Были получены следующие результаты культивирования по накоплению бактериальной массы на сложно компонентной питательной среде: S. aureus - 20Ч10⁸ м.т./мл., A. pyogenes - 9Ч10⁸ м.т./мл.

В тоже время, при культивировании указанных микроорганизмов в матрасах с 2,5% агаром Хоттингера, накопление A. pyogenes составило 4 млрд.м.т. в мл. Такое количество антигенов по старой технологии культивировании в матрасах с 2,5% агаром Хоттингера мы могли получать с 1000 - 2000 матрасов (5 - 10 культивирований по 250 матрасов).

На втором этапе при изыскании питательных сред для культивирования анаэробных микроорганизмов F. necrophorum и D. nodosus, перевар Хоттингера из состава питательной среды был исключен. Вместо экстракта печени использовался её гидролизат. Согласно инструкции по изготовлению, на 100 л экстракта печени необходимо 100 кг печени КРС, а для изготовления 20 л гидролизата печени - всего 15 кг. Гидролизат печени добавляли в количестве 2% к основному объему питательной среды. В конструировании питательной среды также использовали гидролизаты казеина: кислотный и ферментативный, ферментативный гидролизат кровяных сгустков.

Готовая питательная среда имела следующие биохимические показатели: рН - 7,8 -8,0, аминного азота 150-180 мг%.

В результате проведенных исследований сравнительного культивирования анаэробных микроорганизмов на экспериментальной (сложно компонентной питательной среде) и контрольной среде (среда МППБ на основе перевара Хоттингера), нами было установлено, что накопление бактериальной массы на экспериментальной среде в 1,5 раза превышало этот показатель контрольной среды. Замена основного перевара Хоттингера гидролизатом печени в сложно компонентной среде позволила снизить в 6 раз затраты на производство ростовых сред.

Успешное испытание опытно-промышленной серий ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» в неблагополучных по инфекционным болезням конечностей крупного и мелкого рогатого скота животноводческих хозяйствах РФ, а также разработка и усовершенствование промышленной технологии изготовления указанных препаратов позволили:

1. Оформить патенты на ассоциированную вакцину «Овикон» против инфекционных заболеваний конечностей овец, и на ассоциированную вакцину «Нековак» против некробактериоза КРС;

2. Утвердить постоянную действующую нормативную документацию на указанные препараты;

3. Зарегистрировать в РФ указанные препараты;

4. Продолжить серийное производство указанных вакцин на ФГУП «Ставропольская биофабрика».

5. Сертифицировать выпуск этих препаратов;

6. Провести испытания эффективности промышленных серий ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» в неблагополучных по инфекционным болезням конечностей крупного и мелкого рогатого скота животноводческих хозяйствах РФ.

2.8 Испытание эффективности промышленных серий ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» «Овикон». Разработка системы мероприятий по борьбе с инфекционными заболеваниями конечностей крупного и мелкого рогатого скота

Утверждение Нормативной Документации на ассоциированные вакцины «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» и начавшееся на ФГУП «Ставропольская биофабрика» промышленное производство указанных препаратов позволили перейти к испытанию эффективности промышленных серий этих вакцин в неблагополучных по некробактериозу и копытной гнили животноводческих и овцеводческих хозяйствах Российской Федерации.

