46

Размещено на http://www.allbest.ru/

Физиологические особенности тромбоцитарного гемостаза у новорожденных телят в норме и при функциональных нарушениях пищеварения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

03.00.13 - физиология

Горяинова Инга Анатольевна

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре адаптивной физической культуры и спорта ГОУ ВПО "Курский институт социального образования (филиал) Российского государственного социального университета"

Научный консультант:

доктор медицинских наук Медведев Илья Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Максимов Владимир Ильич

Доктор биологических наук, профессор Матвеев Валерий Алексеевич

Доктор биологических наук, профессор Грушкин Александр Георгиевич

Ведущая организация: ГНУ "Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства"

Защита диссертации состоится "17" декабря 2008г. в12-30 часов на заседании совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 220.042.04 при ФГОУ ВПО Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им.К.И. Скрябина"

Автореферат разослан "___" ___________ 200 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент Фомина В.Д.

тромбоцитарный гемостаз новорожденность пищеварение

Список принятых сокращений

Изучить состояние тромбоцитарных функций у физиологически зрелых здоровых новорожденных телят;

Исследовать состояние тромбоцитарных функций у телят имеющих функциональные нарушения пищеварения в фазу новорожденности, находящихся в обычных хозяйственных условиях выращивания;

Определить в плазме крови и тромбоцитах здоровых телят в фазу новорожденности содержание средних молекул, активность перекисного окисления липидов, уровень антиоксидантной защиты и липидный состав кровяных пластинок;

Определить динамику содержания средних молекул, активности перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной защиты плазмы крови и тромбоцитов, изменения липидного состава кровяных пластинок предрасполагающую к развитию тромбоцитарных дисфункций у новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения;

Оценить в плазме крови и тромбоцитах телят с функциональными нарушениями пищеварения в фазу новорожденности содержание средних молекул, активность перекисного окисления липидов, состояние антиоксидантной защиты и липидного состава кровяных пластинок;

Определить степень влияния различных подходов к коррекции тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения;

Разработать и апробировать способ профилактики тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения.

Научная новизна исследования

Впервые у здоровых физиологически зрелых и физиологически незрелых новорожденных телят, до возникновения функциональных нарушений пищеварения и после их развития изучено состояние первичного гемостаза, антиоксидантной защиты тромбоцитов, липидный состав их мембран, активность ПОЛ, и установлено гематологическими исследованиями у телят, подверженных риску возникновения функциональных нарушений пищеварения, что еще до проявления внешне выраженных признаков расстройства пищеварения выявляются повышенный уровень средних молекул, активация ПОЛ и ослабление антиоксидантной защиты жидкой части крови и тромбоцитов с признаками тромбоцитопатии.

Разработан и апробирован способ коррекции функциональных нарушений пищеварения у новорожденных телят, нормализующий активность тромбоцитов, включающий в себя сочетание "Фосфопага", энтеросорбента "Экос" и кальция глюконата.

Полученные данные о повышенном содержании в плазме крови средних молекул, активизации ПОЛ плазмы и тромбоцитов при наличии мембранопатии кровяных пластинок у новорожденных телят с обязательно развивающимися у них в последующем функциональных нарушений пищеварения и тромбоцитопатии, позволяет считать эти изменения ранними предвестниками их развития и служить основанием для проведения мер профилактики, направленных на нормализацию свойств тромбоцитов.

Для практического применения предложен способ профилактики развития функциональных нарушений пищеварения и тромбоцитопатии у новорожденных телят с нормализацией у них субфизиологических нарушений первичного гемостаза, включающий сочетание "Фосфопага", энтеросорбента "Экос" и кальция глюконата.

Практическая значимость работы

Установлено, что у физиологически зрелых телят в течение всей фазы новорожденности сохраняется стабильность функционального состояния кровяных пластинок, способствуя адаптации организма животного к внеутробному существованию.

Выяснена патогенетическая роль повышения уровня средних молекул, активации ПОЛ, ослабления антиоксидантной защиты плазмы и тромбоцитов в формировании реологических нарушений тромбоцитов у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения, что открывает новое направление для поиска средств нормализации первичного гемостаза.

