Идентификация гена вакуолярного Na+/H+-антипортера ячменя и перспективы его использования для повышения солеустойчивости культурных растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Идентификация гена вакуолярного Na⁺/H⁺-антипортера ячменя и перспективы его использования для повышения солеустойчивости культурных растений

03.01.06. - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Васекина Анастасия Владимировна

Москва 2011

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Засоление почв является одним из неблагоприятных факторов внешней среды, который в настоящее время значительно лимитирует производство сельскохозяйственной продукции в южных регионах и на орошаемых угодьях (FAO 2008). Современная стратегия получения солеустойчивых растений базируется на знании молекулярно-биологических и биохимических механизмов, участвующих в формировании устойчивости. Способность растений выживать в условиях высоких концентраций NaCl связана с имеющимися у них возможностями транспортировки, компартментации, выделения и мобилизации ионов Na⁺ [Apse & Blumwald 2007].

Среди большого набора ионных транспортеров и каналов, опосредующих эти процессы, важная роль принадлежит Na⁺/H⁺-антипортерам плазмалеммы и тонопласта. Эти белки удаляют ионы натрия из цитозоля в апопласт либо компартментируют их в вакуоль в обмен на протоны, используя протонный градиент, генерируемый H⁺- насосами плазмалеммы и тонопласта [Niu et al. 1995]. Имеются данные о том, что сверхэкспрессия генов вакуолярных Na⁺/H⁺- антипортеров приводит к значительному повышению солеустойчивости как растений Arabidopsis thaliana, так и целого ряда культурных растений [Munns & Tester 2008].

Вакуолярные Na⁺/H⁺- антипортеры представлены мультигенным семейством родственных изоформ (NHXs), имеющих сходную двухдоменную структуру, но различающихся, по-видимому, спецификой регуляции экспрессии, транспортной активности и ионной селективности, а также локализацией [Rodriguez-Rosales et al. 2009]. Особенности экспрессии и функции отдельных NHX-изоформ недостаточно исследованы.

Цель данной работы заключалась в идентификации кДНК гена Na⁺/H⁺-антипортера в ячмене, изучении локализации и особенностей транспортной активности продукта гена, в определении взаимосвязи между изменением экспрессии гена при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя, а также в оценке возможности использования гена для повышения солеустойчивости растений.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Определить нуклеотидную последовательность кДНК изоформы Na⁺/H⁺- антипортера в ячмене;

Исследовать внутриклеточную локализацию Na⁺/H⁺-антипортера и локализацию в различных органах и тканях;

Показать транспортную активность данной изоформы и оценить ее вклад в общий Na⁺/H⁺-обмен на тонопласте;

Установить особенности регуляции экспрессии идентифицированной изоформы Na⁺/H⁺-антипортера при солевом стрессе в контрастных по солеустойчивости сортах ячменя;

Экспрессировать полученный ген в модельном растении Arabidopsis thaliana и оценить солеустойчивость трансгенных растений.

Научная новизна. В данной работе была идентифицирована нуклеотидная последовательность, кодирующая новую изоформу вакуолярного Na⁺/H⁺-антипортера ячменя HvNHX2 (ГенБанк, Acc.No. AY247791). Показано, что данная изоформа вносит значительный вклад в общий Na⁺/H⁺-обмен на тонопласте клеток ячменя. Показано, что экспрессия HvNHX2 в условиях солевого стресса характеризуется органо- и сортоспецифичностью и регулируeтся на пост-транскрипционном уровне. Впервые обнаружена взаимосвязь между увеличением количества белка HvNHX2 при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя к засолению. Обоснована возможность использования гена HvNHX2 для получения трансгенных растений, обладающих повышенной устойчивостью к солевому стрессу.

Апробация работы. Копии кДНК идентифицированного нами гена HvNHX2 были переданы в Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина (Алматы, Казахстан) и в Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева (Москва, Россия) для проведения работы по трансформации растений табака (Nicotiana tabacum L.) и картофеля (Solanum tuberosum L.) соответственно. В результате было продемонстрировано значительное повышение солеустойчивости трансгенных растений табака [Низкородова и др. 2009] и картофеля [Баят и др. 2010], несущих ген HvNHX2 вакуолярного Na⁺/H⁺-антипортера ячменя. Полученные данные подтверждают практическую значимость наших результатов, т.к. свидетельствуют о способности гена HvNHX2 улучшать солеустойчивость некоторых видов культурных растений.

