Эпизоотология бруцеллёза крупного рогатого скота в СПК "Племзавод имени 60-летия СССР" Приаргунского района Забайкальского края

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИИ

ЗАБАЙКАЛЬСКИЙ АГРАРНЫЙ ИНСТИТУТ

ФИЛИАЛ ФГБОУ ВО «ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. А.А. ЕЖЕВСКОГО»

Технологический факультет

Кафедра Ветеринарной медицины

Специальность 36.05.01. - «Ветеринария»

Допустить к защите:

Заведующий кафедрой Л.Н. Савельева

Дипломная работа

Тема: «Эпизоотология бруцеллёза крупного рогатого скота в СПК «Племзавод имени 60- летия СССР» Приаргунского района Забайкальского края»

Автор: Иванов Виктор Александрович

Руководитель: Кирильцов Евгений Владимирович

Чита 2016

Список сокращений

В.Д. - восточной долготы

ВГНКИ - Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

ВИЭВ - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

Г - грамм

Гол- голов

ГУ - государственное учреждение

ГКУ - государственное краевое учреждение

ГУП ГПЗ - государственное унитарное предприятие Государственный племзавод

ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КГ - килограмм

КГУ - Коммунальное государственное учреждение

КМ - километров

КРС - крупный рогатый скот

МППА - мясо-пептонно-печеночный агар

МППБ - мясо-пептонно-печеночный бульон

МКМ - микромикрон

МЛ - миллилитров

М/СЕК.- метров в секунду

МФА - Метод флуоресцирующих антител

П - поселок

ПЦР - Полимерная цепная реакция

РА - ретроспективный анализ

РА - реакция агглютинации

РСК - реакция связывания комплимента

РИД - реакция имуннодиффузии

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РФ - Российская Федерация

С - село

СББЖ - Станция по борьбе с болезнями животных

СНГ - Содружество независимых государств

СПК- Сельскохозяйственный производственный кооператив

СССР - Союз Советских Социалистических Республик

С.Ш - северной широты

S, ГА - площадь, гектар

ТЫС. ЕД - тысяч единиц действия

УД. ВЕС - удельный вес

Введение

Бруцеллёз относится к группе особо опасных заболеваний, сложный в диагностическом плане, при котором особенности краевой патологии зависят от типа очага и вида бруцелл, циркулирующих среди домашних животных. Бруцеллез является серьезной проблемой медицинской и ветеринарной служб, и не случайно повышение эффективности эпидназора за бруцеллезом во многих странах рассматривается на государственном уровне. На территории России бруцеллез впервые зарегистрирован в 1911 г. Е.А. Марциновским и в последующем получил достаточно широкое распространение.

На протяжении всего периода существования домашнего животноводства, перед человечеством стоял вопрос по обеспечению здоровья имеющихся в хозяйствах животных и недопущения заболевания их в частности инфекционными болезнями. Из огромного списка таких болезней не на последнем месте находится бруцеллёз. Это связано не только с огромным экономическим ущербом, которое наносит данное заболевание, но и с возможностью заражения им и людей. Разработке мер диагностики, профилактики и мерам борьбы с бруцеллёзом животных посвящены многие научные и практические работы.

В настоящее время одной из важнейших задач мирового сельскохозяйственного производства является обеспечение населения земного шара высококачественной экологически чистой животноводческой продукцией, что влечёт за собой поиск новых и совершенствование существующих методов профилактики, диагностики и ликвидации таких антропозоонозов как бруцеллез животных. Бруцеллез представляет собой огромную мировую проблему для здравоохранения, животноводства и экономики. Его значение для общественного здравоохранения объясняется прямой или косвенной передачей инфекции от зараженных животных человеку, что приводит к заболеванию, инвалидности и потери трудоспособности. Данная инфекция также приводит к значительному уменьшению продуктов питания, особенно полноценных белков животного происхождения необходимых для здоровья и благополучия человека. Потери поголовья скота и, следовательно животного белка происходят вследствие абортов, преждевременных отелов, бесплодия и уменьшения лактации. При этом бруцеллез стоит на 1-ом месте среди причин профессиональных заболеваний (Ю.Н. Федоров, В.В. Горшенко, 1982). Наиболее поражены бруцеллезом сельскохозяйственные животные и регистрируется высокая заболеваемость людей в странах Латинской Америки и Средиземноморского бассейна.[1] (Буткин Е.И. Бруцеллез. В кн. Эпизоотология с микробиологией под ред. Бакулова И.А. // М., "Колос", 1981, С. 145-152.)

В РФ и странах СНГ на данный момент достигнуты значительные успехи в борьбе с бруцеллезом животных, однако последние годы имеется тенденция к росту заболеваемости людей этим заболеванием. Наиболее высокие показатели заболеваемости населения регистрируется в республиках Средней Азии и Казахстане , а на территории РФ - в Западно- и Восточно-Сибирском регионах республики и на Северном Кавказе. Эпидемиологическая обстановка по бруцеллезу в Российской Федерации остается неблагополучной и это в частности можно объяснить наличием бруцеллеза среди сельскохозяйственных животных - мелкого и крупного рогатого скота, являющихся основными источниками возбудителя бруцеллеза для людей. На протяжении последнего десятилетия в стране ежегодно регистрируется от 500 до 800 больных с впервые диагностированным бруцеллезом. В среднем 47% больных выявляются в Северо-Кавказском районе, до 15% - в Поволжском районе. Больные регистрируются преимущественно на территориях с развитым овцеводством, что в значительной степени связано с более выраженным течением у людей заболевания бруцеллезом козье-овечьего вида.

Периодически регистрируются групповые заболевания людей с числом заболевших 10 и более.

Также в течение последних лет в несколько раз увеличился удельный вес детей в возрасте до 14 лет в общей заболеваемости впервые диагностированного бруцеллеза - с 5 до 15%, что является показателем напряженной эпидемиологической ситуации по этой инфекции.

