Биотехнологические основы конструирования и использования иммунобиологических препаратов для молодняка крупного рогатого скота

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Красочко Петр Альбинович

Щелково-- 2009 г.



Работа выполнена в отделе вирусных инфекций РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского»

Научный консультант доктор биологических наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ

Еремец Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Заслуженный ветеринарный врач РФ

Албулов Алексей Иванович

член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук, профессор

Девришов Давудай Абдулсемедович

доктор биологических наук, профессор Цыбанов Содном Жамьянович

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко»

Защита состоится 10 апреля 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, поселок Биокомбината, ВНИТИБП;

e-mail: vnitibp@mail.ru; тел./факс: (495) 526-43-74

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП

Автореферат разослан « » марта 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов



Актуальность темы диссертации

Современное ведение мясного и молочного скотоводства, сопровождающееся концентрацией поголовья на небольшой площади, комплектованием животноводческих ферм и комплексов одновозрастными и одновидовыми животными с генетическим потенциалом, приближенным к однородному, приводит к быстрому распространению инфекционных заболеваний, поражающих различные половозрастные группы животных.

Среди болезней крупного рогатого скота вирусные респираторные и желудочно-кишечные инфекции наносят огромный экономический ущерб животноводству. Возбудителями таких инфекций являются вирусы инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, диареи, рота- и коронавирусы и т.д. Это так называемые «малые» инфекции, которые у здоровых животных с нормальным функционированием иммунной системы протекают бессимптомно без выраженных клинических признаков или животные вообще не переболевают. Особенно тяжело болеют животные, когда в патологический процесс вовлекается 2 и более вирусов, то есть возникает смешанная или ассоциативная инфекция (В.Н.Сюрин с соавт, 1998; А.Я.Самуйленко с соавт, 2005 и др.). При тяжелом течении вирусной фазы инфекции наряду с поражением чувствительных клеток наступает значительное угнетение клеточного и гуморального звеньев иммунитета, на фоне чего условно-патогенная микрофлора активизируется и у животных развиваются тяжело протекающие пневмоэнтериты, приводящие к значительному отходу заболевших животных, снижению их продуктивности. По тропизму все вышеуказанные возбудители могут репродуцироваться в клетках респираторного и желудочно-кишечного тракта, половых органов, иммунокомпетентных клетках, то есть они пантропны. Это обуславливает их высокую контагиозность и тяжесть течения болезни.

Важное место в комплексе лечебно-профилактических мероприятий при пневмоэнтеритах телят, вызванных вирусами инфекционного ринотрахеита, диареи, парагриппа-3, рота- и коронавирусами играет специфическая профилактика, проводимая с помощью живых и инактивированных вакцин. Но при современном ведении животноводства, часто связанном с недостатком или несбалансированностью кормления, приводящим к угнетению иммунной системы, вакцинация не всегда достигает нужного эффекта. При этом для снятия иммунодепрессивного эффекта и повышения эффективности иммунного ответа оправдана стимуляция поствакцинального иммунитета с помощью различных препаратов.

Одним из перспективных направлений в разработке средств иммуностимулирующей терапии и профилактики заболеваний молодняка является использование производных бактерий и продуктов пчеловодства. Из бактериальных имуностимулирующих препаратов особое место принадлежит бактериальным полисахаридам, которые являются поликлональными активаторами В_системы лимфоцитов, а препараты, изготовленные из продуктов пчеловодства (пыльцы, перги, прополиса), стимулируют Т_систему лимфоцитов, особенно субпопуляцию Т_хелперов, фагоцитарную активность нейтрофилов, увеличивают активность гуморальных факторов иммунной защиты.

В связи с вышеизложенным, изучение эпизоотической ситуации, разработка новых средств и способов иммунологической профилактики вирусных инфекций является актуальной задачей ветеринарной науки и практики. Поэтому наши исследования были направлены на разработку и совершенствование существующих биотехнологических методов иммунологической профилактики и терапии вирусных респираторных и желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота.

Цель и задачи исследований

Целью настоящих исследований явилась разработка и совершенствование биотехнологических средств и методов иммунологической профилактики и терапии вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Беларусь.

2. Изучить состояние иммунной системы и обменных процессов организма телят при пневмоэнтеритах и коров с заболеваниями репродуктивных органов.

3. Разработать иммуностимулирующие препараты на основе непатогенных для теплокровных животных бактерий и продуктов пчеловодства, отработать схемы их применения, изучить их влияние на иммунную систему и лечебно-профилактическую эффективность при вирусных респираторных и желудочно-кишечных заболеваниях.

4. Разработать унифицированные технологии изготовления и применения моно- и ассоциированных живых и инактивированных культуральных вирус-вакцин для профилактики инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота.

5. Разработать комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике и терапии вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят. пневмоэнтерит коронавирусный ринотрахеит корова

