Влияние факторов космического пространства и орбитального полета на состояние систем "микроорганизмы – конструкционные материалы"

Размещено на http://www.allbest.ru/

20

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Влияние факторов космического пространства и орбитального полета на состояние систем "микроорганизмы - конструкционные материалы"

14.00.32 - Авиационная, космическая и морская медицина

Свистунова Юлия Владимировна

Москва 2007

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Новикова Наталия Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

Мухамедиева Лана Низамовна

доктор медицинских наук,

Воложин Александр Ильич

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится "25" мая 2007 г. В 10⁰⁰ часов на заседании

диссертационного совета К 002.111.01 в ГНЦ РФ - Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, 76А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан " " апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук И.П. Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Осуществление космических полетов с использованием как пилотируемых, так беспилотных средств в обязательном порядке сопровождается выносом за пределы естественных условий биосферы определенной совокупности микроорганизмов, как правило, контаминирующих космическую технику. Известно, что микроорганизмы являются исключительно своеобразной формой организации живой материи, обладающей колоссальным приспособительным потенциалом, изменчивостью и беспрецедентной резистентностью по отношению к самым разнообразным экстремальным факторам. Данные о выживаемости микроорганизмов при температурах в диапазоне +150 С - -240 С, в условиях глубокого вакуума, при воздействии ультрафиолетовой радиации в дозе 50 000 эрг/мм², ионизирующей радиации в дозах до 2-4 Мрад [Кашнер Д., 1981] дают основание считать весьма вероятной возможность сохранения ими жизнеспособности на субстратах искусственного и естественного происхождения в космическом пространстве. Можно предположить, что на внешней стороне беспилотных и пилотируемых космических станций могут присутствовать миллионы микробных клеток, многие из которых находятся в споровых формах, устойчивость которых к неблагоприятным факторам окружающей среды чрезвычайно высока. Однако прямых доказательств, подтверждающих данное предположение, до настоящего времени не было получено.

Что же касается внутренних объемов орбитальных космических станций, то имеющиеся результаты исследований [Новикова Н.Д., 2003] свидетельствуют о возможности в этих условиях не только сохранения, но и развития микрофлоры на конструкционных материалах интерьера, что может сопровождаться биоповреждениями интерьера и оборудования. Очевидно также, что в ответ на воздействие факторов искусственной среды обитания, создаваемой в пилотируемых космических объектах, следует ожидать проявлений фенотипической адаптации микроорганизмов к новым условиям, в основе которой лежит присущая им исключительно высокая пластичность метаболизма (микробная «всеядность») и появления в составе популяций генотипических изменений, выходящих за пределы фона спонтанных мутаций. При этом, рассматривая возможность формирования так называемых микроорганизмов-супертолерантов, необходимо учитывать такую особенность микроорганизмов, как способность к внутривидовой и межвидовой передаче и распространению приобретенных свойств. Указанные предпосылки лежат в основе постановки проблем микроэкологической безопасности космической техники и планетарной защиты.

Исследования, выполненные к настоящему времени как отечественными, так и зарубежными специалистами [Гобен И., Дельку М., Байнов Ж., 1987; Mishra S.K., Pierson D.L., 1992], дают основания считать, что различные космофизические факторы, такие как вакуум, солнечная активность (СА), электромагнитные поля, галактические космические лучи (ГКЛ), могут прямо и опосредованно влиять на микроорганизмы. Следует отметить, что исследования возможности сохранения жизнеспособности различных бактерий и грибов в условиях космического пространства проводились только в кратковременных полетах, причем с применением средств защиты от экстремальных физических факторов [Horneck G., 1993, 1999; Demets R., Schulte W., Baglioni P., 2004].

Следовательно, вопрос о возможности длительного выживания микроорганизмов на внешних оболочках космических аппаратов в течение времени, сопоставимого с длительностью межпланетного перелета по трассе Земля - Марс - Земля, включая оценку изменений их биологических свойств, является чрезвычайно актуальным.

Цель работы.

Изучение возможных границ фенотипической адаптации и генотипических изменений в бактериально-грибных ассоциациях, формирующих типовую микробиоту конструкционных материалов, используемых в космической технике.

Задачи исследования.

- Оценка медицинских и технологических рисков, обусловленных влиянием космофизических факторов на состояние систем «микроорганизмы - конструкционные материалы» в условиях орбитального полета;

- определение принципиальной возможности сохранения жизнеспособности тест-культур микроорганизмов при длительном (сравнимом со сроком полета Земля - Марс -Земля) экспонировании в космическом пространстве систем «микроорганизмы - конструкционные материалы».

- оценка влияния экстремальных факторов космического пространства на морфологические и биологические (биохимические) свойства микроорганизмов.

Научная новизна.

Впервые в мировой практике показана способность микроорганизмов сохранять свою жизнеспособность в ходе более чем полуторагодового экспонирования систем «микроорганизмы - субстраты» как на внешней оболочке Международной космической станции (МКС) в условиях космического пространства, так и в ее внутренней среде.

Практическая и научная значимость работы.

