Ветеринарно-санитарный контроль остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения на основе современных методологий

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ В СЫРЬЕ И ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ОСНОВЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОЛОГИЙ

16.00.06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

КАЛЬНИЦКАЯ ОКСАНА ИВАНОВНА

Москва - 2008

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Материалы и методы. Работа проводилась в период с 2000 г. по 2007 г. в лаборатории ветеринарно-санитарной экспертизы Московского государственного университета прикладной биотехнологии, в Московской Городской ветеринарной лаборатории, в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории МСХ РФ, лаборатории санитарии молока и профилактики мастита ГНУ ВНИИВСГЭ, в ФГУ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве", в ЗАО "РОСТЕСТ", на производственном предприятии "Леггорн" (Республика Молдова), в производственной лаборатории АО "ТАМП", в ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Чувашской республике - Чувашия", в РГУ "Территориальная отраслевая санитарно-технологическая пищевая лаборатория" Чувашской республики, в ООО "Продовольственная корпорация" (г. Казань).

Мониторинговые исследования по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения проводили методом отбора образцов на предприятиях, в лабораториях, в торговой сети. Исследованию подвергали мышечную ткань и субпродукты птицы (РФ, Бразилия, Китай, Дания, Канада), крупного рогатого скота (Бразилия, Польша) и свиней (Германия), фарш куриный (Германия, Франция), яйца куриные (РФ), яичный порошок (Бразилия), молоко и молочные продукты (РФ, Литва, Болгария), рыбу морскую (РФ) - всего 2091 образец.

Пробы продукции любезно предоставлены ОАО "Таганским мясоперерабатывающим заводом", ООО "Герсан" (г. Солнечногорск), АО "Леггорн" (г. Тараклия), СХПК "ТОЙСИ" (Чувашская Республика), ООО "Продовольственная корпорация" (г. Казань), Пятигорским мясокомбинатом.

Данные по содержанию остаточных количеств антибиотиков были получены микробиологическим методом диффузии в агар (МУ 3049-84), экспресс-методом определения антибиотиков в пищевых продуктах (МУК 4.2.026-95), методом иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1912-04).

Штаммы микроорганизмов были получены во Всероссийском государственном институте качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ "ВГНКИ").

Определяли чувствительность четырнадцати тест-культур к бензилпенициллину, тетрациклину, стрептомицину, неомицину, гентамицину, спектиномицину, левомицетину, линкомицину, гризину и бацитрацину. Их содержание в животноводческой продукции регламентируется СанПиН 2.3.2.1078-01 и ФАО - ВОЗ.

В опытах использовали бумажные диски, содержащие антибиотики, полученые в ФГУ "ВГНКИ". Диски, содержащие гризин, бацитрацин и стрептомицин, были изготовлены самостоятельно из ватмана № 2 на 0,01 н растворе соляной кислоты из расчета 1000 мкг антибиотика в 1 мл (Егоров Н.С., 1964).

При приготовлении питательных сред использовали пептон, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, 40%-ный коммерческий раствор глюкозы ("Реахим", Россия).

Питательные среды считали пригодными, если при культивировании получали четкие зоны ингибиции. Всего было испытано 15 вариантов питательных сред. Оптимальной считали агарозную питательную среду, приготовленную на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг % аминного азота, рН 7,2-7,4 с добавлением 1 % глюкозы в виде 40 % стерильного раствора.

Сравнивали предложенный нами способ пробоподготовки образцов со способами, предложенными в "Методических указаниях по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства" (№ 3049-84), в "Экспресс-методе определения антибиотиков в пищевых продуктах" (МУК 4.2.026-95), в методических указаниях по "Определению остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа" (МУК 41.1912-04).

Апробация методики определения концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 проведена комиссионно на производственном предприятии АО "ТАМП".

Для количественного определения левомицетина и тетрациклина в продуктах питания использовали принцип твердофазного конкурентного ИФА на полистироловых планшетах. Измерения проводили на планшетном фотометре "Униплан" с использованием фильтра, соответствующего длине волны 450 нм. Расчеты осуществляли в полуавтоматическом режиме по программе "Photo Check".