Недостатки в лабораторной диагностике бруцеллеза не позволяют проводить необходимое этиотропное лечение больных бруцеллезом людей, что приводит к хроническому течению заболевания и к последующей инвалидности.

Относительное снижение заболеваемости людей бруцеллезом за последние 10 лет нельзя признать достоверным, поскольку оно обусловлено в основном неудовлетворительными выявлением и диагностикой бруцеллеза, проходящего под другими диагнозами. В целом по стране в учреждениях здравоохранения в 2 раза снизилось число диагностических лабораторных исследований на бруцеллез, в 4 раза сократились бактериологические исследования материала от больных людей. Лабораториями отделов особо опасных инфекций типирование выделенных культур не проводится, что, наряду с недостаточным числом бактериологических исследований, препятствует эффективному проведению противоэпидемических мероприятий, осуществлению мониторинга за циркуляцией возбудителя на территории страны.

Несоблюдение руководителями животноводческих хозяйств и владельцами частного скота ветеринарно-санитарного законодательства, а также ослабление контроля за проведением противобруцеллезных мероприятий на животноводческих объектах способствует появлению и распространению скрытых очагов инфекции, о чем свидетельствует выявление больных людей на территориях, где не зарегистрированы больные бруцеллезом сельскохозяйственные животные. Что также сказывается на тяжести последствий этого заболевания.

Бруцеллез по-прежнему занимает первое место среди профессиональных заболеваний инфекционной и паразитарной этиологии.

Однако ежегодно сокращается лабораторное обследование на бруцеллез при плановых профосмотрах контингентов, профессионально связанных с риском

заражения бруцеллезом. Практически не проводятся профосмотры с лабораторным обследованием на бруцеллез работников коммерческих хозяйств и предприятий.

Такое положение является следствием недостаточной координации деятельности учреждений санитарного и ветеринарного надзора в организации и проведении противобруцеллезных мероприятий; ослабления внимания руководителей учреждений госсанэпиднадзора и здравоохранения к проблеме бруцеллеза; сокращения лабораторных, в т.ч. бактериологических, диагностических исследований материала от людей; неудовлетворительного выявления и регистрации профессиональных заболеваний, ослабления контроля за организацией и проведением профосмотров на бруцеллез контингентов, профессионально связанных с риском заражения бруцеллезом; недостаточного уровня подготовки специалистов лечебно-профилактических учреждений по вопросам профилактики, лабораторной диагностики, клиники и лечения бруцеллеза отсутствия зарегистрированных иммунобиологических препаратов для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей. На основании изложенных выше данных, в настоящее время бруцеллёз является актуальным заболеванием как среди животных, так и среди людей.

[2] (.Буткин Е.И. "Бруцеллез. Методические рекомендации по диагностике, лечению и реабилитации больных", 1987.)

Актуальность дипломной работы заключается в том, что бруцеллез КРС все еще является распространенным заболеванием в хозяйствах Приаргунского района Забайкальского края. Поэтому меры борьбы в не благополучных по данному заболеванию районах имеют научную новизну, в связи с использованием различных методов оздоровления хозяйств.

Цель дипломной работы: Провести эпизоотическое исследование при бруцеллезе крупного рогатого скота в Приаргунском районе Забайкальского края.

Задачи дипломной работы:

· Изучить эпизоотическую ситуацию по бруцеллезу КРС на основе неблагополучного пункта СПК «ПЗ 60 лет СССР» Приаргунского района Забайкальского края.

· Проанализировать данные по падежу в данном хозяйстве за период его неблагополучия по данному заболеванию.

· Изучить и охарактеризовать меры борьбы при оздоровлении данного хозяйства от бруцеллёза крупного рогатого скота.

1. Обзор литературы

Бруцеллез - зоонозное инфекционно-аллергическое заболевание, которое характеризуется общей интоксикацией, поражением опорно-двигательного аппарата, нервной и половой систем. Это инфекционная болезнь домашних и некоторых видов диких животных, которая протекает хронически, опасная и для человека. Возбудителем бруцеллёза являются бруцеллы - очень мелкие, не образующие спор бактерии. Известно 6 видов бруцелл. Наибольшее эпизоотическое значение имеют бруцеллы коз и овец, затем - бруцеллы крупного рогатого скота и свиней. Возбудитель устойчив во внешней среде, а также в пищевых продуктах (молоко, брынза). На объектах внешней среды, загрязнённых выделениями животных, бруцеллы могут сохраняться неделями. При пастеризации молока бруцеллы погибают за 30 минут.

Заражение происходит алиментарным путем или через повреждения кожи (родовспоможение при отелах, ягнении и т. д.), у собак при употреблении абортированных плодов, также мяса или молока больных бруцеллёзом коров, овец, свиней. Возбудитель по системе кровообращения распространяется по всему организму, что приводит к аллергопатии.

Инкубационный период продолжается от 6 до 30 дней. В подавляющем большинстве случае бруцеллёз протекает скрытно, бессимптомно или же признаки бывают не характерны. Бруцеллез характеризуется полиморфизмом клинических проявлений. У части инфицированных возникает первично-латентная форма, которая протекает без клинических симптомов и проявляется лишь иммунологическими реакциями. У других заболевание протекает в острой (остросептической) или в хронических (первично-хроническая метастатическая и вторично-хроническая метастатическая) формах. После исчезновения клинических симптомов (при сохранении бруцелл в организме) заболевание переходит во вторично-латентную форму, которая при ослаблении организма может вновь обостриться и снова перейти в одну из хронических форм. Остросептическая форма бруцеллеза характеризуется высокой лихорадкой (до 40 °С), при которой самочувствие больных остается хорошим (иногда они даже сохраняют трудоспособность). Умеренно увеличены все группы периферических лимфатических узлов (микрополиаденит), печень и селезенка. При хронических формах на фоне субфебрильной (реже фебрильной) температуры и ретикулоэндотелиоза (микрополиаденит, увеличение печени и селезенки) появляются различные органные изменения. Отмечаются умеренная головная боль, повторные ознобы, повышенная потливость. Часто поражаются крупные суставы (периартриты, артриты, бурситы), мышцы (миозиты), нервная периферическая система (моно- и полиневриты, радикулиты, плекситы), половая система (орхиты, оофориты, эндометриты, самопроизвольные аборты). Течение хронических форм бруцеллеза длительное, обострения сменяются ремиссиями. У некоторых больных и после санации организма от бруцелл могут быть стойкие остаточные явления (резидуальный бруцеллез).

