Экспериментальная тревожная депрессия и серотонергическая система мозга

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.13. - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Экспериментальная тревожная депрессия И серотонергическая система мозга

Августинович Д.Ф.

Новосибирск - 2008

Работа выполнена в Секторе нейрогенетики социального поведения Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирска

Научный консультант доктор биологических наук Кудрявцева Наталия Николаевна,

Официальные оппоненты доктор медицинских наук

Обут Тимофей Александрович доктор биологических наук, профессор Маркель Аркадий Львович доктор медицинских наук, профессор Суслов Николай Иннокентьевич

Ведущее учреждение: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Защита состоится ______________ 2008 г. на заседании Диссертационного совета Д 001.014.01 при Институте физиологии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии СО РАМН

Автореферат разослан ____ __________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Бузуева Ирина Ивановна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность проблемы. Депрессия является одним из самых распространенных психических заболеваний в развитых странах. Согласно статистике ВОЗ и Национального института психического здоровья США 4-5% населения земли страдают этой патологией, при этом риск развития большого депрессивного эпизода в течение жизни составляет 15-20%. Прогнозируют, что в 2020 г. она будет на втором месте в списке причин нетрудоспособности у людей [Murray, Lopez, 1996; обзор Cryan, Mombereau, 2004]. У женщин униполярная депрессия встречается чаще, чем мужчины: хотя бы раз в жизни депрессивный эпизод переносят 7-12% мужчин и 25% женщин, причем более чем у 75% заболевших наблюдаются рецидивы [Williams et al., 1995; Kornstein et al., 2000b; Piccinelli, Wilkinson, 2000; Kessler et al., 2003; Gold, 2005]. Нередко возникновение депрессии связывают с жизненным дискомфортом, вызываемым общими для всех причинами, такими, например, как проблемы со здоровьем, экологические потрясения, профессиональные и семейные конфликты, отсутствие социальной поддержки и т.д. [Brown, 1996; Kessler, 1997; Piccinelli, Wilkinson, 2000; Bjorkqvist, 2001].

Депрессия может сопровождаться многими невротическими и психотическими симптомами. Наиболее тяжелой формой заболевания считают депрессию, сочетающуюся с признаками тревожности (тревожная депрессия, смешанное тревожно-депрессивное расстройство), поскольку она труднее всего поддается лечению, дольше длится, имеет большой процент рецидивов после лечения и серьезные социальные последствия (суициды) [Fudd, Burrows, 1992; Lewinsohn et al., 1995; Mineka et al., 1998; Lydiard, Brawman-Mintzer, 1998]. Как правило, тревожность предшествует возникновению депрессии и, более того, повышает риск развития депрессивного эпизода, в некоторых случаях в 4,5-9 раз [Bittner et al., 2004]. Ситуация, когда большая депрессия сопровождается тревожными расстройствами, чаще наблюдается у женщин [Breslau et al., 1995]. Поэтому многие клиницисты и экспериментаторы занимаются исследованием причин возникновения депрессии и лежащих в её основе нейрохимических и нейроэндокринных изменений в мозге, а также поиском эффективных антидепрессантов и анксиолитических препаратов, которые, как показывает практика, не всегда эффективны.

В конце 80-х годов, когда начиналась эта работа, было известно около 20 экспериментальных моделей депрессии [обзор Willner, 1984], применяемых, в основном, для исследования эффектов антидепрессантов. Среди них наиболее значимыми признавали три модели [Katz, 1982; Weiss et al., 1982; Willner et al., 1987], в которых в качестве психопатогенных факторов использовали стрессирующие воздействия, такие как неизбегаемый электроток в непредсказуемом режиме, чередование жестких или мягких стрессоров, в основном физической природы, часто оказывавших болевой эффект на животных. При моделировании аффективных расстройств исследователи также обращали внимание на последствия социальных взаимодействий животных [Пошивалов, 1986; Miczek, 1979; Kudryavtseva et al., 1991; Blanchard et al., 1993a; Koolhaas et al., 1997]. Было показано, что однократный [Koolhaas et al., 1997] или повторный [Kudryavtseva et al., 1991] опыт социальных поражений в агонистических взаимодействиях при определенных условиях приводит к появлению признаков депрессивно-подобного состояния у самцов мышей. Однако в этих экспериментальных работах не ставились задачи исследования возможной взаимосвязи и взаимовлияния тревожности и депрессии, о существовании которых было хорошо известно из клинических данных. Поэтому разработка модели смешанного тревожно-депрессивного состояния, которая позволяла бы исследовать механизмы его развития не только у самцов, но и у самок, является актуальной задачей. Надо отметить, что в настоящее время не существует социальной модели депрессии на самках [David et al., 2001; обзор Palanza, 2001; Palanza et al., 2001], формирование которой имеет, несомненно, свою специфику.

Центральная роль серотонергической системы мозга при депрессивных расстройствах подтверждена большим числом клинических и преклинических данных. Однако, несмотря на это, до сих пор не идентифицированы основные нарушения ее функционирования при депрессии [обзоры Brown et al., 1994; Staley et al., 1998; Ressler, Nemeroff, 2000; Nestler et al., 2002; Elhwuegi, 2004], а существующие данные не позволяют однозначно говорить о механизмах серотонергической регуляции этой психопатологии [Kaplan, Mann, 1982; Janowsky et al., 1987; Healy, Leonard, 1987; Coppen, Doogan, 1988; Delgado et al., 1990; Owens, Nemeroff, 1994; Burrows, Norman, 1996; Smith et al., 1997]. Первоначально была выдвинута гипотеза о гипофункции серотонергической системы мозга [Schildkraut, 1965; Lapin, Oxenkrug, 1969], однако, в последующем предполагалось и повышение её активности при депрессии [обзор Brown et al., 1994]. Полагали, что при депрессии существует дефицит серотонина (5-HT) в мозге [обзор, Попова и др., 1978; Coppen, Doogan, 1988; обзоры Brown et al., 1994; Van Praag, 2005], при этом находили нормальный и даже повышенный уровень 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) [Janowslky et al., 1987] в спинномозговой жидкости депрессивных больных. В целом, имевшиеся работы по изучению роли 5-НТ при депрессии не давали ясной картины патологического процесса [Brown et al., 1994; Deakin, 1996; McEwen, 2000ab]. Противоречивость литературных данных может быть объяснена тем, что, как правило, исследователи рассматривают депрессию как конечный результат, не принимая во внимание, что это процесс во времени, при котором активность серотонергической системы мозга может изменяться по мере усугубления патологии. И значит, необходимы подробные исследования динамических изменений серотонергической активности мозга (синтеза, катаболизма, рецепции) в зависимости от глубины развития психопатологии, что, несомненно, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью работы было - изучить динамику формирования и серотонергические механизмы тревожно-депрессивного состояния, вызванного у мышей линии C57BL/6J хроническим социальным стрессом.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Оценить особенности развития тревожности у самцов мышей линии C57BL/6J под влиянием хронического социального стресса и исследовать индивидуальное и социальное поведение животных в зависимости от длительности его действия.

