, крім місця інокуляції ("сателітні" ураження), не були встановлені в жодної тварини.

Таким чином, у 8 морських свинок до 26 доби після інфікування спостерігали тільки ледь помітне почервоніння й припухлість місця інокуляції. Через 33 доби (кінець спостереження) у 9 морських свинок не виявили ніяких змін шкіри в місці зараження. Під час мікологічного дослідження культури контрольних штамів були виділені від двох клінічно хворих тварин на 18 добу після зараження.

Із 7 морських свинок, щеплених підшкірно, захворіли із клінічними ознаками трихофітії й утворенням струпів 6 тварин. У однієї тварини на місці інокуляції культури утворилися лупа й кірки. Зміни шкіри з'явилися через 7-11 діб після зараження та досягли максимуму впродовж 11-18 діб. У 5 тварин струпи зникли вже до 21 доби, а на місці інокуляції були лупа й кірки або припухлість і почервоніння. Тільки в однієї морської свинки трихофітійні струпи зберігалися до 21 доби після інфікування. До кінця досліду (33 доба) на місці експериментального інфікування шкіра в двох тварин ще була почервонілою й припухлою. Шкіра інших тварин не мала ознак захворювання. Під час мікологічного дослідження підтверджено захворювання всіх морських свинок, щеплених підшкірно. Наприкінці спостереження (26 день) у трьох морських свинок ще виділялися культури трихофітонів. Усі 10 контрольних морських свинок, яким внутрішньом'язово ввели фізіологічний розчин, після зараження захворіли з утворенням лупи, кірок або трихофітійних струпів на місці інокуляції.

Отже, після контрольного зараження з 10 морських свинок, щеплених внутрішньом'язово, 8 голів не виявили ознак захворювання, а дві легко захворіли та одужали впродовж 33 діб. Із 7 морських свинок, щеплених підшкірно, легко перехворіли всі тварини. Контрольні морські свинки після зараження захворіли всі з тяжким перебігом хвороби, і в 7 тварин до кінця спостереження реєстрували трихофітійні струпи та кірки.

Визначення профілактичної ефективності вакцини здійснювали також у дослідах на великій рогатій худобі. У першому досліді використали 10 телят віком 10 місяців, у другому - 21 телицю віком від 2-х до 8 міс., з яких формували по 2 групи. Дослідних тварин щепили двічі вакциною "Триходерм", контрольні отримали таку ж дозу фізіологічного розчину натрію хлориду.

У першому досліді після зараження щеплених і контрольних тварин відзначали, що в щеплених тварини місця інокуляції контрольних культур залишались без видимих змін і після 20 доби заростали волоссям. Лише в двох тварин спостерігали почервоніння й незначне запалення шкіри, яке зникло до 30 доби після зараження. Контрольні тварини захворіли з яскраво вираженою клінічною картиною трихофітії після зараження обома штамами. При цьому штам ТМЧ-К був агресивнішим, викликав більш глибокі зміни шкіри та мав тенденцію до поширення на інші ділянки тіла. До 70 доби (термін спостереження) контрольні тварини не одужали, ураження шкіри з'явилося на інших ділянках тіла. Під час мікологічного дослідження місць інокуляції в щеплених тварин виявити наявність трихофітонів не вдалося ні мікроскопічно, ні культурально. Від контрольних тварин були виділені вихідні культури і мікроскопічними дослідженнями підтверджено захворювання на трихофітію.

У другому досліді жодна з імунізованих тварин після контрольного зараження не захворіла на трихофітію. У чотирьох тварин спостерігали почервоніння та легке запалення шкіри після інокуляції культури T.mentagrophytes, у двох тварин - після інокуляції T. verrucosum.

Контрольні (нещеплені) тварини всі захворіли на трихофітію. Серед них у однієї тварини спостерігали зливні мікотичні ураження, ще в однієї - місце інокуляції було повністю покрито струпами. У семи тварин спостерігали тенденцію до поширення зони інокуляції, а ще в двох - ураження на інших ділянках тіла. Під час мікологічних досліджень установлено, що в жодної дослідної тварини захворювання не підтвердилося. У той же час у контрольних тварин, починаючи з 12 доби, 8 голів були культурально позитивні, а на кінець досліджень у всіх тварин захворювання на трихофітію було підтверджено мікроскопічним дослідженням і виділено культури контрольних штамів збудників. До 38 доби (термін спостереження) контрольні тварини не одужали.

Отже, всі щеплені тварини (15 голів) витримали експериментальне зараження, а всі контрольні, нещеплені (16 голів) захворіли на трихофітію з тяжким клінічним перебігом.

