Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa

Таблица 10 Результаты изучения видового состава бактерий, выделенных из пищевого сырья и продуктов

На основе сравнительной оценке и подборе эффективной дифференциально-диагностических сред при индикации и идентификации бактерий, выделенных из пищевого сырья и продуктов, при первичной идентификации установлена эффективность среды «Hi Chrom Medium» (специфичность - 80,0 %), для количественного учета и видовой идентификации бактерий P.aeruginosa установлена эффективность селективной среды «Сetrimide agar», специфичность идентификации - 94,8 %. При изучении видового состава бактерий, из 43 культур микроорганизмов, выделенных из пищевого сырья и продуктов к виду P.aeruginosa относились 19 (44, 3 %) культур микроорганизмов; P. fluorescens 5 (11,6 %); P. putida 3 (7,0 %); C. freundii 4 (9,3%); E. aerogenes 4 (9,3 %), P. mirabilis 5 (11,6 %), E. tarda 3 (7,0 %).

3.3 Результаты изучения патогенных свойств бактерий Pseudomonas aeruginosa

Для оценки патогенных свойств бактерии Pseudomonas aeruginosa культивировали в жидкой среде Хоттингера при 37°С в течение 24 ч, затем центрифугировали при 6000 об\мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения наличия токсинов - опыт (контроль - жидкая среда Хоттингера) в тестах: «кожнореактивный фактор», «эдематозный тест», «эмбрионы птиц», «проницаемость сосудов». При оценке наличия токсина в тесте «кожнореактивный фактор» исследуемый материал в объеме 0,1 мл вводили внутрикожно в участки депиляции кожи беспородным белым крысам, через 24 ч учитывали результаты изменений кожного покрова (положительный результат - показатель коэффициента толщины кожи (мм), К?1,6). Установлено, что показатели коэффициента средних величин толщины кожи колебались в пределах от 1,5±1,8 до 1,9±1,1.

Для изучения наличия токсинов на лабораторной модели «эдематозный тест» 0,1 мл надосадочной жидкости вводили в плантарную поверхность лапок белых беспородных мышей, учет результатов проводили через 24 ч, сравнивая массу лапок зараженных и контрольных животных.

При оценке наличия токсинов с применением модели «эмбрионы птиц» 0,2 мл исследуемой жидкости вводили в аллантоисную оболочку 14-суточных эмбрионов уток «Пекинская» и помещали в термостат при 37 °С. При учете жизнеспособности эмбрионов в овоскопе установили, что через 24 ч после заражения летальность эмбрионов составила 100,0 %. Динамика развития патологических процессов сопровождалась развитием признаков септицемии, при наличии бактериальной эмболии и нарушения кровообращения в тканях и органах дыхательной, сердечно-сосудистой системы, наблюдали обширные кровоизлияния в зародышевых оболочках, наличие гиперемии, гемоциркуляторных изменений в тканях и органах сердечно-сосудистой и дыхательной системы, развитие перикардита, серозно-фибринозного аэросаккулита, перигепатита, катарально-фибринозного энтероколита, гиперплазии селезенки.

При витальном исследовании продукции токсинов с применением лабораторной модели «проницаемость сосудов» исследуемую жидкость вводили интраназально 5-суточным цыплятам породы «Белый леггорн», через 24 ч внутривенно вводили раствор красителя «синего Эванса», не проникающего через неповрежденный эндотелий кровеносных сосудов, результаты оценивали, сравнивая разность массы легких опытных и контрольных животных - тест «проницаемость сосудов». При наличии токсинов бактерий коэффициент проницаемости кровеносных сосудов (К) колебался в пределах от 0,051±0,15 до 1,024±0,14 (табл. 7).

Таблица 7 Результаты изучения токсигенных P. aeruginosa

На начальном этапе экспериментальных исследований (24-32 ч после введения токсина) отмечали признаки скопления значительного количества серозно-геморрагического экссудата в просвете желудочно-кишечного тракта, сочетание общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями собственного слоя слизистой оболочки, лимфоидной инфильтрацией ворсинок тонкого отдела кишечника, скоплением плазматических клеток и экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной системы, лейкоцитарной инфильтрацией и пролиферацией фибробластов перибронхиальной и периваскулярной рыхлой волокнистой соединительной ткани. Через 48-96 ч после воздействия токсинов динамика патологических процессов характеризовалась кровоподтеками кожных покровов, фибринозным перикардитом, фибринозным аэросаккулитом, катарально-фибринозным энтеритом, перигепатитом, кровоизлияниями в почках, гиперплазией селезенки, множественной бактериальной эмболией кровеносных сосудов тканей и органов сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, выделительной, иммунной систем, в паренхиматозных органах выявлялись многочисленные некротические очажки, инфильтрированные лейкоцитами, наблюдали нарушение сосудистой проницаемости сердца, легких, печени, почек, застойную гиперемию селезенки.