2. Изучить показатели развития патологии поведения (ангедония, болевая чувствительность, персистентность), свидетельствующие о глубине формирования тревожно-депрессивного состояния у мышей.

3. Определить содержание 5-HT и его основного метаболита 5-ГИУК, активность ключевого фермента синтеза 5-НТ триптофангидроксилазы (ТПГ), а также фермента деградации моноаминоксидазы А (МАО А), число и аффинность серотониновых 5-HT1A рецепторов в различных структурах мозга на разных стадиях формирования тревожно-депрессивного состояния у мышей.

4. Исследовать эффекты однократного и хронического введения агонистов серотониновых 5-HT1A рецепторов 8-OH-DPAT, ипсапирона и буспирона, обладающих анксиолитическим действием, на поведение мышей, находящихся на разных стадиях развития тревожно-депрессивного состояния.

5. Исследовать эффекты хронического введения антидепрессантов флуоксетина и тианептина на поведение мышей при формировании тревожно-депрессивного состояния.

6. Изучить влияние длительного психоэмоционального воздействия на поведение самок мышей линии C57BL/6J.

Научная новизна исследования. Впервые представлены доказательства развития тревожно-депрессивного состояния у самцов мышей в условиях хронического социального стресса, удовлетворяющего всем критериям сходства с аналогичной патологией у людей: сходство симптоматики, чувствительности к антидепрессантам и анксиолитикам, нейрохимических изменений серотонергической активности мозга. Прежде всего, показано, что в этих экспериментальных условиях у животных формируется выраженная тревожность, развивается ангедония, снижается болевая чувствительность, что свидетельствует о глубине развития патологии поведения. Изменения в социальном и индивидуальном поведении животных имеют динамический характер и усугубляются на фоне неизбегаемого социального стресса.

Впервые показано, что в процессе формирования тревожно-депрессивного состояния у мышей происходит изменение чувствительности 5-HT1A рецепторов, специфически отражающее изменение активности серотонергической системы мозга на уровне синтеза и катаболизма 5-НТ (содержание 5-HT, 5-ГИУК, активность ферментов ТПГ и МАО А) по мере углубления патологии поведения у мышей. Выраженность и направленность сдвигов в активности серотонергической системы зависят от структуры мозга и глубины патологического процесса.

Впервые выявлена различная эффективность анксиолитиков (8-ОН-DPAT, буспирона и ипсапирона) при хроническом введении мышам на фоне действующего стресса, а также антидепрессантов тианептина при превентивном, а флуоксетина при «лечебном» способах введения.

Впервые найдены экспериментальные условия, приводящие к формированию у самок мышей линии C57BL/6J тревожно-депрессивного состояния, позволяющие исследовать механизмы его формирования и оценивать эффекты психотропных препаратов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Экспериментальный подход, позволяющий моделировать состояние тревожной депрессии у самцов и самок мышей линии С57BL/6J, может быть полезен для изучения ее механизмов на разных стадиях развития - от нормы до глубокой патологии. Знание динамических изменений активности медиаторной системы мозга в процессе развития тревожной депрессии позволит предлагать адекватные методы фармакологической коррекции в зависимости от стадии болезни, исследовать механизмы действия и эффективность фармакологических препаратов с потенциальными антидепрессивными и анксиолитическими свойствами в условиях, приближенных к клиническим, и разрабатывать адекватную стратегию фармакологической коррекции состояния на конкретной стадии заболевания.

Результаты проделанной работы были использованы в лекционном курсе для врачей общей практики в рамках школы-семинара «Лимфосанация и оздоровительная медицина», ежегодно проводимой в Институте лимфологии СО РАМН (Новосибирск).

Положения, выносимые на защиту.

1. У самцов мышей линии C57BL/6J в условиях хронического неизбегаемого стресса, вызванного социальными поражениями в ежедневных межсамцовых конфронтациях, развивается тревожно-депрессивное состояние, сходное по симптоматике, этиологии, чувствительности к антидепрессантам и анксиолитикам и нейрохимическим изменениям в мозге с аналогичной патологией у людей.

2. В процессе развития тревожной депрессии, параллельно с изменениями индивидуального и социального поведения, у мышей наблюдаются динамические изменения синтеза, катаболизма и рецепции 5-НТ в мозге. Направленность, характер и выраженность возникающих изменений зависят от глубины патологического процесса и структуры мозга, вовлеченной в него.

3. У самок мышей линии C57BL/6J под влиянием длительного психоэмоционального воздействия, обусловленного содержанием в «агрессивной среде», происходят изменения в поведении, свидетельствующие о развитии тревожно-депрессивного состояния.

Апробация работы. Основные материалы работы были представлены и обсуждались на 2-ом, 3-ом и 4-ом Съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995 г., 1997 г. и 2002 г., соответственно), на Физиологическом Обществе в проблемном докладе «Этологические и серотонергические показатели тревожности» (Институт физиологии СО АМН, Новосибирск, 1996), на Международном Форуме «The Behavioural Pharmacology of Anxiety and Depression» (Bath, UK, 1997), на XIII Международной конференции Общества по исследованию агрессии (Mahwah, New Jersey, USA, 1998), на Международном Симпозиуме «Genetic and developmental psychoneuroendocrinology» (Новосибирск, 1999), на VIII Всероссийской конференции памяти Х.С. Коштоянца «Физиология нейротрансмиттеров» (Москва, 2000), на Международной междисциплинарной конференции по биологической психиатрии «Стресс и поведение» (Москва, 2001), на I Международном Симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Феодосия, Крым, Украина, 2002), на IV Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2003), на Международном междисциплинарном семинаре «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина» (Хургада, Египет, Африка, 2004), на 8-ом Европейском Конгрессе по Нейропсихофармакологии (8th ECNP) (Москва, 2005).

