Научное и практическое обоснование использования штаммов лактобактерий, выделенных в РСО-Алания, для реализации биоресурсного потенциала молодняка свиней и цыплят-бройлеров и получения продуктов функционального питания

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность темы. Полноценное и здоровое питание является одним из наиболее важных и необходимых условий для сохранения жизни и здоровья нации. Издавна считалось, что кисломолочные продукты оздоровляют организм, поэтому различные виды кислого молока широко употреблялись в пищу. Только значительно позже были обоснованы диетические и лечебные свойства этих продуктов.

В последние годы в науке о питании получило развитие новое направление - функциональное питание. Для повышения биологической ценности и лечебно-профилактического действия продуктов все шире применяют молочнокислые пробиотические микроорганизмы. Значительно возрос интерес ученых к использованию пробиотиков и в сельскохозяйственном производстве. Особое значение в этой связи уделяется технологическим и неизвестным ранее физиолого-биохимическим свойствам молочнокислых микроорганизмов.

Селекцию молочнокислых микроорганизмов осуществляют следующими способами: выделение чистых культур молочнокислых бактерий из природных источников; получение производственно-ценных штаммов лактобактерий; получение улучшенных форм лактобактерий адаптацией в целях приспособления к этим условиям (выращивание микроорганизмов при постоянно изменяющихся условиях культивирования). Внешняя среда при этом является мощным фактором эволюции и изменчивости микроорганизмов. Следовательно, выделение из природных источников местных штаммов лактобактерий считается целесообразным.

Поиск и получение производственно-ценных штаммов молочнокислых бактерий, обладающих повышенной биохимической активностью и своеобразным обменом веществ способствует интенсификации производства и выработке новых высококачественных пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов функционального питания.

Исходя из этого, исследования, направленные на изучение биоресурсного потенциала микромира окружающей среды и практическое использование новых пробиотических штаммов молочнокислых микроорганизмов в решении проблем агропромышленного комплекса, являются актуальными.

Целью диссертационной работы явилось выделение чистых культур молочнокислых бактерий из различных природных субстратов; установление их видовой принадлежности и биологических особенностей, а также важнейших производственно-ценных свойств и антагонистической активности в отношении представителей патогенной и условно-патогенной микрофлоры; создание на их основе кисломолочных продуктов функционального назначения; определение эффективности выделенных штаммов в кормлении сельскохозяйственных животных и птицы; депонирование наиболее перспективных штаммов во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ генетика.

В задачи исследований входило:

Ш выделение чистых культур молочнокислых микроорганизмов из различных природных субстратов;

Ш определение биологических особенностей и технологических свойств местных штаммов лактобактерий;

Ш идентификация наиболее перспективных штаммов с последующим депонированием их культур во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ генетика;

Ш установление антагонистической активности отобранных штаммов по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре;

Ш разработка технологии получения кисломолочных продуктов функционального питания на основе отобранных штаммов;

Ш апробация выделенных и изученных пробиотических штаммов бактерий на молодняке свиней и цыплятах-бройлерах.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые, в условиях РСО-Алания выделены и изучены биологические и технологические свойства, идентифицированы и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика производственно-ценные штаммы бактерий Enterococcus durans ВКПМ В-8731 и Lactobacillus casei ВКПМ В-8730. Установлена антагонистическая активность 13 местных штаммов лактобактерий по отношению к 9 представителям патогенной и условно-патогенной микрофлоры. На основе выделенных штаммов молочнокислых бактерий получены новые продукты функционального питания, обладающие диетическими и лечебно-профилактическими свойствами. Научно обоснована и экспериментально доказана целесообразность практического применения полученных пробиотических препаратов в кормлении молодняка животных и птицы. Разработаны эффективные схемы и нормы скармливания молочнокислых бактерий для поросят-отъемышей и цыплят-бройлеров.

Теоретическая и практическая ценность работы. Работа вносит существенный вклад в использование заквасок прямого внесения на основе пробиотических бактерий селекции Горского ГАУ в пищевой промышленности, агропромышленном и биотехнологическом производстве. Научная полезность результатов работы выражается в выделении новых, биологически и технологически активных, штаммов молочнокислых микроорганизмов в экологически чистых районах РСО-Алания, где микроорганизмы не подвержены мутационным изменениям.

Использование разработок позволяет значительно расширить ассортимент функциональных продуктов питания, способствует реализации биоресурсного потенциала молодняка свиней и цыплят-бройлеров, а также повышает экономическую эффективность выращивания молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, увеличивая приросты живой массы и снижая падеж от кишечных инфекций.

Материалы исследований могут быть использованы в учебном процессе при подготовке специалистов в высших учебных заведениях биологического и сельскохозяйственного профиля.

Представленная работа является частью плана научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» (№ гос. регистрации 01.2.007 08206, 01.2.007 08213) и НИИ биотехнологии Горского ГАУ «Рациональное использование биоресурсов в АПК горной и предгорной зон (№ гос. регистрации 01.2.007 08211).

Апробация и реализация результатов исследований. Основные научные положения диссертации доложены и обсуждены на Международных конференциях (Владикавказ, 2003, 2006-2008, 2010-2013; Великие Луки, 2010; Махачкала, 2010, 2012; Краснодар, 2010; Ставрополь, 2010, 2011; Пенза, 2010; Саратов, 2010, 2012; Владивосток, 2010; Троицк, 2011; Курган, 2011; Беларусь, г.Горки, 2011; Тамбов, 2012; Чебоксары, 2012; Нальчик, 2012; Болгария, г.София, 2011; Польша, г.Пшемысль, 2011; Чехия, г.Прага, 2012; Великобритания, г.Лондон, 2012; США, Флорида, г.Тайтусвилл, 2012); Всероссийских конференциях (Владикавказ, 2010; Саратов, 2010; Астрахань, 2010); региональных и других научно-практических конференциях (Владикавказ, 2003-2005, 2008-2012; Магас, 2009); на Всероссийском совете молодых ученных и специалистов аграрных образовательных и научных учреждений (Москва, 2012), на расширенном заседании кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» (Владикавказ, 2013).