Проведенная апробация различных корректирующих подходов (традиционная коррекция, сорбент "Экос", "Биопаг-Д", "Фосфопаг", сочетание "Фосфопага" и "Экоса", а также сочетание "Фосфопага", "Экоса" и кальция глюконата) позволила выявить наиболее эффективный способ коррекции тромбоцитопатии при функциональных нарушениях пищеварения и их профилактики у новорожденных телят, состоящий из "Фосфопага", "Экоса" и кальция глюконата, способный полностью нормализовывать липидный состав мембран тромбоцитов, антиоксидантную защиту, активность ПОЛ плазмы и кровяных пластинок и реологические дисфункции тромбоцитов, исключая тромботические осложнения, нарушения микроциркуляции и ослабление трофики тканей растущего организма.

У новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения для профилактики развития тромбоцитопатии необходимо восьмидневное применение сочетания "Фосфопага", "Экоса" и глюконата кальция.

Основные положения, выносимые на защиту

Показатели тромбоцитарного гемостаза у здоровых телят характеризуются стабильностью показателей в фазу новорожденности.

При функциональных нарушениях пищеварения у новорожденных телят происходит активация тромбоцитарного гемостаза с усилением агрегации кровяных пластинок in vivo и in vitro.

Реологические свойства кровяных пластинок при функциональных нарушениях пищеварения у новорожденных телят изменяются в результате повышения активности ПОЛ и увеличения содержания средних молекул в плазме крови и тромбоцитах, что способствует ухудшению микроциркуляции.

Применением "Фосфопага", глюконата кальция и сорбента "Экос" у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения можно корректировать уровень средних молекул, активность ПОЛ, антиоксидантную защиту плазмы и тромбоцитов, и тем самым способствовать выздоровлению животных.

Комплекс препаратов, включающий "Фосфопаг", глюконат кальция и сорбент "Экос" у физиологически незрелых новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения нормализует субфизиологические отклонения в тромбоцитарном гемостазе.

Реализация результатов исследования. Полученные данные внедрены в работу ветеринарной службы Фатежского, Советского, Суджанского, Октябрьского, Золотухинского, Курского, Железногорского, Обоянского, Конышовского районов Курской области и в педроцесс в Белгородской сельскохозяйственной академии.

Апробация. Апробация проведена на расширенном заседании кафедры АФК и спорта КИСО (филиал) РГСУ, кафедры физиологии Курской государственной сельскохозяйственной академии им.И. И. Иванова с привлечением сотрудников Белгородского государственного университета, Белгородской сельскохозяйственной академии и Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН 27 декабря 2007г.

Публикации. Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции "Экология, окружающая среда и здоровье населения Центрального Черноземья (2005), X съезде биохимиков Украины (2006), Международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества (2007, 2008), IV научной конференции с международным участием "Проблемы агропромышленного комплекса (2007), XI Международной научно-производственной конференции "Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения" (2007),19 Международной межвузовской научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (2007), научном симпозиуме специалистов, молодых ученых и студентов "Адаптивные реакции в биологии и медицине" (2007, 2008) в рамках Международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества".

По теме диссертации опубликованы 62 работы, в т. ч.2 монографии, 9 статей в журналах, вошедших в перечень, рекомендованный ВАКом, получено 3 патента на изобретение.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы, содержащей 364 отечественных и 78 зарубежных источника, двух приложений, полностью раскрывающих суть примененных корректирующих подходов. Диссертация изложена на 250 страницах машинописи, включает 57 таблиц и 34 рисунка.

Материал и методы

Характеристика обследованных телят

Материалы диссертации получены при работе в Курском институте социального образования (филиал) РГСУ совместно с Медведевым Ильей Николаевичем и Беловой Татьяной Александровной, давших согласие на их оформление в виде диссертационного исследования.

Под наблюдением находились телята хозяйств Курской области. В исследование включались здоровые новорожденные телята сементальской и чернопестрой породы в день отела от здоровых коров 1-2 отела с нормально протекавшей беременностью и не имевших отклонений в результатах лабораторных анализов согласно использованных в настоящей работе методов. Во время беременности коровы, полученные от которых телята были включены в настоящее исследование, находились на рациональном режиме питания (Калашников А.П., 2003). Общее количество телят, прошедших первичный осмотр и обследование, составило 449 голов. Здоровые телята осматривались и обследовались за период новорожденности 5 раз (1-2 сут., 3-4 сут., 5-6 сут., 7-8 сут., 9-10 сут.). Все оставшиеся здоровыми телята были физиологически зрелыми. В случае возникновения признаков ФНП у теленка не позднее, чем через 0,5 суток, определялись все оцениваемые показатели и применялся в течение последующих 10 дней один из используемых в работе видов коррекции с оценкой тех же показателей по ее завершению. Общее число телят, у которых за период новорожденности развились ФНП, составило соответствующая коррекция с оценкой тех же аемые показатели и применялась в течении последующий 10 дней 153 (36,7%), при этом 296 (63,3%) остались здоровыми, в т. ч.29 здоровых новорожденных телят с риском облигатного развития ФНП, которым был проведен курс успешной профилактической коррекции. Из новорожденных телят с развившимися ФНП 146 (95,4%) имели признаки физиологической незрелости. Содержание новорожденных животных осуществлялось в стандартных условиях телятника при нередко избыточной выпойке молозивом.