Публикации. Всего автором опубликовано 135 работ, по теме диссертации - 68, из них статей - 35, в том числе в зарубежной печати - 8.

Работа проводилась при поддержке фондов РФФИ (гранты №№ 98-04-49794; 00-04-49541; 02-04-48038), ИНТАС-РФФИ (грант № 97-798), Приоритетные направления генетики (грант № 2.071), Университеты России (грант № 3Н-377-94), Интеграционной программы СО РАН (грант № 146).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 265 страницах машинописного текста, содержит 63 рисунка и 39 таблиц. Список литературы включает 752 источника.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные животные. Эксперименты проводили на половозрелых самцах и самках мышей линий C57BL/6J (C57) в возрасте 2,5-4 мес. и массой тела 24-30 г. Животных разводили и содержали в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО РАН при световом режиме 12:12 часов (свет:темнота). С одномесячного возраста и до периода половой зрелости мыши находились в группах (6-8 особей) в клетках размером 36x23x12 см. В отдельных экспериментах использовали мышей линий CBA/Lac (СВА) и BALB/c (BALB).

Патологическое состояние у самцов мышей формировали в условиях хронического социального стресса, вызванного повторным опытом поражений в ежедневных межсамцовых конфронтациях [Kudryavtseva, 1991]. Для этого животных помещали в экспериментальные клетки размером 28х14х10 см, разделенные пополам прозрачной перегородкой с отверстиями, по одной мыши на отсек. Ежедневно во второй половине дня (15.00-17.00 часов) перегородку убирали на 10 мин, что приводило к межсамцовым конфронтациям, в результате которых выявлялись победители (агрессоры) и побежденные особи, ежедневно терпящие поражения (жертвы). После каждой конфронтации побежденного самца помещали в незнакомую клетку с другим агрессивным самцом за перегородкой. В результате были получены жертвы с ежедневным опытом поражений в 3-х (жертвы T3), 10-ти (жертвы T10), 20-ти (жертвы T20) и 30-ти (жертвы T30) межсамцовых конфронтациях. В соответствии с этим, критические периоды, в которые изучали возникающие изменения в поведении самцов мышей в процессе развития экспериментальной депрессии (от нормы до патологии) были обозначены как начальная стадия (Т3), стадия формирования депрессии (Т10) и стадия выраженной депрессии (стадия Т20 - Т30). В качестве контроля были взяты интактные групповые самцы, рассаженные по одному в аналогичные клетки на 5 дней. По предположению [Кудрявцева, 1999; Kudryavtseva, 1991] это минимальный срок, при котором снимаются последствия опыта социальных взаимодействий в группе и не развиваются эффекты социальной изоляции.

Психоэмоциональное воздействие (ПЭВ) на самок было обусловлено помещением каждой особи в одну половину клетки размером 28х14х10 см, разделенную перегородкой, за которой постоянно находился агрессивный самец, ежедневно атакующий другого самца, подсаживаемого к нему на 10-мин. После взаимодействия самцов, агрессора пересаживали к следующей самке (в другой клетке), отделенной перегородкой. Самки в течение всего эксперимента оставались на своей территории. Длительность ПЭВ была 1-2.5 мес.

Поведенческие тесты

Тест «перегородка» [Kudryavtseva, 1994] количественно оценивает коммуникативность мышей по поведенческой активности возле прозрачной перфорированной перегородки, расположенной посередине клетке, в реакции на партнера в соседнем отсеке. Определяли число подходов к перегородке и длительность нахождения возле нее, а также среднее время пребывания возле перегородки за один подход в течение 5-10 мин наблюдения. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), в котором поведение животных чувствительно к действию анксиотропных препаратов, является одним из наиболее общепринятых тестов для оценки тревожного состояния у грызунов [Lister, 1987; Rodgers, Cole, 1994]. Регистрировали время нахождения в открытых рукавах (ОР), центре и закрытых рукавах (ЗР) лабиринта (данные представлены в процентном соотношении времени нахождения в каждой части лабиринта к общему времени тестирования); число выходов в ОР, центр и ЗР, выраженное, как и время, в процентном соотношении; общее число входов/выходов в рукава и центр; число переходов из одного ЗР в другой; число заглядываний под лабиринт. При тестировании мышей в тесте «открытое поле» (ОП) (размером 80х80 см, расчерченном на квадраты 10х10 см и освещенным ярким светом (100 Вт) на расстоянии 1 м от поверхности поля), фиксировали латентное время первой побежки с центрального квадрата, число пересеченных квадратов, время и число вставаний на задние лапы (стойки), время и число грумингов за 5 мин теста. В тесте «исследовательская активность» у мышей фиксировали число и длительность высовывания носа в отверстия в крышке клетки размером 14х14х10 см, а также латентное время первого высовывания. Тест Порсолта («принудительное плавание», ПП) является чувствительным к действию антидепрессантов [Dalvi, Lucki, 1999; Porsolt et al., 1977a; 1978a] и используется для оценки состояния депрессивности у животных [Kudryavtseva et al., 1991; Cryan et al., 2002; обзор Cryan, Mombereau, 2004]. При тестировании каждую мышь помещали в стеклянный литровый стакан, наполненный водой (t=251С). За 5 мин теста оценивали время пассивного плавания (дрейф + полная неподвижность) в воде, а также латентное время до проявления первой иммобильности. В тесте «горячая площадка» мышей помещали на круглую площадку d=17.5 см, соединенную с термостатом, поддерживающим температуру площадки t=55°±1°С, и фиксировали латентное время от начала помещения особей на площадку до первого лизания лап. В тесте «кубик» клали деревянный кубик (3 см3) в центр домашней клетки (36x23x12 см), где находилась мышь, и регистрировали латентное время первого подхода мыши к кубику, число подходов и суммарное время исследования его. В тесте на половое распознавание самок помещали в стандартные клетки размером 36x23x12 см, в которых в двух противоположных углах были установлены прозрачные перфорированные перегородки, за одну из них помещали интактного группового самца, за другую - самку. Регистрировали латентное время первого подхода самок к сородичам, число подходов и длительность нахождения возле них за 10 мин наблюдения. При тестировании мышей на социальное распознавание за одной перегородкой находился агрессивный самец, за другой - жертва.