В органах пищеварительной системы выявляли наличие волокон фибрина, точечные, пятнистые и полосчатые кровоизлияния в слизистой оболочке тонкого и толстого отделов кишечника. В тонком отделе кишечника бокаловидные клетки были переполнены светло-розовым секретом, наблюдали слизистую дистрофию, некроз и отторжение каемчатых эпителиоцитов. На всем протяжении кишечника наблюдалась гиперемия слизистой оболочки, инфильтрация рыхлой волокнистой соединительной ткани лимфоцитами, гистиоцитами и псевдоэозинофилами. Печень имела тусклый цвет, пульпа органа на разрезе дряблой консистенции, выявляли дискомплексацию балочной структуры долек, кровенаполнение центральной вены и синусоидных капилляров, гепатоциты были увеличенными с признаками белковой и жировой дистрофии. В почках выявляли признаки застойного геморрагического инфаркта, в паренхиме органа выявлены микроабсцессы, гиперемия сосудов с лейкоцитарной инфильтрацией некротических участков, некроз эпителия канальцев нефронов почек.

Цитопатическое действие бактерий Pseudomonas aeruginosa на ткани и органы птиц характеризовалось преобладанием процессов, развивающихся по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа, сочетанием общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями паренхиматозных органов, признаками макрофагальных реакций с последующим заполнением мозгового вещества лимфоидных фолликулов псевдоэозинофильными лейкоцитами, экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной системы. В тимусе отмечали признаки расстройства кровообращения, атрофические процессы, акцидентальную трансформацию, характеризующуюся уменьшением долек, исчезновением коркового вещества, перемещением лимфоцитов в мозговое вещество и формированием кист.

3.4 Результаты изучения антагонистических свойств бактерий Pseudomonas aeruginosa

Для изучения антагонистических свойств псевдомонад применяли методы перпендикулярных штрихов, агаровых блочков, мембранных фильтров, лунок, тестирования в жидкой питательной среде и агаровой пленки. При использовании метода перпендикулярных штрихов на поверхность агаровой среды в чашке Петри высевали штрихом культуру исследуемого штамма и культивировали при оптимальной температуре для образования и диффузии в агар ингибиторных соединений. Затем перпендикулярно от края чашки к штриху выросшей культуры подсевали штрихом культуру тест-штамма, слегка касаясь штриха исследуемого штамма и культивировали при условиях, благоприятных для роста тест-культуры. При оценке антагонистической активности у испытуемой культуры учитывали величину зоны задержки роста тест-штамма. Преимущество метода заключается в учете БАВ штаммов, продуцирующих соединения небольшой молекулярной массы, которые быстрее диффундируют в толще агарового слоя и, следовательно, дают более обширные зоны задержки роста тест-культуры. Вместе с тем недостатком методики является применение одной среды для продуцента антибиотического вещества, и тест-организм, хотя не всегда одна и та же среда одинаково благоприятна как для продуцента и образования антибиотика, так и для роста тест-организма. При исследовании антагонистической активности микроорганизмов методом агаровых блочков испытуемую культуру высевали глубинным способом впитательный агар в чашке Петри и культивировали в оптимальных условиях для образования и накопления в агаре ингибиторных соединений. Затем стерильным пробочным сверлом вырезали агаровый диск (блочок) с выросшей культурой и устанавливали его в другой чашке Петри на поверхности агаровой среды, только что засеянной культурой тест-штамма. При изучении антагонистической активности микроорганизмов методом лунок в слое агара, содержащего тест-штамм, пробочным сверлом вырезали лунку диаметром 5 -7 мм и помещали определенное количество (0,2 см³) жидкой среды с выросшей культурой исследуемого штамма бактерий. Чашку выдерживали в холодильнике для диффузии ингибиторных веществ из лунки в толщу агара, далее - в термостате для роста тест-штамма, после чего измеряли зону ингибирования тест-штамма вокруг лунки. Методом лунок можно определять антагонистическую активность чистых и смешанных культур микроорганизмов. К недостаткам метода можно отнести опасность подтекания жидкости с культурой из лунки в щель между агаром и дном чашки, что ведет к недостоверному результату. Избежать подтекания можно путем формирования лунки, не доходящей до дна чашки, используя при заливке чашки агаровой средой соответствующие шаблон. При использовании методики мембранных фильтров культуру изучаемого микроорганизма в количестве 0,5 мкл и концентрации 10⁷-10⁸ кл/мл наносили в виде капли в центр мембранного фильтра, помещенного на поверхность плотной питательной среды, и культивировали при оптимальных для данного микроорганизма условиях. Затем мембранные фильтры удаляли с поверхности плотной питательной среды и на то же место помещали новые мембранные фильтры, на поверхность которых наносили взвесь исследуемых тест-штаммов патогенных бактерий в той же концентрации. Контролем служил рост культур, не подвергшихся воздействию БАВ. После воздействия биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров выявлялся рост культуры бактерий в виде пятен различной плотности и величины. При использовании методики тестирования в жидких питательных средах тест-культуру культивировали в оптимальной жидкой питательной среде, к которой добавлена бесклеточная культуральная жидкость исследуемого штамма-антагониста. При оценке антагонистической активности учитывали угнетение роста тест-штамма в сравнении с контролем (параллельная культура тест-штамма без добавления бесклеточной культуральной жидкости исследуемой культуры), определяя КОЕ микроорганизмов, метаболитическую активность - по характерному для тест-штамма признаку. При апробации методики «агаровой пленки» или «микрокультуры» на поверхность двух предметных стекол наносили стерильной нагретой пипеткой 0,2-0,3 мл горячей питательной среды (MRS-агар и МПА) и распределяли по всей поверхности стекла. При исследовании межвидового антагонизма, продуцируемые бактериями P.aeruginosa, угнетали рост бактерий S. enteritidis; K. pneumonia; C. freundii; Y.enterocolitica от 10,0±0,2 до 11,3±0,1 (табл.11).