Научная новизна полученных результатов

Впервые в условиях Республики Беларусь изучены особенности эпизоотической ситуации по инфекционному ринотрахеиту, вирусной диарее, парагриппу-3, рота- и коронавирусной инфекциям в животноводческих хозяйствах. Впервые теоретически обоснованы и практически использованы технологии изготовления и применения новых иммуностимулирующих препаратов на основе бактериальных липополисахаридов и продуктов пчеловодства при вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекциях крупного рогатого скота (Патенты Республики Беларусь № 2889, 3913, Республики Молдова № 889, 890, 891). Установлено явление спонтанной персистенции генома инфекционных вирусов в бактериальных клетках, что приводит к биосинтезу вирусспецифических белков в бактериях (диплом на открытие № 291 от 18.10.2005 г.). Разработаны унифицированные технологии изготовления и применения моно- и ассоциированных живых и инактивированных вакцин для профилактики вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят (патенты Республики Беларусь № 5304, 10696, 10697). Впервые изучено влияние на иммунную систему телят моно- и ассоциированных вакцин против респираторных заболеваний и предложены способы стимуляции иммунитета с помощью препаратов бактериального происхождения и препаратов из пчелиной перги. По результатам собственных исследований разработана научная концепция изготовления и применения вакцин и иммуностимуляторов в промышленном животноводстве, предусматривающая регламентированное их использование с учетом состояния иммунной системы организма. Разработана научная основа оптимизации вакцинопрофилактики респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят. Результаты исследований позволяют дополнить и систематизировать научную теорию превентивного применения вакцин и иммуностимуляторов в промышленном животноводстве.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Результаты экспериментальных исследований обогащают современные знания по вопросам патогенеза, лечения и профилактики вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота, что позволяет с достаточно высокой точностью и эффективностью производить борьбу с данными заболеваниями. Изучена этиологическая структура возбудителей респираторных и желудочно-кишечных инфекций в животноводческих хозяйствах Республики Беларусь, состояние иммунной системы и обмена веществ при данной патологии у телят. Разработанные средства, способы и схемы применения иммуностимулирующих и вакцинных препаратов для профилактики и терапии респираторных заболеваний телят позволяют значительно сократить их заболеваемость и непроизводительное выбытие. На основании проведенных исследований утвержнеа нормативная документация на 7 живых и инактивированных вакцин, 14 методических рекомендаций и указаний по совершенствованию ветринарно-санитарных мероприятий при пневмоэнтеритах телят.

Применение указанных разработок в условиях производства позволяет в 3-5 раз сократить заболеваемость и непроизводительное выбытие молодняка крупного рогатого скота от вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

-- распространение вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота в Республике Беларусь, что позволяет рационально осуществлять планирование противоэпизоотических мероприятий;

-- состояние обмена веществ и иммунитета у телят при вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекциях;

-- результаты разработки, апробации и внедрения иммунокорригирующих препаратов из продуктов пчеловодства, сапрофитных бактерий, тканей животных и препаратов серебра;

-- результаты конструирования и внедрения моно-, би-, трех- и четырехвалентных живых и инактивированных вирус-вакцин для специфической профилактики вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота;

-- закономерности иммунного ответа у телят после иммунизации их вакцинами при раздельном и комбинированном применении со стимуляцией поствакцинального иммунитета, позволяющие получать у животных напряженный иммунитет и снижать заболеваемость телят респираторными инфекциями;

Личный вклад соискателя

Исследования по разработке средств и методов иммунологической профилактики и терапии вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций, отработке параметров изготовления иммуностимулирующих и вакцинных препаратов, разработке схем их применения проводились лично соискателем. При выполнении комплексных разработок - иммуностимулирующих и вакцинных препаратов личный вклад соискателя составлял от 60 до 100%.

Апробация результатов диссертации

Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены: на заседаниях и РУП «Институт эксперментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского (1991-2008 гг.); Международных, Всесоюзных и Республиканских конференциях, симпозиумах и конгрессах:

Научной конференции «Болезни молодняка сельскохозяйственных животных и их профилактика на комплексах», Таллин: 1984; Научной конференции «Вопросы интенсификации и научно-обоснованного ветеринарного обслуживания промышленного животноводства», Кишинев, 1987; Всесоюзной научной конференции «Стресс и иммунитет», Ростов-на-Дону, 1989; Первом иммунологическом съезде Сочи, 1989; Научно-практической конференции «Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных», Минск, 1990; Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии и клеточной инженерии в ветеринарной медицине», Нижний-Новгород, 1990; Научной конференции «Siuolaikines veterinarijos problemos», Kaisiadorys, Литва, 1993; Научной конференции «Апитерапия и пчеловодство», Вильнюс, 1993; Научно-практической конференции «Збереженiсть молодняка с/г тварин - запорука розвитку твариництва Украiни», Харькiв, 1994; Научно-практической конференции «Бiотехнологiя ветеринарних препаратiв», Харькiв, 1993; Международной научной конференции «Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы», Харьков, 1995; Международной научной конференции «Иммунодиагностика и иммунотерапия», Витебск, 1995; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», Смоленск, 1996; 5-й Научно- практической конференции по апитерапии “Пчелы и ваше здоровье”, Сочи, 1996; Международном координационном совещании «Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных», Воронеж, 1997; Международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в сельскохозяйственном производстве», Минск, 1997; Международной научно-практической конференции «Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы» Гродно, 1997; 6-й научно-практической конференции по апитерапии “Пчелы и ваше здоровье” Рыбное, 1997; Международной научно-практической конференции «Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве», посвященной 100-летию со дня рождения академиков АНБ Х.С.Горегляда и М.К.Юсковца, Минск, 1998; 1 итоговой научно-практической конференции БелНИИЭМ, Минск, 1998; Республиканской научно-практической конференции «Инфекция и иммунитет», посвященная 75-летию БелНИИЭМ, Минск, 1999; Учредительной конференции Международной ассоциации паразитоценологов, Витебск, 1999; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных», посвященной 70-летию БелНИИЭВ им. С.Н.Вышелесского, Минск, 2000; II Международной научно-практической конференции «Апитерапия сегодня - с биологической аптекой пчел в XXI век», Уфа, 2000; 1 Международной научно-практической конференции и пчеловодству и пчелотерапии «От медоцелительства до научной пчелотерапии III тысячелетия» Минск, 2002; Научно-производственной конференции «Внедрение достижений ветеринарной науки в сельскохозяйственное производство», Смоленск, 2002; Международной научно-практической конференции «Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных», Минск, 2003; Шестом Международном форуме по глобальной вакцинологии «Вакцины и иммунизация», Минск, 2003; Международной научно-практической конференции. «Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства», Ялта, 2005; Simpozionul stiintific international consacrat jubileului de 50 ani de la fondarea Institutului de Zootehnie si Medicina Veterinara "Realizari si perspective in cresterea animalelor", Chisinau, 2006; III з'iзд апiтерапеватiв Украiни. Апiтерапiя: досягнення та перспективи розвитку. Харкiв, 2006.

Опубликованность результатов.