2. Объекты и методы исследований

В качестве объекта исследования использовали корни и листья 7-днев-ных проростков ячменя (Hordeum vulgare L.) разных сортов из коллекции Всероссийского института растениеводства имени Н.И. Вавилова: Белогорский (K-22089), QB60.1 (K-30369) - чувствительные к засолению; Эло (K-29006), Эквадор (К-21576) - солеустойчивые; Московский 121 (К-19417) - средней устойчивости.

Выращивание растений. Растения ячменя выращивали в водной культуре в климатической камере Gallenkamp Fitotron 600H (Великобритания) 7 суток при температуре 25⁰С и 12-часовом фотопериоде на 0,2х среде Кнопа. Для выделения мембран и РНК из корней проростков ячменя солевой стресс создавали добавлением в среду 150 мМ NaCl продолжительностью 1 сутки, а из листьев - ступенчатым добавлением NaCl и общей продолжительностью 4 суток.

Выделение плазматических и вакуолярных мембран из растительного материала. Плазматические мембраны очищали распределением микросомальной фракции в двухфазной полимерной системе декстран Т500/ПЭГ 3350 [Widell et al. 1982]. Вакуолярные мембраны очищали флотационным методом [Maeshima & Yoshida 1989].

Тотальную РНК выделяли, используя реактив Тризол («Invitrogen», США), в соответствии с рекомендацией производителя. Синтез кДНК, постановку ПЦР, клонирование генно-инженерных конструкций осуществляли согласно протоколам «Molecular cloning» [Sambrook & Russell 2001]. Реакции 3ґ-RACE-ПЦP проводили по методике фирмы «Clontech» (США) в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия).

Экспрессию гена HvNHX2 измеряли ОТ-ПЦP в реальном времени, используя пару ген-специфичных праймеров, подобранных к фрагменту 3ґ-нетранслируемого участка кДНК HvNHX2. Для нормализации исходного количества кДНК амплифицировали фрагмент гена актина (ГенБанк, Acc. No. AY145451). Определение количества ПЦР-продукта в образцах в режиме реального времени осуществляли при помощи флуоресцентно меченных гибридизационных зондов TaqMan («Синтол», Россия) на приборе АНК-32 (ИАП РАН, Россия).

Плазмидную ДНК выделяли, используя набор Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System («Promega», США). Нуклеотидную последовательность определяли на автоматическом секвенаторе AhFexpress II («Amersham Рharmacia Biotech», Великобритания) в группе анализа геномов ВНИИСБ.

Получение рекомбинантного белка, состоявшего из целлюлозо-связы-вающего домена из Anaerocellum thermophilum и С-концевого фрагмента HvNHX2 (57 а.о.), проводили по методике, разработанной в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ. Рекомбинантный белок экспрессировали в клетках E. сoli (штамм М15), выделяли из бактерий и очищали на целлюлозе. Конъюгат белка с целлюлозой использовали для иммунизации кролика.

Вестерн-блоттинг. SDS-электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в мини-камере SE-250 («Hoefer», США). Электрофоретически разделенные полипептиды переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Super^TM («Amersham», Великобритания) на приборе Multiphor II («LКВ», Швеция). Полипептидные полосы визуализировали, используя систему усиления хемилюминесцентного сигнала ECL+, («Amersham», Великобритания).

Na⁺/Н⁺-обменную активность в мембранных везикулах регистрировали по изменению разности поглощения при 492 и 540 нм проникающего рН-чувствительного индикатора акридинового оранжевого [Palmgren 1991]. Оптические измерения проводили на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония).

Локализацию HvNHX2 в клетках корней проростков ячменя определяли путем инкубирования полутонких срезов корня с антителами против HvNHX2 и антикроличьими антителами, конъюгированными с флуорохромом Cy3 («Sigma», США), и последующего анализа срезов с помощью микроскопа Axiovert 200M («Zeiss», Германия).

Ооциты гладкой шпорцевой лягушки (Xenopus laevis L.) подготавливали согласно [Colman 1984] и экспрессировали в них ген HvNHX2 как описано Miller и Zhou (2000). Функциональную активность Na⁺/H⁺-антипортера ячменя в мембранах ооцитов подтверждали путем измерения закисления внешней среды ооцитами согласно методу, описанному ранее [Towle et al. 1991].