Таблица 11 Результаты изучения антагонистических свойств P. аeruginosa

Примечание: t - доверительный коэффициент; td -коэффициент достоверности различий средних величин

На основе результатов собственных исследований сделано заключение, что из числа апробированных методов изучения антагонистической активности на плотных питательных средах наиболее результативным являлась методика с применением мембранных фильтров, для исследования антагонистической активности в жидкости - метод «агаровой пленки», позволяющие определять антагонистическую активность микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам, сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа.

3.5 Результаты изучения чувствительности бактерий Pseudomonas aeruginosa к антибактериальным препаратам

3.5.1 Результаты изучения чувствительности к антибиотикам

При изучении чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП) микроорганизмов, выделенных из сырья и пищевых продуктов, применяли методы диффузии в агар; экспресс-тест «Гексадиски Pseudo 6» («HexaDisc», HiMedia-HX050, Индия); серийные разведения. Бактериальную суспензию из 18-часовой культуры, выращенной на МПА, готовили в 3-5 мл изотонического раствора 0,9 % NaCl по оптическому стандарту мутности "McFarland" 0,5. Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат вверх дном и культивировали в течение 24 ч при 37 °С. Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1,0 мм. Для учета чувствительности к антибактериальным препаратам учитывали диаметр зон задержки роста бактерий. Учет результатов определения чувствительности P.aeruginosa к АБП проводили, определяя пограничные значения диаметров зон задержки роста и минимальную подавляющую концентрацию - МПК. При изучении чувствительности микроорганизмов к АБП методом диффузии в агар установлено, что Pseudomonas aeruginosa были чувствительными к группе в-лактамных АБП (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем, меропенем); аминогликозидам (тобрамицин, гентамицин, нетилмицин); хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); устойчивыми к хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклин (табл.12).

Таблица 12 Результаты изучения чувствительности Pseudomonas aeruginosa к антибиотикам методом диффузии в агар

При изучении чувствительности к антибиотикам Pseudomonas aeruginosa применяли экспресс-тест «HexaDisc» - набор из 6 одиночных дисков, радиально прикрепленных к центру (табл. 13).

Таблица 13 Чувствительность к антибиотикам «Гексадиски Pseudo 6»

Аk - амикацин; C -цефепим; Ca - цефтазидим; Cf - ципрофлоксацин; G - гентамцин; I - имипенем

При изучении чувствительности микроорганизмов P. aeruginosa к АБП методом серийных разведений 0,7% МПА разливали в пробирки по 0,5 мл. Рабочий раствор АБП в количестве 0,5 мл при помощи микропипетки со стерильным наконечником вносили в 1-ю пробирку, содержащую 0,5 мл 0,7% МПА, тщательно перемешивали, переносили 0,5 мл раствора АБП в 0,7% МПА во 2-ю пробирку. Процедуру повторяли для приготовления ряда необходимых разведений. Из последней пробирки 0,5 мл раствора удаляли. Для инокуляции использовали взвесь микроорганизмов, содержащую 106 КОЕ/мл. В каждую пробирку, содержащую 0,5 мл соответствующего разведения АБП, вносили 0,5 мл взвеси микроорганизмов, затем производили посев каплями на поверхность МПА, в одну чашку Петри наносили до 6 капель различных десятичных разведений АБП. Чашки культивировали при 37єС в течение 24 ч. Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли с помощью методики «Оценка минимальной ингибирующей концентрации ("МИК")». При отсутствии роста в минимальной и максимальной концентрациях антибиотика микроорганизмы считали чувствительными к препарату. При наличии роста при минимальной концентрации антибиотика чувствительность микроорганизма к препарату считали умеренно чувствительными. Если рост наблюдался при минимальной и максимальной концентрациях антибиотика, микроорганизмы считали устойчивыми к препарату. Минимальной ингибирующей концентрацией считали минимальную концентрацию антибиотика, которая ингибирует рост микроорганизмов. При изучении чувствительности к АБП методом серийных разведений установлено, что наибольшую чувствительность P. аeruginosa выделенных из фарша птицы к цефтазидиму (МИК 4,0 - мг/г), цефепиму (МИК 4,0 - мг/г), меропенем (МИК 1,0 - мг/г), гентамицину (МИК 8,0 - мг/г); ципрофлоксацину (МИК 0,125 - мг/г); умеренно чувствительные к амикацину (МИК 32,0 - мг/г) (табл. 14).

Таблица 14 Результаты изучения чувствительности P. аeruginosa к антибиотикам методом серийных разведений

Примечание: * - референтный штамм; ** - фарш птиц; *** - рыбы

Для обнаружения остаточных количеств антибиотиков в сырье и пищевых продуктах использовали тест-систему «Premi ® Test», основанный на высокой чувствительности бактерий Bacilluss Stearothermophilus к антибактериальным препаратам. Ампулы «Premi ® Test» содержат твердую агаровую питательную среду, стандартное количество спор указанных бактерий и цветной индикатор бромкрезол, при культивировании при 64°С споры прорастают. Из исследуемых проб (n=25), используя пресс, выдавливали около 250 мкл сока. В ампулы «Premi ® Test» добавляли 100 мкл исследуемых образцов и оставляли на 20 минут при комнатной температуре для предварительной диффузии; промыли пробирку деминерализованной водой, осторожно отбирали воду из ампулы, закрывали пробирку фольгой, предварительно доводили температуру нагревательного блока до 64°С, поместили пробирку в инкубатор на 3 часа, затем извлекали пробирку из нагревательного блока и помещали пробирку в сканер «Premi®Scan». Учет результатов проводили по изменении цвета индикатора; «+» результат - при отсутствии в анализируемом образце АБП в концентрации, превышающей минимально обнаруживаемую, рост бактерий подавляется, кислотность среды остается близкой к нейтральной, бромокрезол придает содержимому ампулы фиолетовый цвет; «-» результат - при отсутствии в анализируемом образце АБП происходит размножение бактерий и выделение кислоты, в результате индикатор бромокрезол приобретает желтый цвет. При изучении наличия АБП количество положительных результатов от 40,0 до 80,0 %.