Установлена возможность длительного сохранения жизнеспособности бактерий и микроскопических грибов в условиях пилотируемого космического полета и космического пространства, что имеет неоценимое практическое значение для разработки средств и методов контроля за санитарно-микробиологическим состоянием среды обитания человека и для обоснования мероприятий обеспечения планетарного карантина для будущих межпланетных экспедиций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях среды обитания МКС покоящиеся формы бактерий и микроскопических грибов способны длительное время выживать на конструкционных материалах интерьера и оборудования. При этом факторы пилотируемого космического полета могут оказывать значительное влияние на биологические свойства микроорганизмов.

2. Впервые была установлена принципиальная возможность выживания споровых форм бактерий и микромицетов в условиях космического пространства в течение времени (более 18 месяцев), необходимого для осуществления пилотируемой марсианской экспедиции. Выявлен ряд изменений ультраструктуры как эукариотных, так и прокариотных микроорганизмов, а также их биологических свойств под действием факторов космического полета.

Апробация работы.

Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на 35^th COSPAR Scientific Assembly (Paris, France, 2004), конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященной дню космонавтики (Москва, 2004 г.), IV молодежной конференции (Москва, 2005 г.), 36^th COSPAR Scientific Assembly (Beijing, China, 2006), 57^th International Astronautical Congress (Valencia, Spain, 2006).

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая медицина» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН, 11 апреля 2007 г. (Протокол № 3)

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания методов исследования (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3), обсуждения полученных данных (глава 4), выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материал изложен на 135 страницах, иллюстрирован 23 таблицами и 47 рисунками. Список литературы содержит 132 наименований, из них 71 на русском и 61 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили в рамках научного космического эксперимента «Биориск». Методика проведения каждого цикла эксперимента «Биориск» заключалась в экспонировании систем «микроорганизмы - конструкционные материалы» во внутреннем объеме служебного модуля (СМ) МКС (Биориск-МСВ) в течение 2 лет, а в течение полутора лет - на внешней поверхности СМ (Биориск-МСН). Каждые 6 месяцев при смене экипажей часть экспонированных образцов доставлялась на Землю для лабораторных исследований.

Аппаратура для экспериментов «Биориск-МСВ» и «Биориск-МСН», состояла из 3 контейнеров. Внутри каждого контейнера размещались по 24 пластиковые чашки Петри с образцами конструкционных материалов, зараженных микроорганизмами. Каждая чашка была снабжена микропористым фторлоновым фильтром, пропускающим воздух внутрь чашки и не пропускающим микробные клетки из нее. На каждом контейнере «Биориск-МСВ» и «Биориск-МСН» были установлены дозиметры, позволявшие проводить оценку интегральной дозы облучения.

При снаряжении комплектов «Биориск-МСВ» и «Биориск-МСН» в качестве образцов использованы различные полимерные и металлические материалы, входящие в состав интерьера и оборудования, а также применяемые для внешней обшивки МКС.

В эксперименте «Биориск-МСВ» и «Биориск-МСН» в качестве биологических тест-объектов были использованы представители прокариотных организмов - бактерии видов Bacillus pumilus-25, Bacillus licheniformis-24, Bacillus subtilis-20 из числа ранее выделенных из среды обитания МКС, а также Bacillus licheniformis-ВКМ-1711Д термофильный штамм из Всероссийской коллекции микроорганизмов и Bacillus subtilis 2335/105 - коллекционные штаммы, не подвергавшиеся воздействию факторов космического полета (использовались только в эксперименте «Биориск-МСН») и эукариотных организмов - грибы видов Penicillium expansum, Aspergillus versicolor, Cladosporium cladosporioides, изолированные из внутренней среды МКС в более ранний период ее эксплуатации. Исходная концентрация тест-культур в эксперименте «Биориск-МСВ» составляла для бактерий - 10³ спор и 10⁵ спор в эксперименте «Биориск-МСН», а для грибов в обоих случаях - 10⁴ спор на каждый образец. После возвращения контейнеров на Землю микрофлору с поверхностей образцов отбирали методом отбалтывания в стерильном физиологическом растворе с последующим высевом суспензии на плотные питательные среды. Питательные среды, предназначенные для культивирования бактерий, помещали в термостат на 24-48 часов при 37 ^оС, а для культивирования грибов - на 10-14 суток при 29 ^оС. После истечения указанного времени производили подсчет общего количества бактерий и грибов и отсев колоний для дальнейшей идентификации при помощи автоматизированной системы Vitek фирмы BioMerieux, Франция.

Исследование ультрастраструктуры клеток тест-культур бактерий и грибов

Морфологию клеток бактерий и мицеллиальных грибов изучали с использованием электронного микроскопа на тотальных препаратах, контрастированных 2 %-ным водным раствором уранилацетата. Для получения ультратонких срезов были взяты клетки, выращенные на твердых питательных средах. Клетки бактерий и грибов фиксировали 2,5% глютаровым альдегидом в 0,05М кокадилатном буфере и постфиксировали 1% тетраоксидом осмия в том же буфере, и после обезвоживания заключали в эпоксидные смолы «Эпон 812» и «Аралдит М». Срезы, изготовленные на ультрамикротоме, помещали на медные сеточки, покрытые формваровой пленкой. Для контрастирования использовали реактив Рейнольдса. Тотальные препараты и ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе JEM-100СXII (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Определение ДНК-азной (дезоксирибонуклеазной) и РНК-азной (рибонуклеазной) активности у штаммов бактерий

У всех культур, а также у исходных культур аналогичной видовой принадлежности, производили оценку ДНК-азной и РНК-азной активности согласно принятой методике [Биргер М.О., 1982].

