Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України інститут фізіології ім. О. О. богомольця

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком'язових клітин тонкого кишечнику

03. 00. 02 - Біофізика

Жолос Олександр Вікторович

УДК 577. 352. 5: 577. 353

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії наук України.

Науковий консультант: академік НАН України, доктор медичних наук професор Шуба М.Ф. завідуючий відділом нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Зима В.Л. професор кафедри біофізики Київського університету ім. Тараса Шевченка доктор біологічних наук Кононенко М. І. провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України доктор біологічних наук Веселовський М. С. заступник директора Міжнародного Центру Молекулярно-фізіологічних досліджень

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна Національної Академії наук України, відділ біохімії м'язів, м. Київ.

Захист відбудеться 7 березня 2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д_01. 13. 01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця Національної Академії наук України за адресою: 252 024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми

Механізми регуляції тонусу та скорочення гладеньких мязів вегетативною нервовою системою є центральними проблемами фізіології, фармакології і біофізики гладеньких мязів. Ацетилхолін, принциповий медіатор парасимпатичної нервової системи, викликає збудження і скорочення вісцеральних гладеньких мязів, а також деяких судин. Таким чином, без детального дослідження механізмів дії ацетилхоліну на гладеньком'язові клітини (ГМК) неможливе розуміння функцій різних органів, порушень моторики при різноманітних захворюваннях та пошук нових підходів у лікуванні розладів дихальних шляхів, шлунково-кишкового та сечовидільного трактів.

Збуджуюча дія ацетилхоліну та інших холінергічних агоністів (наприклад, карбахоліну) обумовлена активацією мускаринових рецепторів. Останні належать до великої родини рецепторів, що діють на ефектори - іонні канали та ензими - шляхом активації ГТФ-зв'язуючих G_білків.

Центральною сполучною ланкою між активацією мускаринових рецепторів та м'язовим скороченням є підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію, а основними процесами - вхід Ca²⁺ в клітину при холінергічній деполяризації мембрани та вивільнення Ca²⁺ із внутрішньоклітинних депо. Приймаючи до уваги гетерогенність мускаринових рецепторів і специфічність кожного із підтипів в активації тих чи інших G-білків і, таким чином, у запуску або ж регуляції різноманітних реакцій, на сучасному етапі становиться все більш очевидним, що холінергічний контроль гладеньких м'язів неможливо зрозуміти як просту суму ізольованих подій. Актуальним є вивчення різноманітних взаємодій у цій складній системі, ролі різних підтипів мускаринових рецепторів, механізмів Ca²⁺- та InsP₃-індукованого вивільнення Ca²⁺, а також мембранних механізмів М_холінергічного збудження ГМК.

Механізмам деполяризуючої дії ацетилхоліну у даній роботі було приділено особливу увагу, оскільки мембранні події, що приводять до її деполяризації, є першими і найменш дослідженими у складному ланцюжку реакцій, що виникають при активації холінорецепторів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Роботу виконано у рамках наукових програм відділу нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України: "З'ясування молекулярних механізмів специфічних змін провідності клітинних мембран при виникненні основних нервових процесів", "Механізми електро- і хемокерованої кальцієвої провідності мембрани та її роль у спряженні збудження-скорочення у гладеньких мязах", "Механізми метаболічної регуляції іонних каналів і скорочення гладеньком'язових клітин".

Мета дослідження

Мета роботи полягала у вивченні мембранних та внутрішньоклітинних механізмів М_холінергічної активації гладеньком'язових клітин тонкого кишечнику.

Задачі дослідження

Дослідити біофізичні і фармакологічні властивості потенціалкерованих іонних каналів мембрани нейронів міжм'язового плетива та ГМК тонкого кишечнику.

Дослідити роль і механізми Ca²⁺_ і InsP₃-індукованого вивільнення Ca²⁺ у ГМК, зокрема роль потенціалкерованого входу Ca²⁺ в активації Ca²⁺_індукованого і модуляції InsP₃_індукованого вивільнення Ca²⁺.

Дослідити механізми деполяризуючої дії мускаринових агоністів на мембрану ізольованих ГМК ileum морської свинки.

Дослідити роль активованих G-білків в регуляції катіонної провідності мембрани ГМК і розробити кількісні моделі, які б описували кінетику катіонного струму, виникаючого при активації мускаринових холінорецепторів.

Дослідити механізми холінергічної регуляції потенціалзалежних Ca²⁺ каналів L_типу мембрани ГМК тонкого кишечнику.

Наукова новизна отриманих результатів

Показана наявність регенеративного Ca²⁺_індукованого вивільнення Ca²⁺ у вісцеральних ГМК, що активується навіть при незначному вході Ca²⁺ через L-тип Ca²⁺ каналів.