С учетом способа коррекции тромбоцитарных нарушений новорожденные телята с ФНП были подразделены на 6 групп. Количество новорожденных животных с ФНП в группах составило соответственно 25 (16,4%), 25 (16,4%), 25 (16,4%) 25 (16,4%), 27 (17,4%) и 26 (17,0%). В первой группе новорожденных телят с ФНП в течение 10 суток коррекцию производили с помощью традиционного для данных хозяйств подхода, включающего голод на 10-12 часов с последующим назначением небольших доз молозива (1/4 от обычного количества) 5-6 раз в сутки с постепенным доведением его объема молозива до нормы. За 15 мин до выпаивания телятам давали 50,0мл натурального желудочного сока, разбавленного 50,0мл теплой воды.

Вторую группу составили телята, которым в схему выпаивания вечером включали в виде водной взвеси гидроалюмосиликатный сорбент - "Экос" (производство Белгородского государственного университета) 150мг/кг живой массы в течение 10 суток на ночь.

В третьей группе животных коррекцию производили выпаиванием утром 0,01% раствора полигексаметиленгуанидин хлорида ("Биопаг-Д", производства Института эколого-технологических проблем г. Москва) по 100,0 мл в сутки в течении 10 дней.

Четвертая группа новорожденных телят находилась на коррекции с помощью выпаивания утром полигексаметиленгуанидин фосфата ("Фосфопаг", производства Института эколого-технологических проблем г. Москва) в растворе 0,01% по 100,0 мл в сутки в течении 10 дней.

В пятой группе новорожденных телят с ФНП в течение 10 дней применялось сочетание "Фосфопага" и "Экос" с распределением их в течение суток следующим образом: 0,01% "Фосфопага" 100,0 в утренние часы, а "Экос" 150мг/кг на ночь для исключения сорбции "Экосом" "Фосфопага".

В шестой группе новорожденных телят в течение 10 суток было применено сочетание 0,01% "Фосфопаг" 100,0 мл утром, 10% 10,0 мл глюконата кальция в обед и "Экос" 150мг/кг вечером.

Группа контроля представлена 267 здоровыми новорожденными телятами, не имевшими отклонений в объективном статусе и в результатах лабораторных исследований.

Группа профилактической коррекции представлена 29 здоровыми новорожденными телятами с риском облигатного развития ФНП, обследованных в суточном возрасте. С целью профилактики ФНП и нивелирования зарегистрированных у них отклонений, проводился 8-дневный превентивный курс коррекции: 0,01% "Фосфопаг" 100,0 мл утром, 10% 10,0 мл кальция глюконат в обед и "Экос" 150мг/кг вечером.

Методы исследования

Морфо-биологический анализ крови включал определение эритроцитов и лейкоцитов (Битюков И.П. и др., 1990); гемоглобина - гемоглобинцианидным методом; гематокритной величины - по И. Тодорову (1963); общего белка в сыворотке крови (Колб В.Г. и др., 1982).

Активность перекисного окисления липидов в плазме оценивалась по содержанию ТБК-активных продуктов набором фирмы ООО „Агат-Мед" и ацилгидроперекисей (Гаврилов В.Б. и соавт., 1983). Для оценки антиокислительного потенциала жидкой части крови определялась ее антиокислительная активность по Волчегорскому И.А. и соавт. (2000). В плазме оценивали уровень средних молекул по Габриелян Н.Г., Липатова В.И. и др. (1985) при 280нм и 254нм.