Порівняльні випробування вакцин "Триходерм" і ЛТФ-130. Досліди здійснювали на морських свинках і телятах. З 30 морських свинок сформували 6 дослідних груп. Із них по 2 групи дворазово щеплювали вакциною "Триходерм" і ЛТФ-130, а дві залишали для контролю. Контрольне зараження проводили нашкірним методом у попередньо вистрижені й скарифіковані ділянки шкіри розміром 4х 4 см за лопатками. Для зараження використовували вірулентні штами T. verrucosum С-102 і T. mentagrophytes ТМЧ-К. Тварин перших чотирьох груп щепили з розрахунку 1 профілактична доза в 0,5 см ³ розчину. Повторне щеплення зробили через 15 діб. Через 27 діб після другого щеплення здійснили контрольне зараження тварин. Морських свинок першої, третьої та п'ятої груп заражали штамом T. verrucosum С-102, тварин другої, четвертої та шостої груп - T. mentagrophytes ТМЧ-К.

Проведеними дослідженнями встановлено, що контрольні морські свинки тяжко хворіли з типовою клінічною картиною трихофітії. Мікологічними дослідженнями від них виділяли культури трихофітонів. Морські свинки щеплені вакциною "Триходерм", після зараження штамами T. verrucosum і T. mentagrophytes на трихофітію не хворіли. Діагноз на трихофітію у них не був підтверджений ні мікроскопічними, ні культуральними дослідженнями. Морські свинки щеплені вакциною ЛТФ-130, хворіли з клінічними проявами трихофітії тільки після зараження штамом T. mentagrophytes. Від них виділяли вихідну культуру.

Порівняльні випробування вакцин "Триходерм" і ЛТФ-130 також здійснили на 10 головах клінічно здорових телят віком 3-4 місяці. Було сформовано 3 експериментальні групи. Перша група (4 голови) була щеплена вакциною "Триходерм", друга група (4 голови) була щеплена вакциною ЛТФ-130, третю групу (2 голови) не щепили та використовували як контрольну. Щеплення телят перших двох груп здійснювали згідно з настановою щодо застосування вакцин (1 і 5 см ³ відповідно). Друге щеплення зробили через 16 діб. Через 27 діб після другого щеплення здійснили контрольне зараження тварин. Контрольне зараження здійснювали нашкірним методом у попередньо вистрижені й скарифіковані ділянки шкіри розміром 5х 5 см у середній третині шиї. Для зараження використовували вірулентні штами T. verrucosum С-102 і T. mentagrophytes ТМЧ-К у дозі 2,5 х 10⁶ мікроконідій на 1 см ² шкіри. Термін спостереження за телятами становив 70 діб.

Після контрольного зараження встановлено, що в телят, щеплених вакциною "Триходерм", спостерігали гіперемію шкіри й утворення лупи з обох боків зараження. Ці зміни спостерігалися з 7 до 21 доби, після чого почалося відновлення волосяного покриву на ділянках інокуляції вірулентних культур. У телят, щеплених вакциною ЛТФ-130, у місці інокуляції штаму T. verrucosum С-102 спостерігали гіперемію шкіри і утворення лупи. На місці інокуляції штаму T. mentagrophytes ТМЧ-К спостерігали прогресуюче захворювання з розширенням зони ураження, появою трихофітійних струпів і нових осередків ураження. Контрольні тварини хворіли після зараження обома штамами з вираженою клінічною картиною трихофітії. Під час мікологічного дослідження матеріалу з осередків ураження контрольних телят мікроскопічно було підтверджено захворювання на трихофітію й виділено культури контрольних штамів. Від телят першої групи культури трихофітонів після інокуляції виділити не вдалося, мікроскопічні дослідження захворювання теж не підтвердили. У той же час від телят другої групи після зараження було виділено лише культуру T. mentagrophytes. Від контрольних тварин виділяли обидва збудники трихофітії.

Отже, на відміну від вакцини ЛТФ-130, вакцина "Триходерм" захищала тварин від захворювання на трихофітію в разі зараження як культурою Trichophyton verrucosum, так і Trichophyton mentagrophytes.

Вивчення профілактичної ефективності вакцини у виробничих умовах. У досліді використали 228 голів великої рогатої худоби, що були розміщені на фермі. У 31 тварини спостерігали всі ступені захворювання на трихофітію - від одиничних мікотичних змін, особливо в ділянці голови, шиї й хвоста, до генералізованої трихофітії. Клінічно хворих тварин утримували окремою групою впродовж двох місяців. Для профілактики 93 клінічно здорових тварини віком від 2 до 6 місяців щепили вакциною "Триходерм". Як контрольну групу залишили 104 нещеплених тварини віком від 5 до 10 місяців.