Показано, що при підвищенні внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca²⁺ відбувається початкове посилення та затримане пригнічення InsP₃-індукованого вивільнення Ca²⁺ як при активації мускаринових холінорецепторів, так і при дії екзогенного InsP₃.

Визначена роль G-білків у модуляції потенціалзалежності катіонної провідності як принципового механізму регуляції катіонних каналів, які відкриваються при активації мускаринових холінорецепторів.

Досліджені властивості поодиноких катіонних каналів, а також модулюючий вплив двовалентних катіонів і протонів на катіонну провідність.

Показані принципова роль М₂ рецепторів і модулююча роль М₃ рецепторів в активації катіонних каналів. Вперше визначена пряма роль М₂ підтипу мускаринових рецепторів у гладеньких мязах.

Встановлено новий механізм десенситизації катіонних каналів, що полягає в зменшенні активації G-білків у процесі гідролізу та вичерпання ГТФ.

Досліджена роль G-білків у карбахолінзалежній модуляції Ca²⁺ струму і дана порівняльна характеристика активації катіонного струму і пригнічення Ca²⁺ струму.

Практичне значення отриманих результатів

Дана робота носить в основному теоретичний характер і значно поглиблює і розширює сучасні уявлення відносно механізмів вивільнення Ca²⁺ у ГМК і генерації збудження при активації мускаринових рецепторів. Значимість отриманих результатів цим не обмежується, оскільки даний тип мембранних рецепторів належить до великого сімейства так званих 7_ТМ рецепторів, що нараховує до двох тисяч представників. Структура, механізми активації і передачі сигналу для цих рецепторів багато у чому подібні, тому їх визначення для одного із представників має велике загальнобіологічне значення. Про практичну значимість 7-ТМ рецепторів свідчить той факт, що дія близько 60% ліків спрямована саме на ці рецептори. Зокрема, антагоністи мускаринових рецепторів застосовуються при лікуванні різних захворювань, обумовлених підвищеною реактивністю і моторикою гладеньких мязів (дисфункція кишечнику і січового міхура, обструкція дихальних шляхів, бронхіальна астма, пептична виразка, та ін.). Таким чином, дослідження механізмів холінергічного контролю діяльності гладеньких мязів створює теоретичну основу для цілеспрямованого пошуку селективних фармакологічних препаратів і більш ефективної корекції різних патологічних станів.

Особистий внесок здобувача

Автор самостійно розробив методики отримання поодиноких ГМК і провів переважну більшість експериментів, їх статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів, а також готував до друку наукові статті. Деякі експерименти було виконано спільно з іншими дослідниками з приблизно однаковим внеском:

Дослідження іонних струмів у мембрані ГМК тонкого кишечнику щура - С. В. Смірнов (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України).

Дослідження іонних струмів у мембрані нейронів міжм'язового плетива тонкого кишечнику морської свинки - Л. В. Байдан (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України; Державний університет штату Огайо, США).

Дослідження пригнічуючої дії Ca²⁺ на InsP₃-індуковане вивільнення Ca²⁺ - С. Коморі (Університет Гіфу, Японія).

Дослідження дії карбахоліну на Ca²⁺ канали ГМК ileum морської свинки - В. Пуцовський (Інститут експериментальної фармакології Академії наук Словаччини).

Апробація роботи

Основні положення дисертації були представлені на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України (1988-1997), відділу фармакології і клінічної фармакології Медичної школи госпіталю Св. Георгія (Лондон) і Інституту експериментальної фармакології Академії наук Словаччини (Братислава), на 5-му Міжнародному симпозіумі “Фізіологія і фармакологія гладеньких мязів“ (Варна, 1988), на Всесоюзних симпозіумах ”Поодинокі канали у біологічних мембранах“ (Пущино, 1989; Москва, 1990), на ХIII зїзді Українського Фізіологічного товариства (Харків, 1990), на Радянсько-Іспанському симпозіумі по фізико-хімічній біології (Київ, 1990), на засіданнях FASEB (Атланта, 1991; Лос Анжелес, 1992), на Конференції по захворюваннях травного тракту (Новий Орлеан, 1991), на засіданні Американської Асоціації гастроентерологів (Сан Франциско, 1992), на 2-му Міжнародному симпозіумі по взаємодії мозок - травний тракт (Кембридж, 1992), на ХХХII Міжнародному Фізіологічному конгресі (Глазго, 1993), на трьох засіданнях Фізіологічного товариства Великобританії (Кембридж, 1994; Лондон, 1996), на 1_му Конгресі Українського біофізичного товариства (Київ, 1994), на спільному засіданні Фізіологічних товариств Японії, Великобританії і країн Європи (Нагоя, 1995), на засіданнях Біофізичного товариства США (Балтімор, 1996; Новий Орлеан, 1997), на 7_му Міжнародному симпозіумі по підтипах мускаринових рецепторів (Відень, 1997), на спільному засіданні Фізіологічних товариств Великобританії і Чехії (Прага, 1998), на засіданні Сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України (1999).