Результаты исследований представлены в таблицах 11 и 12. Так, применение промышленной серии вакцины «Нековак» в ГПЗ «Зыбино» Тульской области позволило снизить заболеваемость коров некробактериозом с 65,0% до 4,6%, т.е. в 14,1 раза. В этот период титры специфических агглютининов возросли с 1:90 до 1:3840, т.е. увеличились в 42,7 раза (r=-0,98, P<0,01), что подтверждает наличие обратной коррелятивной связи высокой степени между величиной титров агглютининов и заболеваемостью некробактериозом. В двух хозяйствах Добринского района Липецкой области промышленные серии вакцины «Нековак» испытывали в колхозе «им. Крупской» и в колхозе «им. Ильича». Вакцину использовали в соответствии с наставлением, но комплекс организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий, который применяли вместе с вакцинацией, был в этих хозяйствах различным. Так, в колхозе «им. Крупской», помимо вакцинации всего поголовья КРС, провели обрезку и расчистку копытец, в рацион животных была введена минерально-витаминная подкормка, в пастбищный период был проведен ремонт полов и дезинфекция помещений. В колхозе «им. Ильича», наряду с вакцинацией, всех животных один раз в 5 дней пропускали через ножные дезинфицирующие ванны с 10% раствором медного купороса. В рацион животных помимо минерально-витаминной подкормки были введены добавки серы и метионина, в пастбищный период был проведен ремонт полов в стойлах, дезинфекция животноводческих помещений и выгульных дворов, инвентаря. В пастбищный период все больные животные были отделены от основного стада и подвергнуты лечению антибиотиками широкого спектра.

От животных в период наблюдений брали кровь и исследовали сыворотку в РА на наличие специфических аггютининов. В этих хозяйствах через два месяца после второй вакцинации отмечался высокий уровень подъёма средних титров агглютининов у привитых животных до 1:3200 в колхозе «им. Крупской» и до 1:3680 в колхозе «им. Ильича», что соответственно более первоначального уровня в 32 и 36,2 раза. В указанный период отмечали (с достоверной вероятностью 99%) резкий спад уровня заболеваемости коров некробактериозом соответственно в колхозе «им. Крупской» в 36,2 раза, в колхозе «им. Ильича» в 21,4 раза, до единичных случаев (0,8% и 0,7%). Через 6 месяцев после второй вакцинации к моменту окончания сроков иммунитета и резкого снижения титров агглютининов заболеваемость животных некробактериозом (с достоверной вероятностью 99%) в колхозе «им. Крупской» несколько выросла до 2,6%. В колхозе «им. Ильича» несмотря на окончание сроков иммунитета больных некробактериозом коров не отмечено, что, вероятно, связано с правильным использованием описанной системы мероприятий по борьбе с этой инфекцией. Результаты исследований (с достоверной вероятностью 99%) подтверждают наличие обратной коррелятивной связи между титрами агглютининов и заболеваемостью животных некробактериозом. В обоих хозяйствах обратная коррелятивная связь между титрами и заболеваемостью животных была средней степени в колхозе «им. Крупской» величина r составила (-0,68), в колхозе «им. Ильича» (r=-0,64; P<0,01).

Аналогичные испытания были проведены в АО «Сафоновское» Раменского района Московской области, где в двух животноводческих фермах хозяйствах привили коров вакцинами «Нековак» и «Нековак-стимул», где в качестве имуномодулятора использовали препарат «Беталин», представляющий собой очищенный рекомбинантный лимфотоксин (фактор некроза опухолей бета) человека.

Результаты испытаний убедительно продемонстрировали тот факт, что применение вакцин «Нековак» и «Нековак-стимул» в системе организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий позволяет уменьшить заболеваемость привитых животных до единичных случаев и практически оздоровить хозяйство от этой инфекции.

Испытание промышленных серий ассоциированной вакцины «Овикон» проводили в трех овцеводческих хозяйствах Ставропольского края: СХП «Новомарьевское» Шпаковского района, СХП «Каменнобалковское» Благодарненского района, подсобном хозяйстве ФГУП «Ставропольская биофабрика».

Во всех хозяйствах перед вакцинацией проводили расчистку и обрезку копытец, в рацион животных вводили монокальций фосфат для восполнения недостатка кальция и фосфора и добавки серы. В пастбищный период проводили дезинфекцию кошар, выгульных базов и инвентаря. В СХП «Каменнобалковское и подсобном хозяйстве Ставропольской биофабрики наряду с выше перечисленными организационно-хозяйственными и ветеринарно-санитарными мероприятиями всех животных пропускали один раз в 5-6 дней через ножные ванны с 10% раствором препарата «Цинкосол». По окончании срока иммунитета (5-6 месяцев после второй вакцинации) больным баранам-производителям в этих хозяйствах провели курс лечения антибиотиками широкого срока действия. Животные, не поддававшихся лечению, сдавали на убой. Вакцину «Овикон» применяли в соответствии с наставлением. В результате проведенных исследований были получены следующие результаты:

1. В СХП «Новомарьевское» применение вакцины «Овикон» на 2406 овцах позволило снизить заболеваемость инфекционными заболеваниями конечностей с 9,1% до 2,0%, т.е. в 4,55 раза. В контрольной непривитой отаре в этот период заболеваемость выросла с 4,55 до 10,3%, т.е. 2,3 раза.