При диагностике из специфических методов используют реакции Райта, Хеддлсона, внутрикожную аллергическую пробу с бруцеллином (проба Бюрне). Учитывают эпидемиологические предпосылки и характерные клинические проявления. Дифференцировать необходимо от сепсиса, малярии, туберкулеза, ревматоидного артрита. [3] (Косилов И.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных // Новосибирск, 1992, 260 с.)

Профилактика.

В неблагополучных хозяйствах, где имеется бруцеллёз сельскохозяйственных животных, не следует допускать употребления в пищу мяса или молочных продуктов, сырого молока, сливок. Работники животноводства, ухаживающие за бруцеллёзными животными, должны строго соблюдать правила личной профилактики. При остросептической форме основной является этиотропная терапия, которая продолжается до 3-4 нед. Назначают антибиотики тетрациклиновой группы, стрептомицин, левомицетин, рифампицин. При хронических формах проводят комплекс общеукрепляющих терапевтических мероприятий в сочетании с вакцинотерапией. Санаторно-курортное лечение возможно не ранее 6 мес после исчезновения клинических симптомов бруцеллеза. Прогноз для жизни благоприятный и приводит к частичной потере трудоспособности.

Таким образом, бруцеллёз очень опасен для человека и следует соблюдать все мера по недопущению заражения людей.[4] (. Косилов И.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 197 6г.)

История болезни

Мальтийская лихорадка- под этим названием впервые бруцеллез, как самостоятельная болезнь, был описан в 1863 году на острове Мальта. В 1887 году Брюс выделил на этом острове от одного умершего от мальтийской лихорадки возбудителя и назвал его микрококкус мелитензис. На острове Мальта ученый Заммит в 1905 году установил, что переносчиками и выделителями заразы мальтийской лихорадки в окружающей среде являются козы. Возбудитель "заразного выкидыша" (инфекционного аборта) у крупного рогатого скота - так открыли бруцеллёз 1897 году в Дании Банг и Стрибольт , который был ими назван палочкой Банга, а позднее назван Bac. abortus bovis. В 1914 году Траум выделил микроорганизм из плода свиней, получившего название Br. abortus suis. И только спустя 18-20 лет после открытия, названных возбудителей болезней ("выкидыши" и "мальтийской лихорадки"), американский исследователь Алиса Иванс (1918), изучая возбудителей этих болезней, обнаружила у них большое сходство в морфологии и культуральных свойствах, что явилось основанием для объединения их в одну группу под названием Brucella по имени открывшего их первого исследователя.

После этого возникла задача разработки метода дифференциации этих микроорганизмов, в связи с установлением наличия трех возбудителей бруцеллеза и большого сходства их которую частично разрешил Худдлесон (1921-1929).[5] (Чекишева В.Н. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Москва,1995.375с.)

Распространение

Объединенный комитет экспертов Всемирной организации здравоохранения по бруцеллезу (1986) трактует, что эта болезнь среди животных распространена практически во всем мире (в 155 странах), в том числе в таких развитых капиталистических странах, как США, Франция, Канада).

Наиболее широко распространён бруцеллез животных в странах Средиземноморского бассейна, Малой Азии (Турция, Иран), Юга и Юго-Восточной Азии (Индия, Лаос), Африке, Центральной и Южной Америки (Мексика, Бразилия, Чили, Парагвай, Гватемала).

Успешно проводится борьба с бруцеллезом в Болгарии, Югославии, где регистрируются редкие случаи болезни в отдельных регионах. Вместе с тем ряд стран, особенно в Европе (Англия, Дания, Германия, Финляндия, Швеция, Норвегия, Швейцария, Чехословакия, Румыния), а также Япония добились практически полной ликвидации этой болезни среди сельскохозяйственных животных.

Развивающиеся страны, где нет достаточных ресурсов для обеспечения надлежавшего контроля за эпизоотической обстановкой, в подавляющем большинстве не уделяют достаточного внимания данному вопросу. Поэтому информация о степени поражения стад бруцеллезом в таких государствах, особенно в тропиках, является далеко не полной.

Случаи "повального выкидыша" в дореволюционной России насчитывались сотнями, что объясняется плохим учетом этого явления, но первые научные сообщения, которые появились в 1912-1913 гг., свидетельствуют о широком распространении болезни в северных губерниях России (например, бывшая Новгородская губерния).

В настоящее время наиболее важное эпизоотологическое и экономическое значение в нашей стране имеет бруцеллез крупного рогатого скота, северных оленей и свиней. В эпидемиологическом отношении наиболее опасен бруцеллез овец и коз, с которым связано возникновение 91-100% свежих случаев заболевания людей.

В России бруцеллез регистрируют практически у всех видов сельскохозяйственных и домашних животных, которые поражаются возбудителем бруцеллеза видов B. abortus, B. melitensis, B. suis, B.ovis.

Практически ликвидирован бруцеллез мелкого рогатого скота во всех областях Сибири (кроме Тувы). Также успешно проводятся мероприятия по оздоровлению крупного рогатого скота. Но в ряде областей Западной Сибири (Омская, Новосибирская, Тюменская) он все еще имеет значительное распространение и причиняет большой экономический ущерб отрасти.

