Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa

1.4 Чувствительность Pseudomonas aeruginosa к антибактериальным средствам

Антибиотики (S. A. Waksman, 1942) - группа природных или полусинтетических органических веществ, разрушающих или подавляющих размножениемикроорганизмов. Антибиотики природного происхождения получают экстрагированием из колоний грибов или бактерий, тканей растений или животных, для получения полусинтетических антибиотиков исходную молекулу подвергают дополнительным химическим модификациям. Для рационального применения антибактериальных препаратов необходимо соблюдать основные принципы: изучение антибиотикограммы эпизоотических штаммов микроорганизмов; выбор наиболее активного и наименее токсического препарата; определение оптимальных доз и методов введения, на основе знания особенностей кинетики препаратов; своевременное начало и проведение курса для достижения терапевтического эффекта; знание частоты встречаемости побочных эффектов препаратов, например, гепато-нефротоксический эффект; комбинирование препаратов с целью усиления антибактериального эффекта (И.Е.Мозгов, 1985; А.И.Коротяев, С.А.Бабичев, 1998). Данные литературы изложены в соответствии с классификацией антибактериальных препаратов по механизму и спектру действия:

· в-лактамы группы природных пенициллинов и нескольких поколений цефалоспоринов, нетрадиционных в-лактамаз;

· макролиды;

· аминогликозиды;

· тетрациклины, основой молекулы антибиотиков является полифункциональное соединение - тетрациклин;

· хлорамфеникол (левомицетин);

· фосфомицины из группы фосфоновой кислоты;

· Хинолоны (нефторированные хинолоны и фторхинолоны) - неприродные соединения).

Р. aeruginosa обладает множественной лекарственной устойчивостью (Азямов М.А., 1988; Афонин Э.А., 1999; Навашин С.М., 1986; Clements J.A., 1962; Sonntag C., 1986) и даже способна к контаминации растворов антибиотиков. Это является характерной и важной особенностью псевдомонадов. Высокая лекарственная устойчивость псевдомонад обусловлена R-плазмидами, а не хромосомами клетки.(Emmanoulidou- Arseni A. et al., 1964; Reuben R. et al., 1987). Число маркеров резистентности в 11-плазмиде достигает 11-12, и все они могут передаваться совместно при конъюгации и трансдукции как внутри вида, так и между бактериями разных видов и родов, в то время как в хромосоме возникает устойчивость только к одному, реже к двум, антибиотикам, близким по механизму действия. Такая большая возможность передачи генетической информации об устойчивости к антибиотикам как в пределах вида, так и рода, способствует формированию полирезистентных штаммов Р. аeruginosa, что усложняет борьбу с данной инфекцией.

Инактивация антибиотиков продемонстрирована на примере биоплёночных бактерий Pseudomonas aeruginosa, немукоидные изоляты которых обладали повышенной способностью продуцировать в-лактамазы (Ciofu O., 2003). Это явление приводило к нечувствительности изучаемых биоплёнок к антибиотикам в-лактамного ряда. Активное выведение антибиотика из микробной клетки со скоростью, превышающей скорость поступления внутрь клетки, доказано в опытах биоплёнками на основе P. Аeruginosa (Mandsberg L.F. et al., 2009). Этот процесс, иначе называемый эффлюксом, осуществлялся за счет гиперэкспрессии мембранной помпы MexCD-OprJ. Во-вторых, множественная резистентность может быть связана с фильтрующей способно-стью матрикса. Наблюдения in vitro показали, что матрикс бактериальных биоплёнок состоит из различных биополимеров - полисахаридов, белков и даже ДНК (Романова Ю.М. et al., 2011). Матрикс не только связывает клетки в единую структуру, но и заполняет межклеточные пространства, образуя трехмерную фильтрующую систему. Это позволило назвать биоплёнку «молекулярным фильтром» и считать фильтрацию одной из важнейших функций биоплёнки (Dunne W.M., 2002). Опубликованы работы, в которых наблюдали замедленную диффузию антибиотиков внутрь биоплёнок. Например, было описано затруднение пенетрации ципрофлоксацина внутрь биоплёнки, сформированной P. аeruginosa (Suci P.A. et al., 1994). Трансмиссивная электронная микроскопия показала, что повреждение биоплёночных бакте-рий при обработке цефуроксимом зависит от того, насколько глубоко от поверхности они расположены. Локализация поврежденных бактерий ограничивалась поверхностными слоями биоплёнки, во внутренних слоях поврежденных клеток было значительно меньше (Amorena B. et al., 1999). Элементы матрикса являются не только пассивным фильтром. Глицерол-фосфорилированные бета-глюканы P. aeruginosa не просто замедляют диффузию аминогликозидов сквозь биоплёнку, но и активно связывают антибиотики (Sadovskaya I. et al., 2011). Слизь, которая продуцируется некоторыми патогенами, заполняя межклеточное пространство в биоплёнках, также может обладать связывающим антибио-тик действием. Альгинатная слизь P. aeruginosa значительно ингибировала активность тобрамицина (Nichols W.W. et al., 1988). Третий механизм множественной лекарственной устойчивости может быть связан с тем, что внутри биоплёнки могут присутствовать популяции бактерий с разными защитными свойствами, дополняющими друг друга. Например, в уже упоминавшейся работе (Ciofu O., 2003) авторы считают, что немукоидные изоляты P. aeruginosa из биоплёнок от больных с муковисцидозом способны к продукции высоких уровней бета-лактамаз, что отличает их от мукоидных изолятов, лишенных такой способности. Немукоидные бактерии экзоцити-руют везикулы, содержащие высокие концентрацию в-лактамаз, тем самым обеспечивая защиту своих в-лактамазо-дефицитных «сородичей» от в-лактамных антибиотиков на расстоянии. Мукоид, главным компонентом которого является альгинат, обеспечивает защиту биоплёночных бактерий от других антибиотиков, например от тобрамицина (Nichols W.W. et al., 1988). Подобный механизм защиты описан и для представителей других таксономических групп. Наиболее общий механизм возникновения резистентности может быть связан с повышенной мутабельностью бактерий в биоплёнке. На примере P. aeruginosa было продемонстрировано, что угнетение антиоксидантных систем в клетках биоплёнок ведёт к кислородозависимому повреждению ДНК, т. е. к накоплению множественных мутаций и появ-лению антибиотикорезистентности (Driffield K. et al., 2008). Вероятно, подобные явления возникают в рамках общего правила, сформулированного для псевдомонад, находящейся в условиях адаптации к стрессорам: «Все дороги ведут к резистентности».