Все параметры поведения регистрировали с помощью прибора «Этограф», позволяющего определять частоту и длительность поведенческого акта. Проведение всех тестов проводили через сутки после последней конфронтации.

Дизайны поведенческих экспериментов

Исследование социального поведения. Изучали поведение самцов мышей во время 3-ей, 10-ой и 20-ой межсамцовой конфронтации. Оценивали число и длительность различных форм поведения: активное сопротивление агрессору (активная защита и бегство), пассивное сопротивление или защита, позы выжидания или затаивания, груминг, а также рыхление носом подстилки (опилок) в клетке. Отмечали также такие формы поведения у самцов, как позы «на спине» и «носом в угол», особенно выраженные на 10-ой и 20-ой конфронтации, соответственно.

Исследование персистентности патологии поведения у самцов. После 30 дней социального стресса все самцы были случайным образом разделены на 4 группы: 1) жертвы T30; 2) жертвы-А - жертвы Т30, находившиеся 2 недели в условиях сенсорного контакта с агрессором после социального стресса; 3) жертвы-Б - жертвы Т30 с последующим проживанием с самками в течение 1 недели; 4) жертвы-В - жертвы Т30 с последующим проживанием с самками в течение 2 недель. Предполагалось, что в двух последних случаях относительная комфортность жертв обусловлена отсутствием других самцов, являющихся пугающим компонентом среды, и сменой мотивации страха, которая с очевидностью имела место при совместном проживании с агрессором, на позитивную половую мотивацию.

Исследование развития ангедонии у мышей. Животным в условиях свободного выбора предъявляли 2 бутылочки, одна с водой, другая - с 1% сахарозой с добавлением ванилина (0,2%), обуславливающего привлекательность запаха для мышей, как было показано [Ducottet, Belzung, 2004]. Бутылочки каждый день меняли местами во избежание выработки предпочтения места. Предъявление раствора сахарозы жертвам начинали после 7-ой межсамцовой конфронтации, далее, раз в 5 дней определяли суточное потребление раствора. Межсамцовые конфронтации при этом продолжались в обычном режиме. У контрольных животных, рассаженных по одному, суточное потребление сахарозы замеряли в течение четырех последовательных дней.

Исследование ангедонии у мышей было проведено и при использовании другого гедонического стимула - сыра. При этом рассматривали не только потребление сыра жертвами на фоне межсамцовых конфронтаций, но измеряли также пищевую мотивацию после короткой сырной депривации (3 или 10 дней).

Фармакологические исследования

Для однократного введения препаратов использовали анксиолитики - агонисты 5-HT1A рецепторов (±)8-OH-DPAT [8-Hydroxy-2-(Di-n-propylamino)tetralin] (п/к, 0.1 и 0.5 мг/кг, Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Germany), ипсапирон (в/б, 3 мг/кг, Tropenwerke, Germany), буспирон (в/б, 1 мг/кг, Sigma Chemical Co., USA). Оценивали эффекты препаратов на поведение животных в тестах. Кроме того, было использовано 2 способа хронического введения препаратов - превентивное и «лечебное». Превентивное - ежедневное введение препаратов на фоне социального стресса, начиная с 5-ой межсамцовой конфронтации, в течение 14 дней. Далее исследовали поведение мышей в тестах (1 тест/день), продолжая при этом введение препаратов и межсамцовые конфронтации. Превентивно вводили анксиолитики - агонисты 5-HT1A рецепторов (8-OH-DPAT, ипсапирон, буспирон), а также антидепрессанты - флуоксетин (п/о, 25 мг/кг, «Акрихин», Москва) и тианептин (в/б, 10 мг/кг, Sigma Chemical Co., USA). Кроме этого было использовано «лечебное» введение флуоксетина (п/о, 15 мг/кг и 25 мг/кг, ежедневно в течение 14-17 дней) животным со сформированным патологическим состоянием, т.е. после 20 дней социального стресса. Проведение межсамцовых конфронтаций при этом прекращали.

Биохимические методы исследования

Содержание 5-HT и его метаболита 5-ГИУК в отделах головного мозга животных определяли флюориметрическим методом [Curson, Green, 1970], в модификации [Кудрявцева, Бакштановская, 1989], активность ТПГ - флюориметрическим микрометодом [Куликов и др., 1988; Kulikov et al., 1992], а активность МАО - по методу В.З. Горкина [1981]. Радиолигандное связывание [3H]8-OH-DPAT с 5HT1A рецепторами в мембранах мозга определяли по методу S.J. Peroutka и S.H. Snyder [1979], с небольшими модификациями [Пак (Августинович) и др., 1988]. Максимальное число мест рецепторного связывания (Bmax) и равновесную константу диссоциации (Kd) и их ошибок вычисляли линейно-регрессионным анализом [Корниш-Боуден, 1979].

Статистика. Были использованы однофакторный и двухфакторный дисперсионные анализы, непараметрический дисперсионный анализ Kruskal-Wallis, непараметрический U-критерий Mann-Whitney, непараметрический T-критерий Wilcoxon, t-критерий Стьюдента, представленные в программах «Statgrafics» и «Statistica-6.0». На рисунках приведены средние величины и их стандартные ошибки.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Длительные межсамцовые конфронтации в течение 30 дней вызывали заметные изменения в поведении самцов мышей в тесте «перегородка» (Рис. 1). Уже после 3-х межсамцовых конфронтаций происходило снижение числа и длительности нахождения жертв возле перегородки, за которой находился агрессивный самец. Это же наблюдалось у жертв Т10 и Т20. Полученные результаты свидетельствовали о снижении коммуникативности жертв. Поскольку коммуникативное поведение согласно S. File [1985] включает, как элемент, тревожный компонент, можно заключить о проявлении выраженной тревожности у мышей в условиях хронического социального стресса.