Через 4 тижні після другого щеплення тварин з карантину переставили в загальне приміщення. Щеплених і контрольних тварин клінічно досліджували з інтервалом 7 діб на предмет клінічного прояву захворювання на трихофітію. У разі підозри виникнення осередку трихофітії здійснювали мікологічні дослідження зіскрібків шкіри.

Серед 93 щеплених тварин впродовж 3-8 тижнів захворіли 5 (5,37 %) голів з клінічними ознаками трихофітії. Діагноз був підтверджений мікологічними дослідженнями зіскрібків шкіри. З 5 захворілих тварин у 4 з'явилися одиничні трихофітійні ураження, обмежені однією ділянкою тіла (легкий ступінь ураження). За такого перебігу хвороби тварини видужують без додаткового втручання - через 15-20 діб кірочки відпадають, і до 30 доби місце ураження покривається новим волоссям. У нашому випадку вже на 20-25 добу ознаки захворювання зникали, і в місцях ураження виросло нове волосся. При цьому одна щеплена тварина захворіла на трихофітію вже через три тижні після другої імунізації, а ще одна - через 4. Зважаючи на те, що інкубаційний період при трихофітії триває від 3 до 5 тижнів, можна припустити, що ці тварини були інфіковані ще перед щепленням, або щеплення здійснювалася вже в інкубаційному періоді. І лише в однієї щепленої тварини (1 %) були ознаки трихофітії середнього ступеня ураження з 10 осередками на різних ділянках тіла.

З 22 (23 %) захворілих контрольних, нещеплених тварин у 6 з'явилися незначні зміни на шкірі, у 8 тварин - ураження середнього ступеня й у 3 тварин реєстрували тяжкі ураження з більше, ніж 20 трихофітійними осередками в різних ділянках тіла. У 5 тварин реєстрували генералізовану форму трихофітії з численними осередками ураження, розташованими по всьому тілу. 82 теляти не захворіли на трихофітію впродовж 60 діб спостереження.

Таким чином, здійснені дослідження свідчать про високу імуногенну активність вакцини "Триходерм" як в експериментах (80-100 %), так і під час застосування вакцини в польових умовах, де вона показала високий рівень захисту тварин (95 %).

Вивчення терапевтичної ефективності вакцини. Для вивчення терапевтичної ефективності вакцини використали 33 теляти з різним клінічним перебігом захворювання. Телятам вводили дві або три профілактичні дози вакцини з інтервалом 14 діб. У першому досліді, коли застосували вакцину "Триходерм" на 27 телятах віком до 9 місяців, клінічно хворих на трихофітію, встановлено, що три голови повністю вилікувалися через три тижні, сім - через чотири, шість - через п'ять тижнів. Дві тварини одужали через 6 тижнів після другого щеплення, а одна - через 7 тижнів. П'ять тварин упродовж терміну спостереження (10 тижнів) після другого щеплення не одужали. З п'яти тварин з генералізованою формою захворювання, які через 14 діб після другого щеплення були додатково імунізовані втретє, дві не одужали за час спостереження.

Позитивні результати ми отримали і в другому досліді щодо терапевтичного застосування вакцини "Триходерм". Із 6 хворих після експериментального зараження телят упродовж 3-х тижнів вилікувалось 4 голови. Дві тварини за 3 тижні (термін спостереження) одужати не встигли, але мали позитивну динаміку одужання. При цьому тварини, що були раніше щеплені, вилікувалися швидше.

Таким чином, вакцина "Триходерм" мала виражену терапевтичну дію й під час застосування в рекомендованій дозі (дві профілактичні) забезпечувала клінічне одужання тварин у термін від 3 до 6 тижнів залежно від тяжкості патологічного процесу. За генералізованої форми захворювання рекомендується й третє щеплення тварин.

Показники гуморального імунітету в щеплених тварин. З метою вивчення імунобіологічної перебудови організму та формування специфічного імунітету в щеплених тварин ми застосували реакцію аглютинації (РА). Для реакції використовували антигени, виготовлені нами з гомологічних штамів трихофітонів. Для першого досліду було використано 10 кролів масою тіла 2,5-3 кг, нещеплених проти трихофітії. Першу групу кролів щепили експериментальною вакциною "Триходерм" серії № 2, другу групу - вакциною ЛТФ-130. До щеплення титр аглютинінів становив 4,12±0,42-4,52±0,54 lоg_2. Найвищий титр аглютинінів у щеплених кролів спостерігали на 20-30 день після другого щеплення - у середньому, для першої групи 6,72±0,63-7,52±0,65 lоg₂ (1:112-1:176) для T. verrucosum і 6,72±0,63-7,92±0.85 lоg₂ (1:112-1:224) для T. mentagrophytes. У кролів другої групи - 6,32±0,59-7,52±0,65 lоg₂ (1:88-1:176) для T. verrucosum. У тварин цієї групи до антигена з T. mentagrophytes аглютинінів не виявили.