Состояние внутритромбоцитарного ПОЛ определяли по концентрации базального уровня МДА в реакции восстановления тиобарбитуровой кислотой в отмытых и ресуспендированных тромбоцитах на основе принципа метода Shmith J. B. et al. (1976) в модификации Кубатиева, А.А., Андреева С.В. (1979) и содержанию ацилгидроперекисей (Гаврилов В.Б. и соавт., 1983). В отмытых и ресуспендированных тромбоцитах определяли содержание средних молекул по Габриелян Н.Г., Липатова В.И. и др. (1985) при 280нм и 254нм., уровни общего холестерина энзиматическим колориметрическим методом набором „Витал Диагностикум” и общих фосфолипидов по содержанию в них фосфора (Колб, В.Г. и др., 1982) с последующим расчетом отношения ХС/ОФЛ в тромбоцитах. Активность внутритромбоцитарных антиоксидантных ферментов устанавливали для каталазы и супероксиддисмутазы (Чевари С. и др., 1991).

Подсчитывали количество тромбоцитов в капиллярной крови в камере Горяева. Агрегационная активность тромбоцитов оценивалась визуальным микрометодом по Шитиковой А.С. (1999) с использованием в качестве индукторов АДФ (0,5Ч10^-4 М.), коллагена (разведение 1: 2 основной суспензии), тромбина (0,125ед/мл.), ристомицина (0,8 мг/мл.), адреналина (5,0Ч10^-6 М.), а также сочетания АДФ+адреналин, АДФ+коллаген и коллаген+адреналин в приведенных концентрациях.

Продукты лабилизации тромбоцитарных фосфолипидов - активаторы свертывания (Ф_{3 -} тромбоцитов) оценивали по методу Е.Д. Еремина (1974) с вычислением индекса тромбоцитарной активности. Активность и время образования тромбоцитарного тромбопластина выявляли по методу Biggs R., Douglas A. S., Macfarlane R. G. (1953).

Для косвенной оценки обмена эндогенной арахидоновой кислоты в тромбоцитах, а также активности в них циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы - ферментов, непосредственно осуществляющих образование тромбоксана в кровяных пластинках, использованы три пробы переноса по методу Ермолаевой Т.А. и соавт. (1992) с регистрацией агрегации тромбоцитов на фотоэлектроколориметре.

Морфологическое определение внутрисосудистой активности тромбоцитов производилось с использованием фазово-контрастного микроскопа по методу Шитиковой А.С. и соавт. (1997).

Производилось измерение температуры тела животного, подсчет ЧСС, ЧДД при каждом осмотре.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия (t) Стьюдента и коэффициента корреляции (r) (Бредерфорд Хилл А., 1958; Углова М.В. и др., 1982).

Результаты исследований и их обсуждение

Динамика состояния здоровых телят в фазу новорожденности

Общая физиологическая характеристика здоровых новорожденных телят

Все взятые в исследование животные находились под постоянным наблюдением. Перед каждым исследованием в течение всего периода новорожденности у них определяли основные физиологические параметры, проводили морфологический и биохимический анализы крови, показавшие, что оцениваемые общие функциональные и биохимические величины у здоровых новорожденных телят в течение всего периода новорожденности находились в пределах физиологической нормы, достоверно не отличаясь от исследования к исследованию.

Содержание средних молекул и продуктов ПОЛ в плазме крови здоровых новорожденных телят

Уровень СМ и ПОЛ плазмы в исходном состоянии определяли у всех 267 здоровых новорожденных телят.

Уровень СМ у здоровых телят в возрасте (1-2 суток) составлял СМ ₂₈₀ 0,36±0,04 усл. ед., СМ ₂₅₄ 0,28±0,01 усл. ед., в последующем оставался на данном уровне в течение всей фазы новорожденности.

Уровень ТБК-активых продуктов в жидкой части крови здоровых новорожденных животных составил: 1-2 сут. - 3,90±0,04 мкмоль/л, 3-4 сут. - 3,98±0,07 мкмоль/л, 5-6 сут. - 3,89±0,07 мкмоль/л, 7-8 сут. - 3,95±0,08 мкмоль/л, 9-10 сут. - 3,94±0,03 мкмоль/л. Содержание АГП у них составляло: 1-2 сут. - 1,80±0,06 Д₂₃₃/1мл, 3-4 сут. - 1,96±0,04 Д₂₃₃/1мл, 5-6 сут. - 1,99±0,02 Д₂₃₃/1мл, 7-8 сут. - 1,88±0,09 Д₂₃₃/1мл, 9-10 сут. - 1,94±0,01 Д₂₃₃/1мл, соответственно, указывая на отсутствие достоверной динамики уровня ПОЛ плазмы в период новорожденности у телят. Найденный уровень пероксидации был возможен в результате стабильности антиоксидантной защиты организма животных в первые 10 суток жизни - их антиоксидантный потенциал плазмы составлял в среднем 28,6±0,04%, колеблясь от 28,0±0,03% до 28,9±0,04%.