Рис. 1. Поведение самцов мышей в тесте «перегородка» после 3-х (Т3), 10-ти (Т10), 20-ти (Т20) и 30-ти (Т30) межсамцовых конфронтаций.

Хронический социальный стресс вызывал изменение поведения жертв и в тесте на тревожность ПКЛ. При этом по мере увеличения длительности действующего стресса поведение жертв всё более отличалось от поведения контрольных особей. После 3-х и 10-ти дней нарушались преимущественно показатели двигательной активности - общее число входов/выходов в рукава и число переходов, а также исследовательского поведения - заглядывания под лабиринт. После 20-ти конфронтаций были изменены 8 из 9 оцениваемых параметров, а после 30-ти - все параметры, в том числе были снижены число и время нахождения жертв в ОР лабиринта (Рис. 2), которые рассматриваются как основные показатели тревожности [Pellow et al., 1985; Lister, 1987; 1990; Rodgers, Cole, 1994].



Рис. 2. Число и время нахождения мышей в открытых рукавах ПКЛ после 3-х (Т3), 10-ти (Т10), 20-ти (Т20) и 30-ти (Т30) межсамцовых конфронтаций.

Таким образом, оба теста свидетельствовали о том, что у мышей С57 в условиях хронического социального стресса развивается высокий уровень тревожности. Кроме того, снижаются двигательная и исследовательская активность. Об этом же говорили и результаты тестов ОП и «исследовательская активность» (Таблица 1). По всем показателям в этих тестах жертвы Т30 отличались от контрольных мышей. Более того, увеличенная длительность пассивного плавания мышей в тесте Порсолта после хронического социального стресса свидетельствовала о высоком уровне депрессивности. Следовательно, можно говорить о том, что у мышей в условиях хронического социального стресса, обусловленного межсамцовыми конфронтациями, выраженная тревожность предшествует и сопровождает формирование экспериментальной депрессии (тревожно-депрессивное состояние, тревожная депрессия).

Таблица 1. Поведение контрольных мышей и жертв в тестах.

Параметры поведения	контроль	жертвы Т30
Открытое поле
Латентное время, сек	3.5 ± 1.5	132.9 ± 36.8 ***
Число квадратов	182.0 ± 13.1	21.2 ± 6.3 ***
Число стоек	31.2 ± 3.4	1.9 ± 0.6 ***
Длительность стоек, сек	40.4 ± 3.7	2.6 ± 1.0 ***
Исследовательская активность
Латентное время, сек	42.2 ± 25.9	108.1 ± 29.2 **
Число высовываний	11.9 ± 2.4	4.6 ± 0.9 *
Длительность высовывания, сек	16.4 ± 2.9	5.8 ± 1.4 **
Тест Порсолта
Латентное время, сек	129.7 ± 15.61	74.8 ± 6.5 **
Длительность пассивного плавания, сек	122.3 ± 13.6	159.9 ± 9.9 *

Примечание: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001 - по сравнению с контролем. U-критерий.

Развитие тревожно-депрессивного состояния сопровождалось снижением болевой чувствительности у мышей (Рис. 3). По мере увеличения числа межсамцовых конфронтаций у жертв постепенно увеличивалось латентное время до первого лизания лап на горячей площадке, жертвы Т30 достоверно отличались от интактного контроля по этому показателю.

Рис. 3. Латентное время первого лизания лап в тесте «горячая площадка» у самцов мышей после 3-х (Т3), 10-ти (Т10), 20-ти (Т20) и 30-ти (Т30) межсамцовых конфронтаций.

Изменялось и социальное поведение жертв во время межсамцовых конфронтаций в зависимости от длительности действующего стресса (Рис. 4). Активная защита от агрессора, особенно выраженная в первые дни конфронтаций, постепенно снижалась к 20 дню: на 3-ей конфронтации она составляла 15.5% от общего времени тестирования, на 10-ой - 10.4%, а на 20-ой - всего 1.8%. Кроме того, градуально снижалось бегство и увеличивалось время пассивной защиты жертв. К 20-му дню конфронтаций увеличивалось проявление позы «носом в угол». Таким образом, в условиях длительного социального стресса, при развитии тревожно-депрессивного состояния у самцов происходили изменения в структуре социального поведения: пассивные формы сменяли активные формы защиты и появлялись не характерные для интактного состояния позы «носом в угол».

Рис. 4. Социальное поведение жертв во время 3-ей (Т3), 10-ой (Т10) и 20-ой (Т20) межсамцовой конфронтации.

Как показало исследование, интактные самцы мышей линии С57 исходно проявляют боязливое поведение в отношении незнакомого предмета (кубика), помещенного в домашнюю клетку (Рис. 5). При сравнении с самцами мышей других генотипов (СВА и BALB) у них было повышенно латентное время первого подхода к кубику и укорочено время его исследования.

По мнению G. Griebel с соавторами [1993], избегание незнакомого предмета в домашней клетке может отражать у мышей повышенный уровень базовой тревожности, которая всегда присутствует в поведении человека [Speilberger, 1975] и животных [Lister, 1990; File, 1991; File, 1995]. Можно полагать, что обнаружен высокий уровень базовой тревожности у мышей линии С57, который в условиях хронического социального стресса обуславливает развитие патологической тревожности.

Рис. 5. Поведение самцов мышей линий С57, СВА и BALB в тесте «кубик»

Важным результатом, полученным у самцов мышей в условиях длительного социального стресса, было обнаружение развития ангедонии, одного из главных симптомов большой депрессии у людей [МКБ-10, 1992; DSM-IVR, 1994; Moreau, 2002]. Ангедония считается также главным признаком депрессии в экспериментальных моделях [Katz, 1982; Weiss et al., 1982; Willner, 1983; 1997b] и оценивается по снижению потребления животными раствора сахарозы. Было установлено, что интактные животные в условиях свободного выбора предпочитают потреблять 1% раствор сахарозы - более 70% от общего количества выпитой жидкости (Рис. 6). В отличие от них, жертвы уже после 7-го дня конфронтации демонстрировали сниженное как потребление, так и предпочтение сладкой раствора, которые оставались таковыми на протяжении всего периода действия социального стресса. При этом общее потребление жидкости во всех исследуемых точках не менялось.