Для другого досліду використали 24 теляти віком 3_6 місяців. І-у групу тварин щепили вакциною ЛТФ-130, ІІ-у - експериментальною вакциною "Триходерм". Отримані результати свідчать, що після дворазового щеплення через 28 діб різко збільшувався титр аглютинінів, з максимальним підйомом у період 45-60 діб і поступовим зниженням. До 180 доби титр аглютинінів наближався до рівня, зафіксованого після першого щеплення. При цьому в тварин, щеплених вакциною ЛТФ-130, титри аглютинінів до антигена з T. mentagrophytes не зростали й були на рівні фону 4,24±0,27 lоg₂ (1:23), а до антигена з T. verrucosum сягали 8,4±1,15 lоg₂ (1:360). Титри аглютинінів у тварин другої групи до антигенів з обох збудників були приблизно рівними і знаходилися у межах 8,4±1,07-8,49±0,97 lоg₂ (1:373-1: 386).

Таким чином, вакцина "Триходерм" викликає імунну перебудову організму тварин та індукує появу гуморального імунітету до двох видів збудників трихофітії. Титри аглютинінів у сироватці крові тварин після щеплення вакциною "Триходерм" були на рівні титрів аглютинінів у сироватці крові тварин, щеплених комерційною вакциною ЛТФ-130 (8,4±1,07-8,4±1,15 lоg₂). Рівень аглютинінів сягав максимальних показників через 2 місяці після другого щеплення та поступово знижувався до фонового рівня через 6 місяців.

Вивчення факторів імунітету в тварин, щеплених вакциною "Триходерм". Вивчення імунологічної перебудови організму тварин після щеплення грибковими вакцинами вивчали в дослідах на 20 кролях і 36 телятах. Як контрольних використовували нещеплених та щеплених вакциною "ЛТФ-130" тварин. Здійснені дослідження засвідчили, що в щеплених тварин реєстрували вірогідне зростання рівня циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) середньої молекулярної маси на 0,04±0,02 мг/см ³ (17 %) та активності лізоциму на 26,5±2,8 мкг/см ³ (34 %) у сироватці крові щеплених тварин відносно значень цих показників у контролі. При цьому концентрація серомукоїдів (Sm) у сироватці крові тварин, щеплених вакциною "Триходерм", була вірогідно нижчою від значень цього показника в телят, щеплених вакциною "ЛТФ-130", що свідчить про відсутність шкідливих імуносупресивних ефектів під час застосування препарату "Триходерм" на організм тварин. Виявлено поступове зростання рівня загального білка в сироватці крові тварин, щеплених вакциною "Триходерм", за рахунок підвищення кількості г-глобулінів, що впливало відповідно й на загальну кількість глобулінів відносно значень цих показників у контрольній групі. Зростання рівня загального білка відносно контрольних значень протягом експерименту в середньому становило - 15,5 %, кількості г-глобулінів - 40,1 %, загальних глобулінів - 21,0 % відповідно. У сироватці крові телят, щеплених вакциною ЛТФ-130, було зафіксовано лише вірогідне зростання кількості г-глобулінів та відповідно загальних глобулінів у середньому на 31,5 і 20,3 % через 4 тижні після щеплення на фоні тенденції до підвищення значень рівня загального білка. Слід відзначити, що виявлене зростання показників білкового профілю крові щеплених телят упродовж експерименту було в межах прийнятих референтних значень (норма) відповідних показників для великої рогатої худоби. Разом з тим необхідно підкреслити, що в сироватці крові контрольних телят рівень загальних протеїнів поступово знижувався впродовж експерименту. Виходячи з того, що імунні комплекси середньої молекулярної маси є активаторами системи комплементу та В-лімфоцитів, визначені нами посилення утворення ЦІК та активацію лізоциму можна розглядати в даному випадку як індукцію гуморальної ланки імунітету внаслідок щеплення.

Про відтворення імунної відповіді внаслідок дії запропонованої вакцини свідчить також визначене посилення синтезу імуноглобулінів класів G і М у сироватці крові дослідних телят. Більш ранню відповідь імунної системи реєстрували в тварин, щеплених препаратом "Триходерм", тенденцію якої спостерігали вже на початку досліду - після щеплення, що в подальшому набула вірогідності та залишалася до кінця експерименту. Так, через 10 тижнів після імунізації зростання кількості імуноглобулінів класів G і М у сироватці крові телят цієї дослідної групи становило відповідно 18,4 і 30,4 % відносно контрольних значень.

