Значение ассоциаций микроорганизмов в этиологии и профилактике инфекционных болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота (некробактериоз, копытная гниль)

Л - легкая степень поражения; общее легкое угнетение, снижение аппетита, животные иногда поднимают больную конечность в покое, при движении - слабо выраженная хромота. При осмотре: выпадение волос в межкопытной щели, гиперемия и отечность кожи свода межкопытной щели, повышение местной температуры;

С - средняя степень поражения; общее легкое угнетение, гиподинамия, снижение аппетита, выраженная хромота при движении, в покое животное держит больную конечность приподнятой. При осмотре: в области свода межкопытной щели гиперемия, отечность, наличие эрозий и язв, покрытых сероватым экссудатом с ихорозным запахом, повышение местной температуры;

Испытание опытной серии инактивированной ассоциированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец с масляным адъювантом, провели в сравнении с Югославской ассоциированной вакциной «Памавак» и отечественной моновакциной против копытной гнили овец в совхозе «Кузнецовский» Тверской области. В свою очередь, в совхозе «Мир» Рузаевского района Республики Мордовия испытывались несколько вариантов инактивированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец с различными адъювантами и антигенным составом. Аналогично в совхозе «им. Кирова» Балашихинского района Московской области были испытаны несколько вариантов инактивированной ассоциированной вакцины против некробактериоза КРС с лечебной и профилактической целями, включая вариант вакцины с им- муномодулятором «Гликопин» (ГМДП), в сравнении с Югославской ассоциированной вакциной «Памавак» на 170 головах крупного рогатого скота.

Таблица 4 Результаты сравнительного испытания ассоциированной вакцины и моновакцин

Впоследствии, лучшим вариантом вакцины против некробактериоза КРС было привито все поголовье (1347 коров) этого хозяйства. Другой вариант (эмульгированной) опытной серии инактивированной ассоциированной вакцины против некробактериоза КРС был испытан на 381 голове КРС в совхозе «Луховский» Октябрьского района г. Саранска. В дальнейшем в совхозе «Барыбино» опытно-промышленной серией инактивированной ассоциированной вакцины против некробактериоза КРС с ГОА адъювантом, было привито 32 коровы различными дозами этого препарата. В этом хозяйстве были исследованы также некоторые параметры иммунитета, стимулируемого этой вакциной.

В результате проведенных исследований было установлено, что вакцинация животных инактивированными ассоциированными вакцинами против инфекционных заболеваний конечностей овец и некробактериоза КРС является эффективным методом борьбы с этими болезнями. Их эффективность оказалась выше, чем у Югославской ассоциированной вакцины «Памавак» и эмульгированной моновакцины против копытной гнили овец. В итоге, в качестве адъюванта был выбран 3% ГОА как менее реактогенный по сравнению с масляным и дешевый. Наиболее эффективной оказалась двукратная иммунизация животных с интервалом 28 - 30 дней при подкожном введении в области коленной складки для КРС и в области нижней трети шеи для овец в дозах по 5 мл на 1 голову животного.

Срок иммунитета, стимулируемого этими вакцинами не превышал 6 месяцев, поэтому перспективной являлась однократная реиммунизация через 5-6 месяцев после второй вакцинации для поддержания иммунитета у привитых животных.

Инактивированная ассоциированная вакцина против инфекционных заболеваний конечностей овец получила название «Овикон», а инактивированная ассоциированная вакцина против некробактериоза конечностей КРС - «Нековак».