По итогам 2008 года автор стал действительным членом «Кадрового резерва - Профессиональная команда страны» с вручением рекомендательного письма. Результаты научных исследований по теме диссертационной работы были представлены на выставке достижений молодых ученых и специалистов РСО-Алания (Владикавказ, 2010); на выставке-семинаре Республиканского государственного унитарного предприятия «Инфоцентр» министерства сельского хозяйства РСО-Алания «Оборудование для производства комбикормов и кормовых добавок» (Владикавказ, 2010); на Дискуссионной площадке при поддержке политической партии «Единая Россия» по формированию «Народного бюджета» на секции: Наука. Молодые ученые. Инновации (Владикавказ, 2011). лактобактерия молочнокислый антагонистический патогенный

Материалы диссертационных исследований вошли в конкурсную научную работу «Практические аспекты использования промышленных микроорганизмов в развитии агропромышленного комплекса», которая удостоена Диплома лауреата премии Главы Республики Северная Осетия-Алания в области науки и техники для молодых ученых и специалистов в 2010 году; в конкурсную работу «Выделение и идентификация технологически перспективных штаммов промышленных видов микроорганизмов с последующим депонированием в ВКПМ и практические аспекты их использования в развитии агропромышленного комплекса», представленную на соискание премии Президента Российской Федерации в области науки и инноваций для молодых ученых за 2010 год; представлены в межгосударственном региональном турнире, организованном Международной Академией Науки и Высшего образования (Великобритания) «Открытое Европейско-Азиатское первенство по научной аналитике» и «Национальное первенство по научной аналитике» в виде доклада, который удостоен Диплома «Sophist» (Лондон, 2012). Получена Благодарность за активное участие в работе VI Форума молодых ученых Северо-Кавказского федерального округа «Наука и образование на Юге России: проблемы, перспективы и вклад в развитие региона» (Нальчик, 2012), а также диплом II степени в номинации «Лучший инновационный проект» на выставке инновационных проектов молодых ученых Северного Кавказа (Нальчик, 2013).

Результаты работы вошли в отчеты по научно-исследовательской работе ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» за 2002-2012 гг. и используются в учебном процессе: при выполнении курсовых и выпускных квалификационных работ, при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» (РСО-Алания), ФГБОУ ВПО «Ингушский ГУ» (республика Ингушетия). Практическое применение пробиотиков реализовано на ОАО птицефабрике «Михайловская» РСО-Алания, птицефабрике «Ингушетия» Республики Ингушетия, ООО Свинокомплексе «Кировский» РСО-Алания, что подтверждается актами внедрения.

Личный вклад автора. Личное участие автора диссертации охватывает выделение, определение видовой принадлежности, изучение важнейших производственно-ценных и антагонистических свойств местных штаммов лактобактерий, создание новых продуктов функционального питания, а также установление эффективности их использования в кормлении животных и птицы. Автором выполнен основной объем исследований, проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в 97 научных работах, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ - 24 работ. В журнале «Известия Горского ГАУ» опубликовано 12 работ, в журнале «Птицеводство» - 4 работы, в журнале «Молочная промышленность» - 3 работы, в журналах «Аграрная наука» и «Устойчивое развитие горных территорий» - по 2 работы, в журнале «Ветеринария» - 1 работа.

Получен 1 патент РФ №2480017 «Способ производства сметаны «Лакомка» и 2 положительных решения о выдаче патентов на изобретение.

Основные направления, выносимые на защиту:

Ш выделение и селекция биологически активных производственно-ценных штаммов лактобактерий из различных природных субстратов;

Ш идентификация штаммов молочнокислых бактерий селекции Горского ГАУ;

Ш технологические свойства выделенных штаммов лактобактерий;

Ш антагонистические свойства молочнокислых бактерий;

Ш биотехнология новых продуктов функционального назначения на основе местных штаммов молочнокислых микроорганизмов;

Ш результаты использования пробиотиков в кормлении свиней:

- динамика живой массы и приростов подопытных животных;

- морфологические и биохимические показатели крови;

- переваримость и использование питательных веществ рациона;

- экономическая эффективность использования пробиотических добавок при выращивании поросят;

Ш результаты использования пробиотиков при выращивании цыплят:

- динамика живой массы и приростов подопытной птицы;

- сохранность поголовья цыплят-бройлеров;

- морфологические и биохимические показатели крови;

- переваримость и использование питательных веществ рациона;

- химический и аминокислотный состав мяса;

- микрофлора желудочно-кишечного тракта цыплят;

- экономическая эффективность использования пробиотических добавок при выращивании цыплят-бройлеров.

Ш оценка цитогенетических эффектов молочнокислых бактерий в тест-системе Drosophila melanogaster.

1. Материал и методика исследований

Экспериментальная часть работы выполнена в 2001-2012 гг. Научно-хозяйственные опыты проводились в НИИ биотехнологии ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ», на экспериментальной базе ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» и на государственном птицеводческом предприятии «Михайловское» РСО-Алания.

Материалом для выделения чистых культур молочнокислых микроорганизмов послужили 40 проб, отобранных из различных природных субстратов (22 пробы от растений, 18 проб из фекалий: 7 от поросят, 6 от телят и 5 от овец).

Питательной средой для выделения чистых культур лактобактерий послужило стерильное молоко 0,5% жирности, разлитое в пробирки с ватно-марлевыми пробками по 10 мл.