Застосування вакцини "ЛТФ-130" відрізнялося за впливом на організм телят. Вірогідне зростання кількості імуноглобулінів класів G і М фіксували лише наприкінці експерименту (70 доба), яке було менш виражене. На початку досліджень - після щеплення - кількість імуноглобулінів класів G і М була навіть нижчою за контрольні значення, але ці зміни були не вірогідні.

Отже, як комерційна жива, суха вакцина "ЛТФ-130" так і експериментальна вакцина "Триходерм" спричиняли імунну перебудову організму тварин, зокрема викликали збільшення вмісту імуноглобулінів у сироватці крові щеплених тварин порівняно з контрольними й не чинило імуносупресивної дії на організм тварин.

Визначення тривалості імунітету після щеплення вакциною "Триходерм". Для виконання поставленої мети було використано 10 телиць віком 8-12 місяців. Тварин щепили вакциною "Триходерм" двічі з інтервалом 12 діб у дозі 3 см ³. Для контролю використовували не щеплених проти трихофітії телят віком 2-4 місяці, яких відбирали окремо для кожного дослідження по 1-2 голови. Упродовж 12 місяців здійснювали регулярні (з інтервалом 3 місяці) зараження щеплених телиць вірулентними штамами збудників трихофітії. За тваринами спостерігали впродовж 25-35 діб після зараження. Контрольне зараження здійснювали нашкірним методом у попередньо вистрижені й скарифіковані ділянки шкіри розміром 5х 5 см за лопатками в дозі 2,5 х 10⁶ мікроконідій на 1 см ² шкіри.

Установлено, що з 10 щеплених тварин у однієї телиці спостерігали незначні зміни шкіри, викликані дерматофітами, через 9 і 12 місяців після щеплення. Ще в однієї такі ж зміни спостерігали через 12 місяців після щеплення. Ураження шкіри в цих тварин не мало поширення та зникало через 20-25 діб без лікування. У інших тварин видимих змін шкіри в місці інфікування не реєстрували.

Усі нещеплені контрольні тварини хворіли з клінічним проявом трихофітії в місці інфікування. При цьому захворювання на зараження штамом T. mentagrophytes розвивалося більш інтенсивно, ніж на зараження штамом T. verrucosum. Клінічні прояви захворювання підтверджувалися мікроскопічними та культуральними дослідженнями.

Підсумовуючи отримані нами наукові результати, необхідно зазначити, що наші дослідження були спрямовані на створення нового вітчизняного препарату для специфічної профілактики й терапії трихофітії великої рогатої худоби. У результаті ми удосконалили лабораторну діагностику дерматомікозів тварин, виділили й селекціонували вітчизняні виробничі вакцинні й контрольні вірулентні штами збудників трихофітії великої рогатої худоби, розробили ефективний спосіб довготривалого збереження виробничих штамів дерматофітів, розробили технологію виготовлення високоефективної бівалентної вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби з урахуванням циркуляції збудників захворювання в Україні. Порівняльні дослідження комерційної вакцини "ЛТФ-130" та бівалентної вакцини "Триходерм" дають підставу стверджувати, що вакцина "Триходерм" забезпечує надійний захист і лікування від двох збудників трихофітії великої рогатої худоби - Trichophyton verrucosum і Trichophyton mentagrophytes, а вакцина "ЛТФ-130" лише від одного - Trichophyton verrucosum. За показниками "нешкідливість" та "протективна активність" вакцина "Триходерм" не поступається комерційній вакцині "ЛТФ-130".

ВИСНОВКИ

1. Теоретично та експериментально обґрунтовано розробку й застосування бівалентної, живої, сухої, концентрованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби на підставі вивчення особливостей перебігу захворювання, етіологічної структури, вивчення біологічних властивостей збудників, селекції виробничих штамів. На Державній Сумській біологічній фабриці впроваджено технологію виготовлення вакцини "Триходерм". Розроблено систему довготривалого зберігання культур трихофітонів та вдосконалено лабораторну діагностику трихофітії.

2. Уперше в Україні встановлено, що захворювання великої рогатої худоби на трихофітію спричиняють два види збудників - Trichophyton verrucosum i Trichophyton mentagrophytes. Клінічні прояви захворювання в тварин, спричинені T. verrucosum, установлено в 75,9 % обстежених господарств, Trichophyton mentagrophytes - у 13,8 %, асоціацією обох збудників - у тварин 10,3 % обстежених господарств.