Публікації

Результати роботи опубліковані у 27 статтях вітчизняних та міжнародних журналів та в 26 тезах наукових симпозіумів.

Структура та обсяг дисертації

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження (8 розділів), аналізу і узагальнення результатів, висновків та списку 284 використаних літературних джерел. Робота викладена на 278 сторінках, містить 2 таблиці та ілюстрована 101 рисунком.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єкти досліджень. Досліди проводилися на поодиноких ізольованих та культивованих клітинах. Поодинокі ГМК подовжнього шару ileum морської свинки і щура одержували за допомогою методу ферментативної та механічної ізоляції. Невеличкі шматочки м'язової тканини поміщалися у безкальцієвий розчин, що містив колагеназу (1 мг/мл), соєвий інгібітор трипсину (1 мг/мл) і бичачий альбумін (1 мг/мл), на 25-30 хвилин при 36°С, після чого старанно відмивалися від ферменту і багаторазово пропускалися через скляну піпетку. Для виділення ГМК ileum новонароджених щурів (вік 1-3 дня, вага 5-9 г) концентрація колагенази була 0, 7 мг/мл, еластази - 0, 3 мг/мл, бичачого альбуміну - 2 мг/мл, час інкубації складав 13-17 хвилин. Для дорослих щурів (2, 5-3 місяця, вага 90-120 г) концентрації ферментів збільшувалися у два рази, а час інкубації становив 50-60 хвилин.

ГМК тонкого кишечнику людини (American Type Culture Collection 1692- CRL) утримувалися у модифікованому культуральному середовищі Дюльбеко (DMEM) із додаванням 10% бичачої ембріональної сироватки, 100 U/мл пеніциліну і 100 U/мл стрептоміцину. Використовувалися клітини пасажів 16 і 17.

Для одержання первинної культури нейронів міжм'язового плетива тонкого кишечнику морської свинки ганглії збиралися після обробки тканини, як описано вище, і утримувалися в зволоженій атмосфері 5% СО₂ при 37° С в середовищі 199 із додаванням 10% інактивованої теплом бичачої ембріональної сироватки, 33 мМ глюкози, 100 U/мл пеніциліну, 0, 1 мг/мл стрептоміцину, 0, 1% фунгізона і 0, 5% гентаміцина. Використовувалися нейрони, які знаходилися в культурі від 5 до 15 днів.

Реєстрація іонних струмів. Для дослідження інтегральних іонних струмів застосовувався стандартний метод фіксації потенціалу і внутрішньоклітинної перфузії за допомогою скляної мікропіпетки в конфігурації whole-cell (Hamill et al., 1981). Активність поодиноких іонних каналів досліджувалася у конфігураціях cell-attached і outside-out. У деяких експериментах використовувалася методика подвійної patch-реєстрації (комбінація whole-cell і cell-attached конфігурацій). Після заповнення відповідним розчином піпетки мали опір 1-3 МОм. Послідовний опір складав у середньому 8, 4 МОм і компенсувався на 80%. У більшій частині експериментів використовувався підсилювач фіксації потенціалу Axopatch 200A і інтерфейс Digidata 1200, керований програмою pClamp 6. 0 (Axon Instruments). Дані аналізувалися за допомогою програм pClamp 6 і MicroCal Origin 5. 0. Для реєстрації швидких іонних струмів (наприклад, ТТХ-чутливий Na⁺ струм) сигнал фільтрувався за допомогою фільтра Бесселя 4_го порядку з частотою зрізу 5 кГц і записувався при 40 кГц; при реєстрації активності поодиноких іонних каналів ці величини були 1-2 кГц і 5-10 кГц, відповідно, а при реєстрації катіонних струмів - 1 і 5 кГц, відповідно.

Техніка фотолізу. Світло ксенонової лампи (спалах тривалістю 1 мс, 300<<380 нм) фокусувалося на клітину, що попередньо перфузувалася не менше 5 хвилин розчином з “caged“ речовиною. Інтенсивність спалаху регулювалася шляхом зміни напруги заряду конденсатора (НЗК), тоді як момент подачі спалаху задавався синхроімпульсом із регульованою затримкою відносно імпульсу фіксації потенціалу. Відсоток конверсії складав 2, 2±0, 3 при НЗК 40В і 8, 6±0, 4 (n=5) при НЗК 75.