Определение чувствительности тест-культур бактерий к антимикробным препаратам

В данной работе чувствительность штаммов бактерий оценивалась методом диффузии в агар с применением дисков [Биргер М.О., 1982] к следующим антимикробным препаратам: ампициллину (10 мкг/диск), бисептолу (10 мкг/диск), рифампицину (5 мкг/диск), тетрациклину (30 мкг/диск), канамицину (30 мкг/диск), карбенициллину (100 мкг/диск), неомицину (30 мкг/диск), ристомицину (30 мкг/диск).

Исследование способности тест-культур грибов образовывать органические кислоты и щелочи

Культуры плесневых грибов поверхностно выращивали на жидкой питательной среде Чапека с 10 % глюкозы при температуре 23 ^оС. Исследование динамики кислотообразования и щелочеобразования микроскопических грибов проводилось в течение 15 дней с 2-дневным интервалом отбора проб и измерением pH культуральной среды.

По прошествии 15 суток проводили забор культуральной жидкости и далее - определение массовой концентрации органических кислот (щавелевой, лимонной, винной, яблочной, пировиноградной, янтарной, молочной, муравьиной, уксусной, фумаровой) при помощи жидкостного хроматографа «Стайер» с спектрофотометрическим детектором с использованием хроматографической колонки Rezex ROA-Organic Acid (300 х 7,8 мм 8 мкм, Phenomenex, США). В качестве элюента использовали 0,1 % H₃PO₄. Скорость протока составляла 0,5 мл/мин, объем петли - 20 мкл, длина волны - 220 нм).

Исследования по прямому тестированию колонизационной и биоповреждающей активности бактерий

Сущность методики прямого тестирования колонизационной и биоповреждающей активности грибов заключалась в предварительном заражении ими образцов алюминия АМГ-6, используемого в составе оснащения и оборудования МКС, экспонировании зараженных образцов при имитации условий эксплуатации (в рамках допустимых значений, но наиболее приближенных к оптимальным для роста микроорганизмов) с последующей оценкой интенсивности роста штаммов грибов по ГОСТ 9.048-75 (Методы испытаний на микробиологическую устойчивость), а также замером массы образцов материала до и после экспонирования.

Статистическая обработка

Обработку данных проводили с использованием пакета стандартных программ математической статистики, приведенных в руководстве Большова Л.Н. и Смирнова Н.В. (1998). При этом использовался непараметрический дисперсионный анализ. Достоверность различий сравниваемых параметров оценивали, используя критерий Фишера [Ивантер Э.В., Коросов А.В., 2003].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Длительное экспонирование систем «микроорганизмы - конструкционные материалы» в течение 24 месяцев во внутренней среде космической станции и на ее внешней поверхности в течение 18 месяцев позволило оценить степень выживаемости различных культур микроорганизмов, находящихся в споровом состоянии.

Результаты 24-месячного экспонирования систем «микроорганизмы - конструкционные материалы» убедительно доказывают, что наиболее устойчивыми к условиям среды обитания МКС являются представители видов B.licheniformis и B.pumilus, жизнеспособные клетки которых присутствовали на всех материалах, за исключением образцов материала (шнур технический фторлоновый), где штаммы B.pumilus обнаружены не были. Так, если после 24 месяцев экспонирования тест-культур на конструкционных материалах в основном наблюдалось снижение на один порядок количественного уровня жизнеспособных микробных клеток штамма B.pumilus, то концентрация жизнеспособных клеток штамма B.licheniformis оставалась в пределах фоновых значений. Исключением являлся штамм B.subtilis, который был обнаружен только на образцах материала - шнур технический фторлоновый и к концу эксперимента концентрация его колониеобразующих единиц была на один порядок ниже по сравнению с фоновыми значениями (табл. 1).

Из вышесказанного следует, что в процессе экспонирования происходит селективный отбор наиболее устойчивых форм микробов. Так, из числа исследованных видов рода Bacillus наименее приспособленными к выживанию на материалах оказались представители вида B.subtilis, которые к 12-му и к 24-му месяцу эксперимента были обнаружены лишь на одном материале (шнур технический фторлоновый), а доминирующим видом являлись спорообразующие бактерии вида B.licheniformis. В течение всего срока экспонирования они сохранялись на всех 7 образцах исследованных материалов и именно за счет указанных бактерий достигался наиболее высокий уровень обсемененности образцов. Бактерии вида B.pumilus занимали второе место по выживаемости, так как они сохраняли жизнеспособность через 12 и 24 месяца экспонирования практически на всех образцах, за исключением образцов материала - шнур технический фторлоновый.

Представители плесневой флоры - грибы видов Cladosporium cladosporioides, Penicillium expansum, Aspergillus versicolor оказались более чувствительными к неблагоприятным условиям, и в результате в процессе эксперимента наблюдалось постепенное снижение количественного уровня жизнеспособных колониеобразующих единиц указанных грибов.

Доминирующим видом среди микромицетов являлся Penicillium expansum, жизнеспособные клетки которого обнаруживались на большинстве материалов и в большей концентрации по сравнению с видом Aspergillus versicolor. При этом вид Cladosporium cladosporioides не был обнаружен ни в одной пробе.