3. Установлено сезонні, вікові та клінічні особливості перебігу трихофітії. Захворювання реєструвалося незалежно від пори року з тенденцією поширення в зимово-весняний період (з лютого по квітень); хворіли переважно телята у віці 2-6 місяців (84,0 % клінічно хворих тварин). Найменше тварин хворіло у віці молодше від двох місяців (4 %) і старше від 2-х років (2 %). Впливу статевої або породної належності на рівень захворюваності великої рогатої худоби на трихофітію не виявлено. Інкубаційний період захворювання сягав 12-25 діб. Виявлено десиміновану, плямисту та стерту (атипову) форми захворювання. Найбільше поширення мала плямиста форма хвороби - 69,6 % хворих тварин.

4. Ізольовано 147 епізоотичних культур трихофітонів. Після селекції відібрано для досліджень 10 штамів, які різнилися між собою за культурально-морфологічними ознаками й патогенністю для тварин. Класичним ознакам T. verrucosum відповідав один штам - "С-102", а з виділених культур T. mentagrophytes - штами "ТМЧ" і "ТМЧ-К". Отримані дані зумовили їх використання під час виробництва та контролювання вакцини.

5. Удосконалено методику лабораторної діагностики дерматомікозів тварин. Використання селективних поживних середовищ з циклогексемідом та антибактеріальними препаратами під час первинних висівів матеріалу, зумовлюють підвищення ефективності ізоляції культур на 37 % і скорочують час виділення T. verrucosum вдвічі.

6. Розроблено спосіб довготривалого зберігання дерматофітів на основі вирощування культур у напіврідкому агаровому середовищі, ліофілізації всієї грибниці та відновлення штамів рідким середовищем Сабуро, що дозволяє підвищити кількість життєздатних мікроконідій на 6-8 % та забезпечує життєздатність культур дерматофітів упродовж 2 років за кімнатної температури (20±2 °С).

7. Виділено та селекціоновано штами Trichophyton verrucosum "Кн-01" та Trichophyton mentagrophytes "ТМЧ", які характеризуються значним продукуванням мікроконідій, високою імуногенною активністю, низькою патогенністю для тварин. Ці якості були підставою для їх використання під час виготовлення бівалентної, живої, сухої, концентрованої вакцини "Триходерм".

8. Обґрунтовано використання селекціонованих вірулентних для лабораторних і сільськогосподарських тварин штамів T. verrucosum "С-102" та T. mentagrophytes "ТМЧ-К" з метою контролювання імуногенності вакцин проти трихофітії тварин.

9. Розроблено технологічні параметри виготовлення імуногенної вакцини проти трихофітії. Оптимальним для накопичення біомаси й ліофілізації є культивування вакцинних штамів трихофітонів упродовж 15-25 діб за 26±1 °С і концентрація 400-600 х 10⁶ /см ³ мікроконідій у суспензії для висушування. Ці параметри дають змогу одержати 85-90 % життєздатних мікроконідій у дозі вакцини, що забезпечує напружений імунітет щеплених тварин.

10. Розроблено захисне середовище для ліофілізації штамів збудників трихофітії, що створює оптимальні умови життєдіяльності за рахунок макро- (солі калію) і мікроелементів (солі заліза, міді, цинку, марганцю), пептону (1 %); містить сахарозу (20 %) і желатину (4 %); забезпечує життєздатність мікроконідій після висушування до 90 % і дозволяє отримувати високоякісну бівалентну, живу, суху вакцину проти трихофітії великої рогатої худоби.

11. Створене на основі солодового цукру зі збагаченням його амінокислотами та факторами росту (вітаміни групи Б) середовище для культивування трихофітонів прискорює появу росту колоній збудників трихофітії на 2-3 доби, появу росту мікроконідій на 3-4 доби, забезпечує збільшення кількості мікроконідій на 15-22 % порівняно із загальноприйнятим сусло-агаром і може ефективно використовуватися для селекції та накопичення біомаси збудників трихофітії.

12. Бівалентна, жива, суха, концентрована вакцина проти трихофітії великої рогатої худоби після дворазового внутрішньом'язового введення в дозі 10 х 10⁶ мікроконідій і більше забезпечує надійний захист як проти Trichophyton verrucosum, так і Trichophyton mentagrophytes у 80-100 % лабораторних тварин і 95-100 % великої рогатої худоби. Щеплення вакциною не спричиняє ускладнень та імуносупресивної дії.

13. Серологічними дослідженнями встановлено вірогідну різницю в титрах аглютинінів до 8,4±1,07-8,49±0,97 lоg₂ з виготовленими нами антигенами, збільшення концентрації імуноглобулінів на 2,1±0,06 мг/см ³ (16 %), зростання циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) на 0,04±0,02 мг/см ³ (17 %) та активності лізоциму на 26,5±2,8 мкг/см ³ (34 %) у сироватці крові щеплених тварин порівняно з інтактним контролем.