Для выделения молочнокислых микроорганизмов пробы от растений измельчали и растирали в стерильных фарфоровых ступках, после чего делали посев в стерильное обезжиренное молоко. Образцы содержимого толстого отдела кишечника молодняка животных отбирали в стерильные стеклянные бюксы. Дальнейшая работа осуществлялась так же, как и с пробами, взятыми от растений.

Перевивки осуществляли ежедневно, пока культура не сквашивала молоко с получением ровного плотного сгустка без разрывов и пузырьков газа. Из каждого образца производили посев в 6 пробирок с молоком, из которых 3 пробирки инкубировали в термостате при температуре 30°С, а 3 пробирки - при температуре 37°С.

Окончательное выделение чистых культур лактобактерий осуществляли путем рассева молочного сгустка бактериологической петлей на агаризованное гидролизованное молоко в чашках Петри, с целью получения изолированных колоний, которые отсевались на косой агар.

Направления исследований по теме диссертации приведены на рисунке 1.

Рисунок 1. Направления исследований по теме диссертации

С целью оценки цитогенетических эффектов молочнокислых бактерий методом учета доминантно-летальных мутаций в тест-системе Drosophila melanogaster проведена серия опытов (таблица 1).

Таблица 1. Схема проведения экспериментов

Группы	Способ воздействия
Контрольная	5% раствор сахарозы
1 опытная	5% р-р сахарозы + р-р Cd2+ 1•10-6 М
2 опытная	5% р-р сахарозы + 10% Lbm.acidophilum ВКПМ В-842
3 опытная	5% р-р сахарозы + 10% Ent.durans ВКПМ В-8731
4 опытная	5% р-р сахарозы + 10% L.casei ВКПМ В-8730
5 опытная	5% р-р сахарозы+р-р Cd2+ 1•10-6 М+10% Lbm.acidophilum ВКПМ В-842
6 опытная	5% р-р сахарозы + р-р Cd2+ 1•10-6 М + 10% Ent. durans ВКПМ В-8731
7 опытная	5% р-р сахарозы + р-р Cd2+ 1•10-6 М + 10% L.casei ВКПМ В-8730

В эксперименте были использованы девственные самцы Dr. melanogaster, из которых сформировали 8 групп аналогов, по 100 особей в каждой (50+:50>).

Для установления эффективности использования молочнокислых микроорганизмов местной селекции в кормлении животных и птицы проведено 7 научно-хозяйственных опытов, с использованием 13 штаммов микроорганизмов: Enterococcus durans ВКПМ В-8731, Enterococcus durans ВКПМ-В 10093, Enterococcus hirae ВКПМ B-10088, Enterococcus hirae ВКПМ В-10090, Enterococcus hirae ВКПМ-В 10091, Streptococcus thermophilus ВКПМ В-10089, Lactococcus casei ВКПМ В-8730, Lactobacillus paracasei ВКПМ В-10092, Lactobacterium gallinarum ВКПМ В-10131, Lactobacterium gallinarum ВКПМ В-10132, Lactobacterium gallinarum ВКПМ В-10133, Lactobacterium gallinarum ВКПМ В-10134 и Sacharomyces unisporis Y-3416, идентификация которых подтверждена Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика (ВКПМ).

На основе отобранных культур микроорганизмов разработаны технологии получения кисломолочных продуктов функционального назначения. Общая схема опытов приведена в таблице 2.

Таблица 2. Схема научно-хозяйственных опытов

№ опыта	Группы	Кол-во голов	Характеристика рациона
Поросята-отъемыши (180 сут.)
1	Контрольная	10	Основной рацион (ОР)+0,5 л обезжиренного молока
	1 опытная	10	ОР+0,5 л молока, сквашенного L.casei ВКМ В-535 и Str.lactis ВКМ В-6
	2 опытная	10	ОР+0,5 л молока, сквашенного L.casei ВКПМ В-8730 и Ent.durans ВКПМ В-8731
2	Контрольная	10	Основной рацион (ОР)+0,5 л обезжиренного молока
	1 опытная	10	ОР+0,5 л молока, сквашенного Lbm.gallinarum ВКПМ В-10133, L.paracasei ВКПМ В-10092, Ent.hirae ВКПМ В-10090
	2 опытная	10	ОР+0,5 л молока, сквашенного Lbm.gallinarum ВКПМ В-10132, Str.thermophilus ВКПМ В-10089, L.paracasei ВКПМ В-10092
3	Контрольная	10	Основной рацион (ОР)+0,5 л обезжиренного молока
	1 опытная	10	ОР+0,5 л молока, сквашенного Lbm.gallinarum ВКПМ В-10131, Ent.hirae ВКПМ-В 10091, Sacharomyces unisporis Y-3416
	2 опытная	10	ОР+0,5 л молока, сквашенного Lbm.gallinarum ВКПМ В-10134, Ent.hirae ВКПМ-В 10088, Ent.durans ВКПМ-В 10093
Цыплята-бройлеры кросса «Русь» (1-56 сут.)
4	Контрольная	100	ОР+5% обезжиренного молока
	1 опытная	100	ОР+5% молока, сквашенного Ent.durans ВКПМ В-8731
	2 опытная	100	ОР+5% молока, сквашенного L.casei ВКПМ В-8730
	3 опытная	100	ОР+5% молока, сквашенного Lbm.acidophilum ВКПМ В-842
	4 опытная	100	OP+5% молока, сквашенного смесью культур
5	Контрольная	100	ОР+10% обезжиренного молока
	1 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного Ent.durans ВКПМ В-8731
	2 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного L.casei ВКПМ В-8730
	3 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного Lbm.acidophilum ВКПМ В-842
	4 опытная	100	OP+10% молока, сквашенного смесью культур
6	Контрольная	100	ОР+15% обезжиренного молока
	1 опытная	100	ОР+15% молока, сквашенного Ent.durans ВКПМ В-8731
	2 опытная	100	ОР+15% молока, сквашенного L.casei ВКПМ В-8730
	3 опытная	100	ОР+15% молока, сквашенного Lbm.acidophilum ВКПМ В-842
	4 опытная	100	OP+15% молока, сквашенного смесью культур
Цыплята-бройлеры кросса «Степняк» (1-56 сут.)
7	Контрольная	100	Основной рацион (ОР)+10% обезжиренного молока
	1 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного Str.thermophilus ВКПМ В-10089
	2 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного L.paracasei ВКПМ В-10090
	3 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного Lbm.gallinarum ВКПМ В-10131
	4 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного Lbm.gallinarum ВКПМ В-10134
	5 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного Lbm.acidophilum ВКПМ В-842
	6 опытная	100	ОР+10% молока, сквашенного смесью местных штаммов лактобактерий