По теме диссертации опубликовано 105 научных работ, в том числе 7 монографий, 11 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 32 статьи в журналах и сборниках трудов СНГ, 39 статей и тезисов докладов в материалах конференций, 1 свидетельство на научное открытие, 15 патентов и авторских свидетельств, 14 рекомендаций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 483 страницах машинописного текста и состоит из: введения, общей характеристики работы, обзора литературы по теме и выбора направления исследований, изложения общей методики и основных методов исследований, 8 глав собственных исследований, анализа и обобщения результатов исследований, выводов и практических предложений. Список использованной литературы включает 467 наименование работ отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации иллюстрированы 115 таблицами, 42 фотографиями и рисунками. В приложении на 82 страницах, приводятся документы и таблицы, подтверждающие результаты отдельных работ, их научную и практическую значимость.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в условиях отдела вирусных инфекций РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» и в животноводческих хозяйствах РБ в период с 1991 по 2008 год.

Для конструирования вакцин и проведения иммунологических исследований и получения бактериальных липополисахаридов, пробиотиков использованы штаммы вирусов - инфекционного ринотрахета КМИЭВ-6, диареи КМИЭВ-7, парагриппа-3 КМИЭВ-8, ротавирус КМИЭВ-3, коронавирус КМИЭВ- 1 и бактерий: E. coli, St. epidermidis № 56, M. lysodeicticus, Bac. subtilis, Bacillus alvei КМИЭВ-11.

В качестве основного объекта исследований были использованы коровы и телята черно-пестрой породы из животноводческих хозяйств Республики Беларусь. Для диагностики ИРТ использовано 7068 сывороток крови от крупного рогатого скота из хозяйств Республики Беларусь; к вирусу диареи - соответственно 7692, ПГ-3 - 3159, ротавирусу - 1165, коронавирусу - 1165.

В опытах по изучению состояния иммунитета у телят и иммунологической перестройки организма после обработки иммунобиологическими препаратами (иммуностимуляторами, вакцинами), лечебной и профилактической эффективности испытуемых средств в производственных условиях использовано 23799 телят в возрасте от 1 дня до 6-месяцев, 14025 коров., 290 кроликов породы шиншилла и белый великан массой 1 - 4 кг, 295 белых мышей, 152 белых крыс.

Выполнено более 3800 серологических, 5000 вирусологических, 5250 иммунологических и 750 биохимических исследований.

Для решения поставленных задач по изучению эпизоотической ситуации, разработке, изучению и внедрению средств и методов профилактики и терапии вирусных пневмоэнтеритов телят был использован комплекс различных методов исследований.

1. Клинико-эпизоотологическое обследование животноводческих хозяйств, в которых эпизоотическая обстановка по массовым желудочно-кишечным и респираторным заболеваниям телят была напряженной, проводили по Бакулову (1982),. Эпизоотическая обстановка учитывалась с использованием статистического, описательно-исторического, клинико-гематологического, патологоанатомического, серологического и иммунологического методов исследований по общепринятым методикам.

Диагноз желудочно-кишечных и респираторных болезней телят вирусной и бактериальной этиологии устанавливали, используя метод эпизоотического обследования, в комплексе с клиническим исследованием животных, патолого-анатомическими изменениями у вынужденно убитых и павших животных. Для оценки эпизоотического процесса определяли заболеваемость и смертность.

Для определения эффективности иммуностимулирующих и вакцинных препаратов при пневмоэнтеритах телят проводили клиническое обследование животных - температуру тела, пульс и дыхание определяли выборочно у отдельных животных в зависимости от эпизоотической ситуации хозяйств. Всего общему клиническому обследованию и наблюдению было подвергнуто более десяти тысяч голов крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Беларусь.

2. Серологические методы включали исследование сывороток крови от здоровых и больных животных с различным клиническим состоянием и после введения сывороток и иммунизации вирус-вакцинами. С целью установления противовирусных антител использовали следующие серологические реакции:

а) реакцию нейтрализации (РН) ставили с целью выявления антител к вирусам ИРТ, ВД, ПГ-3, рота- и коронавирусам в исследуемых сыворотках крови кроликов для оценки иммуногенности вакцин по общепринятой методике (В. Н. Сюрин с соавт., 1986);

б) реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) ставили с целью выявления антител к вирусам ИРТ, ВД, рота- и коронавирусам в сыворотках крови с помощью эритроцитарных диагностикумов (П. А. Красочко с соавт., 1988, 1995);

в) реакцию задержки гемагглютинации (РЗГА) для диагностики парагриппа-3 и установления уровня поствакцинальных антител ставили с помощью набора диагностикумов производства Приволжской биофабрики (В. Н. Сюрин с соавт., 1986);

г) иммуноферментный анализ (ИФА, Elisa) ставили по В. Н. Сюрину с соавт. (1983) в нашей модификации;

4. Иммунологические исследования проводили по следующим направлениям:

а) оценка специфического гуморального иммунитета по содержанию иммуноглобулинов М- и G-классов;

б) оценка состояния клеточного иммунитета по содержанию Т_ и В_лимфоцитов, фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса;

в) оценка состояния неспецифического гуморального иммунитета путем определения бактерицидной активности сыворотки крови, бета-лизинов, титра интерферона, концентрации лизоцима, общего белка.

Количественное определение содержания иммуноглобулинов в сыворотках крови крупного рогатого скота проводили с помощью простой радиальной иммунодиффузии в агаровом геле по Манчини (1964).

Содержание Т_лимфоцитов определяли путем постановки реакции спонтанного розеткообразования со стабилизированными эритроцитами барана, а В_лимфоцитов - с эритроцитами мыши по Д. К. Новикову и В. И. Новиковой (1979).

Фагоцитарное число и фагоцитарный индекс нейтрофилов устанавливали по Н. С. Кисляк и Р. В. Ленской (1978) с помощью тест-культуры кишечной палочки или суспензии полистиролового латекса диаметром 0,1 - 0,2 мкм.

Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по О. В. Смирновой и Т. А. Кузьминой (1966) упрощенным нефелометрическим методом по отношению к кишечной палочке (референтный тест-штамм 0 55).

Содержание лизоцима в сыворотках крови определяли нефелометрическим методом по В. Г. Дорофейчуку (1968) по изменению оптической плотности микробной взвеси референтного штамма M. Lysodeictius.