При изучении чувствительности к антибактериальным препаратам культуры микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, выделенные из пищевого сырья и продуктов, 79,8% были чувствительными к антибиотикам группы в-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем, меропенем); 51,8% - аминогликозидам (гентамицин, тобрамицин, нетилмицин), 88,4% - хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); в то время 58,1 % были устойчивы к хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.

3.5.2 Результаты изучения антибактериальной активностиэкстрактов растений и желчи

При изучении антибактериальной активности экстрактов растений установлено, что антибактериальной активностью по отношению к бактериям P. аeruginosa обладали Коптис китайский (Coptis chinensis), Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi), зоны задержки роста составили от 9,0±0,59 до 11,5±0,97; по отношению к изученным видам энтеробактерий обладали Японская жимолость (Honeysuckle aqueous), Коптис китайский, Шлемник байкальский, Чай Пуэр (Camellia sinensis var.assamica), зоны задержки роста от 9,0±0,64 до 13,0±1,1(табл.15).

Таблица 15 Результаты изучения антибактериальной активностилекарственных растений, мм (М±m)

При сочетанном действии антибиотиков и экстрактов растения Коптис китайский зоны задержки роста P. аeruginosa составили от 19,50±1,54 до 25,50±2,12.

Для изучения чувствительности бактерий к действию растворов медицинской консервированной желчи (ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург) использовали метод диффузии в агар, для этого суспензию бактерий наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 1,0 мл, равномерно распределяли по поверхности шпателем. Чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Затем в чашках Петри на поверхностях МПА пробойником делали отверстия (лунки), в которые вносили 1,0 - 4,0 % -ные растворы желчи, культивировали при 37 єС в течение 48 ч. При изучении чувствительности P. aeruginosa к действию растворов желчи установлено, что зоны задержки роста бактерий составили от 11,8 до 15,0 мм. При анализе результатов бактериостатического действия желчи уровень резистентности представителей изученных видов бактерий уменьшался в ряду: псевдомонады, клебсиеллы, протеи, сальмонеллы, эшерихии, цитробактеры, иерсинии.

Для изучения антиадгезивных активности желчи к бактериям использовали методику, позволяющую сохранять естественную архитектонику при взаимодействии бактерий с клетками крови. В опыте использовали суспензию эритроцитов концентрацией 10⁹ кл/мл в физиологическом растворе и суточную бульонную культуру бактерий в концентрации 10⁹кл/мл при воздействии желчи. Для изучении процессов адгезии P. аeruginosa к эритроцитам с использованием оптической микроскопии, подсчитывали адгезированные бактерии на 25 эритроцитах для определения среднего показателя адгезии (СПА). Экспериментальными исследованиями установлена антиадгезивная активность растворов медицинской консервированной желчи, содержащей холевую и дезоксихолевую кислоты. Показано, что 1,0 - 4,0 % растворы желчи при экспозиции 2 часа снижали коэффициент адгезии бактерий в 4 раза.

3.5.3 Результаты изучения чувствительности Pseudomonas aeruginosa к препарату «Дезант»

При исследовании чувствительности к дезинфицирующим препаратам микроорганизмов использовали методы диффузии в агар; серийные разведения; для контроля качества дезинфицирующих препаратов применяли пластины «Дип-слайд» («Oxoid», Англия). Для изучения чувствительности микроорганизмов, выделенных из сырья и пищевых продуктов, использовали препарат «Дезант», содержащего 1,6,3,8-диметано-1,3,6,8-тетраазациклодекан - ЧАС по активному действующему веществу. На первом этапе исследования оценку чувствительности бактерий к указанному препарату проводили методом диффузии в агар. Поверхность агара контаминировали суточными культурами тест-микроорганизмов, в плотной питательной среде пробойником делали отверстия (лунки), в которые заливали дезинфицирующее средство в различных концентрациях (2,0 %, 2,5 %, 3,0 %). Чашки Петри культивировали при 37 °С в течение 2 суток. Результаты учитывали по наличию или отсутствию зон задержки роста культур микроорганизмов вокруг лунок после культивирования. На основании результатов исследований установлено, что зоны задержки роста микроорганизмов P. aeruginosa с 3% препаратом «Дезант» P. аeruginosa от 11,20±1,89 до 13,90±2,33 (табл. 16).