2.5 Разработка методов контроля ассоциированных вакцин

За основу лабораторных методов контроля вакцин «Овикон» и «Нековак» брали существующие стандартные методики: отбор проб по ОСТ 10-07-001-93, определение внешнего вида визуально, определение стерильности согласно ГОСТ 28085-89 - «Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности». При этом в питательных средах с посевами и пересевами не должно быть визуальных признаков роста микрофлоры. Определение безвредности проводили также по стандартной методике, используя 10 белых мышей и двух кроликов, при подкожном введении в соответствующих дозах. Вакцины считали безвредными, если животные в течение 10 суток оставались живы и клинически здоровы. Допускалось образование в местах введения вакцин припухлостей различной величины. Принципиально важным и сложным стал вопрос о разработке методов контроля антигенной и иммуногенной активности ассоциированных вакцин «Овикон» и «Нековак» ввиду большого количества антигенов и анатоксинов входящих в их состав. Ранее, нами в качестве лабораторного контроля антигенной активности вакцины против копытной гнили овец инактивированной эмульгированной был разработан метод определения антител в РА у вакцинированных кроликов. Предварительно нами были изучены вирулентные и иммуногенные свойства D. nodosus на лабораторных моделях. В результате исследований было установлено, что лабораторные животные (кролики, белые мыши, морские свинки и другие) не чувствительны к D. nodosus. При различных методах заражения и дозах культуры D. nodosus не вызывали заболевания и падежа лабораторных животных (Панасюк С.Д., 1982). Однако, нами было экспериментально установлено, что динамика накопления антител в крови вакцинированных кроликов в половинных дозах (от дозы овцы) повторяет динамику накопления агглютининов у привитых овец только на более низком уровне соответственно 1:720-1:880 и 1:2133-1:2533 на пике накопления. При этом коэффициент корреляции был в высокой степени положительным (r=+0,83-+ 0,99). Это позволило использовать кроликов в качестве лабораторной модели контроля антигенной активности вакцины против копытной гнили овец ВИЭВ инактивированной эмульгированной (Панасюк С.Д. 1982, 1983). Предложенный метод прошел проверку на Орской и Армавирской биофабриках и надежно обеспечивал качество указанной вакцины до момента снятия её с производства. Учитывая тот факт, что в состав вакцины «Овикон» входит антиген D. nodosus, мы использовали указанный метод контроля антигенной активности этой валентности на кроликах в тех же параметрах, как и у вакцины против копытной гнили овец. Более того, учитывая потерю вирулентных свойств культур F. necrophorum (быструю потерю вирулентных свойств культур при пересевах на жидких питательных средах и возможность образования L-форм). Нами были проведены сравнительные исследования по определению динамики антител у вакцинированных кроликов, овец и КРС. Результаты исследований показали, как для валентности D. nodosus, так и для валентности F. necrophorum имеется возможность использовать кроликов в качестве лабораторной модели для оценки антигенной активности вакцин. Корреляция титров агглютининов у вакцинированных кроликов и овец, а также у привитых кроликов и КРС была очень высокой и соответственно составляла r=+0,97 и r=+ 0,99,что показано в таблице 5. Полученные результаты позволили нам расширить эксперимент и продолжить использовать кроликов в качестве лабораторной модели антигенной активности вспомогательных валентностей S. aureus, C. perfringens т. А, A. pyogenes ассоциированных вакцин «Овикон» и «Нековак».

Таблица 5 Сравнительное антителообразование у вакцинированных (валентность F.necrophorum) кроликов, овец, КРС

Полученные результаты позволили установить тот факт, что привитые вакцинами «Овикон» и «Нековак» кролики могут быть лабораторной моделью оценки антигенной активности валентностей S. aureus, C.perfringens т. А, А. pyogenes в реакции нейтрализации (РН), о чем убедительно свидетельствовали в высокой степени коэффициенты корреляции (r= +0,97 - +0,99).

Результаты проведенных экспериментов легли в основу создания временной нормативной документации (НД) на инактивированную ассоциированную вакцину против некробактериоза конечностей КРС «Нековак» и на инактивированную ассоциированную вакцину против инфекционных заболеваний конечностей овец «Овикон», включающую временное наставление, временную инструкцию по изготовлению и контролю и временные технические условия (ТУ).

2.6 Изучение некоторых параметров иммунитета при применении инактивированных ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон»

С целью изучения некоторых параметров иммунитета, стимулируемых ассоциированными вакцинами «Овикон» и «Нековак» с руководством и специалистами Курской биофабрики в 1994 году были согласованы вопросы технологии изготовления опытно-промышленной серии вакцин «Овикон» и «Нековак», общим объемом 45000 доз. Одновременно, после согласования вопросов технологии изготовления, выпуск опытно-промышленных серий начался на Ставропольской биофабрике. В период с 1994 по 1996 годы Ставропольской биофабрикой было выпущено 3 опытно-промышленных серии вакцины «Нековак» общим объемом 850 литров (175000 доз) и 4 серии вакцины «Овикон» объемом 1118,6 л (223720 доз).

Изучение некоторых параметров иммунитета, стимулируемых ассоциированными вакцинами «Нековак», «Нековак-стимул» (вакцина «Нековак» с иммуномодулятором ГМДП) и «Овикон», провели по составленной программе исследований. Она предусматривала испытание вакцины «Нековак-стимул» в двух неблагополучных по некробактериозу КРС хозяйствах Ленинского района Тульской области: агрофирмах «Иван-Озеро» и «Саженец» - на всем поголовье КРС (635 голов) этих хозяйств и вакцин «Нековак» и «Нековак-стимул» с СХПК ПЗ «Барыбино» Домодедовского района Московской обл. на 221 корове. При этом вакциной «Нековак-стимул» привили 20 здоровых коров, для оценки некоторых параметров клеточного иммунитета и его сопоставления с аналогичными показателями иммунитета, стимулируемого вакциной «Нековак».