Бактериальный титр интерферона определяли нефелометрическим методом по Н.С.Мурашовой с соавт. (1986) с помощью тест-штамма Staphilococcus epidermidis № 56.

Общий белок сыворотки крови определяли рефрактометрически с помощью рефрактора РПЛ-2.

5.Физико-химические методы исследований включали:

а) выделение иммуноглобулинов классов M и G из сыворотки крови крупного рогатого скот проводили по Й. Броку (1987), а их очистку методом гель-фильтрации на ультрагеле АсА22;

б) выделение бактериального липополисахарида из Bacillus alvei КМИЭВ-11проводили путем термогидролиза с помощью уксусной кислоты по В. М. Никитину (1982) в модификации П.А.Красочко с сотавт. (1989). Полученный липополисахарид стерилизовали автоклавированием.

6. Гематологические исследования выполнялись на гематологическом анализаторе «Medonic CA 620» (Швеция) с использованием реактивов производства фирмы «Cormey» (Польша). Биохимические исследования крови проводились на бихимическом анализаторе «Соrmey-Lumen» с использованием наборов Сormay serum HN производства фирмы «Cormey» (Польша).

7. Биометрическая обработка цифрового материала, полученного в экспериментальных исследованиях, проводилась по Р.Б. Стрелкову (1966) с учетом рекомендаций П. Ф. Рокицкого (1967), а также с использованием персонального компьютера ISA/PCI 80486DX2-66 и программы Microsoft Exel, графическое обеспечение - с помощью программы Graph Exel.

Экономическую эффективность применения научных разработок рассчитывали согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденной ГУВ МСХ и П РБ в 2000 г., а также в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ новой техники, изобретений и рационализаторских предложений», утвержденной МСХ СССР в 1983 г.

Результаты собственных исследований

Изучение причин возникновения респираторных и желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота в Республике Беларусь

На основе анализа результатов исследований нами установлено, что в возникновении респираторных и желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота играют роль следующие факторы:

-основными возбудителями респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят являются вирусы инфекционного ринотрахеита, диареи, парагриппа-3, рота- и коронавирусы, а также условно-патогенная бактериальная микрофлора, осложняющая течение заболевания;

- иммунодефицитное состояние организма новорожденных телят (первичный иммунодефицит) или у телят старше 1-месячного возраста под воздействием неблагоприятных технологических и экологических факторов (вторичный приобретенный иммунодефицит);

-способность вирусов инфекционного ринотрахеита, диареи, парвовирусов, проникать через плацентарный барьер и внутриутробно инфицировать плод с его дальнейшей иммунотолерантностью и вирусоносительством;

-создание стрессовых ситуаций (нарушения технологии содержания и кормления животных, несбалансированность рационов по основным питательным веществам, микро- и макроэлементам, витаминам, низкоэнергетическое питание скота, малый фронт кормления животных, скученное содержание телят на ограниченной площади);

- влияние неблагоприятных экологических факторов внешней среды;

-комплектование групп животных на комплексах или крупных фермах сборными телятами без учета степени инфицированности хозяйств-поставщиков или ферм-поставщиков;

-содержание в одном помещении разновозрастных животных с различным клиническим и иммунологическим состоянием;

-нарушение принципа “пусто-занято” при заполнении помещений новыми телятами;

-генетическая однородность стад, вызванная использованием одних и тех же производителей при осеменении коров;

Наличие антител к вирусам-возбудителям респираторных инфекций в сыворотках крови крупного рогатого скота различных половозрастных групп и клинического состояния свидетельствует о степени инфицированности стад (у взрослых животных), а также о переболевании молодняка вирусными инфекциями. В процессе работы для диагностики ИРТ использовано 4456 сывороток крови от коров из хозяйств Республики Беларусь; к вирусу диареи - соответственно 4678, ПГ-3 - 1646. Кроме того, от переболевших респираторными инфекциями телят 3-4 месячного возраста для диагностики ИРТ было происследовано 1955, ВД -2357, ПГ-3 - 1031 сывороток крови. Также были происследованы сыворотки крови от клинически здоровых телят 6-месячного возраста соответственно 657, 657, 482 проб.

В табл.1. представлены результаты исследований сывороток крови от крупного рогатого скота на наличие антител к вирусам ИРТ, ВД и ПГ-3.



Таблица 1 - Результаты исследования сывороток крови от крупного рогатого скота на наличие антител к вирусам-возбудителям респираторных инфекций

Вирус	Показатели	Клиническое состояние и возраст
		Коровы, 310 лет, клинически здоровые	Телята, 3-4 мес., переболевшие респираторными болезнями	Телята старше 6 мес., клинически здоровые
Инфекционный ринотрахеит	К-во исслед. проб/процент	4456 / 67,6	1955/65,8	657/68,8
Вирусная диарея	К-во исслед. проб/процент	4678 / 86,6	2357 / 84,1	657 / 88,9
Парагрипп-3	К-во исслед. проб/процент	1646 / 55,9	1031 / 71,5	482 / 59,6

Из представленных данных видно, что в стадах крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Беларусь в этиологической структуре вирусных респираторных инфекций основное место принадлежит вирусам ИРТ, ВД и ПГ-3.

Полученные результаты по распространению вирусов ИРТ, ВД, ПГ-3 среди коров свидетельствуют о широком распространении данных возбудителей среди воспроизводящего поголовья. Тем самым инфицированные животные способствуют перезаражению новорожденных телят еще в раннем пренатальном периоде развития. Это приводит к массовым вспышкам пневмоэнтеритов телят, особенно при возникновении каких-либо нарушений в кормлении, содержании животных, стрессовых ситуациях.

В табл. 2 представлены результаты диагностических исследований биологического материала при диагностике на вирусные энтериты.