Таблица 16 Результаты изучения чувствительности бактерий к препарату «Дезант» методом диффузии в агар

Примечание: 1- референтный; 2 - фарш птиц; 3 - фарш свинины; 4 - фарш говядины; 5 - рыбы

бактерия pseudomonas aeruginosa патогенный

При оценке чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему препарату «Дезант», наряду с общепринятым методом диффузии в агар, нами были апробированы тест-пластины «Дип-слайд», предназначенные для бактериологического исследования поверхностей. Для бактериологического исследования применяли пластины «Дип-слайд» из полимера, находящиеся в стерильной прозрачной пластиковой пробирке (контейнер). Дифференциально-диагностические среды, размещенные на пластине, позволяли провести бактериологическое исследование материала с учетом цели исследования и биологии микроорганизмов, уменьшить объем питательных сред и количество бактериологической посуды. «Дип-слайды» содержали следующие питательные среды: Цетримидный агар («Cetrimide agar») - селективный агар с цетримидом для выделения P. aeruginosa в различных образцах; Мак Конки («Mac Conkey») - среда для выделения и дифференциации колиформных бактерий. При исследовании полимерную пластину слайда, покрытую плотной питательной средой, плотно прижимали к поверхности, помещали в контейнер и культивировали при 37 ° С 18-24 ч. Изучение степени контаминации P. аeruginosa пищевых продуктов проводили методом отпечатков с использованием стерильных ватных тампонов. Для посева с использованием стерильных ватных тампонов, перед проведением исследования тампон увлажняли стерильным 0,1% водным раствором пептона или изотоническим раствором хлорида натрия. Смыв с объекта, тщательно раскатывали ватным тампоном по поверхности агара на «Дип-слайде». Для посева методом отпечатка поверхность слайда с питательной средой плотно прижимали к исследуемой поверхности. После посева слайд помещали в контейнер с плотно закрывающейся крышкой, культивировали при 18-24 ч 37 °С. Подсчитывали выросшие колонии микроорганизмов на поверхности питательной среды, определяли КМАФАнМ и учитывали степень контаминации бактериями поверхностей. Определение микроорганизмов основано на анализе морфологии и цвета образуемых колоний (при низкой концентрации бактерий посевы культивировали в течение 2 суток, затем оценивали морфологию). Метод индикации и идентификации псевдомонад с использованием пластин «Дип-слайдов» позволял сократить время проведения эксперимента (поскольку посев на несколько сред происходит одновременно), расход питательных среды и расходные материалы на этапе первичного посева, облегчал транспортировку проб в лабораторию. «Дип-слайды» возможно использовать для проведения контроля качества дезинфекции, так как метод прост в исполнении, информативен, за счет комбинаций дифференциально-диагностических питательных сред, которые позволяли одновременно определить количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), псевдомонады и энтеробактерии.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Бактерии P. aeruginosa при инфицировании восприимчивых видов реализуют факторы вирулентности, связанные с адгезией к живым тканям путем контакта с рецепторами эукариотической клетки, инвазией, обусловленной деплимеризующими биологические субстраты протеолитическими ферментами, синтезом экзотоксинов (гемотоксин, лейкоцидин, цитотоксины) и эндотоксина липополисахаридной природы. (Van Delden, Iglewski, 1998). При бессимптомной персистенции P. aeruginosa в организме бактерионосителей может происходить контаминация пищевого сырья, P. aeruginosa обладают свойством сохраняться в биологических материалах при низких температурах и накапливаться в пищевых продуктах при холодильной обработке, что обусловливает социальную значимость профилактических мероприятий в начале «пищевой цепи» (в животноводстве, птицеводстве и перерабатывающей промышленности). В этой связи для успешного функционирования объектов животноводства к числу приоритетных задач относится изыскание эффективных антибактериальных препаратов, эффективность которых определяется прежде всего экологической безопасностью и широким спектром действия по отношению к патогенным микроорганизмам, в том числе, P. аeruginosa обладают с множественной лекарственной устойчивостью вследствие повышенного синтеза экзополисахаридов, формирующих биопленки, замедляющей диффузию антибактериальных препаратов (Саакян Н.Н., 1986; Чеботарь И.В. и соавт.,2012; Мележик И.А. и соавт., 2013; Anwar H. et al., 1992; Alkawash M.A. et al., 2006; Bjarnsholt T., 2009). В настоящее время установлено, что экзополисахариды, продуцируемые в виде биопленок, обладают защитным эффектом от действия активного кислорода. Для углубления научных познаний малоисследованных вопросов этиологической значимости факторов вирулентности P.aeruginosa целесообразным является изучение динамики патологических процессов на восприимчивых лабораторных моделях, апробация, изыскание и подбор эффективных диагностических сред с селективными свойствами, тест-систем для дифференциации сходных видов бактерий, экспресс-тестов изучения чувствительности к антибактериальным препаратам, что и определило актуальность темы диссертационной работы.

Целью диссертационной работы явилось обобщение данных литературы и результатов собственных исследований по изучению дифференциально-диагностических свойств и чувствительности к антибактериальным препаратам бактерий P. aeruginosa, выделенных из пищевого сырья и продуктов питания.