Таким образом, у здоровых телят в фазу новорожденности выявлено постоянство содержания СМ и ПОЛ плазмы при отсутствии достоверной динамики АОА плазмы, что указывало на стабильность механизмов их регулирующих у здорового молодняка крупного рогатого скота в первые 10 дней жизни.

Средние молекулы, ПОЛ и антиоксидантная защита тромбоцитов у здоровых новорожденных телят

В течение первых 10 дней жизни у здоровых телят в составе мембран тромбоцитов в среднем содержалось холестерина и ОФЛ 0,73±0,001мкмоль/10⁹тр. и 0,49±0,002 мкмоль/10⁹тр., соответственно, при уровне соотношения ХС/ОФЛ в тромбоцитах 1,48±0,01, что указывало на стабильность в данный возрастной период жесткости и текучести их мембран. Это создавало условия стабильности уровня ПОЛ в кровяных пластинках и, в конечном счете, активности тромбоцитов, позволяя сохранить у животных микроциркуляцию на оптимальном уровне в течение периода адаптации их организма к условиям внешней среды.

Концентрация первичных продуктов ПОЛ-АГП в тромбоцитах здоровых телят в возрасте 1-2 суток находилась на уровне 2,90±0,02 Д₂₃₃/10⁹тр., достоверно не меняясь в течение всей фазы новорожденности, составляя в среднем 2,87±0,04 Д₂₃₃/10⁹тр. При этом, уровень базального МДА в тромбоцитах - конечного продукта ПОЛ в 1-2 сутки жизни у телят составил 0,86±0,05 нмоль/10⁹тр., также не меняясь в течение всего периода, составляя в среднем за весь период 0,89±0,02 нмоль/10⁹тр.

Стабильность уровня ПОЛ в тромбоцитах здоровых новорожденных телят стала возможной вследствие неизменности в данную фазу их антиоксидантной защиты и, в первую очередь, каталазы и супероксиддисмутазы 10500,0±11,05 МЕ/10⁹тр. и 1780,0±2,06 МЕ/10⁹тр., соответственно.

В течение всей фазы новорожденности количество СМ₂₈₀ и СМ₂₅₄ в кровяных пластинках также было стабильным, составляя в среднем 0,050±0,004усл. ед/10⁹тр. и 0,055±0,004 усл. ед. /10⁹тр., соответственно.

Таким образом, в мембранах тромбоцитов здоровых телят, в течение всей фазы новорожденности содержание ХС, ОФЛ остается стабильным, испытывая слабые незначительные колебания. Это во многом обуславливает постоянный уровень актиоксидантной защиты кровяных пластинок с сохранением стабильности в тромбоцитах содержания СМ, продуктов ПОЛ, обеспечивая адаптацию структур тромбоцитов к условиям внеутробного существования.

Тромбоцитарный гемостаз у здоровых новорожденных телят

Исследование тромбоцитарного гемостаза у здоровых новорожденных телят выявило отсутствие достоверной динамики оцениваемых функций кровяных пластинок при сохранении содержания количества тромбоцитов в кровотоке животных в границах нормы.

Показатель ИТА, являющийся высоко значимым показателем при оценке активации тромбоцитов при стимуляции процесса свертывания крови, составлял в первые двое суток жизни телят 25,3±0,05%, оставаясь на данном уровне в течение всей новорожденности. У здоровых телят была установлена стабильность активности тромбопластина за фазу новорожденности, составляв среднем 14,0±0,05с. при времени его образования 2,40±0,01мин.

Одной из причин стабильности состояния АТ у телят в фазу новорожденности можно считать отсутствие динамики уровня обмена арахидоновой кислоты в тромбоцитах при оптимальном уровне тромбоксанообразования, косвенно зарегистрированного в простой пробе переноса (30,3± 0,01%).