По результатам проведенных исследований можно сделать заключение, что практически на всех конструкционных материалах сохранялись споры потенциальных биодеструкторов - бактерий рода Bacillus, но, несомненно, главную роль в данном случае сыграли видовые и качественные особенности исследуемых микроорганизмов.

На выживаемость исследуемых микроорганизмов с течением времени, по-видимому, наложил отпечаток один из главных космофизических факторов, присущих космическому полету - возрастание интегральной дозы облучения в процессе экспонирования, что

Таблица 1. Динамика количественных изменений бактериально-грибной ассоциации тест-микроорганизмов, контаминирующей материалы в эксперименте «Биориск-МСВ» (начало экспонирования на МКС - 01.10.2002 г.)

№	Материал	Длительность экспонирования материалов на МКС
		7 мес. (май 2003 г.)	12 мес. (октябрь 2003 г.)	24 мес. (октябрь 2004 г.)
		Вид (КОЕ/16см2)	Вид (КОЕ/16см2)	Вид (КОЕ/16см2)
	Суммарная доза облучения	4 сГр	7,5 сГр	13 сГр
1	Стеклотекстолит фольгированный	B.pumilus -6.0х103 B.licheniformis -3.0х103 B.subtilis -2.0х102	B.pumilus -5.8х103 B.licheniformis -2.0х103	B.pumilus -4.0х102 B.licheniformis -1.4х103
2	Шнур технический фторлоновый	B.licheniformis -3.2х103 B.subtilis -5.0х102 B.pumilus -1.6х101 P.expansum -9.5х102	B.licheniformis -2.2х103 B.subtilis -4.0х102	B.licheniformis -2.0х103 B.subtilis -3.0х102
3	Лента техническая аримидная	B.pumilus -5.0х103 B.licheniformis -3.0х103 B.subtilis -7.5х102 P.expansum -4.0х102	B.pumilus -6.0х102 B.licheniformis -2.8х103	B.pumilus -5.0х102 B.licheniformis -1.2х103
4	Фрагмент кабеля с защитной оболочкой из фторопластовой липкой ленты	B.pumilus -3.1х103 B.licheniformis -5.6х103 A.versicolor -6.6х102 P.expansum -8.7х102	B.pumilus -2.0х103 B.licheniformis -4.0х103 A.versicolor -1.7х102 P.expansum -6.7х102	B.pumilus -1.2х102 B.licheniformis -3.2х103
5	Фрагмент кабеля с защитными оболочками (полиэтилентерефталатная лента и сырая каландированная пленка)	B.pumilus -2.5х103 B.licheniformis -5.0х103 B.subtilis -2.5х102 P.expansum -6.0х102	B.pumilus -2.0х103 B.licheniformis -4.2х103	B.pumilus -1.5х102 B.licheniformis -3.0х103
6	Трубка из поливинилхлоридного пластиката	B.pumilus -4.6х103 B.licheniformis -6.0х103	B.pumilus -2.0х103 B.licheniformis -5.5х103	B.pumilus -1.6х102 B.licheniformis -5.0х103
7	Алюминиевый сплав	B.pumilus -2.3х103 B.licheniformis -4.3х103 P.expansum -3.6х102 B.subtilis -7.0х102	B.pumilus -1.6х103 B.licheniformis -2.0х103 P.expansum -1.7х102	B.pumilus -6.0х102 B.licheniformis -1.4х103

Примечание: исходная концентрация тест-культур составляла для бактерий - 10³ колониеобразуещих единиц (КОЕ), а для грибов - 10⁴ КОЕ на каждый образец.

вероятнее всего могло увеличить число мутаций, в том числе и положительных, направленных на сохранение спор в необычных условиях искусственной среды обитания.

Так, интегральная доза облучения аппаратуры «Биориск-МСВ» в среде обитания МКС за 7-месячный период составляла 4 сГр, за 12-месячный - 7,5 сГр и 24-месячный - 13 сГр.

Известно, что ионизирующее излучение может иметь характер как непрямого воздействия на биологические объекты, определяемого поглощенной дозой, так и прямого - мишенного повреждения. Причем непрямое воздействие преимущественно происходит при малых дозах, в частности, для микроорганизмов при дозах, не превышающих 10 Гр, может проявляться как стимулирующее интенсивность жизненных процессов (т.н. радиационный гормезис).

Результаты исследований систем «микроорганизмы - конструкционные материалы» после доставки трех контейнеров «Биориск-МСН» в лабораторию показали, что бактерии и грибы могут оставаться жизнеспособными даже после полутора лет экспонирования в космическом пространстве.

Отмечено, что все тестируемые бактерии обладали способностью сохраняться в течение 18 месяцев в суровых условиях космического пространства на всех материалах. Содержание жизнеспособных спор варьировало в зависимости от вида микроорганизма. В пределах срока наблюдений в количественной динамике общего содержания бактерий на конструкционных материалах отмечались следующие особенности: на протяжении всего срока экспонирования в условиях космического пространства было зафиксировано заметное снижение уровня жизнеспособных клеток (рис. 1).