Использовали тест-системы RIDASCREEN Левомицетин и RIDASCREEN Тетрациклин (ООО "Стайлаб" R-Biopharm). Образцами для определения левомицетина служили говядина жилованная 1 сорта, свинина жилованная 1 сорта, фарш для докторской колбасы высшего сорта, яйцо столовое 1 категории, полученные в СХПК "Тойси" Батыревского района Чувашской Республики. Образцами для определения тетрациклина служили пробы молока, отобранные в Тукаевском филиале ООО "Продовольственная корпорация" Республики Татарстан и пробы молока и говядины, искусственно загрязненные 50 мкг/л тетрациклина.

Содержание остаточных количеств левомицетина и тетрациклина в продуктах животного происхождения определяли также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1912-04) с последующим количественным определением на жидкостном хроматографе с УФ-детектором, обеспечивающим измерение при длине волны 278 нм для левомицетина и 355 нм для тетрациклина.

Пробы мяса отбирали по ГОСТ 7269-79 "Мясо. Методы отбора проб для органолептического исследования".

Всего в экспериментах по определению левомицетина и тетрациклина использовано более 500 образцов животноводческой продукции.

Для определения влияния температурной обработки на разрушение антибиотиков в мышечной ткани исследованы 140 образцов мышечной ткани различных видов животных и птицы. Тушки птицы получены из АО "Леггорн" г. Тараклия.

Убой опытных животных и птицы проводили в различные сроки после введения препарата. Отбор образцов тканей проводили по ГОСТ 26668-85. Исследование образцов на содержание антибиотиков - по МУ 3049-84 "Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства".

Для термической обработки применяли режимы и параметры, утвержденные "Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов". Мясо убойных животных проваривали кусками массой не более 2 кг в течение 3 ч. при достижении температуры внутри куска не менее 80С. Тушки птицы разрубали вдоль позвоночного столба на две половины и проваривали при 100С в течение 1 ч.

После проварки образцы повторно исследовали на содержание остаточных количеств антибиотиков. Исследованию также подвергали бульон, полученный после варки.

При изучении возможности использования антибиотиков в качестве антимикробных средств для продления сроков хранения пищевых продуктов в лимфатические узлы куска говядины вводили цитратно-кислый буфер, снижающий рН мяса и растворы антибиотиков различной концентрации. Использовали хлортетрациклин и нистатин (Стекольников Л.И., 1984). Эти же растворы были использованы для орошения кусков говядины.

С целью разрушения антибиотиков куски говядины промывали под проточной водой и замораживали в морозильной камере в течение 48 часов. Остаточные количества антибиотиков определяли на поверхности куска, на глубине 1 см и на глубине 3 см.

Для определения присутствия антибиотиков в молоке использовали тест-систему Дельвотест-R (Нидерланды). Кроме того, для исследования были использованы образцы молока с искусственным внесением пенициллина, тетрациклина, стрептомицина и левомицетина.

Пробы молока были подвергнуты длительной (63-65С в течение 30 мин), кратковременной (75-80С в течение 15-20 с) и мгновенной пастеризации (80-90С без выдержки) каждая в объеме 50 мл. Образцы молока также подвергали кипячению и стерилизации. Кипячение проводили при общепринятых параметрах, используя стерильную посуду. Стерилизацию образцов проводили в условиях Юрьев-Польского молочного завода (Владимирская обл.). Молоко сначала нагревали паром до 75С, потом в инжекторе за несколько секунд - до 140С и в течение последующих 4 с выдерживали под высоким давлением.

Для изучения влияния сквашивания на остаточные количества антибиотиков образцы молока сквашивали ацидофильной закваской, а после появления сгустка и охлаждения подвергали исследованию.

Количественные показатели результатов исследований подвергали вариационно-статистическому анализу с помощью пакета программ Microsoft Excel, Statgraf, Statgraf Plus. Достоверность различий устанавливали по методу Стьюдента-Фишера (Плохинский Ш.А., 1970).

Результаты исследований получены лично автором. Участие соисполнителей отражено в списке опубликованных работ. Всех соисполнителей настоящих исследований автор искренне благодарит.

Особую благодарность автор выражает научному консультанту за неоценимую помощь в выполнении данной работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение уровня загрязнения остаточными количествами антибиотиков отечественного и импортного сырья и продуктов животного происхождения. Большинство специалистов связывают попадание антибиотиков в пищевые продукты с широким применением лечебных, лечебно-профилактических и ростостимулирующих средств для сельскохозяйственных животных и птицы, а также с использованием антибиотиков для удлинения сроков хранения продуктов питания.