В литературе имеются сообщения об устойчивости культур псевдомонада к пиперациллину, карбенициллину, азлоциллину, цеофлеразону и тикорциллину. Отмечают высокую резистентность псевдомонады к пенициллину, эритромицину, мономицину, ампициллину, левомицетину, диоксициллину и слабую чувствительность к тетрациклину и неомицину (Азямов М.А., 1988; Буянова Р.Б., 1977; Михайлов Н.Н. и соавт., 1975; Радчук H.A. и соавт., 1977; Савицкая К.И. и соавт., 1981; Холодкова Е.В. и соавт., 1987; Prescott J.F. et al., 1984). Pseudomonas aeruginosa обладает природной чувствительностью к в-лактамным антибиотикам (цефтазидиму, цефепиму, имипенему, меропенему), аминогликозидам и фторхинолонам, которые обычно являются эффективными при терапии псевдомонад (Oie, S.,2003; Шагинян, И. А., 2005).

Природная устойчивость Р. aeruginosa к антимикробным препаратам связана с барьерными свойствами экзополисахаридной слизистой капсулы (Pellett Shahaireen. et al., 1983) и синтезом в-лактамаз, гидролизующих аминогликозиды(Stanczak B. et al., 1986). Кроме этого, поры, образуемые во внешней мембране псевдомонада белком порином F, в основном небольшого размера и не обеспечивают свободного поступления в периплазму антибиотиков, особенно гидрофильных.

При частом применении аминогликозидов (гентамицина и пиперациллина) возникают антибиотикорезистентные мутантные штаммы Р. aeruginosa с повышенной вирулентностью(Bryan L.E. et al., 1984; Холодкова Е.В. и соавт., 1987).

При исследовании чувствительности 146 штаммов псевдомонада, выделенных от животных, к 15 антибактериальным препаратам отметили 100%-ную устойчивость штаммов к ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу и нитрофурановым препаратам. Более половины всех штаммов (51-79%) были устойчивы к канамицину, стрептомицину и карбенициллину. Все культуры были чувствительны к гентамицину, полимиксину и колистину. Установлено, что спектр устойчивости штаммов Р. aeruginosa различного происхождения был однотипным(Zachock M. et al., 1986).

При проверке на чувствительность к 12 бактерицидным препаратам 180 культур псевдомонадов, выделенных от животных, установили, что 100% всех культур были устойчивы к амипициллину, цефалотину и нитрофурантои- ну, 90% - к тетрациклину, хлорамфениколу, каннамицину и сульфаниламидным препаратам. Все культуры обладали чувствительностью к колистину, тобрамицину, амикацину и гентамицину. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) для гентамицина и тобрамицина варьировали от 0,25 до 16 мкг/мл, а для амикацина от 1 до 64 мкг/мл. Многие авторы отмечают высокую чувствительность культур Р. aeruginosa к гентамицину и полимиксину(Артемьев В.И. и соавт., 1979; Бунаков А.П., 1983; Кувшинова З.Я., 1982; Никогосян А.В., 1990; Graber C.D. et al., 1962; Pollack M.L. et al., 1978).

При пассажировании 16 штаммов псевдомонад на суббактериоста- тических концентрациях гентамицина in vitro, к 20 пассажу отметил увеличение минимальной подавляющей концентрации (МПК) с 0,6 до 300 мкг/мл, то есть снижение чувствительности в среднем в 109,4 раза(Бунаков А.П., 1983). Наиболее активным антибиотиком в отношении Р. aeruginosa является тобрамицин, батерициден для культур псевдомонад in vitro в дозе 0,7 мкг/мл, а в терапевтической дозе (2,5 мг/кг) стерилизует организм белых мышей от псевдомонада за 5 суток(Минухин В.В. и соавт., 1986).

Наибольшую чувствительность изоляты Р.аeruginosa выделенных из различных объектов проявили к препаратам: энрофлоксацину (90,7%), пефлоксацину (81,4%), гентамицину (83,6%) и ципрофлоксацину (76,4%). Наименьшая чувствительность отмечена к колистину (37,9%), диоксидину (44,3%), цефалотину, апрамицину и полимиксину М (45%). Если проанализировать общую чувствительность изолятов Р.аeruginosa по группам объектов, то четко прослеживается, что наибольшее количество чувствительных изолятов выделено из кормов (69,3%), объектов внешней среды и патматериала от пушных зверей (64,7%). Меньшее количество чувствительных изолятов выделяется из спермы, смывов из влагалища, абортплодов и патматериала крупного рогатого скота (57,3%, 58%), 60%, 60% соответственно), а так же из патматериала птицы (59,3%), из патматериала и смывов из влагали-ща свиноматок (60,7%). В среднем активность противомикробных препаратов составляет 61,3 % (Марченко Т.В., 2006).

При изучении чувствительности 67 штаммов псевдмонада, выделенных из замороженной спермы быков, наиболее активными антибиотиками являлись гентамиции, карбенициллии и римактаи. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) для них варьировала от 1,5 до 50 мкг/мл. Все выделенные штаммы были устойчивы к тетрациклину, стрептомицину, боргалу, тилану, оксациллину и фуразолидону. Культуры Р. aeruginosa, выделенные из спермы быков производителей, были резистентны к действию фуразолидона и нитрофурановых препаратов (Кувшинова З.Я., 1982; Михайлов Н.Н. и соавт., 1975).

При изучении 68 полевых штаммов псевдмонада, выделенных от быков-производителей, установил, что 98,8% штаммов чувствительны к гента- мицину, 94,4% - к рифампицину, 81,1% - к полимиксину М, 14,4% - к неомици- ну и 7,7% - чувствительны к карбенициллину(Абдель Раззак P.A., 1985).