Этиология

По данным "Краткого определителя бактерий" Берги (1980), возбудители бруцеллеза относятся к родам с неясным систематическим положением под общим таксономическим названием Brucella. Общим для всех видов и биоваров этого рода является содержание гуанина + цитозина (Г+Ц) в ДНК от 56 до 58 мол.%.

Род Brucella подразделяется на шесть видов, которые, в свою очередь, дифференцируются по ряду биологических свойств на биовары. Виды бруцелл: 1) Br. abortus; 2) Br. melitensis; 3) Br. suis; 4) Br. neotomae (крысы); 5) Br. ovis; 6) Br. canis.

Оптимальными условиями для роста бруцелл являются температура 37° С, рН 6,6-7,2.

Бруцеллы хорошо растут на многих питательных средах. В нашей стране хорошо зарекомендовали себя мясо-пептонно-печеночный агар (МППА) или бульон (МППБ) с добавлением глюкозы (1%) и глицерина (2-3%).

Бруцеллы, особенно в первой генерации, растут медленно - 7-14 суток и более, поэтому среды выдерживают в термостате в течение 3х недель. Лабораторные культуры развиваются быстрее (18-30 часов).

На твердых питательных средах вырастают мелкие, куполообразные колонии гладкого (S-) типа, величиной 2-3 мм. На бульоне - вначале отмечают равномерное помутнение, а по мере старения культуры образуется пристеночное кольцо голубовато-серого цвета. . По методу Козловского бруцеллы окрашиваются в ярко-красный цвет, по Граму - в розовый.

При микроскопии под иммерсией бруцеллы представляют собой мелкие кокки размером 0,3-0,6 мкм или палочки 0,6-2,5 мкм с закругленными концами. Спор и капсул не образуют и не имеют жгутиков Электронно-микроскопическое строение сложное. Оболочка клетки состоит из ряда внешних и внутренних мембран. Цитоплазма представлена нуклеоидом относительно большой величины и множеством рибосом.

Дифференцировать разные типы бруцелл можно по росту первых генераций в аэробных условиях. Например, Br. abortus bovis лучше растет в условиях пониженного содержания кислорода и повышенного уровня углекислоты. Br. melitensis и Br. suis могут расти в обычных аэробных условиях.

Большое количество сероводорода в течение 3-4 суток образуют бруцеллы вида suis, вид abortus bovis выделяет этот газ только в течение первых двух суток, бруцеллы melitensis сероводорода почти не образуют.

Дифференциация бруцелл основана на некоторой разнице биохимических и тинкториальных свойств. Каждый вид бруцелл в существующей классификации объединяет ряд биотипов. Биотипы различаются незначительными отклонениями биохимических свойств. Вид Br. melitensis имеет один классический и два других биотипа; вид Br. abortus bovis - один основной и 8 атипичных биотипов; вид Br. suis - один классический и два атипичных биотипа.

Бруцеллы вида melitensis способны восстанавливать (редуцировать) фуксин, тионин, пиронин, и поэтому хорошо растут на средах с этими красками. Бруцеллы вида abortus bovis редуцируют фуксин и пиронин, а бруцеллы вида suis -редуцируют только тионин. На этом бактериостатическом действии красок основан классический метод дифференциации видов бруцелл. Изменения биологических свойств отдельных культур бруцелл отражается на форме и строении, образуемых ими колоний. Изменения формы колоний можно назвать диссоциацией. По величине, структуре, цвету колонии подразделяют на S- и R-формы. При переходе культуры из S- в R-форму снижается ее патогенность. Кроме того, бруцеллы могут трансформироваться в L-формы при этом патогенность микроорганизма еще более снижается. Роль L-форм в эпизоотологии болезни пока не выяснена Бруцеллы относятся к биохимически слабоактивным микроорганизмам. Они не образуют протеолитических ферментов и обладают слабой сахаролитической способностью, поэтому не разжижают желатина и не свертывают молоко, но иногда расщепляют ксилозу, левулезу, декстрозу, галактозу и сбраживают арабинозу. Вызывают гидролиз аминокислот, белков и пептонов с образованием аммиака и сероводорода.

В настоящее время для дифференциации разных видов бруцелл используют и монорецепторные сыворотки. Однако, исследование бруцелл лишь одним из названных методов, не может служить основанием для определения вида.

Современная система профилактики и борьбы с бруцеллезом основывается на проведении общих ветеринарно-санитарных мероприятий, выявлении источников инфекции -- больных животных и их удалении, применении средств специфической профилактики.

Наиболее важным элементом этой системы является диагностика бруцеллеза, от эффективности которой зависят размеры экономического ущерба при ликвидации заболевания.

Актуальность проблемы, вызываемый видами abortus, melitensis, suis.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в ликвидации бруцеллеза в Российской Федерации совместными усилиями научного потенциала и практической ветеринарной службы, проблема ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота окончательно не решена.

Значительные трудности в диагностике бруцеллеза создают циркулирующие в природе измененные варианты возбудителя бруцеллеза: R, RS, SR и L-формы, о существовании которых сообщали многие исследователи. [6] (П.А.Вершилова с соавт., 1972; Н.П. Потапов, 1974; K.M. Салмаков с соавт., 1974; И.А. Косилов, 1975, 1992; П.А. Триленко, 1976; Е.С. Мозесюк, 1982; В.Г.Ощепков, 1990; Л.Н. Гордиенко, 1999 и др.).

Измененные формы бруцелл, несмотря на их пониженную вирулентность, способны к реверсии в исходные формы и могут вызвать вспышки бруцеллеза.

Изменения в антигенной структуре возбудителя создают трудности в бактериологической диагностике при индикации возбудителя бруцеллеза и в серологической, поскольку официальные диагностические средства сконструированы на основе типичных S-форм бруцелл.

В этой связи исследования по изысканию новых эффективных диагностических препаратов с учетом изменчивости возбудителя бруцеллёза являются актуальными.