Наиболее высокое содержание жизнеспособных спор к концу срока эксперимента было отмечено у бактерий вида Bacillus licheniformis - ВКМ-1711Д. Второе место по процентному содержанию выживших спор принадлежало виду B.subtilis-2335/105. Интересно то, что штамм B.licheniformis-24, имевший высокие значения указанного показателя вплоть до 12-го месяца экспонирования, оказался на третьем месте. И, наконец, минимальный процент выживших спор отмечался у штамма B.pumilus.

При количественной оценке выживших спор микромицетов было установлено, что представители эукариотных микроорганизмов обладали менее выраженной устойчивостью к экстремальным условиям космического пространства. На протяжении 18 месяцев экспонирования было зафиксировано значительное снижение содержания уровня жизнеспособных спор по сравнению с фоновыми значениями.

Рис 1. Динамика выживаемости спор бактерий после экспонирования в условиях космического пространства (в % от фоновых значений)

Так, в течение года жизнеспособными оставались все исследуемые тест-культуры грибов. Через 18 месяцев из тестируемых микромицетов сохранил свою жизнеспособность лишь Penicillium expansum (рис. 2).



Рис 2. Динамика выживаемости спор грибов после экспонирования в условиях космического пространства (в % от фоновых значений)

На основании полученных данных можно сделать однозначный вывод о возможности сохранения в течение полутора лет жизнеспособности спор бактерий и грибов на внешних оболочках космических кораблей и их прорастания в случае попадания в благоприятные условия.

Данное утверждение затрагивает давно наболевшие проблемы экзобиологии и планетарного карантина. В последние годы активно обсуждаются риски заноса земных микроорганизмов на Марс и другие планеты на космических аппаратах. Следовательно, опираясь на наши данные, ответ на вопрос о возможности длительного выживания микроорганизмов на внешних оболочках космических аппаратов и переноса их на другие планеты и с других планет на Землю можно дать положительный.

При сравнительном изучении ультраструктуры клеток вегетативного мицелия у трех штаммов A. versicolor (1 - контрольный «земной штамм» из коллекции ВКМ, который никогда не подвергался воздействию факторов космического полета; 2 - исходный штамм, изолированный с внутренней поверхности Международной космической станции; 3 - опытный штамм, экспонированный в условиях космического пространства в течение 7 месяцев) выявлены некоторые различия, которые касаются структуры клеток вегетативного мицелия. Эти различия касаются степени развития дыхательного аппарата, вакуолярной системы и запасных включений (полифосфаты и гликоген). У опытного штамма A. versicolor 3, побывавшего в условиях космического пространства, наблюдали большее количество митохондрий и вакуолей, что свидетельствует о повышенной активности окислительных и литических процессов в клетках мицелия, при этом основным резервным веществом являлись липидные включения. У контрольных штаммов A. versicolor 1 и A. versicolor 2 соответственно наблюдали в клетках меньше митохондрий и вакуолей, а запасными включениями являлись помимо липидов полифосфаты и гликоген.

Для штаммов вида P. expansum были обнаружены особенности ультраструктуры штамма (P. expansum 3), претерпевшего влияние факторов космического пространства, по сравнению с контрольными штаммами (P. expansum 1, P. expansum 2). В клетках вегетативного мицелия наблюдали утолщение клеточных покровов за счет развития пигментированного защитного слоя экзополисахаридного чехла. Также было отмечено увеличение количества митохондрий и вакуолей в клетках мицелия, что может свидетельствовать о тенденции повышения активности окислительных и литических процессов в мицелии опытных штаммов по сравнению с контрольными штаммами.

Таким образом, основные ключевые позиции в защитной роли двух видов грибов Aspergillus versicolor и Penicillium expansum от неблагоприятного действия «космического пространства» принадлежат:

- покровным структурам, пограничным органеллам грибов,

- хондриоме, отвечающей за энергетические процессы в клетке,

- вакуолярной системе, которая выполняет много функций в клетке грибов: поддержание осмоса, накопление и нейтрализация токсических веществ, регуляция водно-солевого баланса, является резервом запасных низкомолекулярных полифосфатов и другие.

Сравнительные электронно-микроскопические исследования, проведенные в фоновый период и после 7-месячного экспонирования спор микроорганизмов на внешней поверхности орбитальной станции, показали, что у штаммов бактерий рода Bacillus, побывавших в полете, в большинстве случаев наблюдались изменения в ультраструктурной организации клеточной стенки, цитоплазматической мембране, характере деления клеток и частоте встречаемости прикрепления региона ori C.

Наиболее существенные изменения в ультратонкой структуре были выявлены у бактерий вида B.subtilis после экспонирования на внешней оболочке МКС.

Особого внимания заслуживает то, что после 7 месяцев эксперимента у B.subtilis отмечалось нестандартное деление клетки, в частности, появление такого признака как множественность септ, что является косвенным показателем того, что после пребывания в условиях космического пространства происходит нарушение функционирования группы генов, отвечающих за процессы деления клетки. Анализ ультратонких срезов полетных штаммов первого пассажа показал нехарактерное строение бактериальной клеточной стенки по сравнению с контрольным вариантом. На полюсах клеток отмечалось утолщение клеточной стенки. Характерным признаком для большинства клеток являлась поперечная изогнутость клеточной стенки (рис. 3).

 а

б в

Рис 3. Ультраструктура бактерий вида B.subtilis.