Стабильный уровень метаболизма АА в кровяных пластинках здоровых новорожденных телят отмечался во многом вследствие отсутствия достоверной динамики двух ключевых ферментов ее превращения в тромбоцитах - циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы. Восстановление АТ в коллаген-аспириновой пробе, косвенно оценивающей активность ЦО в тромбоцитах в среднем в этот возрастной период составляло 78,4±0, 19%. Восстановление АТ в коллаген-имидазольной пробе, позволяющей косвенно определить состояние ТС в кровяных пластинках, также не испытывало у телят в период новорожденности достоверных колебаний, составляя в среднем 39,2±0,02%.

У новорожденных в 1-2 суточном возрасте время развития АТ под влиянием коллагена составляло 29,4±0,26с., находясь на данном уровне в в течение всей новорожденности. Аналогичная динамика АТ у здоровых новорожденных животных отмечена под влиянием АДФ (в среднем 39,0±0,28с.) и ристомицина (в среднем 41,0±0,26с.). В более поздние сроки развивалась тромбиновая и адреналиновая АТ, также при отсутствии их достоверной динамики в течение периода новорожденности, составляя в среднем за фазу 54,0±0,2с. и 97,0±0,45 с., соответственно. Установленное отсутствие динамики АТ у новорожденных телят при изолированном применении индукторов согласовалось со стабильностью у них времени развития АТ на фоне их сочетания, имеющего место в реальных условиях кровотока, позволило в большей степени приблизить наше представление об АТ in vivo у здоровых животных к реально возникающему в их кровяном русле агрегационному процессу тромбоцитов в течение всей фазы новорожденности, подтвержденной динамикой ВАТ.

Уровень дискоцитов в крови у здоровых новорожденных телят в первые 1-2 суток жизни составил 76,1±0,03%, достоверно не меняясь на протяжении всего периода новорожденности (в среднем - 82,0±0,16%). Количество диско-эхиноцитов в их кровотоке (в среднем 10,3±0,1%), а также содержание сфероцитов, сферо-эхиноцитов и биполярных форм тромбоцитов, также оставалось стабильным на протяжении всей фазы новорожденности. Вследствие этого сумма активных форм тромбоцитов также не претерпела достоверных изменений, составляя в среднем 18,0±0,2%. В кровотоке новорожденных телят уровни свободноциркулирующих малых и больших агрегатов тромбоцитов не имели достоверной динамики, составляя в начале периода новорожденности 3,4±0,06 и 0,15±0,03 на 100 свободно лежащих тромбоцита и в конце 3,8±0,06 и 0,13±0,02 на 100 свободно лежащих тромбоцита, соответственно. Количество тромбоцитов, вовлеченных в процесс агрегатообразования, у здоровых телят на начало, и конец фазы новорожденности составило 5,3±0,08% и 5,3±0,02%. Эти данные говорят о достоверной стабильности ВАТ in vivo в течение всего периода новорожденности у здоровых телят, обеспечивая у них оптимальную микроциркуляцию во время адаптации к внеутробному существованию.

Таким образом, стабильность активности кровяных пластинок у здоровых новорожденных телят обуславливает постоянство у них ВАТ, оптимальный уровень реологии крови и микроциркуляции в тканях, способствуя нормальному росту и развитию животных. Важную роль в этом играет отсутствие достоверной динамики в первые 10 дней жизни у телят содержание в плазме и тромбоцитах СМ и ПОЛ.

Исходное состояние новорожденных телят с ФНП

Общая характеристика новорожденных телят с ФНП

Уровень СМ у здоровых телят (1-2 суток) до развития у них ФНП был повышен против контроля, дополнительно увеличиваясь при их возникновении.

Наряду с ростом уровня СМ у телят с ФНП обнаружена активация ПОЛ плазмы. Уровень ТБК-активых продуктов в жидкой части крови этих животных был в 1,3 раза выше, чем в группе контроля, причем перед развитием ФНП он превышал контроль в 1,1 раза. Содержание АГП в плазме также было выше контрольных значений, нарастая с 2,80±0,01 Д₂₃₃/1мл до 3,50±0,01 Д₂₃₃/1мл. Усиление пероксидации стало возможным в результате ослабления антиоксидантной защиты организма животных - антиоксидантный потенциал плазмы на фоне ФНП у них снижался с 23,6±0,03% до уровня 20,3±0,1%.

Таким образом, у телят с ФНП при исследовании содержания СМ крови и ПОЛ плазмы установлено увеличение данных показателей перед возникновением ФНП, дополнительно повышающихся на фоне их развития.