Трансгенные растения Arabidopsis thaliana L. получали стандартным методом «floral dip» [Zhang et al. 2006].

3. Результаты и обсуждение

Идентификация кДНК гена вакуолярного Na⁺/H⁺-антипортера ячменя.

В известных аминокислотных последовательностях вакуолярных Na⁺/H⁺-антипортеров из различных растений нами были найдены наиболее консервативные участки и сконструированы вырожденные праймеры для амплификации методом ОТ-ПЦР центрального фрагмента (404 п.н.) Na⁺/H⁺-антипортера Hordeum vulgare. Далее, методом 3'-RACE-ПЦР амплифицировали 3'-фрагмент кДНК (816 п.н.). Используя высокую гомологию полученных фрагментов к ТаNHX пшеницы, методом последовательных ОТ-ПЦР амплифицировали недостающий 5'-фрагмент (981 п.н) кодирующей части кДНК. Суммарная нуклеотидная последовательность кДНК была получена после секвенирования и объединения 5'-, 3'- и центрального фрагментов. кДНК представлена олигонуклеотидом размером 1941 п.н. (без 5'-нетранслируемого участка), имеет одну открытую рамку считывания (стартовый кодон - 1; стоп кодон - 1639; размер нетранслируемого 3'- концевого участка равен 300 п.н.) и кодирует белок из 546 аминокислотных остатков.

Идентифицированная нами нуклеотидная последовательность, названная HvNHX2, занесена в базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) под номером Acc. No. AY247791, белок - Acc. No. AAO91943.

Анализируя профиль гидрофильности и гидрофобности аминокислотной последовательности, компьютерные программы предсказали наличие у HvNHX2 10-12 трансмембранных сегментов на N-конце и гидрофильного С-концевого домена длиной 108 а.о. Профиль гидрофобности HvNHX2, приведенный на рис. 1, совпадает с общими представлениями о структуре катион/протонных антипортеров растений, животных, дрожжей: N-терминальный гидрофобный и С- терминальный гидрофильный домены [Rodriguez-Rosales et al. 2009]. Выбор между возможными положениями HvNHX2 в вакуолярной мембране был сделан нами в пользу цитоплазматической ориентации С-конца, которая подтверждена данными эксперимента по изучению действия антител против HvNHX2 на Na⁺/H⁺-обменную активность везикул тонопласта (см. далее).

В аминокислотной последовательности HvNHX2 обнаружены некоторые функциональные мотивы и сайты посттрансляционной модификации (рис. 1), в частности, консервативный домен 84 IFFIYLLPPI 94, определяющий сайт связывания амилорида - специфичного ингибитора многих Na⁺/H⁺-антипортеров [Counillon et al. 1993].

Рис. 1. Модель укладки аминокислотной последовательности HvNHX2 в вакуолярной мембране клеток ячменя, созданная на основе предсказанного трансмембранного строения HvNHX2 программами TMHMM и TMPRED. IFFIYLLPPI - предсказанный амилорид-связывающий сайт; KKESHP - предсказанный сайт связывания белков 14-3-3; LIGKFLYLFLTSTVLGVAAGLL - «лейциновая молния»; S, T, Y - аминокислотные остатки в сайтах фосфорилирования; N - остаток аспарагина в сайтах N-гликозилирования; С - остатки цистеина, способные сформировать дисульфидные связи.

Далее, в области цитоплазматической петли между Х и ХI трансмембранными сегментами обнаружена последовательность 371 KKESHP 376, характерная для сайтов связывания белков 14-3-3 [Sehnke et al. 2002], что позволяет предположить возможный механизм регуляции HvNHX2 путем фосфорилирования/дефосфорилирования. Подобный механизм с участием белков 14-3-3 показан в активации Na⁺/H⁺-антипортера млекопитающих [Lehoux et al. 2001]. В VII-м трансмембранном сегменте имеется мотив «лейциновая молния», посредством которого возможно образование димеров белковых молекул [Dang et al. 1989]. Доказано, что Na⁺/H⁺-антипортер Escherichia coli NhaA функционирует в мембране в виде гомодимера [Gerchman et al. 2001, Hilger et al. 2007].