Примечание: а - контроль (тест-культура микроорганизма до полета); б - опыт (тест- культура после 7 месяцев экспонирования в космическом пространстве, 1-й пассаж); в - опыт (тест-культура после 7 месяцев экспонирования в космическом пространстве, 3-й пассаж)

Показано, что после 3-го пассажа наблюдалось полное исчезновение деструктивных нарушений, видимо связанное с работой репаративных систем. Подобные, но менее выраженные изменения были обнаружены и у послеполетных штаммов вида B.licheniformis. Интенсивность выявленных ультраструктурных изменений в клетках микроорганизмов коррелировала с количеством пассажей тест-культур.

Таким образом, выявленные на электронно-микроскопическом уровне морфо-физиологические изменения отражают сложный характер влияния многочисленных факторов космического пространства на микроорганизмы, а также в определенной степени объясняют отмеченные нами количественно-качественные изменения на популяционном и функциональном уровнях.

У представителей бактериальной флоры после экспонирования в условиях космического полета на станции и космического пространства были также отмечены весьма интересные биохимические особенности (табл. 2-3).

Известно, что не только в процессе вегетативного роста микробной культуры, но и в споровом состоянии метаболический баланс бактериальной клетки подвергается широким изменениям в пределах нормы реакции данного вида, что обеспечивает оптимальную приспособляемость микроорганизма к меняющимся условиям окружающей среды. Несмотря на заторможенный обмен, спора сохраняет способность воспринимать внешние сигналы, в том числе химические.

Имеются данные о способности покоящихся клеток изменять содержание специфических соединений в ответ на различные стрессы, что свидетельствует о существовании в покоящейся клетке механизмов адаптации, подобных таковым в вегетативных клетках [Терешина В.М. и др., 2004].

Таблица 2. Некоторые отличия биохимической активности, выявленные после 24 месяцев экспонирования в среде обитания МКС

Видовая принадлежность штаммов	Характеристика отличий штаммов
B.licheniformis-24	Повышенная ДНК-азная и РНК-азная активность
B.pumilus-25	Отсутствие различий в ДНК-азной активности с контролем. Повышенная РНК-азная активность
B.subtilis-20	Пониженная ДНК-азная и РНК-азная активность

Для гибкого реагирования на окружение и быстрого переключения метаболических потоков клетка снабжена мощным аппаратом регуляции отдельных биохимических реакций и глобальных физиологических процессов. Поэтому закономерным и предсказуемым событием явилось появление сдвигов в биохимических характеристиках у штаммов бактерий, оказавшихся в условиях неестественной для них среды космической станции, и тем более в условиях агрессивной среды космического пространства.

Таблица 3. Некоторые отличия биохимической активности, выявленные после 7 месяцев экспонирования в условиях космического пространства

Видовая принадлежность штаммов	Характеристика отличий штаммов
B.licheniformis-24	Повышенная ДНК-азная и РНК-азная активность
B.pumilus-25	Отсутствие различий в ДНК-азной активности с контролем. Повышенная РНК-азная активность
B.subtilis-2335/105	Пониженная ДНК-азная и РНК-азная активность
B.licheniformis-ВКМ-1711Д	Отсутствие различий в ДНК-азной активности с контролем. Повышенная РНК-азная активность

космический орбитальный микроорганизм

Характерной особенностью доминирующего вида бактерий B.licheniformis-24 являлась активизация биологической и биохимической активности в процессе экспонирования образцов материалов в среде обитания МКС и в условиях космического пространства. Было установлено, что активность ферментов, характеризующих уровень потенциала патогенности (РНК-азы и ДНК-азы), у бактерий данного вида к концу эксперимента была выше, чем в фоновый период.

Аналогичные особенности наблюдались и у бактерий вида B.pumilus-25 экспонированных в среде обитания МКС, а также на внешней поверхности орбитальной станции и у бактерий вида B.licheniformis-ВКМ-1711Д, экспонированных только в условиях космического пространства.

Существенным отличием, однако, являлось то, что все они сохраняли продукцию фермента ДНК-азы на уровне фоновых величин. ДНК-аза и РНК-аза являются хорошо известными «ферментами агрессии и защиты» у значительного числа облигатно- и условно-патогенных бактерий [Юсупова Д.В. и др., 1973]. На примере шигелл, в частности, было показано, что нарастание у них ДНК-азной и РНК-азной активности было пропорционально стадиям развития инфекционного процесса [Поликарпов Н.А., Викторов А.Н. и др., 1988] и достигало максимума у лиц, переболевших дизентерией. Как следует из полученных результатов, штаммы видов B.licheniformis-24, B.pumilus-25, B.licheniformis-ВКМ-1711Д в основном демонстрировали более высокую РНК-азную и ДНК-азную активность либо ДНК-азную активность, равную фоновым величинам. Такая динамика диагностического признака напоминает описанную [Поликарпов Н.А., Викторов А.Н. и др., 1991] ситуацию формирования возбудителей инфекции (типа «госпитальных штаммов») в коллективах, изолированных в герметично замкнутых помещениях. Комплекс данных, полученных в наших экспериментах, свидетельствует о повышении патогенных и вообще адаптивных свойств данных видов, направленных на выживание, так как функция обеспечивать патогенность бактериальной клетки является далеко не единственной у фермента РНК-азы.