Большинство авторов, характеризуя чувствительность штаммов Р. aeruginosa, выделенных из спермы и содержимого препуция быков и хряков- производителей, отмечают высокую бактерицидность полимиксина М и гента- мицина(Зайцев Е.А. и соавт., 1985; Палий Г.К. и соавт., 1976; Кирилова Э.В. и соавт., 1984; Кувшинова З.Я., 1982; Михайлов Н.Н. и соавт., 1975; Мороз И.Г. и соавт., 1986).

Некоторые антибиотики (азлоциллин, цефсулодин и тикарциллин) хотя и не оказывают бактерицидного действия на Р. aeruginosa in vivo, но повреждают клеточную оболочку псевдомонада, что делает ее более уязвимой при фагоцитозе полимерфонуклеарных лейкоцитов(Stubner G. et al., 1986).

Псевдомонады, выделенные из больных с флегмонами и абсцессами различной локализации обладали очень высоким уровнем резистентности к антибиотикам. Наиболее эффективными, по данным исследования, оказались амикацин (23,16%), ципрофлоксацин - 26,47% резистентных штаммов (Окулич. В.К., 2003). Исследована резистентность 150 клинических штаммов P. aeruginosa к антибиотикам и их комбинациям in vitro. Штаммы P. аeruginosa характеризуются высокой частотой резистентности к антисинегнойным антибиотикам: к цефтазидиму-17,3%, к амикацину и карбенициллину-51,3%, к ципрофлоксацину-78,7%. Антисинегнойные антибиотики в порядке убывания активности: цефтазидим > меропенем > карбенициллин > цефепим > амикацин > ципрофлоксацин > цефотаксим > имипенем > доксициклин > хлорамфеникол (Горбунов В.А., 2007). Практика применения антибиотиков для лечения псевдомонадов показала, что ее возбудитель обладает потенциальными возможностями формировать устойчивость к новым антибиотикам и другим лекарственным средствам. При массовых заболеваниях как людей, так и животных необходимо либо постоянное совершенствование методов химиотерапии, либо создание специфических средств борьбы. Последнее важно тем более, что псевдомонад обладает не только приобретенной устойчивостью, но и природной.

1.5 Заключение по обзору литературы

Бактерии Pseudomonas aeruginosa при инфицировании восприимчивых видов реализуют факторы вирулентности, связанные с синтезом экзотоксинов (гемотоксин, лейкоцидин, цитотоксины) и эндотоксина липополисахаридной природы, что обусловливает многообразие клинических проявлений болезней, вызываемых данной группой бактерий. Установлено, что популяции бактерий P. aeruginosa, выделенные из объектов внешней среды, характеризуются психрофильностью, метаболической пластичностью, ростом на обедненных средах с сохранением вирулентности Особенностью псевдомонад является наличие широкого спектра факторов вирулентности (Bodey G.RP. et al., 1983; Rocha C.L. et al., 2003; Scharmann W. 1976). Адгезия P. aeruginosa к абиотическим поверхностям обусловлена неспецифическими взаимодействиями (например, за счет разницы заряда), адгезия к живым тканям осуществляется путем контакта с рецепторами эукариотической клетки (Езепчук Ю.В.,1985; Малышева Э.Ф., 1988; DholakiaP.M., 1985). Сравнительное электронно-микроскопическое исследование штаммов P. aeruginosa показало, что клетки вирулентных штаммов имеют слизеподобную капсулу, в которой различимы два слоя - внутренний ригидный, тесно связанный с клеточной стенкой, и наружный, более тонкий, гомогенный. На поверхности наружного слоя были обнаружены множественные мелкие шаровидные образования (Дзюбак С.Т., 1983). Данные образования определяют адгезивные свойства, обеспечивающие прикрепление бактерий к различным субстратам. Клетки авирулентных штаммов слизеподобной капсулой не обладают и имеют типичную для большинства грамотрицательных бактерий структуру. В присутствии очищенного полисахарида слизи адгезивные свойства мукоидных штаммов P.aeruginosa повышаются на 30-50 % (Ramphai R., 1985). На основании анализа данных литературы сделано заключение, что функционирование факторов патогенности имеет общие закономерности, связанные со способностью к опознаванию специальных рецептов, взаимодействию и как следствие, проявлению адгезивных свойств, колонизации эпителия, затем нарушению функций иммунной системы, диссеминации возбудителей в ткани и органы, развитию инфекционно-аллергических реакций, длительной персистенции возбудителей в организме.

Учитывая, биологию микроорганизмов семейства Pseudomonaceae, методы обнаружения бактерий построены по общему принципу: посев исследуемого материала на плотные дифференциально-диагностические среды для выделения псевдмонад («Cetrimide agar»), кроме того, для выделения псеввдомонады, неразведенные пробы засевают в среды обогащения (селенитовый бульон). Грамотрицательные культуры микроорганизмов пересевают в пробирки со скошенным мясопептонным агаром, для дальнейшего изучения ферментативных, антигенных и патогенных свойств.

Pseudomonas aeruginosa способны к формированию биопленок на поверхностях, контактирующих с водой. Эти биопленки считаются потенциально опасными, так как могут содержать и другие патогены. Кроме того, они приводят к повреждению поверхностей, к которым прикрепляются, демонстирует высокую резистентность и проявляет рост устойчивости к антибиотикам. Поэтому Р. aeruginosa обладает множественной лекарственной устойчивостью (Азямов М.А., 1988; Афонин Э.А., 1999; Навашин С.М., 1986; Clements J.A., 1962; Sonntag C., 1986) и даже способна к контаминации растворов антибиотиков. Это является характерной и важной особенностью псевдомонадов.