Во исполнение п. 17 постановления Правительства города Москвы № 59-ПП "Об основных направлениях укрепления продовольственной безопасности города Москвы на дальнейшую перспективу" с 2002 года по 2005 год нами проводились мониторинговые исследования по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения отечественного и импортного производства и изучалась степень загрязнения продуктов животного происхождения антибиотиками.

За изучаемый период было обнаружено 114 случаев превышения содержания антибиотиков в продуктах животного происхождения, поступающих на исследования в городские лаборатории: мышечная ткань и субпродукты птицы (РФ, Бразилия, Китай, Дания, Канада), крупного рогатого скота (Бразилия, Польша) и свиней (Германия), фарш куриный (Германия, Франция), яйца куриные (РФ), яичный порошок (Бразилия), молоко и молочные продукты (РФ, Литва, Болгария) (табл.1).

Следует отметить, что остаточные количества антибиотиков в мышечной ткани крупного рогатого скота и свиней обнаруживались только в продукции импортного происхождения (Бразилия, Германия, Польша). Большая часть мышечной ткани и субпродуктов птицы, загрязненная остатками антибиотиков, также была импортного происхождения (Бразилия, Китай, Дания, Канада). Молочная продукция и яйца куриные, в которых обнаруживались антибиотики, были отечественного производства, однако на рынке этот сектор представлен в основном отечественными производителями.

В мышечной ткани и субпродуктах птицы, крупного рогатого скота и свиней чаще всего обнаруживали антибиотики тетрациклинового ряда. Следующим по частоте встречаемости отмечен стрептомицин. В мышечной ткани и субпродуктах редко обнаруживали левомицетин. Пенициллин не обнаружили ни в одном образце.

Гризин и бацитрацин (кормовые антибиотики) были обнаружены в блочной замороженной говядине импортного происхождения (Польша).

Таблица 1. Антибиотики, обнаруживаемые в продуктах животного происхождения в количествах, превышающих требования СанПиН 2.3.2.1078-01

В куриных яйцах и яичном порошке присутствовали тетрациклин и стрептомицин, другие антибиотики не были обнаружены.

В молоке и молочных продуктах встречались остатки пенициллина, тетрациклина, стрептомицина и левомицетина.

Анализ результатов исследования образцов продуктов животноводства показал, что из всех случаев обнаружения антибиотиков наиболее часто в пробах выявляли антибиотики тетрациклинового ряда - в 74,5 % случаев. Стрептомицин присутствовал в 14,9 % образцов мышечной ткани и субпродуктов, молока и молочных продуктов. Левомицетин встречался чаще в молоке и молочных продуктах - всего 5,2 % случаев. Пенициллин обнаруживался только в молочных продуктах в 4,0 % случаев. Гризин и бацитрацин обнаруживались еще реже - в 0,6 и 0,8 % случаев (рис. 1).

Рис. 1. Частота обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения

Нами методом случайной выборки проводился отбор проб для собственных исследований.

В продуктах убоя птицы (табл. 2) чаще всего обнаруживали тетрациклин - в 18,5 % в куриных грудках, в 26,3 % в печени, в 60,5 % в желудках, в 33,3 % в фарше. Антибиотик вдвое чаще обнаруживали в фарше и втрое чаще в желудках, по сравнению с мышечной тканью, которая хуже накапливает антибиотики.

Наибольшая частота обнаружения тетрациклина - в мышечной ткани индейки, она составила 72,7 %. Возможно это связано со сложностями при выращивании молодняка индейки и дополнительным введением тетрациклина. Наши данные согласуются с данными Аксенова В.И. и Ковалева В.Ф. (1977).

Таблица 2. Частота обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства и растениеводства

Левомицетин был обнаружен в 8,3 % продуктов убоя птицы, гризин - лишь в 2,6 %. Всего в 251 образце продуктов убоя птицы выявлено 95 случаев превышения допустимого содержания антибиотиков, что составило 37,9 %.

При исследовании 60 шт. яиц куриных тетрациклин обнаружили в 17 шт. (28,3 %), стрептомицин - в 2 шт. (3,3 %), левомицетин - в 1 шт. (1,6 %). Итого, в 33,3 % случаев яйца куриные содержали антибиотики, несмотря на то, что куры-несушки не должны получать антибиотики.