Развитие ангедонии у мышей в условиях хронического социального стресса установлено и при использовании другого гедонического стимула - сыра (данные не представлены). В этом случае жертвы, также как и интактные мыши, предпочитали потреблять сыр (80% от потребляемой пищи), по сравнению со стандартным кормом (гранулы). Однако, после трехдневной сырной депривации у жертв обнаружено снижение интереса к сыру, в то время как известно, что депривация увеличивает аттрактивность предпочитаемой пищи [Sinclair, 1998; Spanagel, Holter, 1999; Neznanova et al., 2002]. У жертв была снижена пищевая мотивация, а также потребление сыра как за первый час (p<0.006) после депривации, так и за сутки в целом (p<0.045). Это может служить еще одним доказательством развития ангедонии у мышей, испытывающих социальный стресс.

Рис. 6. Снижение потребления и предпочтения раствора сахарозы жертвами Т8, Т13 и Т18.

Аффективные расстройства у людей считаются заболеванием, если они устойчивы и длятся не менее 2 недель [МКБ-10, 1992]. Естественно возникал вопрос, являются ли нарушения в поведении мышей, возникающие в условиях хронического социального стресса, длительными или они транзиторны и исчезают сразу по окончании психопатогенного воздействия? Для выяснения этого вопроса тревожно-депрессивных самцов помещали в комфортные условия. Содержание жертв 1-2 недели с самками не оказало существенного положительного влияния на их дальнейшее поведение в тестах (Рис. 7; Таблица 2).



Рис. 7. Поведение контрольных мышей (К), жертв Т30 (Т30), жертв-А (Ж-А), жертв-Б (Ж-Б) и жертв-В (Ж-В) в тесте ОП.

В тесте ОП число пересеченных квадратов и число/длительность стоек у жертв через одну (жертвы-Б) и две недели (жертвы-В) проживания с самками не достигали контрольных значений, хотя и были достоверно выше, чем у жертв Т30 (Рис. 7). Следует подчеркнуть, что у жертв, которые после прекращения конфронтаций содержались 2 недели в условиях только сенсорного контакта с агрессором (жертвы-А), также сохранялись нарушения в поведении в тесте ОП, и, как показал тест «перегородка», у них оставалась сниженной коммуникативность. Все параметры теста ПКЛ свидетельствовали о высоком уровне тревожности у жертв, проживших 1-2 недели с самками (Таблица 2). Был отмечен и высокий уровень депрессивности в тесте Порсолта у жертв-Б и жертв-В. Таким образом, условия комфортного проживания после прекращения действия социального стресса не сняли тревожно-депрессивного состояния и не улучшили существенно поведение жертв. Результаты исследования позволяют придти к заключению, что тревожная депрессия, индуцированная хроническим социальным стрессом, сохраняется у мышей и через две недели после прекращения действия патогенного фактора. Это говорит о персистентности развившейся психопатологии, а не об адаптивных изменениях в поведении, которые, как правило, проходят сами по себе после исчезновения угрожающих факторов, вызвавших ее.

Таблица 2. Поведение контрольных мышей и жертв, содержавшихся с самками одну (жертвы-Б) и две (жертвы-В) недели.

Параметры поведения	контроль	Жертвы-Б	Жертвы-В
ПРИПОДНЯТЫЙ КРЕСТООБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ
Число выходов в ОР, %	5.8 ± 1.4	1.9 ± 1.3	0.0 ± 0.0 *
Время в ОР, %	2.3 ± 0.6	0.3 ± 0.2 *	0.0 ± 0.0 **
Число выходов в центр, %	45.4 ± 4.6	45.8 ± 2.0	42.4 ± 1.8 **
Время в центре, %	16.9 ± 2.1	8.3 ± 1.6 **	4.7 ± 0.9 **
Число входов в ЗР, %	48.8 ± 5.2	52.4 ± 2.4 *	57.6 ± 1.8 **
Время в ЗР, %	80.8 ± 2.4	91.4 ± 1.6 **	95.3 ± 0.9 **
Общее число входов/выходов	22.4 ± 3.2	11.7 ± 3.0 *	9.2 ± 1.5 **
Число переходов	6.3 ± 1.3	2.0 ± 1.0 *	2.1 ± 0.8 *
Число заглядываний	3.3 ± 0.8	0.8 ± 0.3	0.7 ± 0.3 *
ТЕСТ ПОРСОЛТА
Латентное время, сек	129.7 ± 15.61	124.8 ± 28.7	95.9 ± 7.7 #
Пассивное плавание, сек	122.3 ± 13.6	160.1 ± 15.6 *	155.7 ± 6.8

Примечание: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001 - по сравнению с контролем;

# p<0.05; ## p<0.01 - по сравнению с жертвами Т30 (в Таблице 1).

Фармакологическим доказательством наличия у животных тревожно-депрессивного состояния является, согласно известным критериям валидности [McKinney, Bunney, 1969], обнаружение чувствительности наблюдаемых отклонений в поведении к корректирующему влиянию анксиолитиков и антидепрессантов, применяемых у людей. Поэтому у мышей, находящихся в условиях хронического социального стресса, исследовали эффекты превентивного введения агонистов 5-HT1A рецепторов (8-OH-DPAT, ипсапирон, буспирон), которые, наравне с анксиолитиком диазепамом, широко используются в медицине и фундаментальных исследованиях [Hjorth et al., 1982; De Vry et al., 1991; 1992; обзор Griebel, 1995; обзор Menard, Trait, 1999; обзор Graeff, 2002; Graeff, 2004].

Как показало исследование, превентивное введение 8-OH-DPAT (0.5 мг/кг) не оказывало протекторного влияния на поведение жертв в тестах ПКЛ и Порсолта и свидетельствовало о сохранении у них тревожно-депрессивного состояния.