Среди различных видов рода Pseudomonas, P. aeruginosa является самым распространенным возбудителем порчи пищевых продуктов. Известно, что P. aeruginosa особенно часто выделяются из богатых белками пищевых продуктов (мясо, птица, рыба) (Ali Luzan A., 1982; Bower et al., 1996; Iroha I. R. et al.,2011), хранившихся при низких температурах (Gram et al., 2002). Употребление пищевых продуктов, контаминированных P. aeruginosa, при наличии предрасполагающих факторов может привести к инфекциям мочеполовой и дыхательной систем, дерматитам, инфекции мягких тканей и бактериемии. Описаны вспышки пищевых токсикоинфекций псевдомонадной этиологии и обнаружение P. aeruginosa в пищевых продуктах, что характеризует последние как возможный источник пищевой токсикоинфекции (Huang Meizi. et al.,2003; Shen Ying. et al.,2010; He Lanxiang, et al.,2012). Острые кишечные инфекции псевдомонадной этиологии клинически протекают в виде диарей той или иной тяжести, особенно тяжело у детей, пожилых людей и больных хроническими заболеваниями, а при пищевых токсикоинфекциях со всеми признаками этиопатогенеза этого типа заболеваний. Факторы вирулентности P. aeruginosa включают детерминанты, позволяющие вызывать заболевания различных видов восприимчивых организмов и детерминаты, специфичные для определенного вида. При инфицировании эволюционно различных видов восприимчивых организмов P. aeruginosa экспрессирует разные факторы патогенности, вызывая проявление соответствующих клинических признаков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2011 по 2015 гг. на кафедре «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «МГУПП», часть исследований в лаборатории «Санитарная микробиология» ФГБНУ «ВНИИВСГЭ».

В работе использовали паспортизированные штаммы: P. aeruginosa ATCC 9027; P. fluorescens; P. putida; A. hydrophila; S.enteritidis; S.typhimurium №5715; E.coli 0141:K87:K88, №727; K. pneumonia; C.freundii №33/57; E.aerogenes CCM 2531; Y.enterocolitica 09, №383, полученные из коллекции ФГУ ВГНКИ, Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. С целью выделения бактерий исследовали 6 проб фарша из мяса птицы и 5 проб фарша из свинины, 5 проб фарша из говядины; 10 проб живых рыб (карпа); 8 проб свежих креветок.

С целью изучения морфологии бактерий и изменчивости бактерий при воздействии антибактериальных препаратов использовали микроскоп «H604 TTrinocularUnico» (США); цифровой видеоокуляр «DCM510 SCOPE» (Германия); стереоскопический микроскоп «БИОМЕД МС - 1 Стерео» (Россия); электронный микроскоп «Hitachi-800» со сканирующей приставкой (Япония).

2.1 Методы индикации и идентификации Pseudomonas aeruginosa

Пробы пищевых продуктов для бактериологических исследований отбирали в количествах, предусмотренных нормативными документами: ГОСТ 26668-85 (СТСЭВ 3013-81) «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа»; ГОСТ 7269-79 «Мясо. Методы от-бра образцов и органолептические методы определения свежести»; СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». Отбор проб воды проводили согласно методик отбора проб на гидрохимические (Методики гидрохимических исследований проб из рыбохозяйственных водоемов № 115 - 6а от 20.10.1983 г. М: печатный цех МСХ СССР. 1983. 37 с.) и бактериологические исследования (ГОСТ Р 51592 - 2000. Вода. Общие требования к отбору проб).

Исследования проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях) (1984), ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов»; ГОСТ 30519-97 (ГОСТ Р 50474-93) «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)»; ГОСТ Р 54755-2011 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa». При определении чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам использовали методы диффузии в агар и серийных разведений в 0,7%-ном МПА (МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам).

С учетом биологии микроорганизмов P. aeruginosa бактериологическое исследование feces, продуктов животного происхождения и окружающей среды осуществляли с использованием одних и тех же сред обогащения и плотных питательных сред.

На первом этапе проводили высевы на МПА. Гемолитические свойства микроорганизмов изучали на агаре Хоттингера с добавлением 5,0 % цельной крови барана, через 24 ч культивирования при 37°С. Учет проводили на 2, 5, 7 и 10-е сутки. Пробы пищевых продуктов помимо среды обогащения высевали на среду МПА и агар с цетримидом. Чашки с посевами инкубировали при 22-28 °С и производили просмотр через 24-48 ч. С плотной среды характерные колонии псевдомонад пересевали в пробирку со скошенным агаром или в чашку с МПА и проводили дальнейшую идентификацию. Для определения формы бактериальных клеток, расположения относительно друг друга, размера и способности к окраске анилиновыми красителями (тинкториальные свойства) готовили мазки из чистых бульонных и агаровых культур, окрашивали по Граму. Ферментативные свойства изучали на средах Гисса с мальтозой. Для определения присутствия оксидазы использовали ОКСИ-тест. Для подтверждения редукции нитратов проводили посевы в пробирки с нитратной среды, через 48 ч культивирования при 37°С добавляли 1,0 %-ный водный раствор крахмала и затем 10,0 %-ный раствор серной кислоты. Появление тёмно-синего окрашивания - положительный результат. Схема бактериологического выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa, предложенная Д.А. Васильевым, Э.А. Афониным. Посев на накопительную среду УСХИ (37°С 24-48 часов). Перенос бактериальной суспензии на элективную среду КМ УСХИ (37°С - 24 часа). Пересев выделенных колоний на ацетамидный агар, питательный агар с хлоридом бария, МПА (42°С - 24 часа). По результатам культивирования - идентификация выделенной культуры (рис. 5). Схема бактериологического выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa, предложенная по ГОСТу Р 54755 - 2011 (рис.1).

Основными дифференциальными признаками бактерий Pseudomonas aeruginosa являются: аэробные не образующие спор грамотрицательные оксидазоположительные палочки, образующие пигменты флюоресцин и пиоционин, не ферментирующие мальтозу, вывающие редукцию нитратов.

Рис. 1. Схема бактериологического исследования на наличие бактерий P. aeruginosa

2.2 Методы изучения патогенных свойств Pseudomonas aeruginosa

Оценку патогенных и токсигенных свойств проводили на лабораторных моделях с использованием общепринятых методов (Ю.П. Вартанян и соавт., 1978; Н.И. Романенкова и соавт. 1980; Н. Ф. Тимченко и соавт., 2004). В опытах использовали: белые беспородные мыши (n=5); рыбы «Карп» (n=5).