На первом этапе исследований проводили изучение морфологических свойств бактерий P. aeruginosa, апробацию и изыскание эффективных диагностических сред с селективными свойствами. По морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам свойствам выделенные бактерии P. aeruginosa аналогичны описываемым в определителе Берджи и других источниках (Сидоров М.А. и соавт, 1995; Скородумов Д.И. и соавт, 2005; Коротяев А.И., Бабичев С.А., 2008). Установлено, что на МПА 50,1 % колоний имели округлую форму, ровные края - S-форма; 33,4 % плоские неправильной формы, 8,4 % складчатые, непрозрачные, с шероховатыми краями, d?3,0 мм - R-форма; 6,7 % слизистые - М-форма. На среде «CIN agar» 54,2 % - М-форма; 36,5 %. - карликовые. На среде «Cetrimide agar» 88,0 % колониий - S форма. Для исследования колоний бактерий при сканирующей электронной микроскопии применяли метод культивирования бактерий на мембранных фильтрах «Владипор, №5, №2», фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30-40 мин, для дополнительного контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (O_SO₄) в течение 1-2 мин, после обработки колонии приобретали темно-коричневый цвет, что позволило подсчитывать количество колоний, в том числе очень мелких (?1,0 мм). При изучении морфологии популяции бактерий без нарушения архитектоники колоний выявили морфологические изменении на уровне популяции бактериальных клеток, что связано с диссоциацией, частичной или полной потерей бактериями клеточной стенки, разрушением предшественников синтеза нуклеиновых кислот и ферментативной системы. При благоприятных условиях нестабильные L-формы способны реверсировать в исходное состояние, так, через 7-10 суток реверсировавшие культуры визуально формировали нетипичный рост мелких, уплощенных закрытых тонкой слизистой биопленки. При нарушении структуры бактериальных клеток и перехода популяции P. aeruginosa в гетероморфизм с различными проявлениями L-трансформации образуются сферопласты или протопласты округлой формы различной величины, а также нестабильные и стабильные L-формы. Разработанная методика изучения популяции бактерий без нарушения архитектоники колонии, позволила выявить морфологические изменении на уровне структуры бактериальных клеток P. aeruginosa, проявляющаяся диссоциацией на S-, R-, М-формы колоний: S-формы имели типичную для вида палочковидную форму и гладкие края колоний; у R-форм наряду с типичными для данного вида бактериями по морфологическим критериям выявлен гетероморфизм; М-формы представлены сливными слизистыми колониями под массивными покровами (биопленками).

При изучении дифференциально-диагностических свойств P. aeruginosa объектом исследования служили питательные среды «Hugh Leifson Medium»;«Mac Conkey аgar»; «Hi Chrom Medium»; «CIN agar», «Cetrimide agar». При изучении ростообеспечивающих свойств среды «Hugh Leifson Medium» установлено, что среднее количество колоний P. aeruginosa составило - 81,33±1,63; S. enteritidis - 90,17±1,47; E. coli - 70,0 ±1,41; K. pneumoniae - 79,67±0,89; Y. enterocolitica - 62,17±1,37; C. freundii - 78,0±1,12. При посеве суспензии, содержащей около 100 бактериальных клеток, среднее количество колоний P. aeruginosa, выросших на среде «Mac Conkey аgar» составило 64,15±1,35; S. enteritidis - 69,15±2,15; E. coli - 72,15±1,10; K. pneumoniae - 77,66±0,69; Y. enterocolitica - 54,13±1,37; C. freundii - 76,0 ±1,1. При оценке ростообеспечивающих, ингибирующих и дифференциально-диагностических свойств хромогенных сред «Hi Chrom Medium», при посеве суспензии, содержащей около 100 бактериальных клеток, среднее количество колоний P. aeruginosa составило - 84,15±1,35; S. enteritidis - 80,17±1,44; E. coli - 75,0 ±1,41; K. pneumoniae - 79,67±0,89; Y. enterocolitica - 42,17±1,37; C. freundii - 76,0 ±1,21. На среде «CIN agar» - P. aeruginosa - 74,15±1,35; Y. enterocolitica - 70,17±1,27; S. еnteritidis, E. сoli, K. рneumoniae, C. freundii - рост отсутствовал. На среде «Cetrimide agar» P. aeruginosa - 86,25±2,31; C. freundii - 73,25±1,3; S. еnteritidis, E. сoli, K. рneumoniae, Y. enterocolitica - рост отсутствовал. При культивировании микроорганизмов на средах «Hugh Leifson Medium», «Mac Conkey аgar», «CIN agar» за счет наличия достаточно часто встречающегося фермента (лактоза, глюкоза, маннит), специфичность сред для идентификации P. aeruginosa относительно невысокая - от 21,4 до 66,6%, что не позволяло дифференцировать P. aeruginosa от сходных видов бактерий. Для дифференциации P. aeruginosa специфичность среды «Hi Chrom Medium» несколько выше по сравнению с предыдущими средами - 80,0 % за счет выявления специфического фермента «в-глюкозидаза» и «в-галактозидаза», P. аeruginosa, S. enteritidis и C. freundii, не продуцирующие данные ферменты, формировали бесцветные колонии; K. pneumoniae, Y. enterocolitica продуцирующие фермент «в-глюкозидаза», формировали сини-зеленые колонии, E. coli, продуцирующие фермент «в-галактозидаза», формировали фиолетовые колонии. Среда «Cetrimide agar» за счет цетримида (этилтриметиламмоний-бромид) подавляет рост сопутствующих бактерий. Цетримид действует как четвертичное аммониевое соединение, катионный детергент, который освобождает азот и фосфор из бактериальных клеток (за исключением псевдомонад), специфичность данной среды 94,8 %. На основании сравнительной оценки и подбора эффективных дифференциально-диагностических сред рекомендуется использовать среды «Hi Chrom Medium», «Cetrimide agar», для дифференциации P.aeruginosa эффективной является среда «Cetrimide agar», которая обладает ростообеспечивающими свойствами, ингибирует рост грамположительной бактерий, позволяет дифференцировать P.aeruginosa от бактерий, чувствительных к четвертичным аммониевым соединениям, специфичность среды - 94,8 %.