14. Установлено виражену терапевтичну ефективність вакцини "Триходерм" при трихофітії великої рогатої худоби, зумовленій двома збудниками (T. verrucosum і T. mentagrophytes). Після дворазового щеплення в терапевтичній дозі (для телят віком до 4-х місяців - 2 см ³, 4-8 місяців - 4 см ³, старші за 8 місяців - 6 см ³) у 78-100 % випадків тварини одужують упродовж 3-6 тижнів.

15. Клініко-епізоотологічні спостереження та порівняльні дослідження комерційної вакцини "ЛТФ-130" та бівалентної вакцини "Триходерм" свідчать, що вакцина "Триходерм" забезпечує надійний захист (80-100 %) і лікування (78-100 %) від двох збудників трихофітії великої рогатої худоби - T.verrucosum і T. mentagrophytes, а вакцина "ЛТФ-130" лише від одного - T. verrucosum.

Пропозиції виробництву. Розроблено й запропоновано для ветеринарної медицини:

1. Вакцина "Триходерм" проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентна, жива, суха, концентрована, на яку отримано патент України за № 25296, ТУ У 24.1-19024865-002:2005, РП № 2503-04-0284-07.

2. Настанова щодо застосування вакцини "Триходерм" проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентної, живої, сухої, концентрованої. Затверджена Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 19 грудня 2005 року.

3. Інструкція з виготовлення та контролювання вакцини "Триходерм" проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентної, живої, сухої, концентрованої. Затверджена директором ДНКІБШМ 6 грудня 2005 року.

4. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика дерматомікозів тварин". Розглянуті й затверджені на засіданні НМК Державного Департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, протокол № 3 від 20 грудня 2006 року.

5. Виробничі вакцинні штами трихофітонів. Патенти України №№ 23490, 23492.

6. Контрольні вірулентні штами трихофітонів. Патенти України №№ 23491, 23493.

7. Система довготривалого зберігання культур дерматофітів. Патент України № 9617.

8. Захисне середовище для ліофілізації трихофітонів. Патент України № 9637.

9. Основні положення дисертації можуть бути використані в процесі вивчення дисциплін "Мікробіологія", "Вірусологія", "Імунологія", "Біотехнологія" та інших, які є в навчальному плані підготовки фахівців ветеринарної медицини.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ветеринарні імунобіологічні препарати: Довідник / Під загальною ред. П.І. Вербицького та А.М. Головка. - К.: Реферат, 2004. - С. 92-93, 101-102.

2. Лабораторна діагностика дерматомікозів тварин / В.Г. Скрипник, А.М. Головко, В.О. Ушкалов, Н.В. Кокоріна, О.М. Литвинов // Методичні рекомендації. - К., 2006. - 25 с.

3. Створення комплексного середовища для культивування збудників мікозів/ А.М. Головко, В.Г. Скрипник, В.В. Чумаченко, В.С. Тиндик, О.І. Гордієнко, Л.Г. Стецюра // Ветеринарна медицина України. - К., 2004. - № 3. - C. 15-16 (дисертант накопичив фактичний матеріал, зробив аналіз. Брав участь у написанні статті).

4. Скрипник В.Г. Деякі аспекти стандартизації вакцин проти дерматомікозів тварин // Ветеринарна медицина: Міжвідом. темат. наук. зб. - Х., 2004. - Вип.84. - С. 630-632.

5. Головко А.М., Лемещенко Г.П., Скрипник В.Г., Волков М.В. Використання мікроміцетів для одержання біологічних препаратів з фунгіцидними властивостями // Вісник аграрної науки. - 2004. - № 3. - С. 43-45 (дисертант розробив методику постановки досліду, брав участь у постановці досліду та написанні статті).

6. Скрипник В.Г. Селекція дерматофітів за показником спороутворення // Ветеринарна біотехнологія. - К. "Аграрна наука", - 2004. - №5. - С. 136-139.

7. Скрипник В.Г. Випадок захворювання кролів на трихофітію // Ветеринарна медицина України. - 2005. - № 2. - С. 7-8.

8. Скрипник В.Г. Вплив захисного середовища на зберігання грибів дерматофітів // Ветеринарна біотехнологія. - К.: "Аграрна наука", 2005. - № 6. - С. 183-188.

9. Скрипник В.Г. Визначення оптимальних строків вирощування вакцинних штамів трихофітонів // Ветеринарна медицина: Міжвідом. темат. наук. зб. - Х., 2005. - Вип.85. - Т.2. - С. 994-996.