Основными методами серологической диагностики бруцеллеза у не привитого и иммунизированного противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота в нашей стране являются РА, РСК, РИД. Однако, для эффективного выявления больных животных на всех стадиях развития инфекционного процесса этих реакций недостаточно. Возникает необходимость в разработке новых легко выполнимых, доступных для массового исследования экспресс методов диагностики бруцеллезных антител в сыворотке крови и молоке.

Широко применяющаяся в системе противобруцеллёзных мероприятий слабоагглютиногенная вакцина из штамма B.abortus 82, имеющая RS-антигенную структуру, осложняет диагностику из-за проблемы дифференциации поствакцинальных реакций от реакций у больного скота.

Эта проблема также требовала проведения исследований, направленных на разработку надежных диагностических средств и методов дифференциальной диагностики, которые возможно было бы использовать не только в отдаленные, но и ранние сроки после иммунизации животных.

Такие диагностические средства и методы необходимы не только для выявления больных животных в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, но и для зон свободных от инфекции, где взамен РА, дающей в ряде случаев неспецифические реакции на бруцеллез, и трудоемких дорогостоящих РСК, РИД целесообразно внедрять более простые, эффективные способы диагностики. [7]( . Косилов И.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных //Новосибирск,1992,260с.)

Бруцеллез собак, вызываемый B.canis, впервые установленный в США G.E. Carmichael в 1966 году, впоследствии в результате разработки средств диагностики зарегистрирован во многих странах мира: Франции, Англии, ФРГ, Японии, Мексике, Румынии, Аргентине, Германии, Китае, Бразилии и др.

В России первый случай бруцеллеза собак, обусловленный B.canis, был зарегистрирован в Волгоградской области в 1994 году (К.В. Шумилов с соавт.,1996).

Важной проблемой до настоящего времени остается ликвидация инфекционного эпидидимита баранов, вызываемого B.ovis, и наносящего ощутимый экономический ущерб овцеводству.

Наряду с широким распространением этого заболевания почти во всех странах мира, он имеет место и в Российской Федерации. Несмотря на разработанные в ВГНКИ - ВИЭВ такие эффективные диагностические методы, как ИФА, РНГА, РНАТ, РНИФ, на практике применяется, в основном, один серологический тест - РДСК, что является недостаточным как для профилактики, так и для оздоровления хозяйств от ИЭ баранов.

Эпизоотология бруцеллеза

Бруцеллёз широко распространён, им болеют в основном сельскохозяйственные животные - крупный рогатый скот,

овцы, козы, свиньи, верблюды, северные олени и др. Причем каждый вид животных обычно поражается определенным видом возбудителя. Однако бруцеллы вида melitensis и abortus могут мигрировать на других животных. Это имеет большое эпидемиологическое значение, особенно в случае миграции наиболее опасного для человека вида melitensis на крупный рогатый скот.

В организм животного микроб проникает через слизистые оболочки

пищеварительного тракта, половых и дыхательных путей, конъюнктиву, а также через кожные покровы в случае нарушения их целостности.

Типичное клиническое течени бруцеллеза у животных характеризуется полиморфизмом, основным признаком которого является аборт. Аборты имеют решающее значение в эпизоотологии и эпидемиологии бруцеллеза, т.к. они сопровождаются длительным и массивным выделением бруцелл с абортированным плодом, плацентой, выделениями из матки и влагалища, при метритах и других поражениях половых и родовых органов. Также больные животные могут выделять бруцеллы с молоком и мочой. Таким образом, выделение большого количества бруцелл при абортах и родах больных животных, а также с молоком является основным фактором распространения инфекции в хозяйстве, а нередко и заражения людей.

Это необходимо учитывать при составлении плана мероприятий и проведении профилактической разъяснительной работы с людьми.

Помимо абортов бруцеллез у животных может сопровождаться поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой сферы (эндометриты, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит), молочных желез (мастит).

Часто бруцеллез у животных может протекать в скрытой форме и обнаруживаться лишь при специальном исследовании. Распространять возбудителя инфекции могут и положительно реагирующие при обследовании на бруцеллез животные, не имеющие клинических проявлений бруцеллеза. Отдельные животные остаются носителями бруцелл и выделяют их в течение 5 лет и более.

Эпидемиологические особенности бруцеллеза. Для бруцеллёза в природе естественным резервуаром являются животные. По этой причине эпидемиология бруцеллеза целиком определяется его эпизоотологией, а заболевание с полным правом можно отнести к типичным зоонозам.

Для людей при бруцеллёзе основными источниками возбудителя инфекции являются овцы, козы, крупный рогатый скот и свиньи. Отмечаются случаи заражения людей от северных оленей.

Имеют место случаи заражения людей от собак как В.melitensis, В.canis, так и другими видами бруцелл. Описаны случаи заражения людей от кошек (В.suis).Иногда источником заражения могут быть лошади, верблюды, яки, собаки и другие животные.

Неблагополучие по бруцеллёзу овцеводческих хозяйств имеет особое значение в заболеваемости людей, в которых чаще возникают групповые заболевания. Тогда как в очагах крупного рогатого скота и свиноводческих фермах обычно регистрируются единичные, спорадические случаи заболевания.

Роль человека в передаче бруцеллезной инфекции эпидемиологического значения не имеет.

В целом пути распространения бруцеллеза многообразны, т.к.бруцеллы выделяются больными животными через все выделительные системы. Передача возбудителя бруцеллеза и заражение людей происходит алиментарным, контактным, и реже - аэрогенным путем, возможны сочетанные пути передачи.

Решающую роль в очагах бруцеллеза имеет контактный механизм передачи инфекции.

В большей степени заболеваемость, отмечается среди лиц, имеющих тесный контакт с больными животными (чабаны, пастухи, работники ферм, в т.ч. звероводческих, зооветспециалисты, доярки). Особенно высока возможность инфицирования при оказании животным помощи во время родов и при абортах, когда проводят ручное отделение плаценты.

Таким образом , можно сделать вывод, что ветеринарные специалисты являются также группой риска по возможности заражения бруцеллёзом.