Для поведения работы использовано 90 поросят крупной белой породы, 1500 голов цыплят-бройлеров кросса «Русь» и 700 голов цыплят-бройлеров кросса «Степняк». Все подопытное поголовье находилось в аналогичных условиях кормления и содержания, разница состояла в том, что в рационы животных и птицы опытных групп включали различные дозы и штаммы микроорганизмов.

Основные методы исследований:

1. В молоке, используемом для выделения культур лактобактерий и установления их технологических свойств, определяли следующие показатели: массовая доля сухого вещества - по ГОСТ 3626-73; массовая доля жира - по ГОСТ 5867-90; кислотность - по ГОСТ 3624-92; плотность - по ГОСТ 3625-84; степень чистоты - по ГОСТ 8218-89; наличие фосфатазы - по ГОСТ 3623-73; микробиологические показатели - по ГОСТ 9225-84.

2. В сквашенном выделенными и изученными молочнокислыми бактериями молоке и полученных продуктах функционального питания определяли: пищевую ценность - расчетным методом; органолептические показатели - по ГОСТ Р 51331-99; кислотность - по ГОСТ 3624-92; массовая доля жира - по ГОСТ 5867-90; массовая доля белка - по ГОСТ 23327-98; массовая доля сухого вещества - по ГОСТ 3626-73; микробное число - методом серийных разведений и по ГОСТ 10444.11; антибиотическую активность - методом диффузии в агар.

3. Видовую принадлежность выделенных местных штаммов лактобактерий определяли по методике Л.А.Банниковой (1975). Изучены показатели: морфологические свойства; культуральные свойства; физиолого-биохимические свойства: окраска по Граму; рост в молоке при различных температурах; устойчивость молочнокислых бактерий к поваренной соли; устойчивость молочнокислых бактерий к желчи; рост в мясо-пептонном бульоне; образование культурами NH3 из аргинина; устойчивость молочнокислых палочек к фенолу; терморезистентность молочнокислых бактерий; устойчивость культур к метиленовому голубому; активность кислотообразования; предел кислотообразования; способность сбраживать углеводы и спирты.

4. Оценка цитогенетических эффектов молочнокислых бактерий методом учета доминантно-летальных мутаций в тест-системе Drosophila melanogaster - по методике учета доминантных леталей П.Я.Шварцмана (1986).

5. Рост и развитие молодняка свиней исследовались на основе изучения их возрастной динамики, изменений живой массы и абсолютного прироста живой массы, взятия основных промеров и расчета индексов телосложения.

6. Учет сохранности подопытного поголовья птицы и причины ее падежа вели ежедневно; с целью изучения скорости роста проводились индивидуальные контрольные взвешивания птицы раз в неделю, оперяемость цыплят-бройлеров определяли визуально.

7. Морфологические и биохимические показатели крови подопытных животных и птицы исследовали с помощью гематологического автоматического анализатора крови PCE-90Vet, а также общепринятыми методами (А.М. Смирнов и Г.Л. Дугинин и др., 1978): гемоглобин - по методу Сали; количество эритроцитов и лейкоцитов, подсчитано в счетной камере Горяева; общий белок - рефрактометрическим методом; общий кальций - по Вичеву и Каракашову; неорганический фосфор - по Аммону и Гинсбергу в модификации С.А. Ивановского; кислотная емкость - по Неводову; каротин - по В.Ф. Коромыслову и Л.А. Кудрявцевой.

8. Изучение кормовой ценности молока, сквашенного лактобактериями, образцов корма, мяса, кала: первоначальная влажность - высушиванием в сушильном шкафу при температуре 60-65єС по ГОСТ 1396.3-92 (27548.98); гигроскопическая влажность - высушиванием в сушильном шкафу при температуре 100-105єС по ГОСТ 1396.3-92 (27548-97); «сырой» протеин - по Къельдалю, ГОСТ 1396.4 (28074-89); «сырой» жир - в аппарате Сокслета по ГОСТ 13496.15; «сырая» клетчатка - по Геннебергу и Штоману (модификация ЦИНАО) по ГОСТ 1396.2-91; «сырая» зола - методом сухого озоления (температура 400-450єС) по ГОСТ 26226-95; БЭВ - расчетным путем; кальций и фосфор - объемным методом; железо по ГОСТ 27998-88; медь по ГОСТ 27995-88; цинк по ГОСТ 27996-88.

9. Для определения переваримости и использования питательных веществ рациона провели обменный опыт по методике А.И.Фомина и А.Я. Аврутиной (1967). Усвояемость азота корма определяли по методу М.И. Дьякова (1959).

10. Контрольный убой подопытных цыплят-бройлеров проводили по ГОСТ 18292-85.

11. Анатомическую разделку тушек цыплят-бройлеров проводили в конце опыта, по методике ВНИТИП (1983).