Наибольший удельный вес тетрациклина возможно обусловлен тем, что его продолжают давать птице для стимуляции роста, невзирая на запрещающую инструкцию.

Мышечная ткань крупного рогатого скота содержала тетрациклин в 8 % случаев, а свиней - в 16,9 % случаев. В печени крупного рогатого скота и свиней также был обнаружен тетрациклин в 10,5 % и 16,9 % случаев соответственно. Кроме того, в печени крупного рогатого скота был обнаружен левомицетин в небольшом количестве случаев - 0,08 %. В 12,6 % почек крупного рогатого скота и в 19,4 % почек свиней присутствовал тетрациклин, в 1,8 % почек крупного рогатого скота и 10,0 % свиней обнаруживался левомицетин.

Всего было исследовано на содержание антибиотиков 1200 образцов продуктов убоя крупного рогатого скота, из них в 135 случаях были обнаружены тетрациклин и левомицетин, то есть в 11,2 % образцов остаточные количества антибиотиков превышали МДУ.

Для исследования продуктов убоя свиней было отобрано 480 проб, в 91 пробе были обнаружены антибиотики, что составило 19,0 %.

Молоко содержало наиболее широкий спектр выделенных антибиотиков. В 14,7 % случаев МДУ превышало содержание пенициллина, в 17,6 % случаев - тетрациклина, в 35,5 % случаев - стрептомицина. Из 34 образцов в 23 были обнаружены антибиотики, что составило 67,6 %.

В сметане из 17 исследованных образцов в 8 случаях было превышение остаточных количеств антибиотиков (в 47,6 %), из них в 23,5 % случаев выделяли тетрациклин, в 11,8 % - стрептомицин и в 11,8 % - пенициллин.

Десерт творожный содержал тетрациклин в количествах, превышающих МДУ во всех исследованных пробах - в 100 % случаев.

Сыр твердый содержал в 25,0 % случаев левомицетин, в 16,6 % - тетрациклин, в 8,3 % - стрептомицин, то есть в 50 % отобранных образцов отмечено содержание остаточных количеств антибиотиков.

Для более полной картины исследованию на остаточные количества антибиотиков подвергали образцы рыбы морской (РФ), яблок (Польша) и помидоров (Египет). В рыбе был обнаружен тетрациклин в 38,8 % случаев. Смывы с яблок импортного производства (Польша) в 100 % случаев содержали антибиотик низин, смывы с помидоров содержали низин в 16,6 % случаев. Мы связываем загрязнение рыбы, яблок и помидоров с их поверхностной обработкой антибиотиками, применяемой практически повсеместно для продления сроков хранения скоропортящихся продуктов.

Итого, как видно из таблицы 2, исследованию на содержание остаточных количеств антибиотиков подверглись 2091 образец продуктов животного происхождения и продуктов растениеводства, из которых 19,0 % содержали антибиотики в количествах, превышающих нормы, установленные СанПин 2.3.2.1078-01.

Рис. 2 отражает степень загрязнения различных продуктов животноводства и растениеводства антибиотиками, наиболее часто применяемыми в животноводстве, ветеринарии и пищевой промышленности.

Рис. 2. Степень загрязнения продукции сельского хозяйства остаточными количествами антибиотиков

Из 2091 исследуемых проб в 377 (19,0 %) были обнаружены антибиотики: тетрациклин - в 344 случаях (16,4 %), левомицетин - в 21 случае (1,0 %), стрептомицин - в 17 случаях (около 1,0 %), пенициллин - в 7 случаях (0,4 %), низин - в 6 случаях (около 0,4 %), гризин - в 2 случаях (около 0,01 %).

Таким образом, сырье и продукты животного происхождения характеризуются содержанием различных величин остаточных количеств антибиотиков - от невыявления до 100 % положительных проб, кроме того, в продуктах присутствует весь спектр антибиотиков, остаточные количества которых нормируются СанПиН 2.3.2.1078-01.

Установлено, что во всех пробах остаточные количества антибиотиков в десятки раз превышали МДУ, который определен СанПиН 2.3.2.1078-01, тогда как согласно инструкций по применению антибиоиков, не разрешается добавлять антибиотики в корм коровам, племенному скоту, курам-несушкам. Кроме того, инструкциями установлены сроки прекращения введения или дачи с кормами антибиотиков за 3-7 суток перед убоем животных. Молоко от коров, которых лечили антибиотиками, не должно поступать в пищу.