Заражение может произойти при переработке мясного сырья, кожи, шерсти, шкур животных, больных бруцеллезом (работники мясоперерабатывающей промышленности, кожзаводов, шерстеобрабатывающих предприятий). В таких случаях проникновение бруцелл в организм человека происходит через кожные покровы. Малые размеры возбудителя инфекции и его высокая инвазивная способность позволяют бруцеллам проникать через неповрежденную кожу. Различные повреждения кожных покровов (царапины, ушибы, мацерация) в значительной степени увеличивают эти возможности.

Особую опасность при несоблюдении или невозможности соблюдения мер личной профилактики работниками животноводства и предприятий по переработке продуктов животноводства и др., которые по своей небрежности заносят инфицированный материал на слизистые рта, носа и глаз.

Такой механизм проникновения бруцелл представляет при контактном пути заражения проникновение бруцелл происходит также через слизистые глаз, носа, ротовой полости.

При употреблении пищевых продуктов, полученных от зараженных животных возможен алиментарный путь передачи бруцелл. Наибольшую опасность представляют сырое молоко и молочные продукты (брынза, сливки, сметана, кумыс и др.). Коровье молоко является причиной инфицирования многих людей (особенно в городах), которые профессионально не связаны с животноводством. Опасность инфицирования людей бруцеллезом при алиментарном заражении в значительной степени зависит от вида бруцелл, находящихся в молоке или молочных продуктах. Бруцеллы сохраняются в молоке до 10 дней, а в брынзе - до 45 дней.

Значительно меньшую эпидемиологическую опасность представляет мясо, т.к. оно, как правило, употребляется в термически обработанном виде. Однако в ряде случаев при недостаточной термической обработке в связи с национальными особенностями приготовления пищи (строганина, шашлык с кровью, сырой фарш и др.) мясо и мясные продукты могут являться причиной заражения бруцеллезом. Бруцеллы сохраняются во внутренних органах, костях, мышцах и лимфатических узлах инфицированных туш более одного месяца, а в замороженных продуктах в течение всего срока хранения.

При заражении алиментарным путем решающую роль играет возможность

проникновения бруцелл через слизистые оболочки ротовой полости и верхних отделов пищеварительного тракта, т.к. бруцеллы быстро погибают в кислой среде желудочного сока, не успев проникнуть во внутренние органы и ткани организма. Таким образом, при алиментарном пути заражения, важную роль имеет человеческий фактор, так как причиной заболевания чаще всего является небрежность и халатность самих людей.

Аэрогенный путь заражения человека бруцеллезом возможен при стрижке шерсти, сборе пуха, уборке скотных дворов, обработке шкур, убое скота и других производственных процессах, связанных с уходом за больными животными, или при обработке продуктов и сырья, полученных от них. В таких случаях нередки сочетанные пути передачи возбудителя - аэрогенный и контактный, аэрогенный и алиментарный (при сглатывании накопившейся слизи в носоглотке). Аэрогенный путь передачи возможен и в бактериологических лабораториях, во время различных манипуляций при работе с чистыми культурами (пересевы, центрифугирование и др.), когда могут образовываться аэрозоли. Аэрогенный путь при передаче возбудителя бруцеллезной инфекции определяется возможностью проникновения частиц, диаметр которых менее 5 мкм, в нижние отделы дыхательных путей (бронхиолы и альвеолы).

В шерсти бруцеллы сохраняют жизнеспособность при хранении при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

В науке известны казуистические случаи заражения людей половым путем.

Для заболевания людей бруцеллезом, вызванным козье-овечьим видом, характерна весенне-летняя сезонность. При заражении бруцеллезом от крупного рогатого скота сезонность выражена слабее, что объясняется длительным периодом лактации и заражением в основном через молоко и молочные продукты.

Сезонность в заболеваемости людей бруцеллезом обусловлена хозяйственной деятельностью человека и, в частности, процессом обслуживания сельскохозяйственных животных. Особого внимания заслуживает время отелов, окотов и абортов, уход за животными в послеродовый период, а также время купки и стрижки овец.

Хотелось бы отметить, что различия в заболеваемости по полу зависят от занятости мужчин и женщин в животноводстве. В очагах бруцеллеза крупного рогатого скота, где доля мужского труда имеет второстепенное значение, заболеваемость женщин несколько выше, чем мужчин. В регионах, где основным источником заражения людей является мелкий рогатый скот, наибольший процент заболеваемости отмечается у мужчин.

Заболеваемость людей бруцеллезом носит выраженный профессиональный характер. Заражаются люди преимущественно в результате непосредственного контакта с больными бруцеллезом животными или их сырьем. К группам профессионального риска относятся работники как государственных, так и других форм собственности животноводческих (звероводческих) хозяйств (ферм), мясо- и молоко-комбинатов и других предприятий по переработке продуктов и сырья животного происхождения, убойных пунктов, пунктов стрижки, купки овец, зооветработники, персонал лабораторий, работающих с вирулентными культурами, и персонал других предприятий, учреждений, работа которых связана с риском заражения бруцеллезом.

В очагах бруцеллеза сельскохозяйственных животных часто отмечаются заболевания людей всех возрастных групп, от детей дошкольного возраста (в том числе грудных) до людей преклонного возраста. Однако большая часть людей, заболевших бруцеллезом, приходится на средний работоспособный возраст, так как именно эта группа людей больше других принимает участие в обслуживании животных и обработке сырья животного происхождения.[8] (Бруцеллез. СП 3.1.085-96, ВП 13.3.1302-96", сборник санитарных и ветеринарных правил "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных)

Профилактика бруцеллеза

Перечень общих профилактических мероприятий, обязательных для учреждений, должностных лиц и граждан Российской Федерации определен санитарными правилами СП 3.1.085-96 и Ветеринарными правилами ВП 13.3.1302-96 "Бруцеллез".