12. Массу полупотрошенной, потрошенной тушек и убойный выход определяли по ГОСТ 25391-82.

13. Химический анализ средних образцов грудных и бедренных мышц цыплят-бройлеров проводили по методике П.Т. Лебедева и А.Г. Усочева (1976).

14. Количественный подсчет бактерий микрофлоры кишечника птицы проводили по методике Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской (1977).

15. Экономическая эффективность подсчитана по общепринятой методике на основе учета разницы между затратами и стоимостью полученной продукции.

Полученные экспериментальные данные обработаны статистически (Е.К. Меркурьева, 1970). Достоверность различий между группами определяли с использованием t критерия Стьюдента.

3. Результаты собственных исследований

Результаты селекции и идентификации местных штаммов лактобактерий.

Каждый новый штамм микроорганизмов, выделенный из природных или других источников, должен быть охарактеризован для получения полного набора данных о свойствах чистой культуры данного микроорганизма. Полученные данные могут быть использованы для составления паспорта перспективных в промышленном использовании штаммов, а также для их идентификации. Цель идентификации - установить таксономическое положение исследуемого штамма на основании сравнения его свойств с изученными и принятыми (официально зарегистрированными) видами. Поэтому, результатом идентификации обычно является отождествление исследуемого микроорганизма с каким-нибудь видом или отнесение его к определенному роду (Н.С.Егоров, 1995).

Биологическая ценность молочных продуктов в большей степени зависят от используемых культур молочнокислых микроорганизмов, правильного выбора их комбинаций для составления заквасочной микрофлоры, а также возможных способов их применения в производстве продуктов функционального питания и пробиотических добавок.

Лактобактерии, обитающие в различных природных субстратах, не занимают доминирующего положения среди различных бактерий. Чаще над ними превалируют следующие микроорганизмы: грамотрицательные палочковидные формы, плесневые грибы, дрожжи и др. В связи с этим, для получения чистых культур молочнокислых бактерий необходимо использовать такие среды, которые способны обеспечить их питательные потребности.

С точки зрения потребности в различных питательных веществах, среди различных групп микроорганизмов, лактобактерии относятся к наиболее сложным организмам, которые характеризуются высокой требовательностью к компонентам (углеводы, азотистые и минеральные вещества, витамины), применяемых для их выделения и исследования, питательных сред. Следовательно, для выделения чистых культур молочнокислых бактерий в качестве питательной среды мы брали молоко стерильное 0,5% жирности, т.к. оно содержит все вышеперечисленные питательные вещества и по сравнению с молоком высокой жирности является более благоприятной средой для размножения лактобактерий.

Выделение чистых культур молочнокислых микроорганизмов из разных природных субстратов производили общепринятым методом.

Путем проведения многократных ежедневных пассажей мы достигли чистоты 40 культур молочнокислых микроорганизмов из 25 природных источников (22 пробы от растений, 18 проб из фекалий поросят, телят и овец), из которых в процессе предварительных исследований мы отобрали 12 штаммов с наиболее стабильными технологическими свойствами: по 2 штамма из фекалий поросят, телят, овец и 6 штаммов, выделенных из образцов от растений (батат, кабачок, огурец, гречиха сахалинская, крапива и ромашка).

Для предварительного испытания выделенных чистых культур местных штаммов молочнокислых бактерий мы проводили следующие технологические операции: термическая обработка молока, проверка молока на стерильность, заквашивание молока отобранными культурами лактобактерий, сквашивание молока в термостате, анализ сквашенного молока.

Морфологические и культуральные свойства.

При решении вопроса о последующих этапах окончательной идентификации микроорганизмов очень важна первоначальная оценка морфологии колоний бактерий. С целью изучения морфологических и тинкториальных свойств молочнокислых микроорганизмов мы определили такие показатели как: форма и расположение клеток, наличие спор, окраска по Граму, подвижность, размеры (таблица 3).

В связи с тем, что микроскопия является основным методом изучения морфологии бактерий, нами готовились препараты, с содержанием живых и убитых клеток молочнокислых микроорганизмов.

Таблица 3. Морфологические свойства местных штаммов лактобактерий

№ штамма	Источник выделения	Морфологические свойства
		форма, расположение, споры	окраска по Граму	подвижность
Р1	Крапива	кокки, без спор	+	+
Р6	Ромашка	стрептококк, без спор	+	+
Р10	Огурцы	длинные цепочки стрептококка, без спор	+	-
Р20	Кабачок	короткие цепочки стрептококка, без спор	+	+
Р21	Батат	кокки, без спор	+	+
Р22	Гречиха	кокки, без спор	+	+
С2	Фекалии поросят	короткие цепочки палочек, без спор	+	-
С5	Фекалии поросят	длинные цепочки палочек, без спор	+	+
К2	Фекалии телят	кокки, без спор	+	-
К5	Фекалии телят	диплококк, без спор	+	+
О1	Фекалии овец	кокки, без спор	+	-
О5	Фекалии овец	кокки, без спор	+	+

Микроскопирование мазков из культур испытуемых молочнокислых микроорганизмов показало, что штаммы С2 и С5 относятся к бактериям палочковидной формы, а остальные - имеют шарообразную (кокковидную) форму клеток. Ни у одного из исследуемых штаммов наличие спор не было обнаружено. Все они грамположительны, среди них встречаются как неподвижные формы, так и подвижные.

Определение размеров клеток исследуемых культур микроорганизмов проводили по общепринятой методике с использованием окулярной линейки.

Проведенными исследованиями установлено, что размер молочнокислых палочек находился в пределах 0,9-1,0Ч2,6-2,8 мкм, а диаметр клеток молочнокислых стрептококков - 0,6-0,9 мкм.

Культуральные свойства постоянны для каждого вида бактерий и являются важными диагностическими признаками, которые определяются характером их роста на питательных средах. Питательной средой для изучения культуральных свойств местных штаммов лактобактерий послужило агаризованное молоко.