При изучении контаминации бактериями пищевых продуктов использовали три способа: способ I - серийные разведения в 0,9 % NaCl; способ II - серийные разведения в 0,7 % МПА; способ III - посев на тест-пластины «Petrifilm». При учете контаминации бактериями пищевых продуктов в исследованных пробах фарша из мяса птицы КМАФАнМ составило 72х10³ КОЕ/г, фарша из свинины - 84х10⁵ КОЕ/г, фарша из говядины - 90х10⁵ КОЕ/г, фарша из мяса рыбы - 26х10³ КОЕ/г; креветок - 31 х 10³ КОЕ/г. Определение контаминации бактериями пищевых продуктов показало, что КМАФАнМ пищевых продуктов, определенное тремя способами, существенно не отличалось, однако применение в качестве раствора для разведения 0,7 % раствора МПА и тест-пластин «Petrifilm» позволило сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа. При первичной идентификации изолятов на среде «Hi Chrom Medium» установлено, что из пищевого сырья и продуктов выделены 43 культур микроорганизмов, из которых 27 культур отнесены к семейству Pseudomonaceae: P.aeruginosa 19 (44, 3 %); P. fluorescens 5 (11,6 %); P. putida 3 (7,0 %); 16 - семейства Enterobactericeae: C. freundii 4 (9,3%); E. aerogenes 4 (9,3 %), P. mirabilis 5 (11,6 %), E. tarda 3 (7,0 %). При изучении видового состава бактерий на среде «Cetrimide agar» выделено и идентифицировано 19 культур микроорганизмов P.aeruginosa (44, 2 %), из числа которых 13, 9 % культур были выделены из продукции птицеводства; 7,0 % - фарша свинины; 11,6 % - фарша говядины; 7,0 % - мяса рыбы; 4,6 % - креветок.

Следующим этапом исследований явилось изучение факторов вирулентности P. aeruginosa. Особенностью P. aeruginosa является наличие широкого спектра факторов вирулентности (Bodey G.RP. et al., 1983; Rocha C.L. et al., 2003; Scharmann W. 1976). Адгезия P. aeruginosa к абиотическим поверхностям обусловлена неспецифическими взаимодействиями (например, за счет разницы заряда), адгезия к живым тканям осуществляется путем контакта с рецепторами эукариотической клетки (Езепчук Ю.В.,1985; Малышева Э.Ф., 1988; DholakiaP.M., 1985). Токсины и токсические продукты P. aeruginosa дифференцируются на экзо- и эндотоксины. Экзотоксины представлены продуктами жизнедеятельности с широким спектром активности: экзотоксин А - нарушает организацию матрицы белкового синтеза; экзотоксин S - вызывает патологические процессы в легких; цитотоксин - повышает проницаемость клеточных мембран, что приводит к структурному изменению клеток, гемолизины - приводят к развитию некротических поражений печени и легких (Езепчук Ю.В., 1985; Мавзютов А.Р., 2001; Тимченко Н.Ф., 2004; Павлова И. Б., Ленченко Е.М., 2007; Волкова Е.А., 2011; Smith H.R., Scotland S.M., Willshaw G.A. et al., 1988; Моrаn А.Р., 1995; Sears C.X., Kaper J.B., 1996; Fekete P.Z., Gerardin J., Jacquemin E., 2002). Изучение токсигенных свойств P. aeruginosa проводили с использованием лабораторных моделей «кожнореактивный фактор», «эмбрионы птиц», «проницаемость сосудов». При оценке наличия токсина в тесте «кожнореактивный фактор» исследуемый материал в объеме 0,1 мл вводили внутрикожно в участки депиляции кожи беспородным белым крысам, через 24 ч учитывали результаты изменений кожного покрова (положительный результат - показатель коэффициента толщины кожи (мм), К?1,6). Установлено, что показатели коэффициента средних величин толщины кожи колебались в пределах от 1,7±1,8 до 1,9±1,12. При оценке наличия токсинов с применением модели «эмбрионы птиц» 0,2 мл надосадочной жидкости вводили в аллантоисную оболочку 14-суточных эмбрионов уток «Пекинская» и помещали в термостат при 37 °С. При учете жизнеспособности эмбрионов в овоскопе установили, что через 24 ч после заражения летальность эмбрионов составила 100,0 %. Динамика развития патологических процессов сопровождалась развитием признаков септицемии, при наличии бактериальной эмболии и нарушения кровообращения в тканях и органах дыхательной, сердечно-сосудистой системы наблюдали обширные кровоизлияния в зародышевых оболочках, наличие гиперемии, гемоциркуляторных изменений, развитие перикардита, серозно-фибринозного аэросаккулита, перигепатита, катарально-фибринозного энтероколита, гиперплазии селезенки. При витальном исследовании продукции токсинов с применением лабораторной модели «проницаемость сосудов» исследуемую жидкость вводили интраназально 5-суточным цыплятам породы «Белый леггорн», через 24 ч внутривенно вводили раствор красителя «синего Эванса», не проникающего через неповрежденный эндотелий кровеносных сосудов, результаты оценивали, сравнивая разность массы легких опытных и контрольных животных - тест «проницаемость сосудов». При наличии токсинов бактерий коэффициент проницаемости кровеносных сосудов колебался в пределах от 1,09±0,11 до 1,24±0,14. Действие токсинов P. aeruginosa на ткани и органы цыплят и лабораторных мышей характеризовалось преобладанием процессов, развивающихся по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа, токсической дистрофией кардиомиоцитов, кровоизлияниями и застойной гиперемией, лимфоидно-клеточной инфильтрацией рыхлой волокнистой соединительной ткани, периваскулярным отеком тканей, образовавшимся вследствие выхода плазмы и форменных элементов крови, диссеминированным тромбозом. В тимусе отмечали признаки расстройства кровообращения, атрофические процессы, акцидентальную трансформацию, характеризующуюся уменьшением долек, исчезновением коркового вещества, перемещением лимфоцитов в мозговое вещество и формированием кист. На начальном этапе экспериментальных исследований (24-32 ч после введения токсина) признаки скопления значительного количества серозно-геморрагического экссудата в просвете желудочно-кишечного тракта, сочетание общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями собственного слоя слизистой оболочки, лимфоидной инфильтрацией ворсинок тонкого отдела кишечника²⁸, скоплением плазматических клеток и экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной системы, лейкоцитарной инфильтрацией и пролиферацией фибробластов перибронхиальной и периваскулярной рыхлой волокнистой соединительной ткани.