2. В СХП «Каменнобалковское», где применяли систему мероприятий вместе с вакцинацией на 879 овцах пораженность инфекционными заболеваниями конечностей снизилась к концу испытаний с 9,1% до 0,0%. В контрольной не привитой отаре заболеваемость выросла в течение наблюдений с 7,8% до 10,4%.

3. В подсобном хозяйстве Ставропольской биофабрики промышленные серии вакцины «Овикон» испытывали на поголовье 1720 овец. В результате осмотра установили 371 животное с поражениями конечностей (21,6%). Помимо вакцинации в хозяйстве провели весь комплекс организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий по ликвидации инфекционных болезней конечностей, включая расчистку и обрезку копытец, ножные дезинфицирующие ванны с 10% раствором препарата «Цинкосол», введение в рацион минерально-витаминных добавок, лечение антибиотиками широкого спектра действия больных баранов-производителей и других, применённых в СХП «Каменнобалковское.

Таблица 10 Результаты испытания вакцины «Нековак» в колхозах «имени Крупской» и «им. Ильича» Добринского района Липецкой области

Таблица 11 Результаты испытания вакцины «Нековак» и «Нековак-Стимул» в АО «Сафоновское» Раменского района Московской области

До иммунизации средние титры специфических аггютининов по валентности Dichelobacter nodosus составили 1:100, по валентности Fusebacterium necrophorum -1:95. Через один месяц после второй вакцинации средние титры антител составили по валентности Dichelobacter nodosus составили 1:2880, по валентности Fusоbacterium necrophorum -1:2720. Через 5,5 месяцев после второй вакцинации к окончанию сроков иммунитета средние титры антител по валентности Dichelobacter nodosus находились в пределах 1:260, а по валентности Fusоbacterium necrophorum -1:280. в указанный период был проведен так же заключительный осмотр всех животных 1740 овец на наличие клинических признаков инфекционных заболеваний конечностей. В результате осмотра было установлено 4 больных овцы (0,23%).

Таким образом, к концу проведенных испытаний промышленных серий ассоциированной вакцины «Овикон» в системе организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий с достоверной вероятностью 99% (Р<0,01) заболеваемость животных копытной гнилью и некробактериозом снизилась в 94 раза, т.е. практически хозяйство было оздоровлено.

Основываясь на успешных результатах испытаний промышленных серий ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон»в неблагополучных хозяйствах, особенно там, где применялась система организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий, нами в соавторстве была предложена система мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями конечностей КРС и овец, представленная в рекомендациях: «Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе крупного рогатого скота», Москва, 2000 год и «Методических рекомендациях по профилактике и борьбе с копытной гнилью овец», Москва, 2004 год.

Итоговые многолетние результаты испытаний инактивированных ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул»и «Овикон», в том числе в системе лечебно-оздоровительных мероприятий, показаны в таблице 12. Данные этой таблицы убедительно иллюстрируют тот факт, что использование вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» «Овикон» в системе лечебно-оздоровительных мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями конечностей позволило оздоровить 5 животноводческих и 2 овцеводческих хозяйства.

Это подтверждает её эффективность и необходимость использования в ликвидации некробактериоза и копытной гнили жвачных, что также иллюстроирует таблица.