Таблица 2 - Результаты диагностических исследований телят на вирусно-бактериальные энтериты

Инфекция	Вид материала	Количество проб	Положительные пробы, %
вирусная диарея	сыворотка крови от переболевших телят	1270	64,8
	фекалии	574	35,1
ротавирусная	сыворотка крови от переболевших телят	1165	90,9
	фекалии	492	67,4
коронавирусная	сыворотка крови от переболевших телят	1165	80,6
	фекалии	492	33,7
колибактериоз	патологический материал	152	42,4
псевдомоноз	патологический материал	152	5,8
сальмонеллез	патологический материал	152	1,9
стафилококкоз	патологический материал	152	7,7

Анализ результатов диагностических лабораторных исследований показал, что при серологическом исследовании антитела к вирусу диареи выявлялись у 64,8% обследованных переболевших энтеритами телят из хозяйств, в которых отмечались массовые заболевания телят энтеритами, к ротавирусу - 90,9%, коронавирусу - 80,6%. У больных энтеритами телят установлено наличие антигенов ротавирусов у 67,4% от обследованных животных, коронавирусов - у 33,7%, вируса диареи - у 35,1%.

Состояние иммунной системы и обмена веществ у телят при вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекциях

Переболевание телят вирусными респираторными и желудочно-кишечными инфекциями сопровождалось значительным угнетением клеточного и гуморального звеньев иммунной системы. Наиболее характерным являлось уменьшение количества Т-лимфоцитов (в 1,2 раза меньше, чем у клинически здоровых), В-лимфоцитов ( в 1,28 раза), фагоцитраной активности нейтрофилов периферической крови (в 1,23 фагоцитраное число и 1,56 - фагоцитарный индекс).

Изучение состояния гуморального иммунитета показывает, что в 2,7 раза снижается количество лизоцима, в 1,3 раза бактерицидная активностьт сыворотки крови, 1,6 раза титр интерферона, в 4,3 раза увеличивается количество циркулирующих иммунных комплексов. Кроме того, отмечен повышенный титр противирусных антител. К вирусу ИРТ у больных телят он был в 2,5 раза выше, чем у здоровых, к ПГ-3 в 2,53 раза.

Наряду с изменениями в иммунной системе переболевание телят вирусными респираторными инфекциями сопровождалось значительными изменениями в белковом, азотистом, углевордном, липидном и пигментном обменах организма животных при респираторных инфекциях. Содержание низкомолекулярных азотистых веществ (мочевины, креатинина и мочевой кислоты) в сыворотке крови у больных и переболевших телят превышало уровень здоровых животных в 1,2-2,2 раза. Это взаимосвязано с повышенным содержанием циркулирующих иммунных комплексов (в 4,3 и 5 раз выше чем у здоровых), которые воздействуют на фильтрующую способность почечных канальцев. Концентрация биллирубина в крови у больных и переболевших телят была в 1,3-1,5 раза выше, чем у здоровых, а концентрация глюкозы в 1,23-1,27 раза и липидов в 1,1-1,47 раза ниже. Была повышена активность аспартатаминотрансферразы в 3,14 (у больных) и в 3,2 раза (у переболевших), аланинаминотрансферразы соответсвено 2,7 и 5,09 раза; креатининкиназы в 4,6 и 1,8 раза, понижена активность амилазы в 1,05 и 1,16 раза, щелочной фосфатазы в 1,73 и 1,6 раза, холинэстеразы в 1,28 и 1,05 раза. Значительные изменения отмечены и при изучении минерального обмена - у больных ОРЗ телят отмечено повышение концентрации меди в 1,23, калия в 1,13 раза, снижение концентрации кальция в 1,07 раза, железа в 1,72 раза, цинка в 1,4 раза.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при переболевании респираторными и желудочно-кишечными заболеваниями в патологический процесс вовлекаются не только органы дыхания и пищеварения, но и угнетаются основные звенья иммунитета, обмена веществ, а также поражаются жизненноважные системы организма теленка - сердечно-сосудистая и выделительная.

Иммуностимулирующие препараты в терапии и профилактике вирусных респираторных инфекций телят.

Стимуляция иммунной системы телят при вирусных респираторных инфекциях с помощью бактериальных липополисахаридов.

Известно, что для стимуляции иммунной системы организма животных используются бактериальные липоплисахариды (ЛПС), являющиеся поликлональными активаторами В-системы лимфоцитов. Обладая высокой иммунологической активностью, данный вид иммуностимуляторов, особенно полученных из грамотрицательных бактерий нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта организма животных и человека, обладает высокой реактогенностью. Поэтому, путем экспериментальных исследований, из 22 различных штаммов микроорганизмов с использованием таких иммунологических тестов, как реакция бласттрансформации лимфоцитов, нагрузочные тесты с лейкоцитами, взятыми от животных с иммунодефицитами, был отобран ЛПС из спорообразующей аэробной бактерии - Bac.alvei КМИЭВ-11 - возбудителя европейского гнильца пчел. Данный микроорганизм не имеет контакта с теплокровными животными и поэтому его применили в диагностических целях для оценки функционального состояния В-системы лимфоцитов, а также для повышения резистентности организма сельскохозяйственных животных. В целях диагностики бактериальный ЛПС из Bac.alvei КМИЭВ-11 использован для постановки реакции бласттрансформации в концентрации 20-50 мкг/мл. При сравнении результатов РБТЛ, поставленной с ЛПС из Bac.alvei и Bact.prodigiosum и E.coli, фитогемагглютинином, конканавалином-А установено, что он по своей активности не уступает общепринятым митогенам и его можно с успехом использовать в комплексных исследованиях при оценке функционального состояния Т- и В-лимфоцитов.