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей HvNHX2 и других NHX-изоформ ячменя: HvNHX1 (Acc. No. BAC56698), HvNHX3 (Acc. No. ABD62853), HvNHX4 (Acc. No. ABC42029). Трансмембранные спирали обозначены римскими цифрами.

Как видно из выравнивания аминокислотных последовательностей HvNHX2 и HvNHX1, 3, 4 (рис. 2), наблюдается значительная консервативность N-концевого домена и вариабельность С-концевого домена этих изоформ. По всей вероятности, гидрофобный N-концевой домен отвечает за ионный обмен [Wiebe et al. 2003], а с С-терминальным доменом связана регуляция транспортной активности и катионной селективности ионных транспортеров [Hamada et al. 2001a, Waditee et al. 2001]. Высокая степень вариабельности С-терминальных доменов изоформ вакуолярного Na⁺/H⁺-антипортера ячменя, по-видимому, указывает на специфическую регуляцию активности этих транспортеров в разных тканях и органах или на разных стадиях онтогенеза.

Аминокислотная последовательность HvNHX2 имеет высокую гомологию с вакуолярными Na⁺/H⁺-антипортерами из других растений (более 70%), меньшую гомологию - с эндосомальными антипортерами человека, животных, грибов и бактерий (около 30%). Парная гомология аминокислотных последовательностей NHX-изоформ ячменя составляет около 70% для HvNHX1, 2 и 3 и около 30% - между HvNHX1-3 и HvNHX4.

На рис. 3 представлен филогенетический анализ последовательности HvNHX2. Согласно филогенетическому дереву, HvNHX2 наиболее близки TaNHX1 и TaNHX3 пшеницы и OsNHX1 и OsNHX2 риса. HvNHX2 также близкородственна изоформам HvNHX1,3. При этом изоформы HvNHX1-3 кластеризуются с AtNHX1-AtNHX4 арабидопсиса, в то время как HvNHX4 входит в кластер с AtNHX5-AtNHX6 и LeNHX2. Известно, что изоформа AtNHX1 способна обменивать протоны на ионы как Na, так и K [Apse et al. 1999], в то время как LeNHX2 с гораздо большей эффективностью обменивает ионы H на ионы K, чем на Na⁺ [Venema et al. 2003].

Таким образом, согласно данным анализа структуры белка и филогенетического анализа последовательности, идентифицированная нами изоформа HvNHX2 принадлежит к группе NHX-белков класса I (вакуолярные) семейства СРА1 катион/протонных антипортеров (по классификации Saier с соавт. (1999)).

Рис. 3. Филогенетическое дерево NHX - родственных Na⁺(К⁺)/H⁺-антипортеров растений: HvNHX1 (Acc. No. BAC56698), HvNHX2 (Acc. No. AAO91943), HvNHX3 (Acc. No. ABD62853), HvNHX4 (Acc. No. ABC42029) - [Hordeum vulgare]; TaNHX1 (Acc. No. AAK76737), TaNHX2 (Acc. No. AAK76738), TaNHX3 (Acc. No. AAP55209) - [Triticum aestivum]; OsNHX1 (Acc. No. AAQ63678), OsNHX2 (Acc. No. AAT93981) - [Oryza sativa]; LeNHX1 (Acc. No. CAC84522), LeNHX2 (Acc. No. CAC83608), LeNHX3 (Acc. No. CAK12754) - [Lycopersicon esculentum] ([Solanum lycopersicum]); ZmNHX1 (Acc. No. AAP20428), ZmNHX2 (Acc. No. AAP20429), ZmNHX3 (Acc. No. AAP20430), ZmNHX4 (Acc. No. AAP20431) - [Zea mays]; AtNHX1 (Acc. No. AAD16946), AtNHX2 (Acc. No. AAM08403), AtNHX3 (Acc. No. AAM08404), AtNHX4 (Acc. No. AAM08405), AtNHX5 (Acc. No. AAM08406 ), AtNHX6 (Acc. No. AAM08407) - [Arabidopsis thaliana]; AgNHX1 (Acc. No. BAB11940) - [Atriplex gmelini]; HbNHX (Acc. No. AAO25547) - [Hordeum brevisubulatum]; ThNHX (Acc. No. ABJ97691) - [Thellungiella halophila].

Исследование внутриклеточной локализации белка HvNHX2.