Патогенные свойства при идентификации изолятов псевдомонад не типируемых по О-антигену определяли заражая внутрибрюшинно белых беспородных мышей массой 14-16 г по 0,5 см³ взвесью микроорганизмов в концентрации 1 млрд/см³ бактериальных клеток.

Для изучения токсигенных свойств исследуемые штаммы культивировали в жидкой среде Хоттингера в течение 24 ч при 37С, при 28С. Затем культуры микроорганизмов P. aeruginosa центрифугировали при 6000 об\мин, в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость вводили лабораторным животным (опыт), аналогичной группе животных вводили стерильный бульон Хоттингера (контроль). Для оценки токсигенных свойств псевдомонад применяли следующие тесты: «дилятации кишечника» на мышах-сосунках; «плантарный тест» и метод «кожной пробы».

При изучении токсигенности псевдомонад с использованием теста «дилятации кишечника» белых беспородных мышей-сосунков 2-3-суточного возраста за сутки до заражения отсаживали от маток и 20 ч при 25 °С выдерживали на голодной диете в стеклянных банках емкостью 0,2-0,5 л, на дно которых положен слой бумаги. Заражение проводили per rectum с использованием шприца со стерильным наконечником от дозаторной пипетки. Надосадочную жидкость исследуемого микроорганизма, вводили в объеме 0,2 мл медленно и равномерно, правильность введения материала и отсутствие травмы определяли при вскрытии. Группа мышей, которым вводили стерильный бульон, служила отрицательным контролем, группа мышей, зараженных надосадочной жидкостью, энтеротоксигенного штамма P. aeruginosa, - положительным контролем. Животных, погибших в течение первого часа после заражения, исключали из опыта. Через 4 ч после заражения мышей-сосунков усыпляли эфиром и вскрывали. Пинцетом зажимали нижний и верхний концы тонкого кишечника, отрезали его ножницами от брыжейки, желудка и слепой кишки и переносили в полиэтиленовый мешочек заранее определенной массы. Взвешивали тонкий кишечник и оставшуюся часть тела. Коэффициентом расширения тонкого кишечника (К) за счет накопления в просвете жидкости, продуцируемой под воздействием энтеротоксина, служило отношение массы тонкого кишечника с содержимым к массе остального тела. Определяли коэффициент расширения для каждой мыши, взятой в опыт, вычисляя затем среднюю арифметическую и коэффициент достоверности различий средних величин по отношению к отрицательному контролю. За положительный результат принимали показатель, превышающий 0,090.

При использовании «плантарного теста» белым мышам надосадочную жидкость, вводили 3 мышам в область плантарной поверхности лапы в дозе 0,1 мл. В качестве контроля использовали исходную среду, которую вводили параллельно в другую лапу в той же дозе. Учет результатов проводили через 24 ч, конечности ампутировали по голеностопному суставу и взвешивали на торсионных весах. Величину отека определяли по разности массы лапок мышей в контроле и опыте. Штаммы, дающие отек менее 15 мг, считали нетоксигенными; 15-34 мг - слаботоксигенными; 35-64 мг - умеренно токсигенными; 65 мг и более - высокотоксигенными. Рассчитывали среднюю арифметическую разницы массы лапок мышей в контроле и опыте.

Для определения токсигенности при использовании «кожной пробы» у морских свинок массой 200 - 250 г, за 24 ч до начала опыта на спине тщательно выстригали волосы. Затем в участки депиляции (размеры 1,0 см³) внутрикожно шприцом с тонкой иглой срезом вверх под острым углом вводили испытуемый материал в объеме 0,1 мл. Учет результатов проводили через 24 ч после инъекции. Оценка проводилась визуально с учетом показателей: отсутствие покраснения кожных покровов - 0 баллов; наличие покраснения - 1,0 - 3,0 балла. Образование покраснений и темно-красной окраски кожных покровов свидетельствовало о наличии энтеротоксина, и штамм относили к высокотоксигенному с оценкой в 3,0 балла.

2.3 Методы изучения антагонистической активности бактерий

Антагонистические свойства микроорганизмов изучали общепринятыми методами (Егоров Н. С., 1979; Степаненко П. П., 1999) и с применением мембранных фильтров (Павлова И. Б., Ленченко Е. М., 1997).

Метод перпендикулярных штрихов. Испытуемый организм высевается штрихом (полоской) на поверхность агаровой пластинки чашки Петри. После культивирования перпендикулярно штриху подсеваются различные тест-организмы. Чашки помещаются в термостат на 20-24 ч. Если изучаемый организм оказывает антимикробное действие, ряда тест-культура микроорганизмов будет расти вдали от штриха антагониста. Нечувствительные микробы будут развиваться в непосредственной близости от штриха изучаемого организма.

Метод агаровых блочков. Изучаемый организм высевают сплошным «газоном» на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. После культивирования пробочным сверлом (диаметр примерно 8 мм) вырезают агаровые блочки, которые переносят на поверхность другой агаровой среды, предварительно засеянной тест-организмом. На одной чашке Петри размещают 5-7 агаровых блочков. Чашки с агаровыми блочками помещают в термостат на 20-24 я. Если выделяемый организмом антибиотик подавляет развитие тест- культура микроорганизмов, то вокруг агарового блочка образуется зона отсутствия роста.

Метод высева антагониста на одной половине агаровой пластинки с последующим подсевом тест- культура микроорганизмов штрихами на другой половине агаровой пластинки. Чашка Петри разделяется стеклянной перегородкой пополам. В одну половину заливается питательный агар, другая половина чашки остается свободной. На половину агаровой пластинки высевают сплошным «газоном» изучаемый микроорганизм, чашки помещают в термостат. После этого на оставшуюся свободную часть пластинки в чашке заливают расплавленный питательный агар, тест-микробы высевают штрихами, перпендикулярными границе развития антагониста.