В отличие от 8-OH-DPAT, превентивное введение ипсапирона (3 мг/кг) оказывало анксиолитическое влияние на поведение жертв в тесте ПКЛ. У них увеличивались время нахождения в ОР лабиринта, число выходов в них, общее число входов/выходов в рукава, число переходов из одного ЗР в другой и снижалось число входов в ЗР лабиринта (Таблица 3). Другой агонист 5-HT1A рецепторов - буспирон (1 мг/кг), по сравнению с ипсапироном, оказывал менее выраженное анксиолитическое влияние на поведение жертв в тесте ПКЛ, поскольку изменил 2 из 9 оцениваемых параметров. Достоверно увеличился основной параметр, время нахождения в ОР (p<0.046), свидетельствующий о снижении тревожности, а также число заглядываний под лабиринт (p<0.042). По другим параметрам (число выходов в ОР, число и время нахождения в ЗР и общее число входов/выходов) анксиолитическое влияние буспирона было на уровне тенденции. В обоих случаях наблюдаемые изменения говорили о снижении уровня тревожности у жертв на фоне введения агонистов. Кроме того, буспирон заметно предотвращал развитие высокого уровня депрессивности жертв в тесте Порсолта (Рис. 8).

Таблица 3. Поведение жертв T20 в тесте ПКЛ после хронического превентивного введения ипсапирона.

Параметры поведения	растворитель	ипсапирон
Время в ОР, %	0.26 0.16	1.33 0.41 *
Время в центре, %	4.11 1.10	5.49 0.76
Время в ЗР, %	95.63 1.22	93.17 1.13
Число выходов в ОР, %	4.22 2.37	11.00 1.81 *
Число выходов в центр, %	39.94 2.40	45.27 1.41
Число входов в ЗР, %	55.87 4.28	43.76 2.46 *
Общее число входов/выходов	6.00 1.30	11.25 1.90 *
Число переходов	0.11 0.11	1.75 0.61 *
Число заглядываний под лабиринт	1.22 0.43	2.17 0.64

Примечание: * p<0.05 - по сравнению с растворителем; U-критерий.

Рис. 8. Поведение жертв в тесте Порсолта после хронического превентивного введения буспирона.

Следует отметить, что буспирон по-прежнему широко применяется в клинике, в том числе при лечении депрессивных больных с сопутствующей тревожностью [Stahl, 1997; Lydiard, Brawman-Mintzer, 1998; Apter, Allen, 1999; Levine et al., 2001].

Таким образом, тревожность, развивающаяся у мышей в условиях хронического социального стресса, оказывается чувствительной к действию анксиолитиков, что является еще одним доказательством того, что рассматриваемая модель является моделью тревожной депрессии. Более того, полученные данные позволяют заключить, что тревожность, может быть одним из факторов, способствующих развитию депрессии в условиях хронического социального стресса у мышей, поскольку сохранение высокого уровня тревожности на фоне превентивного введения 8-OH-DPAT сопровождается сохранением депрессивного статуса у животных. И наоборот, снижение тревожности на фоне введения буспирона тормозит развитие депрессивности у мышей.

Помимо противотревожных средств, были исследованы эффекты используемых в клинике антидепрессантов тианептина («Коаксил») и флуоксетина («Прозак»). Несмотря на противоположные механизмы действия, оба антидепрессанта демонстрируют хорошую эффективность и безопасность при лечении депрессивного эпизода, повторяющейся депрессии и биполярного аффективного расстройства, а также тревожной депрессии [Wilde, Benfield, 1995; Levine et al., 2001; Loo et al., 2001; McEwen, Olie, 2005; Sheehan et al., 2005; Uzbekov et al., 2006]. Кроме того, препараты из группы селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, к которым относится флуоксетин, являются самыми эффективными средствами для лечения наиболее распространенных форм тревожности (генерализованной тревожности, паники, обсессивно-компульсивных расстройств, социальной фобии, посттравматических стрессорных расстройств), особенно в ситуации коморбидности их с депрессией [Levine et al., 2001].

Как показало наше исследование, хроническое превентивное введение тианептина (10 мг/кг) не повлияло на параметры поведения жертв в тестах ПКЛ и «перегородка», что предполагает отсутствие корректирующего влияния антидепрессанта на тревожность и коммуникативность на фоне действия социального стресса. Однако установлен выраженный антидепрессивный эффект тианептина на поведение жертв в тесте Порсолта (Рис. 9а), проявленный в снижении времени пассивного плавания. Другими исследователями [Watanabe et al., 1992] также было показано благотворное влияние на животных тианептина при введении на фоне действующего стресса (длительной 21-дневной рестрикции), антидепрессант был способен предотвращать даже структурные разрушения в гиппокампе мозга.

При «лечебном» способе введения эффективным был флуоксетин (Рис. 9б). Так, в тесте Порсолта антидепрессант оказывал выраженный дозо-зависимый эффект на основной показатель депрессивности: в дозе 15 мг/кг он вызывал заметное, а в дозе 25 мг/кг значительное снижение длительности пассивного плавания. На фоне введения растворителя этот параметр был увеличенным.

Превентивное введение флуоксетина, в отличие от «лечебного» способа, оказалось не эффективным и не влияло на состояние тревожности и депрессивности, а также на двигательную и исследовательскую активность у мышей. тревожность хронический стресс патология

Рис. 9. Эффект тианептина и флуоксетина на длительность пассивного плавания жертв в тесте Порсолта после хронического превентивного (а) и «лечебного» (б) введения.

Таким образом, антидепрессанты тианептин и флуоксетин оказывали выраженное положительное влияние на поведение тревожно-депрессивных животных. Однако, как обнаружено, эффекты препаратов зависели не только от класса используемых веществ, но также от режима (превентивное или «лечебное») введения.