Например, известно, что РНК-аза принимает участие на различных этапах синтеза ДНК и РНК в клетке [Николаев А.Я., 1998], а также -- на уровне регуляции синтеза белка [Laursen B.S. et al., 2005]. Поэтому повышенный синтез РНК-азы может служить косвенным признаком происходящих в клетке репаративных процессов, а также активного синтеза белка.

Что же касается штаммов B.subtilis-20, экспонированных в среде обитания МКС, и штаммов B.subtilis-2335/105, экспонированных на внешней поверхности орбитальной станции, то для них было характерно уменьшение ферментативной активности в отношении продукции как ДНК-азы, так и РНК-азы. Картина их биохимической активности указывает скорее на срыв адаптационного потенциала, по крайней мере, у штаммов, экспонированных в условиях среды обитания МКС, что и объясняет их минимальную способность сохраняться на материалах.

Весьма важным с эпидемиологической точки зрения является показатель устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам. Очевидно, что при возрастании в среде обитания резистентных и полирезистентных к антимикробным веществам штаммов микроорганизмов снижается эффективность санитарно-гигиенических мероприятий и возрастает вероятность возникновения осложнений инфекционной этиологии.

Наблюдение за динамикой изменения устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам после экспонирования в условиях среды обитания МКС и в условиях космического пространства выявило тенденцию усиления этого показателя к 24-му месяцу исследования. Так, из 8 исследованных антимикробных средств у доминирующих видов бактерий (B.licheniformis и B.pumilus) возросла устойчивость к 5 препаратам по сравнению с фоновыми данными.

В качестве примера можно проиллюстрировать устойчивость указанных бактерий к бисептолу (рис. 4). Как видно из представленного рисунка, по мере увеличения сроков экспонирования как у B.licheniformis, так и у B.pumilus снижалась чувствительность к данному антибиотику.

Рис.4. Динамика изменений устойчивости бактерий рода Bacillus к бисептолу Достоверное различие с фоновым значением: *p 0,05; **p 0,01

Примечание: з.п.р.-зона подавления роста

Результаты оценки изменения динамики щелоче- и кислотообразования у исследуемых штаммов грибов до и после экспонирования в условиях среды обитания МКС и космического пространства показали, что все исследуемые штаммы тест-культуры A.versicolor являлись слабыми щелочеобразователями. Опытные штаммы данной тест-культуры менее активно защелачивали среду по сравнению с «исходным» штаммом. Причем, способность к защелачиванию среды незначительно снижалась в зависимости от длительности срока пребывания внутри МКС. В отношении штаммов A.versicolor, экспонированных в условиях космического пространства в течение 6 месяцев, можно отметить, что они обладали самой низкой активностью по защелачиванию среды по сравнению со штаммами, которые подвергались лишь воздействию факторов, присущих среде обитания МКС. Кроме того, было отмечено, что внутри группы штаммов, экспонированных в условиях космического пространства, имело место отчетливое разнообразие активностей в отношении защелачивания среды.

Результаты проведенных исследований по оценке динамики накопления органических кислот свидетельствуют о том, что каждый из исследуемых штаммов тест-культуры P.expansum увеличивал кислотность среды.

Как показали исследования, интенсивность кислотообразования микроорганизмов, экспонированных в среде обитания МКС, зависела от длительности пребывания в условиях космического полета - чем больше срок полета, тем активнее штаммы закисляли среду (рис. 5).



Рис.5 Динамика кислотообразования штаммов тест-культуры Penicillum expansum, экспонированных внутри МКС

Также установлено, что микроорганизмы, находившиеся продолжительное время в среде обитания МКС, обладали большей кислотообразующей способностью по сравнению со штаммами, экспонированными в условия космического пространства.

Результаты, полученные в ходе проведения хроматографических исследований культуральной жидкости исследуемых штаммов P.expansum, позволили сделать ряд заключений: во-первых, микроорганизмы, экспонированные в среде обитания МКС значительно сократили основной спектр продуцируемых кислот, а также включили в свой синтез новую, не входящую в состав кислот «исходного» штамма - молочную кислоту, во-вторых, количественные показатели содержания кислот в культуральной среде вышеупомянутых штаммов значительно превышали фоновый уровень «исходного» штамма (рис.6, 7).

Эти процессы имеют большое значение в аспекте возможности проявления микробиологической деструкции конструкционных материалов, так как биоповреждения полимеров и биокоррозия металлов в значительной степени обусловлены воздействием на материалы таких продуктов продуктов метаболизма грибов, как органические кислоты.

Результаты оценки колонизационной и биоповреждающей активности штаммов грибов Aspergillus versicolor и Penicillium expansum в отношении сплава алюминия Амг-6, относящегося к группе материалов с высокой коррозионной устойчивостью, показали, что штаммы Penicillium expansum после экспонирования в условиях среды обитания МКС и космического пространства характеризовались высокой коррозионной активностью.