При использовании вышеуказанного ЛПС для телят наиболее оптимальной явилась доза 5-10 мкг/кг живой массы. После однократной обработки телят ЛПС в этих дозах к 5 дню отмечено увеличение Т-лимфоцитов на 47%, В-лимфоцитов на 37%, фагоцитарного числа на 15% по сравнению с исходными данными. К 14 дню указанные показатели снизились и пришли к уровню исходных данных. После трехкратной обработки телят ЛПС из Bac.alvei с интервалом в 7 дней отмечена значительная стимуляция клеточного и гуморального иммунитета, продолжающаяся до 18 дня наблюдения. Так, к 4 дню отмечено возрастание фагоцитарного числа на 22%, фагоцитарного индекса на 108%, к 8-му дню - соответственно на 25 и 52%, к 18-му дню - на 5 и 27%, Т-лимфоцитов - соответственно на 37%, 45%, 33%; В-лимфоцитов на 62%, 87%, 55%, лизоцима на 94% (5-й день), 215% (8-й день). Другие показатели гуморального иммунитета у обработанных телят не отлачилсь от уровня контрольных животных. Обработка телят бактериальным ЛПС оказывает активизирует белковый, углеводный, липидный, азотистый, пигментный, минеральный обмены. Производственные испытания бактериального ЛПС на телятах с целью повышения резистентности организма показали высокую его эффективность. Заболеваемость телят ОРЗ снизилась в 2,3 раза, прирост живой массы увеличился на 80 г, окупаемость ветмероприятий составила 10,86 рублей на 1 рубль затрат.

Иммунологическая эффективность препарата, полученного на основе пчелиной перги.

Нами разработана технология изготовления инъекционной формы иммуностимулирующего препарата “Апистимулина-А” на основе пчелиной перги с низкой себестоимостью и высокой эффективностью. Проведенные токсикологические исследования показали его низкую токсичность и отсутствие аллергенных свойств, стимулирущее воздействие на обмен веществ организма лабораторных животных. В результате проведенных исследований на животных установлена терапевтическая доза, которая составила 1 мг/кг живой массы при 3-4-х кратном введении с интервалом в 3-4 дня. При обработке больных пневмоэнтеритами телят отмечалось восстановление угнетенных звеньев иммунитета до уровня клинически здоровых животных. При изучении влияния на клеточный и гуморальный иммунитет препарата “Апистимулин-А” в оптимальной терапевтической дозе (1 мг/кг массы) у клинически здоровых (подопытная группа № 1) и больных пневмоэнтеритами (подопытная группа № 2) телят установлено, что введение препарата способствует увеличении Т- и В-лимфоцитов, активизации фагоцитарной активности нейтрофилов, повышении активность интерферона и лизоцима. Проведенные производственные испытания препарата “Апистимулин-А” показали, что его применение способствует снижению заболеваемости телят респираторными инфекциями с 66,7-95% до 20-32,5%, отхода с 17,3-23,35 до 4,8-7%. Окупаемость ветмероприятий при его использовании составляет 40,39 рублей на 1 рубль затрат.

Иммунологическая перестройка организма телят и лечебно-профилактическая эффективность Т-активина при респираторных заболеваниях.

В ряду известных иммуностимулирующих препаратов, нашедших применение в профилактике и терапии респираторных заболеваний телят особое место принадлежит Т-активину, представляющему собой комплекс полипептидов из тимуса крупного рогатого скота. Проведенные исследования по изучению лечебно-профилактической эффективности и влияния на клеточный иммунитет больных ОРЗ телят показали его высокую активность. В частности, отмечено стимулирующее влияние на лимфоциты периферической крови (на общее их количество, на Т-и В-систему лимфоцитов). Установлено, что в результате заболевания у телят отмечается значительное угнетение Т- и В-звеньев лимфоцитов - до 10,0+0,95 и 10,2+0,84%. Но через 7 дней после обработки Т-активином отмечается значительное увеличение их количества - соответственно до 19,4+1,29% и 13.0+0,9%. К 28 дню наблюдения количество Т-лимфоцитов возросло до 24,8+0,9% и В-лимфоцитов до 15,4+1,72%. У контрольных животных значительных колебаний в содержании Т- и В-лимфоцитов не обнаружено. Обработка телят Т-активином восстанавливала угнетенные звенья клеточного иммунитета у телят, больных ОРЗ, что способствовало быстрейшему их выздоровлению.

Лечебно-профилактическая эффективность Т-активина была проверена на 2-х группах телят, заболеваемость в которых составляла 50%. После обработки Т-активином, число больных телят через 4 дня снизилось до 25%, а через 20 дней - до 4,5%, тогда как среди телят контрольной группы к 10 дню больных было 63,6%. К 20 дню число заболевших было 36,4%, а к 40 дню - 9,1%. Полное выздоровление телят контрольной группы произошло к 45 дню наблюдения. Экономическая эффективность от применения Т-активина составляет 2,54 рубля на 1 рубль затрат.

Иммунологическая и лечебно-профилактическая эффективность протаргола при вирусных респираторных инфекциях.

Из имеющихся антибактериальных химиотерапевтических препаратов известны препараты серебра - протаргол и колларгол, которые обладают противовирусными и иммуностимулирующими свойствами. В результате проверки раствора протаргола в различных концентрациях на культуре клеток отмечено угнетение репродукции вирусов ИРТ и ВД при 0,25-0,5%-ной его концентрации. Проведенные исследования влияния 0,5%-ного раствора протаргола на иммунную систему позволили установить его иммуностимулирующий эффект. Так, через 14 дней после обработки у телят отмечено увеличение Т-лимфоцитов на 49%, В-лимфоцитов на 55%, фагоцитарного числа на 15%, фагоцитарного индекса на 58%, бактерицидной активности сыворотки крови в 2 раза, общего белка сыворотки крови на 34%. Это позволило применить его для лечения вирусных респираторных инфекций животных. Протаргол для лечения телят использовали в 0,5%-ной концентрации, растворенный на неспецифическом иммуноглобулине. Применялось интратрахеальное и аэрозольное введение препарата. Интратрахеально раствор протаргола вводили 3-4-х кратно с интервалом в 3-5 дней, аэрозольно- в дозе 2 мл на 1 кубический метр помещения 1 раз в 3-5 дней с экспозицией не менее 60 минут. В результате проведенных исследований коэффициент заболеваемости интратрахеально обработанных телят снижается с 0,24 до 0,08, аэрозольно обработанных - с 0,42 до 0,24. Окупаемость ветеринарных мероприятий соответственно составляла 12,01 и 8,81 рублей на 1 рубль затрат.