Профилактика бруцеллеза включает комплекс ветеринарно-санитарных, хозяйственных и медико-санитарных мероприятий, конечной целью которых является ликвидация инфекции среди животных и прекращение заболеваний среди населения. Учитывая то, что бруцеллез - зоонозная инфекция, основой эпидемического благополучия являются меры по профилактике инфекции среди животных и ликвидации очагов эпизоотии в случае их возникновения. Медико-санитарные мероприятия по профилактике бруцеллеза включают: 1) защиту людей от инфицирования; 2) вакцинопрофилактику; 3) профилактические осмотры профессиональных контингентов и 4) санитарно-просветительную работу.

Лабораторная диагностика бруцеллеза

В настоящее время в медицине и ветеринарии для лабораторной диагностики бруцеллеза применяются три группы методов: первая - тесты, позволяющие выявить возбудитель заболевания и его растворимые антигены; вторая - тесты, выявляющие сенсибилизацию организма к бруцеллезным антигенам; третья - методы определения специфических антител.

Методы выделения возбудителя заболевания и его растворимых антигенов

Бактериологический метод

В первую очередь при работе с возбудителями бруцеллёза необходимо помнить, что вся работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в условиях, предупреждающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителем объектов внешней среды, в строгом соответствии с санитарными правилами "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности. СП 1.2.011-94".

Медленный рост на питательных средах, особенно в первых генерациях является характерной особенностью рода Brucella. При посевах крови, костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5 - 10 дней, а иногда через 20 - 30 дней после засева. При этом биовары В.abortus 5, 6 и 7 могут расти в обычных аэробных условиях, а первые генерации культур В.abortus и В.ovis способны расти только при наличии в атмосфере повышенного содержания углекислоты (5 - 10%).

Для выделения культур бруцелл рекомендуются следующие среды: сывороточно-декстрозный агар, агар из картофельного настоя + сыворотка и кровяной агар (5% овечьей крови в среде), Albimi - агар, среда "Д", печеночные и мясопептонные агары и бульоны (pH сред - 6,8 - 7,2).

В настоящее время в практике широко используется коммерческая среда для выделения бруцелл - эритрит агар (г. Махачкала). Следует отметить, что данная среда является высокоэффективной для выделения первой генерации возбудителя. Однако при последующих пересевах на этом агаре изучаемая культура бруцелл может диссоциировать.

Посевы следует производить на предварительно проверенные питательные среды. Для проверки агара из 2-суточной культуры В.melitensis или В.abortus готовят суспензию бруцелл в концентрации 200 мк в 1 мл [3] (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Посев проводят на 4 чашки по 0,1 мл - 20 мкл суспензии. Агар признается пригодным, если через 5 суток пребывания в термостате при 37 ЬC в среднем вырастает не менее 18 колоний на чашку.

Кровь для посева следует брать до лечения антибиотиками. Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут шприцем из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона. Один из флаконов инкубируют при повышенном содержании углекислоты (5 - 10%), а другой - в обычных условиях.

Посевы крови рекомендуется делать во время лихорадочного состояния больного, т.к. в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Однако не исключена возможность получения гемокультуры и при нормальной температуре. Посевы крови рекомендуется проводить во флаконы (желательно прямоугольные) емкостью 100 - 200 мл, в которые наливают по 30 - 50 мл агара. После стерилизации их укладывают так, чтобы агар астыл на одной из сторон флакона. Затем в каждый флакон стерильно добавляют по 25 - 30 мл предварительно простерилизованного бульона и выдерживают в термостате при 37 °C в течение 2 - 3 суток (агар с бульоном может быть использован не позднее 5 - 7 дней).. Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста культуры поверхность агара орошают бульоном.

При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду. При бактериологическом обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 месяц и спустя 4 - 6 месяцев после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения (особенно при субфебрилитете) перед началом лечения рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальную питательную среду для выделения L-культур бруцелл (состав питательной среды см. в конце указаний).

Бруцеллы можно выделить также из костного мозга, мочи, спинномозговой жидкости, экссудата из бурситов, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т.д. Посевы проводят на твердые и жидкие питательные среды. В случаях исследования загрязненного материала для задержки роста посторонней микрофлоры к среде следует добавлять генцианвиолет из расчета 1:200000. С этой целью также добавляют различные антибиотики, в частности полимиксин - 3 мкг/мл и амфоглюкамин - 3 мкг/мл.

Способ посева бактериологического материала для выделения L-культур идентичен с методом выделения бактериальных гемокультур. Посевы выдерживаются в термостате не менее 35 - 40 дней.[9] (Янышев А.А. Эффективность вакцинопрофилактики против бруцеллёза сельскохозяйственных животных в Южном Федеральном округе, / Деп. в ВИНИТИ 25.04.2007 N2 472-В 2007.)

Биологический метод

Морские свинки (весом 300 - 350 г) или белые мыши (весом 17 - 18 г) используются для выделения бруцелл из материалов, загрязненных посторонней микрофлорой и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале. Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок.

Вскрытие белых мышей производится через 20 - 25 дней, а морских свинок - через 30 - 35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует взять кровь из сердца для исследования сыворотки в реакции агглютинации. Для посевов у белых мышей берут лимфатические узлы: паховый, акселярный, парааортальный, подчелюстной, кусочки селезенки и печени у морских свинок целиком лимфатические узлы (регионарные к месту введения исследуемого материала): паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный, кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу;. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг для засева берут пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, а также мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательные среды (агар и бульон). Лимфатические узлы животных перед посевом рекомендуется надсекать ножницами. После этого каждый лимфатический узел и кусочки органов (по возможности больше) берут "уколом" стерильной деревянной палочки (палочка должна быть длиной 25 - 30 см, диаметром 4 - 5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом) и вносят первоначально в пробирку с агаром, где той же палочкой материал раздавливают и тщательно втирают в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. После использования палочки погружают на 1 час в дезраствор (5% раствор фенола), затем автоклавируют, после чего тщательно промывают и стерилизуют для последующего употребления. Посевы выдерживают при 37 °C в термостате 20 - 25 дней. Просмотр посевов на пробирках с агаром и бульоном производят каждые 3 - 4 дня, из помутневших бульонов делают высевы на пробирки со скошенным агаром.