Таблица 12 Результаты испытаний ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-Стимул» и «Овикон» и системы мероприятий против некробактериоза крупного рогатого скота и копытной гнили овец

Рисунок 2 Схема оздоровительных мероприятий при инфекционных болезнях конечностей КРС и овец

Выводы

1. Инфекционные болезни конечностей крупного и мелкого рогатого скота широко распространены в различных природно-климатических зонах Российской Федерации и Республике Киргизия. Заболеваемость конечностей КРС некробактериозом варьирует в широких пределах в хозяйствах Центральной России от 11,6 до 83,0%, в хозяйствах Ставропольского края от 1 до 17,6%, в хозяйствах Республики Киргизия от 6,5 до 20,3% поголовья животных хозяйства. Заболеваемость конечностей овец копытной гнилью и некробактериозом так же варьирует в широких пределах в хозяйствах Центральной России от 3,5 до 52%, в хозяйствах Ставропольского края от 3,6 до 38,1%, в хозяйствах Республики Киргизия от 8,0 до 86,0% поголовья животных . Уровень заболеваемости также зависит от условий содержания, кормления, внешней среды и складывающейся патогенетической ассоциации микроорганизмов.

2. Источником возбудителей инфекционных болезней конечностей КРС и овец являются больные животные. Во всех природно-климатических зонах инфекционные болезни конечностей крупного и мелкого рогатого скота имеют два сезонных пика наибольшего распространения: зимне-весенний и летне-осенний, что связано с действием предрасполагающих факторов внешней среды.

3. Клиническое проявление инфекционных болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота зависит от условий содержания и кормления, а также от факторов внешней среды и состава складывающейся патогенетической ассоциации. Наиболее тяжело некробактериоз конечностей КРС проявляется у быков на откорме и высокопродуктивных молочных коров в период непосредственно перед отёлом или сразу после него. Копытная гниль и некробактериоз (инфекционные болезни конечностей) у овец часто протекают совместно. Наиболее тяжело инфекционные болезни конечностей проявляются у баранов-производителей и взрослых овцематок.

4. В этиологии и патогенезе инфекционных болезней конечностей крупного рогатого скота (некробактериоз) и овец (некробактериоз и копытная гниль) помимо основных возбудителей этих болезней F. necrophorum и D. nodosus важную роль играют представители сапрофитной, условно-патогенной и патогенной микрофлоры, формирующие экопаразитарные патогенетические ассоциации синергетического типа.

5. Гнойно-раневая микрофлора: C. perfringens т. А, A. pyogenes и S. aureus в ассоциации с D. nodosus и F. necrophorum усиливает вирулентность последних, позволяя действием своих ферментов значительно быстрее преодолевать защитные барьеры организма животного и вызывать тяжелые поражения конечностей и внутренних органов, часто приводя к летальному исходу.

6. Подобран видовой состав микрофлоры для создания ассоциированных вакцин против инфекционных болезней конечнестей КРС и овец. Определены оптимальные концентрации антигенов D. nodosus, F. necrophorum, C. perfringens т. А, A. pyogenes, S. aureus в составе ассоциированных вакцин, не вызывающие их конкуренции в организме привитых животных и стимулирующие иммунологическую перестройку организма.

7. Поствакцинальный иммунитет, стимулируемый инактивированными ассоциированными вакцинами «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон», сопровождается существенным ростом титров специфических агглютининов (в 10-100 раз), которые с достоверной вероятностью 99% находятся в обратной коррелятивной связи в средней и высокой степени с заболеваемостью конечностей привитых животных. Пик выработки специфических гуморальных антител наблюдается через 2-4 недели после 2-й вакцинации. Заболеваемость конечностей у привитых животных на пике иммунитета была минимальной и снижалась в десятки раз. Через 2-4 недели после 2-й иммунизации у вакцинированных животных максимально увеличиваются показатели клеточного иммунитета: значительно возрастает концентрация иммуноглобулинов классов G и M и происходит увеличение всего пула (Т-) и (В-), лимфоцитов, одновременно возрастает интенсивность фагоцитоза нейтрофилов.

8.Разработаны методы контроля инактивированных ассоциированных вакцин «Нековак» и «Овикон».Кролики массой 2,5-3 кг. привитые в дозе 2,5 мл могут быть лабораторной моделью оценки антигенной активности указанных препаратов. Титры специфических агглютининов и токсин-нейтрализующих антител у привитых овец, КРС и кроликов с достоверной вероятностью 99% коррелируют между собой в высокой степени (r=+0,97-+0,99).