10. Скрипник В. Роль гіпсовидного трихофітона (Trichophyton mentagrophytes) в епізоотології трихофітії тварин // Науково-технічний бюлетень інституту біології тварин і державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок. - Вип. 6. № 3,4. - С. 356-360. - Львів, 2005.

11. Скрипник В.Г. Деякі аспекти епізоотології та епідеміології трихофітії в Україні // Ветеринарна медицина: Міжвідом. темат. наук. зб. - Х., 2006. - Вип.86. - С. 297-302.

12. В.Г. Скрипник. Патогенність дерматофітів Trichophyton verrucosum, виділених в Україні, для лабораторних тварин // Ветеринарна біотехнологія. - К.: "Аграрна наука", 2006. -- № 8. - С. 246-251.

13. Валерій Скрипник. Випробування експериментальної вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби на лабораторних тваринах // Ветеринарна медицина України. - 2006. - № 11. - С. 32-34.

14. Прудніков В.С., Лабусова Н.І., Алешкевич В.М., Красочко П.А., Скрипник В.Г. Вплив "Апістимуліну-А" на морфологічні показники органів імунітету телят, вакцинованих проти трихофітії // Вісник Сумського національного аграрного університету. - Суми, 2006. - Випуск 1-2 (15-16), - С. 161-164 (дисертант приймав участь у розробці методики постановки досліджень, проведенні клінічного досліду, відборі патологічного матеріалу та написанні статті).

15. В.Г. Скрипник. Динаміка біохімічних показників крові у телят, вакцинованих протигрибковими вакцинами // Збірник наук. праць "Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини". - Харків, 2007. - Вип. 14 (39). - Ч. 2. - Т. 2. - С. 73-77.

16. Скрипник В.Г. Вивчення дії експериментальної вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби на телятах // Ветеринарна біотехнологія. - К.: "Аграрна наука", 2007. - № 10. - С. 208-213.

17. Валерій Скрипник. Визначення якості протигрибкових вакцин за біохімічними показниками крові // Ветеринарна медицина України. - 2007. - № 5. - С. 34-36.

18. Скрипник В.Г. Оцінка якості протигрибкових вакцин за показниками неспецифічної резистентності сироватки крові кролів // Ветеринарна медицина: Міжвідом. темат. наук. зб. - Х., 2007. - Вип.88. - С. 203-207.

19. Валерій Скрипник. Епізоотологія та етіологія трихофітії великої рогатої худоби (огляд літератури) // Ветеринарна медицина України. - 2007. - № 6. - С. 17-19.

20. Скрипник В.Г. Динаміка показників білкових фракцій сироватки крові кролів, щеплених протигрибковими вакцинами // Вісник Білоцерківського ДАУ. - Біла Церква, 2007. - Вип. 44. - С. 152-155.

21. Скрипник В. Вивчення вірулентних властивостей культур трихофітонів // Науково-технічний бюлетень інституту біології тварин і державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок. - Львів, 2007. - Вип. 8. - № 3,4. - С. 303-309.

22. Лемещенко Г.П., Головко А.М., Скрипник В.Г. // Мінеральне живильне середовище для культивування Trichophyton verrucosum / Деклараційний патент на винахід. № 20020866543; заявлено 06.08.2002; опубл. 15.05.03, Бюл. №5. - 2 с. (дисертант брав участь у постановці дослідів, оформленні заявки на патент).

23. Скрипник В.Г., Головко А.М., Ушкалов В.О. Процес довготермінового зберігання штамів дерматофітів // Деклараційний патент на корисну модель № u 2005 00688; заявлено 26.01.2005; опубл. 17.10.2005. - Бюл. № 10. - 2 с. (дисертант провів експериментальні дослідження і оформив заявку на патент).

24. Скрипник В.Г., Головко А.М., Ушкалов В.О., Яненко В.М. Захисне середовище для довготермінового зберігання штамів дерматофітів // Деклараційний патент на корисну модель № u 2005 01106; заявлено 07.02.2005; опубл. 17.10.2005. - Бюл. № 10. - 2 с. (дисертант здійснив експериментальні дослідження і оформив заявку на патент).

25. Скрипник В.Г., Головко А.М., Ушкалов В.О., Скрипник А.В. Застосування штаму гриба Trichophyton verrucosum для виготовлення вакцин проти дерматомікозів тварин // Патент на корисну модель № 23490; заявлено 18.01.2007; опубл. 25.05.2007. - Бюл. № 7. - 6 с. (дисертант здійснив експериментальні дослідження і оформив заявку на патент).