Метод агарового блочка, находящегося в центре чашки Петри. В чашку Петри заливается питательный агар. В застывшем агаре стерильным пробочным сверлом (диаметр 20-22 мм) вырезают агаровые блочки, которые затем переносят в другие стерильные чашки Петри. В центр каждой чашки помещают по одному такому блоку, затем в эти же чашки на свободную их часть наливают питательный агар с тем расчетом, чтобы уровень этого агара был на 1-1,5 мм ниже уровня блочка. После того как чашки подготовлены, изучаемый микроорганизм высевают микробиологической петлей на поверхность агарового блочка, чашки помещают в термостат. Затем по радиусам агаровой пластинки высевают штрихами тест-организмы, и чашки вновь на 20-24 ч помещают в термостат. Отсутствие роста штриха тест-микроба на том или ином расстоянии от блочка будет указывать на угнетение его антибиотическим веществом изучаемого организма.

Метод мембранных фильтров. При исследовании межвидового антагонизма, наряду с общепринятыми методами исследования, были апробированы методы с использованием мембранных фильтров (Павлова И. Б., Ленченко Е. М., 1997). При апробации метода перпендикулярных штрихов на поверхность агаровой пластинки чашки Петри помещали 3-4 мембранных фильтра «Владипор» №2. Суспензию испытуемого тест-штамма микроорганизма высевали штрихом (полоской) на поверхность мембранных фильтров. После культивирования в течение 18-20 ч при 37 єС перпендикулярно штриху подсевали различные тест-культуры.

2.4 Методы изучения чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам

Чувствительность микроорганизмов к желчи и экстрактам растения изучали методом диффузии в агар (Навашин С. М., Фомина И. П., 1982). Для приготовления суспензии использовали суточную культуру микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, выросших на плотных питательных средах. Суспензию наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 1-2 мл, равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Приоткрытые чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. В плотной питательной среде пробойником делали отверстия (лунки). В лунки заливали медицинскую консервированнню желчь (ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург) и экстракт растения (Японская жимолость, коптис китайский, шлемник байкальский). в различных концентрациях. Чашки Петри культивировали в термостате при 37 °С в течение 24 ч. Результаты учитывали по наличию или отсутствию зон задержки роста культур вокруг лунок.

При изучении чувствительности к антибиотикам для приготовления суспензии использовали 18-ти часовые культуры микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, выросших на плотных питательных средах. Суспензию наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 1-2 мл, равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем, после чего удаляли избыток суспензии пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Аппликацию дисков проводили с помощью стерильного пинцета. Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и культивировали при 37 °С в течение 24 ч. Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1,0 мм. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста. Метод позволяет определять чувствительность исследуемой культуры микроорганизмов к нескольким антибиотикам одновременно. К недостаткам можно отнести невозможность применения метода в случае, если антибиотики слабо диффундируют в агар (аминогликозиды). При определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с помощью «Е-теста» использовали полоску, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской «Е-тест» получали значение минимальной подавляющей концентрации (МПК). При изучении чувствительности к антибиотикам с применением экспресс-теста «HexaDisc», представляют собой набор из 6 одиночных дисков, радиально прикрепленных к центру ("ромашка"). Комбинации антибактериальных препаратов в гексадисках составлены с учетом Методических указаний («Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» МУК 4.2.1890-04).

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам макрометодом серийных разведений 0,5 мл рабочего раствор антибиотика вносили в пробирку, содержащую 0,5 мл 0,7 %-ного МПА. Процедуру повторяли для приготовления ряда необходимых разведений. Для инокуляции использовали взвесь микроорганизмов - 10⁶ КОЕ, по 0,1 мл каждого разведения высевали в чашки Петри на поверхность плотной питательной среды, культивировали при 35 °С в течение 24 ч. Минимальную подавляющую концентрация (МПК) определяли по наименьшей концентрации антибактериального препарата, подавляющей видимый рост микроорганизма. При использовании микрометода исследуемую культуру микроорганизмов (10⁶ КОЕ) вносили в лунки планшета, содержащие антибиотики, культивировали при 35 °С в течение 24 ч. Учет результатов проводили спектрофотометрически, сравнивая рост микроорганизмов в лунке, содержащей антибиотик, с отрицательным контролем. Преимуществом микрометода является высокая производительность и возможность длительного хранения планшет.

При использовании метода серийных разведений в агаре исследуемую культуру микроорганизмов (10⁴ КОЕ) высевали на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные разведения антибиотика. Параллельно для контроля роста производили посев на агар, не содержащий антибиотики, культивировали при 35 °С в течение 24 ч, затем определяли МПК препарата.

Методы определения чувствительности к дезинфицирующим средствам. Исследования по устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам проводили в соответствии с методическими указаниями «О порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики» (М., 1987), «Проведение дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» (М., 2002).

При оценке чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам на первом этапе исследования проводили методом диффузии в агар (Вашков В. И., 1956). В плотной питательной среде пробойником делали отверстия (лунки). В них заливали дезинфицирующее средство в различных концентрациях, а поверхность агара контаминировали суточными культурами тест-микроорганизмов. Чашки Петри культивировали в термостате при 37 °С в течение 2 суток. Результаты учитывали по наличию или отсутствию зон задержки роста культур вокруг лунок после культивирования. Наряду с общепринятым методом диффузии в агар, нами были апробированы «Дип-слайды», предназначенные для бактериологического исследования поверхностей. При исследовании полимерную пластину слайда, покрытую плотной питательной средой, плотно прижимали к поверхности, а затем помещали в контейнер и культивировали при 37 °С 18-24 ч. При бактериологическом контроле качества дезинфекции определяли наличие на поверхностях обеззараживаемых объектов жизнеспособных клеток санитарно-показательных микроорганизмов-бактерий группы кишечной палочки (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter), S. aureus, S. epidermatis, S. saprophiticus, микобактерий или спорообразующих аэробов рода Bacillus. Пробы отбирали стерильными ватно-марлевыми тампонами, смоченными в стерильном нейтрализующем растворе или воде. Участки площадью 10х10 см тщательно протирали до полного снятия с поверхности всех имеющихся на ней загрязнений, после чего тампоны помещали в пробирку с нейтрализующей жидкостью. Для индикации E. coli 0,5 мл центрифугата высевали в пробирки со средой Кесслера. Посевы культивировали 12-18 ч при 37 °С. Для индикации стафилококков 0,5 мл центрифугата высевали в 5 мл мясо-пептонного бульона с 6,5 % хлористого натрия. Через 24-48 ч культивирования посевов при 37 °С делали пересевы бактериологической петлей на 8,5% солевой мясо-пептонный агар. Посевы выдерживают в термостате 24-48 ч при 37 °С. Из выросших культур для подтверждения роста стафилококков готовили мазки, окрашивали по Граму и микроскопировали. Для индикации спорообразующих аэробов из центрифугата каждой пробы делали посевы в одну пробирку с мясо-пептонным бульоном (МПБ) и на две чашки с мясо-пептонным агаром (МПА). Посевы культивировали 24-48 ч при 37 °С.