Специфическая профилактика вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят

Общие подходы к конструированию вакцин для профилактики вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят.

В комплексе лечебно-профилактических мероприятий при вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекциях крупного рогатого скота специфическая профилактика занимает одно из ведущих мест.

Специфическая профилактика этих инфекций в современных условиях осуществляется по следующим направлениям:

Активная специфическая профилактика живыми и инактииврованными моно- и ассоциированными вакцинами;

Активная специфическая профилактика с использованием рекомбинантных штаммов бактерий, имеющих в своем геноме геном вирусов;

Активная специфическая профилактика с использованием маркерных штаммов вирусов;

Вакцинация телят позволяет создать напряженный специфический иммунитет (как местный, так и общий), а также неспецифический противовирусный иммунитет из-за высокой интерфероногенной активности некоторых вакцинных штаммов вирусов, обусловленный созданием невосприимчивости к ряду возбудителей, не входящих в вакцину. Такое положение характерно для иммунизации живыми вирус-вакцинами. Постоянная иммунизация как молодняка крупного рогатого скота, так и взрослых животных способствует вытеснению из стада эпизоотических штаммов вирусов вакцинными и тем самым снижению степени инфицированности возбудителями респираторных инфекций. Это относится к таким вирусным инфекциям, как инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, парагрипп-3, респираторно-синцитиальная инфекция.

Но механизм действия инактивированных вакцин несколько иной. В основном инактивированные вакцины при вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекциях используют:

-для иммунизации племенных животных, которым нежелательно применять живые вакцины;

- для иммунизации глубоко стельных коров с целью создания напряженного колострального иммунитета у телят;

- на заключительных стадиях оздоровления хозяйств от вирусных инфекций.

Современное ведение животноводства, связанное с нарушениями в кормлении, содержании животных, постоянными стрессами приводит к значительному угнетению иммунной системы. В идеальных условиях профилактическая эффективность вакцин должна быть 90-100%, однако при современных условиях содержания животных, иммунизация крупного рогатого скота, у которого отмечены нарушения обменных процессов и угнетение иммунной системы сопровождается значительным снижением эффективности вакцин. Для решения вопроса повышения эффективности иммунизации наряду с улучшением технологии содержания и кормления животных, важным моментом является стимуляция поствакцинального иммунитета с помощью иммуностимулирующих препаратов.

В связи с вышеизложенным, нами проведен комплекс исследований по разработке технологии изготовления живых и инактивированных моно- и ассоциированных вирус-вакцин для иммунизации крупного рогатого скота различного возраста и физиологического состояния, а также принципа стимуляции иммунной системы при иммунизации вирус-вакцинами.

Исследования по разработке живых и инактивированных моно- и ассоциированных вирус-вакцин против ИРТ, ВД, ПГ-3, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота проводились в несколько этапов:

- Подбор и отработка режимов культивирования вакцинных штаммов вирусов;

- Отработка оптимальных методов инактивации вирусов для конструирования инактивированных вакцин;

- Изучение антигенной активности живых и инактивированных штаммов вирусов на лабораторных и сельскохозяйственных животных;

- Подбор оптимальных адъювантов для конструирования инактивированных вакцин;

- Отработка оптимальных доз и соотношений компонентов при конструировании ассоциированных живых и инактивированных вирус-вакцин;

- Изучение иммунологической перестройки организма коров и телят после иммунизации живыми и инактивированными вирус-вакцинами;

- Определение иммуногенности живых и инактивированных культуральных вирус-вакцин против вирусных инфекций крупного рогатого скота на лабораторных животных.

- Изучение профилактической эффективности живых и инактивированных культуральных вирус-вакцин против вирусных инфекций при респираторных и желудочно-кишечных болезнях телят, заболеваниях репродуктивных органов коров.

Подбор, селекционирование, отработка режимов культивирования и антигенная активность вакцинных штаммов вирусов крупного рогатого скота для конструирования вакцин

Как правило, для изготовления вирус-вакцин накопление вирусной массы осуществляется на первично трипсинизированных культурах клеток почки эмбриона теленка или тестикул бычка, а в последние годы - перевиваемых культурах клеток (ПТ-линия "Таурус", МДБК, ПТ-80). В качестве питательных культуральных сред применяли среду 199, 0,5% лактальбумина гидролизат, среду Игла, ферментный гидролизат мышечных тканей (ФГМС). Для повышения эффективности культивирования и удешевления вакцин нами для накопления вирусной массы использованы перевиваемые культуры клеток ПТ-линия "Таурус", МДБК, ПТ-80, которые адаптированы к 5%-ному гемогидролизату, изготавливаемому на предприятии «Диалек» (Белбиофарм Республики Беларусь). Данная питательная среда в 3-4 раза дешевле вышеуказанных и по своим ростовым свойствам им не уступает.

Для конструирования живых вакцин против ИРТ крупного рогатого скота в Республике Беларусь и странах СНГ с 70-х годов используются аттенуированные штаммы ТК-А и МВА 2/81, а инактивированных - «4016», «Оренбург» и «Молдавский», диареи - крупного рогатого скота в Республике Беларусь и странах СНГ используются аттенуированный штамм ВК-№ 28, а инактивированных - «Орегон С-24», парагриппа-3 крупного рогатого скота в Республике Беларусь и странах СНГ используются аттенуированные штаммы ПТК-45, SF-4, «Белорусский-9», ротавирусной инфекции - эпизоотические штаммы ротавирусов 243, «Белорусский-7», коронавирусной инфекции - эпизоотические штаммы коронавирусов «Линкольн», F-17 и «Белорусский-11».

При этом проведена работа по адаптации референтных штаммов вирусов ИРТ, ВД, ПГ-3, коронавируса, в основном культивируемых на первичных клетках почки эмбриона коровы (ПЭК) к перевиваемым клеткам - почки теленка (ПТ, линия “Таурус”), (ПТ-80) и МДБК, адаптированных к 5%-му гемогидролизату. Ротавирус адаптировали к перевиваемыем линиям клеток почек зеленой мартышки - Vero, почки теленка - МДВК, перевиваемые клетки почки поросенка - СПЭВ. Проведение 12 пассажей каждого вируса на новых клеточных линиях показали, что вышеуказанные перевиваемые культуры можно с успехом использовать для накопления вирусной массы при конструировании вакцины.