Нами установлено, что у исследуемых культур местных штаммов лактобактерий размер колоний точечный, реже мелкий (до 1-2 мм), профиль выпуклый, за исключением штамма С2 (профиль кратерообразный), форма округлая, консистенция мягкая, структура мелкозернистая (у штаммов Р1 и С2 - струйчатая), цвет белый.

В результате изучения комплекса биологических и технологических свойств нами отобраны две пробиотические культуры с высоким и стабильным биологическим потенциалом: штамм Р10 и C5, что послужило предпосылкой для их более глубокого изучения и испытания на животных и птице.

Физиолого-биохимические исследования являются одним из методов идентификации молочнокислых микроорганизмов. Так, отличительные признаки микроорганизмов, используемые в таксономии можно определить по составу среды и условиям культивирования. Изучение физиолого-биохимических свойств наиболее существенно характеризует производственную ценность выделенных культур молочнокислых бактерий (таблица 4).

Таблица 4. Идентификация молочнокислых стрептококков по физиолого-биохимическим свойствам

Показатели	Штамм
	Р1	Р6	Р10	Р20	Р21	Р22	К2	К5	О1	О5
Окраска по Граму	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Рост в молоке при температуре: 40єC 45єC	+ +	+ -	+ +	+ -	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +
Рост в мясопептонном бульоне, при рН 9,2 9,6	+ -	- -	- -	+ -	- -	+ -	+ -	- -	- -	- -
Рост в гидролизованном молоке, содержащем NaCI 2 4 6,5	+ + -	+ - -	+ + +	+ + -	+ - -	+ + -	+ + -	+ + -	+ - -	+ - -
Рост в гидролизованном молоке, содержащем желчь, % 20 30 40	+ + +	+ - -	+ + -	+ - -	+ + +	+ + -	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +
Рост в молоке, содержащем метиленовый голубой, % 0,01 0,1	+ +	- -	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +
Образование NH3 из аргинина	+	-	-	+	-	+	+	-	-	-
Нагревание в течение 30 мин при температуре, єC 55 60	+ +	+ -	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +
Активность кислотообразования, ч	6	6	4	7	5	10	11	10	14	12
Предел кислотообразования, є Т	85,9	72,4	112,1	80,8	88,7	93,7	84,6	200,7	76,1	82,7
Сбраживание углеводов и спиртов глюкоза галактоза лактоза сахароза мальтоза маннит арабиноза ксилоза раффиноза сорбит глицерин декстрин крахмал	+ + + - + - - - - - - + -	+ + + + + - - - - - - - -	+ + + + + - - - - - - + -	+ + + - - - + - - - - - -	+ + + - + - - - - - - - -	+ + + - + - - - - - - + -	+ + + - + - - - - - - + -	+ + + - + - - - - - - - -	+ + + + + + - - - - - - -	+ + + - + + - - - - - - -

Таблица 5. Идентификация молочнокислых палочек по физиолого-биохимическим свойствам

Показатели	Штамм
	С2	С5
Окраска по Граму	+	+
Рост в молоке при температуре: 15єC 45єC 48єC	- + -	+ + -
Рост в гидролизованном молоке, содержащем NaCI 2 4 6	+ - -	+ - -
Рост в гидролизованном молоке, содержащем желчь, % 20 40	+ -	+ -
Рост в мясопептонном бульоне, при рН 8,3	+	+
Образование NH3 из аргинина	-	-
Рост в молоке с 0,4% фенола	+	+
Нагревание при температуре, єC 60єC в течение 90 мин 65єC в течение 30 мин	+ -	+ +
Активность кислотообразования, ч	14	9
Предел кислотообразования, є Т	318,7	235,0
Сбраживание углеводов и спиртов арабиноза глюкоза лактоза сахароза мальтоза раффиноза маннит	- + + + + - -	- + + - + - +

При определении видовой принадлежности на основании данных физиолого-биохимических исследований штаммы Р1, Р22 и К2 нами идентифицированы как Streptococcus lactis, Р6 и Р20 - как Streptococcus paracitrovorus и Streptococcus acetoinicus, Р10 отнесен к Enterococcus durans, Р21, К5, О1 и О5 - к Streptococcus cremoris, С2 - к Lactobacillus acidophilus, а штамм С5 - к Lactococcus casei.

Активность кислотообразования. Штаммы молочнокислых микроорганизмов, обладающие высокой активностью кислотообразования и повышенной биохимической активностью, способствуют улучшению качества кисломолочных продуктов, повышению интенсификации процесса сквашивания молока и ускорению созревания, повышая тем самым производительность труда за единицу времени.

Проведенные исследования показали, что штамм Ent.durans сквашивает молоко в течение 4 часов, а штамм L.casei - в течение 9 часов.

Предельная кислотность. Определение предельной кислотности в сквашенном молоке имеет не менее важное технологическое значение. От этого показателя зависит срок хранения готового продукта, частота перевивок и как следствие качество кисломолочного продукта.

При сквашивании молока культурой Ent.durans предельная кислотность достигает 112,1°Т через 4 дня, а для культуры L.casei данный показатель равен 235,0°Т через 5 дней.

После изучения морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и технологических свойств выделенных молочнокислых микроорганизмов, два наиболее перспективных штамма (Р10 и С5) нами отправлены во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ Генетика для подтверждения идентификации проведением анализа 16S РНК, в результате чего видовая принадлежность вышеуказанных штаммов была подтверждена.

Штаммы депонированы под следующими коллекционными номерами: Enterococcus durans - ВКПМ В-8731 и Lactococcus casei - ВКПМ В-8730.

Микробиологические показатели молока, сквашенного разными штаммами лактобактерий.