9. Вакцинация животных инактивированными ассоциированными вакцинами: против некробактериоза КРС ( «Нековак» и «Нековак-стимул»), против некобактериоза и копытной гнили овец («Овикон») является эффективным средством в борьбе с указанными болезнями. Оптимальной является двукратная подкожная иммунизация животных указанными препаратами в дозах 5 мл с интервалом 28-30 дней за 2 недели перед ожидаемым пиком подъема заболеваемости. Длительность иммунитета, стимулируемого этими вакцинами, составляет 6 месяцев. Для поддержания активного иммунитета у привитых животных перспективной является однократная ревакцинация в дозе 5 мл за 1 месяц до окончания срока иммунитета.

10. Использование инактивированных ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» в системе организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий против инфекционных болезней конечностей КРС и овец позволяет существенно снизить или полностью ликвидировать указанные инфекции в животноводческих и овцеводческих хозяйствах.

Практические предложения

1. Разработаны и зарегистрированы в РФ инактивированные ассоциированные вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота «Нековак» и «Нековак-стимул». Промышленное производство указанных препаратов освоено и сертифицировано на ФГУП «Ставропольская биофабрика» согласно нормативной документации, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ. Препараты применяются в неблагополучных по некробактериозу крс хозяйствах в соответствии с наставлением по их применению.

2. Разработана и зарегистрирована в Российской Федерации инактивированная ассоциированная вакцина против инфекционных болезней конечностей овец (копытная гниль и некробактериоз) «Овикон». Промышленное производство вакцины освоено и сертифицировано на ФГУП «Ставропольская биофабрика» согласно нормативной документации, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ. Препарат применяются в неблагополучных по некробактериозу и копытной гнили овец хозяйствах в соответствии с наставлением по применению.

3. Разработана и внедрена в ветеринарную практику система организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий по борьбе с некробактериозом КРС и инфекционными болезнями конечностей овец, вошедшая в «Инструкцию о мероприятиях по профилактике и борьбе с некробактериозом животных», утвержденную Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ в 2000 г., а также изложенная в рекомендациях «Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе крупного рогатого скота», одобренных Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ в 2000 г. и в «Методических рекомендациях по профилактике и борьбе с копытной гнилью овец», утвержденных РАСХН в 2004 г.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Панасюк С.Д. Иммунологическая оценка антигена B.nodosus, применяемого с различными адъювантами / Панасюк С.Д. // Бюллетень ВИЭВ - 1982 - Вып.48, С.29-32.

Панасюк С.Д. Изучение вирулентных и иммуногенных свойств Bacteroides nodosus на лабораторных моделях / Панасюк С.Д. // Тр. ВИЭВ - 1983 - т. 57, С.69-73.

Архангельский И.И. "Некоторые вопросы иммунитета при копытной гнили овец" / Архангельский И.И., Караваев Ю.Д., Сидорчук А.А., Семенова И.Н., Панасюк С.Д. // Тр. ВИЭВ - 1983 - т.57 - С.81-86.

Артюшина И.А. Выделение гена пилина - основного белка пилей B.nodosus "./ Артюшина И.А., Панасюк С.Д., Артюшин С.К.// "Новые направления биотехнологии" Тез. докл. конф. - Пущино Моск. обл.- 1986 - 13-15 октября - С.48.

Панасюк Д.И. Гельминты как резервуарные хозяева и инокуляторы возбудителей инфекционных и инвазионных заболеваний человека и животных / Панасюк Д.И., Панасюк С.Д. // Тр. лаборатории гельминтологии АН СССР - 1986 - №36 - С.212-221.

Панасюк С.Д. Эффективность ассоциированных вакцин против копытной гнили овец. / Панасюк С.Д., Сидорчук А.А., Караваев Ю.Д. // Мат. пленума секции паразитоценологии АН СССР - Витебск, 1988 - С. 19-21.