2.5 Методы статистической обработки результатов исследований

Экспериментальные данные подвергали статистической обработке общепринятым методом (Ашмарин И.П., Воробьев Л.А., 1962; Садовский Н.В., 1975). Статистическую ошибку средней арифметической (m) определяли по формуле: m = К·Уа, где К - константа Молденгауэра; Уа - сумма отклонений вариантов от средней арифметической. Константа Молденгауэра рассчитана по формуле:

,

где n - число повторности.

Коэффициент достоверности средней арифметической (t) для одного вариационного ряда определяли по формуле:

Коэффициент достоверности различий средних величин двух вариационных рядов вычисляли по формуле:

=

По величине t_d судили о достоверности, основываясь на связи этой величины с уровнем вероятности (Р), по таблице Стьюдента-Фишера.

Коэффициент корреляции вычисляли с использованием компьютерной программы «SPSS» и «Statistika» (StatSoft, Inc.).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Результаты исследований морфологии колоний бактерий Pseudomonas aeruginosa

При культивировании бактерий P. аeruginosa на МПА, «CN agar» «Cetrimide agar» через 18 - 48 ч при 37 °С выявило формирование S-R-M форм колоний. S-формы колоний имели округлую форму, были прозрачными, с ровными краями, d=2,0-5,0 мм; R-формы - плоские неправильной формы, складчатые, непрозрачные, с шероховатыми краями, d?3,0 мм; карликовые, d?1,0 мм; М-формы - мукоидные (слизистые), d=1,5 - 3,0 мм (табл. 5).

Таблица 5 Морфология колоний P. aeruginosa

Для изучения морфологии колоний препараты фиксировали в течение 3 мин в этиловом спирте, после подсушивания на поверхность колонии наносили 3 - 5 капель 1,0 %-ного водного раствор метиленового синего или водного раствора кристаллвиолета в разведении 1:2000. Для сохранения естественной архитектоники колоний препараты фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30 - 40 мин, для контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (O_SO₄) в течение 1-2 мин, после обработки колонии приобретали коричневый цвет.

Для исследования колоний бактерий при сканирующей электронной микроскопии применяли метод культивирования бактерий на мембранных фильтрах «Владипор, №5, №2», фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30-40 мин, для дополнительного контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (O_SO₄) в течение 1-2 мин, после обработки колонии приобретали темно-коричневый цвет, что позволило подсчитывать количество колоний, в том числе очень мелких (?1,0 мм). При изучении морфологии популяции бактерий без нарушения архитектоники колоний выявили морфологические изменении на уровне популяции бактериальных клеток, что связано с диссоциацией, частичной или полной потерей бактериями клеточной стенки, разрушением предшественников синтеза нуклеиновых кислот и ферментативной системы. При благоприятных условиях нестабильные L-формы способны реверсировать в исходное состояние, так, через 7-10 суток реверсировавшие культуры визуально формировали нетипичный рост мелких, уплощенных закрытых тонкой слизистой биопленки. При нарушении структуры бактериальных клеток и перехода популяции P. aeruginosa в гетероморфизм с различными проявлениями L-трансформации образуются сферопласты или протопласты округлой формы различной величины, а также нестабильные и стабильные L-формы.Разработанная методика изучения популяции бактерий без нарушения архитектоники колонии, позволила выявить морфологические изменении на уровне структуры бактериальных клеток P. aeruginosa, проявляющаяся диссоциацией на S-, R-, М-формы колоний: S-формы имели типичную для вида палочковидную форму и гладкие края колоний; у R-форм наряду с типичными для данного вида бактериями по морфологическим критериям выявлен гетероморфизм; М-формы представлены сливными слизистыми колониями под массивными покровами (биопленками).

3.2 Результаты изучения дифференциально-диагностических свойств бактерий Pseudomonas aeruginosa

Для подбора эффективных дифференциально-диагностических сред изучали ростобеспечивающие, ингибирующие свойства, специфичность сред: «Hugh Leifson Medium»;«Mac Conkey аgar»; «Hi Chrom Medium»; «CN agar» и «Cetrimide agar» культивировали 24 - 48 ч при 37 °С. При оценки ростообеспечивающих свойств сред взвесь микроорганизмов, содержащих около 1000 бактериальных клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича), высевали по 0,1 мл на поверхность сред, среднее количество колоний P. aeruginosa составило 64,15±1,35 - 81,33±1,63; энтеробактерий 42,17±1,37 - 90,17±1,47 (табл. 6).

Таблица 6 Сравнительная оценка ростообеспечивающих свойств сред (М±m)

Примечание: числитель - «+»; знаменатель - «-»

При оценке ингибирующих свойств сред в опытах со смешанной суспензией микроорганизмов установлено, что на среде «Cetrimide agar» среднее количество колоний P. аeruginosa и C. freundii составило: 41,2±2,1/39,2±3,7 (табл. 7).