Комиссионное испытание опытно-промышленной серии вакцины «Овикон» провели на 1234 головах мелкого рогатого скота в ГПЗ «Котовский» Пронского района Рязанской области, неблагополучного по копытной гнили и некробактериозу овец, в наиболее сильно пораженных отарах баранов-производителей и овцематок племъядра, где заболеваемость конечностей соответственно составляла до начала эксперимента 30,0 и 10,3%. Обе вакцинированные отары составили примерно половину всего поголовья овец хозяйства.

В хозяйствах, где испытывали опытно-промышленные серии вакцин «Овикон» и «Нековак», контрольные и вакцинированные животные содержались в одинаковых условиях. Выпасались и выгуливались совместно.

Результаты представлены в таблицах 6, 7.

Итоги экспериментов по изучению некоторых параметров иммунитета, стимулируемых ассоциированными вакцинами «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» показывают, что указанные препараты вызывали в организме привитых животных значительное повышение иммунного статуса, выражающегося выработкой как гуморального, так и клеточного иммунитета. Поствакцинальный иммунитет сопровождался значительны ростом титров специфических агглютининов, которые с достоверностью 99% (Р <0,01) в средней и высокой степени находятся в обратной коррелятивной связи с заболеваемостью конечностей у привитых животных. Пик выработки специфических гуморальных тел наблюдались через 2-3 недели после второй вакцинации.

Так, при применении вакцины «Нековак-стимул» агрофирме «Иван-Озеро», титры специфических агглютининов увеличились с 1:200 в начале испытания, до 1:2240 через 3,5 месяца после второй вакцинации, т.е. увеличились в 11,2 раза. В этот период заболеваемость КРС резко снизилась с 58,4% в начале опыта до 4,4% в конце исследований, т.е. в 13,3 раза. Коэффициент корреляции (r) по результатам опыта составил с достоверной вероятностью 99% (Р <0,01) величину (-0,88). Это указывает на наличие высокой степени обратной коррелятивной связи между величиной титров специфических агглютининов и заболеваемостью конечностей животных.

Аналогичные результаты были получены при испытании вакцины «Нековак-стимул» в агрофирме «Саженец», где при увеличении титров гуморальных антител в РА с 1:230 до 1:3680, т.е. в 16 раз, уровень заболеваемости животных некробактериозом снизился с 83% до 0,6% в 138,3 раза, т.е. хозяйство было практически оздоровлено от этой инфекции. Коэффициент корреляции (r) составил (-0,57), что подтверждает наличие обратной корреляционной связи между величиной титров агглютининов и заболеваемостью некробактериозом животных средней степени.

В тоже время, в СХПК ПЗ «Барыбино» во время испытания опытно-промышленной серии вакцины «Нековак», при росте титров агглютининов в 10,4 раза (с 1:370 до 1:3840) заболеваемость некробактериозом снизилась с 31,7% до 3,0% т.е. в 10,6 раза, что с достоверной вероятностью 99% подтвердило наличие обратной коррелятивной связи между титрами агглютининов и заболеваемостью животных некробактериозом (r=-0,98) в высокой степени. В этом эксперименте, как и в предыдущих опытах, отмечали увеличение всего пула лимфоцитов. Несколько большее увеличение Т- и В- лимфоцитов констатировали у коров, привитых вакциной «Нековак-стимул», соответственно на 7,13 и 5,09% по сравнению с первоначальным уровнем. У животных, привитых вакциной «Нековак» количество Т- и В- лимфоцитов увеличилось соответственно на 4,7 и 3,83%. В контрольной группе уровень Т- и В- лимфоцитов оставался в пределах физиологической нормы.

Результаты опыта, отображенные в табл. 7, свидетельствуют о нарастании интенсивности фагоцитоза в группах, где использовались вакцины «Нековак» и «Нековак-стимул», в то время как в контрольной группе этого не произошло.

Данные табл. 7 свидетельствуют также об увеличении концентрации в крови вакцинированных животных иммуноглобулинов классов G и М. Максимальный рост иммуноглобулинов наблюдали через 1 месяц после второй вакцинации. В этот период Ig G у привитых вакциной «Нековак-стимул» составили величину 24,06±0,95 мг/мл, что на 10,6% больше первоначальной величины. У коров, иммунизированных вакциной «Нековак», иммуноглобулины G увеличивалась на 8,4% и достигли величины 23,68±0,85 мг/мл. Анологично увеличивалась концентрация Ig M.

Результаты эксперимента убедительно показали, что вакцина «Нековак» стимулировала у привитых животных выработку первичного и вторичного напряженного поствакцинального гуморального и клеточного иммунитета и обладала лечебным действием. Применение вакцины «Нековак» в СХПК ПЗ «Барыбино» позволило в 10,6 раза снизить заболеваемость привитых животных некробактериозом и свести её до единичных случаев.