Количество микроорганизмов в 1 мл сквашенного молока.

Одним из основных показателей качества и положительного воздействия на организм человека продуктов функционального питания является высокое содержание в них живых клеток молочнокислых бактерий.

Установлено, что в образцах молока, сквашенного штаммами молочнокислых бактерий L.casei и Ent.durans, микробное число является высоким и составляет 109 и 1010 клеток. Очевидно, что столь высокая популяция живых клеток молочнокислых микроорганизмов в сквашенном молоке способна осуществлять выраженное антагонистическое воздействие на нежелательную микрофлору желудочно-кишечного тракта.

Антагонизм штаммов лактобактерий селекции НИИ биотехнологии Горского ГАУ к патогенным и условно-патогенным бактериям.

Антагонистическая активность молочнокислых бактерий является одним из наиболее значимых микробиологических показателей, по результатам которого можно утверждать о лечебно-профилактических свойствах определенного штамма. У каждого отдельного штамма показатель антагонистической активности и способность синтезировать антибиотические вещества варьирует, что подтверждает необходимость изучения данного показателя.

О высокой степени антагонизма лактобактерий в отношении вредной микрофлоры свидетельствует диаметр зоны стерильности. Результаты исследований антагонистической активности 13 местных штаммов молочнокислых бактерий, приведены в таблице 6.

Таблица 6. Антагонистическая активность лактобактерий к тест-микробам (зона стерильности, мм) n=10

Штамм лактобактерий	Тест-микроб
	Escherihia coli	Staphylococcus aureus	Staphilococcus saprophiticus	Staphilococcus epidermidis	Proteus vulgaris	Moraxella catarrhalis	Pseudomonas aeruginosa	Klebsiella pneumoniae	Bacillus mesentericus
Ent. durans ВКПМ В-8731	24	26	15	20	19	22	23	14	21
Ent. durans ВКПМ В-10093	26	21	14	14	20	14	21	13	15
Ent. hirae ВКПМ B-9069	26	24	14	16	18	15	23	14	19
Ent. hirae ВКПМ B-10088	26	24	15	15	16	15	17	13	18
Ent. hirae ВКПМ В-10090	20	23	12	15	20	18	16	13	14
Ent. hirae ВКПМ В-10091	25	25	13	16	13	17	13	13	15
Str. thermophilus ВКПМ В-10089	17	23	16	18	17	15	25	13	25
L. casei ВКПМ В-8730	30	29	22	26	23	24	19	18	28
L. paracasei ВКПМ В-10092	26	22	18	12	15	13	12	13	14
Lbm. gallinarum ВКПМ В-10131	25	35	24	24	29	23	22	18	31
Lbm. gallinarum ВКПМ В-10132	28	23	25	28	29	32	26	14	29
Lbm. gallinarum ВКПМ В-10133	25	21	16	24	17	28	21	15	28
Lbm. gallinarum ВКПМ В-10134	34	26	30	21	28	24	30	16	30

Анализ данных таблицы 6 свидетельствует о том, что исследуемые штаммы молочнокислых микроорганизмов обладают неодинаковой способностью ингибировать рост патогенной и условно-патогенной микрофлоры, и их антагонистическая активность меняется от штамма к штамму, что необходимо учитывать при подборе чистых культур для получения пробиотических препаратов для профилактики и лечения тех или иных возбудителей болезней.

Так, зона стерильности по отношению к Escherichia coli составила от 17 до 34 мм, Staphylococcus aureus - от 21 до 35 мм, Staphylococcus saprophiticus - от 12 до 30 мм, Staphylococcus epidermidis - от 12 до 28 мм, Proteus vulgaris - от 13 до 29 мм, Moraxella catarrhalis - от 13 до 32 мм, Pseudomonas aeruginosa - от 12 до 30 мм, Klebsiella pneumoniae - от 13 до 18 мм, Bacillus mesentericus - от 14 до 31 мм.

Исследования показали, что наибольшую антагонистическую активность в отношении большинства представителей патогенной и условно-патогенной микрофлоры проявляют штаммы Lbm.gallinarum ВКПМ В-10131, Lbm.gallinarum ВКПМ В-10132, Lbm.gallinarum ВКПМ В-10134 и L.casei ВКПМ В-8730.

Таким образом, полученные результаты позволяют считать возможным и целесообразным использование чистых культур молочнокислых микроорганизмов селекции Горского ГАУ для приготовления бактериальных заквасок, пробиотических препаратов и функциональных продуктов питания.

Разработка технологии новых кисломолочных продуктов на основе штаммов лактобактерий, депонированных в ВКПМ.

Загрязненность окружающей среды, широкое применение антибиотиков и химических препаратов, стрессы и другие неблагоприятные факторы приводят к нарушениям в составе нормальной микрофлоры кишечника, процессов пищеварения и обмена веществ, что снижает иммунную активность организма человека и способствует росту заболеваемости. В этой связи, в последние годы актуальными являются вопросы, связанные расширение ассортимента продуктов функционального назначения с использованием новых видов микроорганизмов.

В условиях НИИ биотехнологии Горского ГАУ нами разработаны технологии получения кисломолочных продуктов функционального питания на основе изученных чистых культур молочнокислых микроорганизмов и их ассоциаций.