Особенно высокий инфекционный титр установлен при культивировании вирусов на перевиваемых клетках МДБК (до 6,5 -8,0 lg ТЦД 50/мл).

Для идентификации ДНК и РНК вирусов и подтверждения их специфичности нами проведено типирование нуклеиновых кислот в полимеразной цепной реакции в условиях отдела биотехнологии Института Сибири и Дальнего Востока РАСХН, диагностической лаборатории Белорусского государственного ветеринарного центра.

На рис. 1 - 4 представлены результаты постановки ПЦР с штаммами вирусов ИРТ, ВД, рота- и коронавируса

Рисунок 1. Постановка ПЦР с различными штаммами вируса ИРТ

Рисунок 2. Постановка ПЦР с различными штаммами вируса диареи



1 2 3

Маркеры - стандартные олигонуклеотидные праймеры ротавируса. 2 - отрицательный контроль; 1 - РНК из ротавируса КМИЭВ 3, 3 - положительный контроль

Рисунок 3. Постановка ПЦР с ротавирусом крупного рогатого скота

1 2 3

Маркеры - стандартные олигонуклеотидные праймеры коронавируса. 2 - отрицательный контроль; 1 - РНК из коронавируса КМИЭВ 1, 3 - положительный контроль

Рисунок 4. Постановка ПЦР с коронавирусом крупного рогатого скота

В дальнейшей работе нами использованы адаптированные и аттенуированные штаммы вирусов, которые депонированы в Республиканской коллекции микроорганизмов и им присвоены номера: инфекционного ринотрахеита - КМИЭВ - 6, диареи - КМИЭВ - 7, парагриппа-3 - КМИЭВ- 8, ротавирус - КМИЭВ - 3, коронавирус - КМИЭВ - 1.

Следующим этапом работы при разработке культуральных вирус-вакцин против ИРТ, ВД, ПГ-3 рота- и кронавирусной инфекций крупного рогатого было изучение возможности отдельного и совместного культивирования аттенуированных и адаптированных к перевиваемым культурам клеток вакцинных штаммов вирусов.

Первоначально была проведена работа по изучению возможности одновременного культивирования аттенуированных штаммов вирусов ИРТ, ВД и ПГ-3 при раздельном и совместном инфицировании культуры клеток МДБК. Заражение культуры проводили вирусами ИРТ -- штамм «КМИЭВ-6», ВД -- «КМИЭВ-7», ПГ-3 - «КМИЭВ-8» в разных дозах и соотношениях. О репродукции вирусов судили по их титру. Так, при совместном культивировании на культуре клеток штаммов вирусов ИРТ, ВД и ПГ-3 они репродуцируются не в одинаковой степени. Так, вирус диареи способствовал угнетению накопления вирусов ИРТ и ПГ-3 вследствие его быстрой репродукции. Это не позволяет использовать метод одновременного культивирования вирусов ИРТ, ВД и ПГ-3 на культуре клеток, т.к. получаемый низкий титр вирусов снижает экономическую эффективность промышленного производства вакцины.

Также была проведена работа по изучению возможности одновременного культивирования аттенуированных штаммов рота- и коронавирусов при раздельном и совместном инфицировании культуры клеток МДБК. Заражение культуры проводили ротавирусом - штамм «КМИЭВ-3» и коронавируса - штамм «КМИЭВ-1» в разных дозах и соотношениях. При совместном культивировании на культуре клеток штаммы рота- и коронавирусов также репродуцируются не в одинаковой степени. Ротавирус, репродукция которого проходила за 24 часа, способствовал угнетению накопления коронавируса. Это не позволяет применять метод одновременного культивирования рота- и коронавирусов на культуре клеток, т.к. получаемый низкий титр коронавируса снижает экономическую эффективность промышленного производства вакцины.

При накоплении монокомпонентов вакцин на матрасах и на роллерах ЦПД, характерное для вируса ИРТ наступало через 36-48 часов, вируса диареи - 24-36 часов, вируса парагриппа-3 - 60-72 часов, ротавируса - через 24 часа, кронавируса - через 72-96 часов. К этому сроку отмечалась полная деструкция клеточного монослоя, его сползание со стекла и наличие в вируссодержащей жидкости взвеси клеток. Титрация вируссодержащей жидкости по Риду и Менчу показала, что после культивирования на матрасах титр вируса ИРТ составлял 5,5-6,0 lg ТЦД 50/ 1,0 мл, вируса диареи - 6,0-6,5 lg ТЦД 50/ 1,0 мл, вируса парагриппа-3 - 5,0-5,5 ТЦД lg 50/1,0 мл, ротавируса - 7,5-8,0 ТЦД lg 50/ 1,0 мл, коронавиурса - lg 5,0 ТЦД 50/ 1,0 мл. Но при культивировании на роллерах - титр вируса был выше на 1,5-2.0 lg ТЦД 50/ 1,0 для каждого вируса.

Изучение антигенной активности адаптированных нами штаммов вирусов ИРТ, ВД и ПГ-3, рота- и коронавирусов на кроликах и телятах в сравнении с исходными проводилось путем двукратного внутримышечного введения кроликам по 2 мл вируссодержащей жидкости каждого из вирусов при инфекционном титре 6,0 lg ТЦД 50/мл и телятам - интратрахеального или внутримышечного по 2 мл вирусов при этом же титре. Кровь у животных брали до введения вирусов и через 14 дней после введения. В сыворотках крови титр антител определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток.

Результаты исследований показали, что адаптация вирусов ИРТ, ВД, ПГ-3, рота- и коронавирусов на клеточных линиях МДБК и СПЭВ не влияет на их антигенную активность в сравнении с исходными штаммами. Штаммы не реактогенны, вызывают активную выработку противовирусных антител сельскохозяйственными (крупный рогатый скот) и лабораторными (кролики) животными в достаточно высоких титрах.

...