Биохимические показатели тромбоцитов у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения

Установлено, что в составе мембран тромбоцитов телят с ФНП было повышено содержание холестерина и снижено ОФЛ, сопровождаясь увеличением соотношения в них ХС/ОФЛ, что обуславливало повышение жесткости и уменьшение текучести их мембран. Это создавало условия для усиления ПОЛ в кровяных пластинках и в конечном счете активации тромбоцитов (табл.1).

Таблица 1. Биохимические показатели тромбоцитов у новорожденных телят с ФНП

Условные обозначения: Р - достоверность различий между группой телят с ФНП и контролем, Р₁ - достоверность различий до и после развития ФНП у телят, Р₂ - достоверность различий между здоровыми телятами с развившимися в последующем ФНП и контролем. В последующих таблицах обозначения сходные.

Полученные данные позволяют говорить о врожденной мембранопатии тромбоцитов у телят, с развившимися в последующем ФНП в фазу новорожденности. Нарушение соотношения ХС с ОФЛ мембран кровяных пластинок изменяет рецепторные и пострецепторные механизмы функционирования тромбоцитов, способствуя снижению антиоксидантной защиты кровяных пластинок.

Концентрация первичных продуктов ПОЛ-АГП в тромбоцитах здоровых телят в возрасте 1-2 суток, до возникновения ФНП оказалось повышенной, еще более увеличиваясь при их развитии. Это свидетельствует об активации свободнорадикальных процессов в их кровяных пластинках. Уровень базального МДА в тромбоцитах - конечного продукта ПОЛ был также достоверно выше контроля еще до развития болезни (1, 20±0,001 нмоль/10⁹тр.), дополнительно возрастая при манифестации ФНП - 1,34±0,004 нмоль/10⁹тр.

Усиление ПОЛ в тромбоцитах телят с ФНП стало возможно из-за ослабления их антиоксидантной защиты и, в первую очередь, активности каталазы (снижена в 1,34 раза перед развитием ФНП и в 1,84 раза на его фоне по сравнению с контролем) и супероксиддисмутазы (снижена в 1,21раза и 1,42 раза, соответственно).

Количество СМ₂₈₀ и СМ₂₅₄в кровяных пластинках (0,055±0,01усл. ед/10⁹тр. и 0,061±0,02 усл. ед. /10⁹тр., соответственно) телят до возникновения ФНП превышал контрольные значения (Р<0,01). Уровни СМ₂₈₀ и СМ₂₅₄ на фоне ФНП у новорожденных телят дополнительно возрастали и были больше контроля в 1,22 и 1,25 раза, соответственно, свидетельствуя об активации беспорядочного протеолиза белков внутри тромбоцитов.

Корреляционный анализ выявил наличие обратной сильной связи между подавлением активности каталазы и СОД и содержанием СМ₂₈₀ и СМ₂₅₄ в кровяных пластинках - r=-0,75 (t=3,42), r=-0,82 (t=4, 20) и r=-0,73 (t=4,29), r=-0,76 (t=4,11), соответственно. Это указывало на один из возможных механизмов активации тромбоцитарного гемостаза посредством продуктов аномального протеолиза, активно идущего при функциональных нарушениях пищеварения.

Таким образом, в мембранах тромбоцитов новорожденных телят с ФНП еще до их развития было увеличено содержание ХС, снижен уровень ОФЛ и ослаблена актиоксидантная защита кровяных пластинок. Это обуславливает активацию ПОЛ, повреждающего структуры тромбоцитов, дополнительно повышающее их функциональную активность и увеличивающее содержание СМ.

Тромбоцитарный гемостаз у новорожденных телят с ФНП

При ФНП количество тромбоцитов в крови оставалось без изменений. ИТА в группе животных до ФНП возрастал с 32,6±0,03% до 39,2±0,05% на фоне их развития (в контроле - 26,0±0,03%). У телят с ФНП было найдено повышение активности (Р<0,01) тромбопластина с 12,0±0,02с. перед их возникновением и 9,6±0,02с. на его фоне с компенсаторным замедлением его синтеза до 2,95±0,05 мин. (в контроле - 2,40±0,01мин.).

Одним из механизмов ускорения развития АТ при ФНП можно считать интенсификацию обмена арахидоновой кислоты в тромбоцитах с повышением тромбоксанообразования. Так до развития ФНП в простой пробе переноса, косвенно зарегистрировано усиление синтеза в тромбоцитах проагрегантных метаболитов АА, в том числе ТхА₂ максимально увеличивающееся на фоне ФНП за счет активации ЦО и ТС, активность которых нарастала при развитии ФНП.