Сметана «Лакомка» (патент РФ № 2480017). Для приготовления сметаны использовали штаммы молочнокислых микроорганизмов Ent.durans ВКПМ В-8731, Ent.hirae ВКПМ B-9069 и Str.thermophilus ВКПМ В-10089. Сметана обладает выраженным ароматом, с приятным вкусом, консистенция густая, однородная, цвет белый. Массовая доля жира составила 20%, массовая доля белка - 2,5%, титруемая кислотность - 70єТ. Продукт обладает антагонистической активностью по отношению к Staph.аureus (25 мм) и к E.coli (23 мм), при КОЕ в 1 мл готового продукта 1010 клеток, что свидетельствует о его лечебно-профилактических свойствах. Таким образом, сметану «Лакомка» можно рекомендовать для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Простокваша из пахты «Горная». При производстве простокваши из пахты использовали штаммов молочнокислых бактерий Ent.hirae ВКПМ В-9069, Ent.durans ВКПМ В-8731 и Str.thermophilus ВКПМ В-10089. Установлено, что массовая доля сухих веществ в готовом продукте составила 9,5%, жира - 0,5%, белка - 3,2%, углеводов - 4,7%. Количество микроорганизмов в 1 мл продукта - 1010 клеток. Энергетическая ценность - 37 ккал. Основная ценность этого продукта заключается в высокой биологической ценности состава и в низкой калорийности. Благодаря наличию в своем составе живых пробиотических лактобактерий, холина, лецитина, ненасыщенных жирных кислот, она помогает в лечении хронических и острых гастритов, гепатитов, холециститов, панкреатитов, заболеваний нервной системы, почек, желудочно-кишечного тракта, показана при ожирении, рекомендована для всех возрастов, а особенно для детей и пожилых.

Кисломолочный продукт функционального питания «Селен+». Для производства кисломолочного продукта «Селен+» мы использовали штаммы Ent.durans ВКПМ В-8731, Ent. hirae ВКПМ-В 10091, Str. thermophilus ВКПМ В-10089. Продукт представляет собой белую однородную массу сметанообразной консистенции, вкус и аромат чистые, кисломолочные. Кислотность продукта составила 80?Т, массовая доля жира - 0,5%, белка - 2,8%, селексена - 0,025%, калорийность - 35 ккал. Продукт обладает высокой антагонистической активностью по отношению к Staph.аureus (26 мм) и E.coli (25 мм) при КОЕ/см3 - 1010. Наличие в продукте селексена направлено на улучшение функционального состояния сердечно-сосудистой системы, нормализацию холестеринового обмена, повышение функциональной активности антиоксидантной системы организма.

Кисломолочный продукт функционального питания, обогащенный йодом. Для получения кисломолочного продукта с добавлением йода использовали закваску из штаммов лактобактерий Ent.durans ВКПМ В-10093, Ent.hirae ВКПМ В-10090 и Ent.durans ВКПМ В-8731. Полученный продукт имеет молочно-белый цвет; консистенция однородная; вкус и запах - чистый, кисломолочный. Массовая доля сухих веществ в готовом продукте составила 9,2%, жира - 0,5%, белка - 2,9%, добавки «Йод-актив» - 0,05%, кислотность - 85оТ. Антагонистическая активность по отношению к Staph.аureus и E.coli - 26 мм, при КОЕ/см3 - 1010. Энергетическая ценность готового продукта - 35 ккал. Благодаря высокому титру живых молочнокислых бактерий и наличию биологически активной добавки (органическое соединение йода, встроенное в молекулу молочного белка), продукт может использоваться для профилактики и лечения дисбактериоза и других заболеваний желудочно- Кисломолочный продукт функционального питания, обогащенный спирулиной плантекс. В состав закваски при производстве кисломолочного продукта с добавлением спирулины плантекс вошли штаммы лактобактерий Str.thermophilus ВКПМ В-10089, Enterococus hirae ВКПМ В-9069 и Ent.durans ВКПМ В-8731. Массовая доля сухих веществ в готовом продукте составила 11,7%, жира - 0,7%, белка - 4,5%, спирулины плантекс - 0,3%, кислотность - 80оТ. Благодаря наличию в своем составе высокому титру «живых» клеток пробиотических лактобактерий и спирулины, продукт имеет широкий спектр положительного воздействия на организм: подавляет условно-патогенную и патогенную микрофлору; нормализует обмен веществ; улучшается сопротивляемость бактериальным инфекциям; повышает неспецифическую резистентность организма и стимулирует иммунную систему; компенсирует витаминную и минеральную недостаточность; восстанавливает и нормализует очистительные функции печени, способствует выведению из организма токсинов, радионуклидов и шлаков; служит средством профилактики атеросклероза, коронарных заболеваний, сахарного диабета.

Синбиотичесий кисломолочный продукт функционального питания, обогащенный клетчаткой. В производстве кисломолочного продукта, обогащенного клетчаткой. использовались штаммы лактобактерий Str.thermophilus ВКПМ В-10089 и Ent.durans ВКПМ В-8731. В результате проведенных исследований установлено, что массовая доля жира в продукте составила 0,5%, белка - 2,9%, кислотность - 70оТ. Энергетическая ценность составляет 35 ккал. Готовый продукт обладает лечебно-профилактическими свойствами, благодаря содержанию микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) - 0,05% и высокой антагонистической активности по отношению к Staph.аureus (26 мм) и E.coli (24 мм) при КОЕ в 1 мл продукта 1010. В желудочно-кишечном тракте МКЦ образует стабильный коллоидный гель или дисперсию. Ее частицы адсорбируют компоненты продуктов распада и токсины. Прием МКЦ препятствует всасыванию холестерина в кровяное русло, активизирует секретную и двигательную функцию тонкого и толстого кишечника, вызывает чувство насыщения и подавляет аппетит. Микрофлора кишечника перерабатывая клетчатку, синтезирует витамины группы В, витамины РР и К.

Синбиотический кисломолочный продукт функционального питания, обогащенный лактулозой. Данный кисломолочный продукт произведен на основе чистой культуры Lbm.gallinarum ВКПМ В-10131. Кислотность продукта составила до 80°Т, массовая доля жира - 0,5%, белка - 2,6%, лактулозы - 3%, калорийность - 35 ккал., обладает высокой антаг...