Тот факт, что остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в сырье и продуктах животного происхождения, может свидетельствовать о нарушении существующих инструкций по их применению, а также возможно, что сроки выдержки животных перед убоем после последней дачи антибиотика недостаточны. Проследить причины попадания антибиотиков в импортную продукцию и вовсе невозможно.

Обнаружение в пробах только перечисленных антибиотиков объясняется тем фактом, что для анализа положительных проб использовали методы дифференциального определения только пенициллина, стрептомицина, левомицетина и тетрациклинов. Для более полного выяснения вида антибиотика необходимо использовать несколько методов, что практически невыполнимо в условиях производственных лабораторий.

С целью снижения трудозатрат на проведение анализов и расширения круга выявляемых антибиотиков целесообразно разработать универсальный метод их обнаружения в продуктах убоя, базирующийся на подборе наиболее чувствительных тест-культур к наибольшему спектру антибиотиков.

Подбор унифицированных культур микроорганизмов для определения антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения. Большинство современных микробиологических методов выявления антибиотиков ориентировано на определение антибиотиков, МДУ которых нормируется СанПиН - пенициллин, тетрациклин, левомицетин, стрептомицин, гризин, бацитрацин. В то время как в современном животноводстве и ветеринарии используется около 50 антибиотиков и их миксов.

Мы изучали чувствительность микроорганизмов к основным антибиотикам, используемым в ветеринарии и животноводстве, с целью подобрать унифицированные тест-культуры к наиболее широкому спектру антибиотиков.

Показателем чувствительности микроорганизма к антибиотику служил размер зоны задержки микробного роста вокруг бумажного диска.

Тестирование чувствительности четырнадцати микроорганизмов по отношению к антибиотикам (содержание активного вещества 0,1 мкг/мл) дало возможность обозначить наиболее чувствительные штаммы.

Грамотрицательный микроорганизм E.coli ATCC 9637 малочувствителен к таким антибиотикам как бензилпенициллин (диаметр зоны 9 мм), тетрациклин (10 мм), стрептомицин (7 мм), линкомицин (9 мм), бацитрацин (7 мм). Известно, что эти антибиотики малоэффективны против грамотрицательной микрофлоры.

Штамм B.subtilis L2 оказался высокочувствительным ко всем изучаемым антибиотикам (диаметр зоны 17 мм и более), за исключением левомицетина (14 мм) и бацитрацина (13 мм), к которым он оказался умеренно чувствительным.

Штамм B.subtilis ATCC 6633 проявил высокую чувствительность к тетрациклину, неомицину, гризину, бацитрацину (диаметр более 19 мм) и умеренную чувствительность к бензилпенициллину, гентамицину, линкомицину, левомицетину (13-14 мм).

Аналогична чувствительность к антибиотикам и у штамма B.subtilis 720.

Штамм B.cereus ATCC 11778 высокочувствителен к тетрациклину, левомицетину, гризину (диаметр зоны 22 мм), но к остальным изучаемым антибиотикам штамм проявил умеренную чувствительность.

Штамм B.mycoides 537 оказался умеренно чувствительным ко всем используемым антибиотикам.

B.calidolactis чувствителен к бензилпенициллину и левомицетину (соответственно 21 и 17 мм), к остальным антибиотикам умеренно чувствителен (12-15 мм).

Штамм B.pumilus NCTC 8241 ко всем изучаемым антибиотикам оказался устойчиво чувствительным (диаметр зоны 17-20 мм).

Оба штамма S.aureus 209-P и ATCC 6538 одинаково высокочувствительны к концентрации изучаемых антибиотиков, содержащейся в бумажных дисках (16-20 мм).

Три изучаемых штамма M.luteus - ATCC 9341, ATCC 10240, 8340 незначительно различаются по своей чувствительности к антибиотикам, но самым высокочувствительным является M.luteus ATCC 9341 (19-24 мм).

Зоны задержки роста вокруг дисков, пропитанных антибиотиками, у штаммов стрептококков Str.thermophilus и S.faecium относительно одинаковы (14-20 мм).

Исходя из полученных результатов, считаем, что для дальнейших исследований должны быть использованы штаммы со стабильной высокой чувствительностью к антибиотическим препаратам.

Таблица 3. Нижний предел чувствительности микробных культур к антибиотикам