Рис. 6. Спектр органических кислот, синтезируемых исходным штаммом тест-культуры P.expansum.	Рис. 7. Спектр органических кислот, синтезируемых штаммом тест-культуры P.expansum, экспонированным в течение 12 месяцев в среде обитания МКС

Установлено, что штамм Penicillium expansum, экспонированный в среде обитания МКС в течение 12 месяцев, обеспечивал достоверную максимальную потерю массы образца металла Амг-6 по сравнению с исходным штаммом. Это объясняется тем, что данный штамм имел самые низкие значения pH культуральной среды по сравнению со всеми остальными штаммами, а также имел в своем многочисленном спектре синтезируемых кислот уксусную кислоту. Согласно результатам исследований, штаммы плесневых грибов Penicillium expansum, экспонированные в условиях среды обитания МКС, провоцировали большие массовые потери металла в отличие от группы штаммов, экспонированных в условиях космического пространства.

Таким образом, данные результаты дают основания считать, что после длительного пребывания тест-культуры Penicillium expansum в условиях среды обитания МКС риск биологического повреждения металлов и преждевременного выхода из строя различных элементов космической техники значительно увеличивается, что является недопустимым при осуществлении длительных космических полетов, в том числе планируемой экспедиции на Марс.

ВЫВОДЫ

1. Споровые формы бактерий и микроскопических грибов могут оставаться жизнеспособными после длительного экспонирования в среде обитания МКС (до двух лет) и в космическом пространстве (до полутора лет).

2. Способность к выживанию во внутренней среде Международной космической станции и в условиях космического пространства у микроорганизмов существенно отличалась: она была наиболее выражена у представителей прокариот - бактерий, а наименее - у представителей эукариот - мицеллиальных грибов.

3. С увеличением срока экспонирования в среде обитания МКС возрастала биоповреждающая активность мицеллиальных грибов, наиболее существенно у Penicillium expansum.

4. Длительное воздействие на тестируемую микробиоту факторов, присущих космическому полету и космическому пространству, сопровождалось усилением кислотообразования у плесневых грибов, и в первую очередь, у пенициллов.

5. Условия космического полета и космического пространства различным образом влияли на биологические свойства (продукцию ферментов ДНК-азы и РНК-азы) бактерий различной видовой принадлежности: для B.licheniformis, B.pumilus была характерна существенная активизация указанных свойств, в а для B.subtilis - незначительное снижение биологической активности.

6. У большинства исследованных культур бактерий после экспонирования во внутренней среде и на внешней оболочке МКС отмечалось возрастание устойчивости к антимикробным препаратам.

7. Влияние факторов космического пространства отразилось на состоянии покровных структур как эукариот, так и прокариот, причем, для мицеллиальных грибов было характерным изменения митоходриальной и вакуолярной ситемы, а для бактерий - нарушение процесса деления клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В связи с тем, что споры бактерий и мицеллиальных грибов способны оставаться жизнеспособными в среде орбитальной станции в условиях многолетней эксплуатации, а также в условиях космического пространства в течение времени, необходимого для осуществления продолжительной пилотируемой марсианской экспедиции, для минимизации медицинских и технических рисков, обусловленных жизнедеятельностью микроорганизмов, и для разработки стратегии планетарной защиты необходимо:

1. Постоянно проводить мониторинг состояния бактериально-грибного сообщества, формирующегося в условиях среды обитания МКС.

2. При превышении нормативных показателей по содержанию микроорганизмов в среде обитания станции, регламентируемых документом SSP 50260 (MORD), необходимо обосновывать и передавать членам экипажа рекомендации по снижению уровней бактериальной и грибной обсемененности за счет использования имеющихся на борту штатных антимикробных средств.

3. Результаты исследований длительного выживания споровых форм микроорганизмов в условиях космического пространства необходимо учитывать при разработке и реализации мер планетарного карантина при будущих межпланетных полетах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение возможности развития микроорганизмов на конструкционных материалах, используемых в космических объектах // Сб. докл. конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященной дню космонавтики - Москва, 2004г. - С. 28. (в соавторстве с Раковой Н.М.)

2. Космический эксперимент «Биориск», его задачи и перспективы // Материалы IV молодежной конференции (Москва 2005 г.) С. 41. (в соавторстве с Поликарповым Н.А.)

3. Изучение способности роста и репродукции на конструкционных материалах представителей бактериального сообщества Международной космической станции // Авиакосмическая и экологическая медицина, 2005. № 1. С. 44-47 (в соавторстве с Новиковой Н.Д., Раковой Н.М.)

4. «Biorisk» space experiment its problem and prospects // International Conference on Environmental, Industrial and applied Microbiology (BioMicroWorld - 2005), Badajoz (Spain), March 16-18^th 2005. P. 41. (в соавторстве с Novikova N.D., Polikarpov N.A., Deshevaya E.A.)

5. Extermophylic microorganisms: issue of interplanetary transfer on external spacecraft surfaces // CD# COSPAR 2006-A-01575, 36^th COSPAR Scientific Assembly Beijing, China, 16-23 July 2006 (в соавторстве с Novikova N.D., Deshevaya E.A., Polikarpov N.A., Grigoriev A.I.)

6. Study of capability of microorganisms to develop on construction materials used in space objects // CD# IAC-06-A1 P.2.06, 57^th International Astronautical Congress Valencia, Spain - October 2-6, 2006.

7. Основные результаты эксперимента «Биориск» на Международной космической станции // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2006. Т. 40. № 3. С. 3-9 (в соавторстве с Барановым В.М., Поликарповым Н.А., Новиковой Н.Д., Дешевой Е.А., Поддубко С.В., Цетлиным В.В.)

Размещено на Allbest.ru

...