Таблица 7 Сравнительная оценка ингибирующих свойств сред (M±m)

Условные обозначения: «-» нет роста микроорганизмов

Для оценки специфичности сред (отношение количества идентифицированных культур микроорганизмов от общего числа типичных для вида колоний) проводили опыты со смешанными суспензиями микроорганизмов P. aeruginosa, S. enteritidis, E. coli, K. pneumonia, Y. enterocolitica, C. freundii содержащими 1 млрд. бакт. клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Суспензии культур микроорганизмов в объеме по 30 мл вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты («NascoWHIRL-PAK», Germany), содержащие по одной куриной голени, выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин, периодически встряхивая. Затем голени переносили в полиэтиленовые пакеты, содержащие по 50 мл пептонной воды и выдерживали в течение 15 мин. Для выделения чистой культуры микроорганизмов суспензию из пакетов высевали по 0,1 мл на поверхность дифференциально-диагностических сред, культивировали при 37 °С 24 ч. При видовой идентификации типичных для семейства Pseudomonaceae изолированных колоний, исследовали морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов. При оптической микроскопии в мазках, окрашенных по Граму P. aeruginosa были представлены грамотрицательными бактериями, длиной 0,5 - 1,4 мкм и шириной 0,2 - 0,4 мкм. При наличии грамотрицательных палочек аэробные (расщепление глюкозы путем окисления с образованием кислоты без газа - окислительно-ферментативный тест Хью-Лейфсона), оксидазаположительные, каталазаположительные культуры микроорганизмов пересевали в пробирки со скошенным МПА для изучения ферментативных свойств. Культуры микроорганизмов P. aeruginosa - восстанавливали нитрат в нитрит, обладали протеолитической активностью (разжижали желатин и свернутую кровяную сыворотку, гидролизовали казеин), свертывали лакмусовое молоко и расщепляли сгусток, не ферментировали мальтозу, не образовали индол, сероводород.

При культивировании микроорганизмов на средах «Hugh Leifson Medium», «Mac Conkey аgar» и «CN agar» за счет наличия достаточно часто встречающегося фермента (лактоза, глюкоза, маннит), специфичность сред для идентификации псевдомонад относительно невысокая от 21,4 до 66,6%, не позволяло дифференцировать P.aeruginosa от сходных видов бактерий. Для дифференциации бактерий рода Pseudomonas специфичность среды «Hi Chrom Medium» выше по сравнению с предыдущими средами 80,0 % за счет выявления специфического фермента «в-глюкозидаза» и «в-галактозидаза», P. аeruginosa, S. enteritidis и C. freundii не продуцировали данные ферменты, формировали бесцветные колонии; K. pneumoniae, Y. enterocolitica продуцировали фермент «в-глюкозидаза», формировали сини-зеленые колонии, а E. coli продуцировали фермент «в-галактозидаза», формировали фиолетовые колонии.

Для видовой идентификации эффективной является селективная среда «Cetrimide agar» (специфичность 94,8 %) за счет наличия цетримида (этилтриметиламмоний-бромид) - четвертичное аммониевое соединение, подавляется рост сопутствующих бактерий (табл. 8).

Таблица 8 Изучение эффективности схемы бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Pseudomonas

Следующей задачей исследований явилось изучение контаминации бактериями пищевых продуктов к определенному объему (0,1 мл) разведения исследуемых образцов в ступке добавляли 10 мл стерильного 0,9 %-ного раствора NaCl, затем тщательно размешивали и выдерживали 10-15 мин при комнатной температуре для осаждения крупных частиц, из основного разведения делали ряд последующих разведений, используя три способа: способ I - серийные разведения в 0,9 % NaCl; способ II - серийные разведения в 0,7 % МПА; способ III - посев на тест-пластины «Petrifilm». Из исследуемых образцов готовили серию десятичных разведений в пробирках, содержащих 9 мл 0,9 % NaCl, затем при относительно переносимом объеме (0,1 мл) из соответствующих последних разведений проводили посев на поверхность питательных сред в чашки Петри - способ I. После автоклавирования (121 °С, 15 мин) 0,7 % раствор МПА разливали в пробирки по 9,0 мл, из исследуемых образцов готовили серию десятичных разведений, затем из соответствующих разведений производили посев каплями по 0,1 мл пипеткой вместимостью 1 мл, в одну чашку Петри наносили до 6 капель различных десятичных разведений образцов, так чтобы капли не сливались, каждая капля соответствовала посеву 0,1 мл суспензии на поверхности одной чашки - способ II. Производили посев 1 мл соответствующих последних разведений для определения КМАФАнМ под верхнюю пленку в центр пластин «Petrifilm Aerobic Plate Count», БГКП - «Petrifilm E. coli / Coliform Count Plate» - способ III. Количество микроорганизмов определяли через 18 ч культивирования при 37 °С по количеству колоний, выросших на питательной среде с пересчетом на количество посеянного материала и степень разведения культуры по формуле: x = а x 10ⁿ, где x - КОЕ микроорганизмов; a - количество выросших колоний; n - степень разведения. Определение контаминации бактериями пищевых продуктов показало, что КМАФАнМ пищевых продуктов, определенное тремя способами, существенно не отличалось, однако применение в качестве раствора для разведения 0,7 % раствора МПА и тест-пластин «Petrifilm» позволило сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа (табл. 9).

Таблица 9 Результаты изучения количества микроорганизмов (КОЕ/ед.об)

Примечание: I - 0,9 % NaCl; II - 0,7 % МПА; III - тест-пластины «Petrifilm»

Для идентификации изолятов, выделенных при изучении контаминации бактериями пищевых продуктов, исследуемые пробы (мясо птицы, фарш из мяса птицы, субпродукты, фарш свинины, фарш говядины, мясо рыбы, креветок) m=25,0 г, помещали в среду обогащения (Триптон - соевый бульон или сердечно-мозговой бульон) в соотношении 1:9 (масса/объем) и культивировали при 37є С 18 - 24 ч. Из среды обогащения делали высев на дифференциально-диагностические питательные среды: «Hi Chrom Medium» «Cetrimide agar» и культивировали при 37є С 18 - 48 ч. При первичной идентификации установлено, что из пищевого сырья и продуктов выделены 43 культур микроорганизмов, из которых 27 культур были отнесены к семейству Pseudomonaceae, 16 - семейству Enterobactericeae (табл. 10).