При испытании опытно-промышленной серии инактивированной ассоциированной вакцины «Овикон» в ГПЗ «Котовский» на группе баранов-производителей и овцематок, мы наблюдали теже закономерности, что и при испытании вакцин «Нековак» и «Нековак-стимул» на КРС.

Так, в группе баранов-производителей, привитых вакциной «Овикон», титры гуморальных антител увеличились по валентности D. nodosus с 1:120 до 1:2160, т.е. в 32,0 раза, а по валентности F. necrophorum с 1:120 до 1:3760, т.е. в 37,6 раза через месяц после второй вакцинации. В указанные сроки заболеваемость копытной гнилью и некробактериозом в группе баранов-производителей снизилась с 30,5 до 6%, т.е. в 5 раз.

В группе привитых овцематок племъядра титры специфических антител с начала испытания выросли по валентности D. nodosus с 1:120 до 1:2320, т.е. в 19,3 раза, а по валентности F. necrophorum с 1:110 до 1:3200, т.е. в 32,0 раза. Заболеваемость конечностей у привитых овцематок в те же периоды снизилась с 10,3% до 3,4%, т.е. в 3,0 раза. Результаты исследова ний подтвердили наличие обратной коррелятивной связи с достоверностью 99% между уровнем титров специфических агглютининов и заболеваемостью копытной гнилью и некробактериозом в группе баранов-производителей высокой степени по валентности D. nodosus (r=-0.82), а по валентности F. Necrophorum (r=-0.90).

Таблица 6 Результаты испытания вакцины против некробактериоза КРС (Нековак) в СХПК ПЗ «Барыбино» Домодедовского района, Московской области

Таблица 7 Основные параметры иммунного статуса коров, привитых вакцинами против некробактериоза КРС «Нековак» и «Нековак-стимул» в СХПК ПЗ «Барыбино» Домодедовского района Московской области

Количество животных (n)=20, достоверность Р< 0,01

У привитых овцематок племъядра наблюдалась обратная коррелятивная связь между этими показателями средней степени по валентности D. nodosus (r=-0,57), а по валентности F. necrophorum коэффициент корреляции r был равен (- 0,66).

При изучении некоторых параметров клеточного иммунитета у животных, привитых указанными препаратами, максимально увеличивалась концентрация иммуноглобулинов классов G и М. У привитых животных отмечали увеличение всего пула лимфоцитов, как тимусзависимых, так и бурсазависимых. Особенно значительным оно было на 14 - 30 день после второй вакцинации. Иммунизация указанными препаратами также стимулировала у вакцинированных животных интенсивность фагоцитоза нейтрофилов. Основные показатели фагоцитоза: фагоцитарная активность, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс - достигли максимума на 14 день после вакцинации. На этом фоне все показатели иммунного статуса контрольных животных оставалась в пределах физиологической нормы.

Иммунизация вакцинами «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» сопровождалась выраженным лечебным эффектом, проявляющимся в легком переболевании привитых животных, их быстром выздоровлении и отсутствии случаев рецидивов заболевания.

Доказательство иммуногенности указанных вакцин позволило поставить вопрос об их промышленном выпуске и создании промышленной технологии изготовления.

2.7 Промышленная технология изготовления ассоциированных вакцин «Нековак» и «Овикон»

Успешное испытание опытно-промышленных серий вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» в неблагополучных по инфекционным болезням конечностей хозяйствах, позволило перейти на серийное примышленное производство указанных препаратов.

Общая схема технологического процесса изготовления указанных вакцин состоит из следующих стадий, представленных в табл. 10.

Технология, разработанная при создании опытно-промышленных серий вакцин «Нековак» и «Овикон» в 1994-1996 гг., предусматривала культивирование анаэробных штаммов F. necrophorum, D. nodosus, C. perfringens т. А на жидких питательных средах из натурального сырья. Аэробные культуры S. aureus и A. pyogenes выращивали на плотных питательных средах - 2,5% агаре Хоттингера в 1,5 л. матрасах.

Технология изготовления последних двух валентностей вакцин являлась весьма трудоемкой, с высокими материальными затратами и низким выходом бактериальной массы. По нормативно-технической документации F. necrophorum и D. nodosus выращивалась на питательной среде, состоящей из смеси печеночного экстракта и одного из переваров мяса (ферментативного или казеинового) в соотношении 1:3. Это очень дорогостоящая среда.

Таблица 8 Испытание опытно-промышленной серии ассоциированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец «Овикон» в ГПЗ «Котовский» Пронского района Рязанской области

Таблица 9 Основные параметры иммунного статуса овец, привитых ассоциированной вакциной против инфекционных заболеваний конечностей «Овикон» в ГПЗ «Котовский» Пронского района Рязанской области

Достоверность Р<0,01