При исследовании межвидового антагонизма наряду с общепринятыми методами исследования, были апробированы методы с использованием мембранных фильтров (Петровская В.Г. Бондаренко В.М., 1994; Ленченко Е.М., Павлова И. Б., 1998; Павлова И. Б. и соавт, 2007). В результате исследований было установлено, что изоляты P. aeruginosa, угнетали рост бактерий S. typhimurium с зоной задержки роста 1,3±0,1 мм; S. enteritidis - 1,4±0,1 мм; K. pneumonia - 1,1±0,1 мм; C. freundii - 1,5±0,2 мм; E. coli - 2,0±0,2 мм; Y.enterocolitica- 1,5±0,2 мм. При сравнении методик оценки антагонистической активности микроорганизмов установлено, что из апробированных наиболее результативным является метод мембранных фильтров. Суть методики состоит в способности биологически активных веществ, продуцируемых бактериями-антагонистами, диффундировать через мембранные фильтры в слой питательной среды. После воздействия биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров выявляется рост культуры бактерий в виде пятна различной плотности и величины. Для определения антагонистической активности микроорганизмов оптимальными в практических условиях являются методы с использованием мембранных фильтров, с помощью которых на хромогенных средах представляется возможным определять антагонистическую активность микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам. Кроме того, эти методики позволяют проводить количественно-качественную оценку степени ингибирования штамма-антагониста. Это расширяет познание о действии БАВ и показывает, что визуальное отсутствие роста бактерий не свидетельствует о результатах бактерицидного действия. Использование методик с мембранными фильтрами уменьшает время культивирования микроорганизмов, существенно снижает экономические затраты на питательные среды, т.к. на одной чашке Петри можно проводить исследования антагонистической активности 3-4 штаммов-антагонистов к 9-24 тест-культурам. Свойство бактерий продуцировать биологически активные вещества широко используется как один из экологически безопасных способов профилактики желудочно-кишечных инфекций сельскохозяйственных животных. Установлено, что БАВ действуют на патогенную микрофлору значительно дольше, так как продукты метаболизма продуцируются в процессе жизнедеятельности популяции в отличии химических агентов (дезинфицирующие и лекарственные препараты).

При определении чувствительности P. aeruginosa к антибиотикам использовали ускоренный метод диффузии в агар по общепринятой методике, параллельно с классическими методами проводили определение антибиотикочувствительности микроорганизмов с помощью экспресс-теста «Гексадиски Pseudo 6» - набор из 6 одиночных дисков, радиально прикрепленных к центру. Для определения чувствительности микроорганизмов к АБП взвесь P. aeruginosa (106 КОЕ/мл) высевали на поверхность МПА, приоткрытые чашки Петри подсушивали в течение 15 мин, раскладывали гексадиски, культивировали при 35° С в течение 20 ч, учет результатов в соответствии с методическими указаниями (МУК 4.2.1890-04: «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»). Из числа культур микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, выделенных из пищевого сырья и продуктов, 79,8% чувствительны к антибиотикам группы в-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем, меропенем); 51,8% - аминогликозидам (гентамицин, тобрамицин, нетилмицин), 88,4% - хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); 58,1 % устойчивы к хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.

Для обнаружения остаточных количеств антибиотиков в сырье и пищевых продуктах использовали тест-систему «Premi ® Test», принцип действия которой основан на высокой чувствительности бактерий Bacilluss Stearothermophilus к антибактериальным препаратам. Ампулы «Premi ® Test» содержат твердую агаровую питательную среду, стандартное количество спор бактерий и цветной индикатор бромокрезол. При культивировании при 64°С споры прорастают. В отсутствие АБП происходит размножение бактерий и выделение кислоты, в результате индикатор бромокрезол приобретает желтый цвет. При наличии в анализируемом образце АБП в концентрации, превышающей минимально обнаруживаемую, рост бактерий подавляется, кислотность среды остается близкой к нейтральной, бромокрезол придает содержимому ампулы фиолетовый цвет. Учитывая цвет пробы после культивирования, устанав...