Таким образом, одной из причин усиления АТ у телят с ФНП является активация метаболизма АА синтезирующих ТхА₂.

Важную роль в активации самой биферментной системы тромбоксанообразования в кровяных пластинках играет увеличение СМ в тромбоцитах при ФНП. Рост СМ₂₈₀ и СМ₂₅₄ сильно прямо коррелировал с восстановлением АТ в простой пробе переноса - r = 0,82 (t = 5,86) и r = 0,76 (t = 8,90), что говорит о тесной взаимосвязи повышения уровня СМ в тромбоцитах и активации тромбоцитарных функций в условиях ФНП.

У телят на фоне манифестации ФНП отмечалось ускорение АТ, особенно под влиянием коллагена (табл.2). Несколько медленнее АТ развивалась у этих животных под влиянием ристомицина и АДФ. Тромбиновая и адреналиновая АТ также развивались быстрее, чем в контроле (Р<0,01). Время развития АТ на фоне сочетания индукторов было еще более укороченным за счет взаимопотенциирующего действия индукторов.

По ранней АТ с ристомицином, который по своей способности влиять на тромбоциты, идентичен субэндотелиальным структурам сосудов косвенно зарегистрировано повышение уровня ФВ при ФНП. Известно, что ФВ способен соединяться одним концом молекулы с коллагеном, а другим с тромбоцитом через рецептор - гликопротеид Iв, формируя „ось адгезии”: коллаген - ФВ - GPIв, что позволяет предполагать повышение числа этих рецепторов на тромбоцитарных мембранах.

Таблица 2. Агрегационная активность тромбоцитов у новорожденных телят с ФНП

Усиление адгезивной способности тромбоцитов на фоне нормального их количества, реализующейся в мелких и крупных кровеносных сосудах, создает опасность активации агрегации тромбоцитов в сосудах любого калибра. По всей вероятности данный механизм активации тромбоцитов сочетается с интенсификацией внутритромбоцитарных путей активации кровяных пластинок, что было обнаружено при исследовании АТ у новорожденных животных с ФНП.

Связь сильных агонистов агрегации - коллагена и тромбина в стандартных концентрациях с рецепторами на мембране тромбоцитов ведет к активации фосфолипазы С, стимуляции фосфоинозитольного пути через диацилглицерол и протеинкиназу С с фосфолирированием белков сократительной системы. Инозитолтрифосфат способствует выходу Са²⁺ из внутритромбоцитарных депо, обуславливая интенсификацию сокращения актомиозина.

Слабые агонисты агрегации тромбоцитов - АДФ и адреналин взаимодействуют с рецепторами их мембраны и вызывают экспрессию фибриногеновых рецепторов (GPIIв-IIIа), стимулируют фосфолипазу А₂, регулирующую выход из фосфолипидов арахидоновой кислоты с усилением образования Т_ХА₂, стимулирующего АТ посредством фосфолипазы А₂ и С и прямого выхода Са²⁺ в цитоплазму.

Не исключено, что видная роль в усилении АТ с сильными и слабыми индукторами играют сдвиги в липидном составе мембран тромбоцитов, связанные с их нагруженностью ХС, снижением ОФЛ и усилением в них ПОЛ.

Сочетанное использование двух индукторов агрегации, имеющих место в реальных условиях кровотока позволило приблизить наше представление об АТ in vivo у новорожденных животных с ФНП животных к реально возникающему в их кровяном русле агрегационному процессу тромбоцитов.

Корреляционный анализ выявил статистически значимые обратные сильные и средней силы связи между содержанием СМ₂₈₀ и СМ₂₅₄, АГП и ТБК-соединений в крови телят с ФНП одной стороны и активностью у них АТ под влиянием всех примененных индукторов и их сочетаний с другой. При сочетании индукторов статистическая связь АТ с СМ плазмы была выше, чем в случае одного индуктора, причем связь АТ с СМ₂₅₄ оказалась максимальной.

Статистическая связь АГП и МДА тромбоцитов и АТ оказалась обратной и для большинства индукторов средней силы.

Повышение способности кровяных пластинок к агрегации in vitro до возникновения ФНП, усиливающееся при их развитии у телят сочеталась с усилением АТ in vivo.