Параллельно с поведенческими и фармакологическими экспериментами было проведено исследование серотонергической системы головного мозга, играющей ключевую роль в патогенезе тревожности и депрессии [обзоры Ressler, Nemeroff, 2000; Nestler et al., 2002a]. Ранее была выдвинута гипотеза о динамических изменениях серотонергической активности мозга в зависимости от длительности и глубины развивающегося патологического процесса [Кудрявцева, Бакштановская, 1988; Kudryavtseva et al., 1995]. Поэтому параметры, отражающие активность системы - уровни 5-НТ и 5-ГИУК, активности ферментов ТПГ и МАО А, а также состояния 5-HT1A рецепторов, определялись у жертв на разных стадиях формирования тревожно-депрессивного состояния.

На начальной стадии патологии (жертвы Т3) установлено снижение уровня 5-HТ в среднем мозге и повышение коэффициента катаболизма, что говорит об усиленном расходовании 5-НТ в этой структуре мозга (Рис. 10). В гипоталамусе и миндалине уровни 5-НТ были повышены, без существенных изменений уровней 5-ГИУК и коэффициентов катаболизма, что свидетельствует об увеличении синтеза медиатора. Во фронтальной коре, гиппокампе и стриатуме изменений по всем трем показателям не было, а в прилежащих ядрах несколько возрос коэффициент катаболизма. Полученные результаты свидетельствуют о возможной неспецифической активации серотонергической системы в ответ на острый социальный стресс, в первую очередь, в структуре, содержащей тела серотониновых нейронов (средний мозг), а также в лимбических структурах мозга (гипоталамус, миндалина).

На стадии формирования депрессии (жертвы Т10) ещё более повысился уровень 5-HТ, а также активность ТПГ в гипоталамусе (Рис. 11). В среднем мозге, стриатуме, фронтальной коре и гиппокампе исследуемые показатели серотонергической системы (Рис. 10) не отличались от контрольных значений. В то же время, в миндалине жертв Т10 обнаружено снижение уровня 5-ГИУК и тенденция в сторону снижения содержания 5-HT (p<0.09). Одновременно с этим в миндалине жертв Т10 установлено снижение активности фермента синтеза ТПГ (Рис. 11). В прилежащих ядрах найдено снижение как уровня 5-ГИУК, так и коэффициента катаболизма 5-ГИУК/5-HТ при неизмененном содержании 5-HТ (Рис. 10). Кроме этого была снижена активность фермента МАО А в стриатуме жертв Т10 (Рис. 11). Полученные результаты свидетельствуют о гипофункции серотонергической системы, преимущественно, в лимбических структурах мозга.

Рис. 10. Уровни 5-HT, основного метаболита (5-ГИУК) и коэффициента катаболизма (5-ГИУК/5-HT) в мозге самцов мышей после 3-х и 10-ти дней социального стресса.

Примечание: * p<0.05; ** p<0.01 - по сравнению с контролем; # p<0.05; ## p<0.01 - сравнение жертв Т3 и Т10; U-критерий. Здесь и на Рис. 11: СМ - средний мозг, ФК - фронтальная кора, Гт - гипоталамус, С - стриатум, М - миндалина, Гк - гиппокамп, ПЯ - прилежащие ядра.

На стадии выраженной депрессии (жертвы Т20) активность ТПГ в гипоталамусе еще более возросла по сравнению с контрольным уровнем и уровнем активности у жертв Т10 (Рис. 11). В гиппокампе, напротив, было постепенное снижение активности фермента ТПГ, достоверно выраженное у жертв Т20, а также фермента МАО А (Рис. 11), что говорит о гипоактивности серотонергической системы в этой структуре мозга как на уровне синтеза 5-НT, так и его катаболизма. В миндалине пониженная активность ТПГ на стадии Т10 постепенно повышалась и не отличалась у жертв Т20 от активности у контрольных мышей.

Рис. 11. Активности ферментов ТПГ и МАО А в отделах мозга самцов мышей после 10-ти и 20-ти дней социального стресса.

Однако в миндалине жертв Т20, как видно на графике Скэтчарда (Рис. 12), более чем в 2 раза было увеличено значение Bmax 5-HT1A рецепторов по сравнению с контролем и жертвами Т10, что, по-видимому, является компенсаторным ответом на гипофункцию серотонергической системы, установленную на предыдущей стадии. Одновременно с этим, как показывают величины Kd (4.46±0.68 нМ - жертвы Т20, 0.95±0.19 нМ - контроль и 0.97±0.14 нМ - жертвы Т10), связующая способность 5-HT1A рецепторов в миндалине жертв Т20 была достоверно ниже, чем у контрольных мышей и жертв Т10, что может отражать снижение чувствительности 5-HT1A рецепторов на этой стадии патологии.

О сниженной чувствительности 5-HT1A рецепторов в мозге жертв Т20 свидетельствовали и фармакологические данные, полученные после однократного введения 8-OH-DPAT (0.1 и 0.5 мг/кг). Введение агониста дозо-зависимо изменяло поведение контрольных животных и жертв Т10. В тесте ПКЛ установлено достоверное влияние агониста на 8 из 10-ти оцениваемых параметров у контрольных животных и на 6 из 10-ти - у жертв Т10, с максимальным эффектом агониста в дозе 0.5 мг/кг для обеих групп. Однако у жертв Т20, в отличие от контрольных мышей и жертв Т10, агонист в максимальной дозе 0.5 мг/кг не повлиял ни на один из 10 оцениваемых параметров. Так же, как и в тесте ПКЛ, в тесте «перегородка» после введения агониста 8-OH-DPAT изменялось поведение у контрольных мышей и жертв Т10, при этом в большей степени в дозе 0.5 мг/кг, но не у жертв Т20 (Рис. 13).

Рис. 12. Графики Скэтчарда для специфического связывания [3H]8-OH-DPAT с 5-HT1A рецепторами в миндалине мышей.

Аналогично, разный эффект, в зависимости и стадии формируемой патологии поведения, был установлен для другого агониста 5-HT1A рецепторов - ипсапирона (3 мг/кг). В тесте ПКЛ ипсапирон снизил основные показатели тревожности - время нахождения и число выходов в открытые рукава у контрольных животных, но не оказывал влияния на поведение жертв Т20.



Рис. 13. Влияние однократного введения 8-OH-DPAT (0.5 мг/кг) на параметры поведения контрольных мышей и жертв Т20 в тесте «перегородка».

...