Результат исследования оценивается положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл из организма животного или при наличии положительной реакции Райта у животных в титре не менее 1:20. [4] (Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности. СП 1.2.011-94".)

Методы идентификации бруцелл

При идентификации для определения принадлежности выделенных культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение морфологии колоний, микроскопия окрашенных препаратов по Граму или Козловскому, люминесцентная микроскопия и проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле.

Величина колоний может быть различной. Наряду с крупными, достигающими в диаметре 3 - 4 мм и больше, могут быть очень мелкие - точечные колонии 0,1 - 0,05 мм. Различные факторы (pH питательной среды, влажность, наличие бактериофага в культуре и др.), влияющие на биологию культуры, могут привести также к изменению внешнего вида колоний (встречаются зернистые, стекловидные колонии, растущие в толще агара, эрозированные, сухие, слизистые, радиально исчерченные и др.).

Колонии бруцелл на агаре бесцветны, выпуклы (холмиком), с гладкой поверхностью, гомогенны, иногда с нежной зернистостью в центре колонии. С возрастом нежные и прозрачные колонии постепенно мутнеют.

Для изучения структуры колоний целесообразно использовать стереоскопическую лупу МБС-1 или обычный микроскоп с объективом наименьшего увеличения.

Проба со специфической сывороткой.

Для быстрой, предварительной идентификации ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю специфической сыворотки, разведенной 1:25 0,5% карболизированным физиологическим раствором, в которой эмульгируется одна петля исследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 минуты) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев, в отрицательных - суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной сыворотки или физиологическом растворе.

Микроскопия окрашенных препаратов.

При окраске по Граму бруцеллы грамотрицательны (окрашиваются в красный цвет). Окрашивание препаратов по способу Козловского: препараты, фиксированные на пламени горелки или спиртовки, окрашивают 0,5% водным раствором сафранина при подогревании до появления пузырьков, промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5%-ным

водным раствором малахитовой или бриллиантовой зелени в течение 40 - 50 секунд. Бруцеллы сохраняют красную окраску сафранина, а остальные бактерии окрашиваются в зеленый цвет.

Методы идентификации L-форм бруцелл

Чтобы определить принадлежность выделенных L-культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение характера роста и морфологии колоний, микроскопия нативных препаратов, проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле, а также способность к росту на специфической питательной среде с пенициллином. Характер роста и морфологии L-форм бруцелл.

L-колонии бруцелл могут быть изолированными или в виде нежного сплошного налета. Колонии от 2 до 3 мм имеют золотистый цвет, слизистую консистенцию, часто врастают в агар. При просмотре через бинокулярную лупу МБС-1 L-колонии имеют вид "яичницы" - плотный центр и ажурные светлые края.

Проба со специфической сывороткой.

Необходимо учитывать, что L-культуры бруцелл очень плохо эмульгируются, что затрудняет учет реакции. L-культуры бруцелл сохраняют антигенное родство с исходными штаммами бруцелл. Для предварительной быстрой идентификации L-культур бруцелл ставят реакцию агглютинации на стекле со специфической агглютинирующей поливалентной антисывороткой в разведении 1:25. Поэтому рекомендуется сначала петлю культуры тщательно растереть стеклянной палочкой в небольшом количестве физиологического раствора и после этого каплю эмульсии перенести в каплю специфической сыворотки на предметном стекле и параллельно в каплю нормальной сыворотки или физиологического раствора в качестве контроля.

Скорость специфической реакции агглютинации может быть только замедленной. Характер агглютината при положительной реакции обычен.

Микроскопия нативных препаратов.

Для изучения морфологии L-клеток отбирают характерные колонии и из них готовят нативные препараты: на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют одну каплю исследуемой культуры, закрывают покровным стеклом, края заливают парафином и просматривают в световом микроскопе в фазовом контрасте с иммерсией.

По морфологии L-формы бруцелл представляют собой полиморфные клетки в виде шаров, грушевидных и неправильной формы тел от 1 до 6 мкм с цитоплазмой разной оптической плотности с вакуолями и зернистостью. Зерна-гранулы могут располагаться как внутри крупных клеток, так и лежать свободными зернистыми массами. В препарате могут находиться клетки от 0,2 до 0,5 мкм гетероморфные или близкие по морфологии к нормальным клеткам бруцелл.

Методы дифференциации бруцелл

Когда бруцеллы идентифицированы по роду, их культуры проверяют на диссоциацию. С этой целью применяют следующие тесты: реакция термоагглютинации (проба с нагреванием) и проба с трипафлавином.

Реакция термоагглютинации.

2 - 3 мл 1 x 10 мкл/мл двухсуточной культуры бруцелл в физиологическом растворе подогревают в пробирке на водяной бане при 90Ь в течение 30 минут. Результаты учитывают через 30 минут, 1 час и окончательно через 24 часа пребывания при комнатной температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной. Дифференциации подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.

Также тестами дифференциации бруцелл являются: их отношение к росту в присутствии CO2, образование H2S, устойчивость к фуксину и тионину, способность агглютинироваться монорецепторными сыворотками, отношение к фагу "Тб".

Проба с раствором трипафлавина (на стекле).

На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры.

У диссоциированных культур быстро через 1 - 2 минуты наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.

Дифференциация по редуцирующей активности в отношении красок.

Для этого метода дифференциации рекомендуется применять твердые питательные среды - агар Albimi и мясо-пептонный агар. Применяют основной фуксин и тионин, предварительно оттитрованные по отношению к трем основным видам референтных штаммов бруцелл, в концентрации: фуксин - 1:50000, тионин - 1:50000.

...