Склад і зміна розчинів. Нормальний зовнішній розчин містив (ммоль/л) : 120 NaCl, 6 KCl, 2, 5 CaCl₂, 1, 2 MgCl₂, 11, 5 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; NaOH). Для реєстрації Na⁺ струмів KCl замінявся на CsCl, а CaCl₂ - на MgCl₂. У клітинах, де були присутні Na⁺ канали (нейрони, ГМК ileum щура), Са²⁺ струми реєструвалися при заміні NaCl і KCl на 130 мМ ТЕА-Cl, а в усіх інших випадках - при заміні KCl на CsCl. Катіонні струми при активації мускаринових рецепторів реєструвалися у розчині такого складу (ммоль/л) : 120 CsCl, 12 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; CsOH). Розчин у піпетці мав такий склад: 85 KCl, 30 KH₂PO₄, 1 MgSO₄, 1 Na₂ATФ, 5 креатин, 20 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; NaOH), 0, 05-5 ЕГТА в залежності від мети експерименту. Для реєстрації Са²⁺ струму KCl і KH₂PO₄ замінювалися на 115 мМ CsCl. Для реєстрації K⁺ і Ca²⁺ або Na⁺ струмів у ГМК ileum щура розчин містив відповідно 130 мМ KCl або CsCl, добавлялося також 0, 1 мМ цАМФ. Розчин для дослідження катіонного струму при активації мускаринових рецепторів містив 80 CsCl, 1 MgCl₂, 1 Na₂АТФ, 5 креатин, 10 BAPTA, 4, 6 CaCl₂ ([Ca²⁺]_i=100 nM), 20 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; CsOH).

Зовнішній розчин мінявся у всьому об'ємі експериментальної камери (~0, 4 мл) за час, що не перевищував 1 с. У деяких експериментах, наприклад, при вимірі латентного періоду виникнення катіонного струму при аплікації карбахоліну, була потрібна більша швидкість аплікації. В цих випадках використовувалася п'езоелектрична позиційна система PCS-250, яка дозволяла змінити розчин на протязі приблизно 1 мс.

Статистичні методи. Результати статистичного аналізу експериментальних даних представлені як середнє арифметичне ± стандартна помилка середнього арифметичного (n - кількість вимірів). Для статистичного порівняння використовувався t-критерій Стьюдента, розходження приймалися як достовірні при P<0, 05.

Дані описувалися відповідними математичними функціями з використанням програмного забезпечення Origin. Концентраційні залежності та активаційні/інактиваційні криві описувалися, відповідно, такими рівняннями:

(1) (2)

де Y - вимірювана величина (струм або мембранна провідність), Ymax - її максимальне значення, EC₅₀ і V_1/2 - параметри, при яких Y=Ymax, а p і k - чинники нахилу кривої.

Результати досліджень

Іонні струми мембрани нейронів інтрамуральних гангліїв.

Електрична активність міентеральних нейронів є тою початковою ланкою, що призводить до вивільнення у нервових закінченнях ацетилхоліну і запуску цілого каскаду складних реакцій, опосередкованих активацією мускаринових рецепторів ГМК і координуючих скорочувальну активність кишечнику. Характер активності відрізняється в різноманітних ділянках травного тракту і між нейронами різних типів. Ці дані базуються в основному на експериментах із використанням мікроелектродних методів реєстрації (Wood, 1989), тоді як із застосуванням методу patch-clamp досліджувалися лише нейрони новонароджених тварин, властивості яких можуть істотно відрізнятися від нейронів дорослих тварин. В умовах фіксації току більшість досліджуваних нейронів генерували лише 1-2 потенціалу дії з наступною тривалою слідовою гіперполяризацією, що дозволяло віднести їх до AH/тип 2 нейронів.

Потенціалкеровані натрієві і кальцієві струми

Вхідній струм складався зі швидкого і повільного компонентів. Швидкий струм зникав у безнатрієвому розчині і блокувався тетродотоксином (ТТХ, IC₅₀=10, 7 нМ), але зберігався в безкальцієвому розчині і був таким чином ідентифікований як Na⁺ струм. Навпроти, повільний компонент струму зберігався в безнатрієвому розчині і змінювався по амплітуді в залежності від [Ca²⁺]_o і був ідентифікований як I_Ca. I_Na досягав максимального значення при _10 мВ (2, 2±0, 3 нА, n=15). При більш позитивних потенціалах внесок I_Ca збільшувався, максимум току спостерігався при 10 мВ (0, 8±0, 1 нА, n=15).

При деполяризації Na⁺ канали інактивувалися з однією постійною часу, яка зменшувалася від 161 мс при _70 мВ до 2, 3 мс при _30 мВ. Вихід із інактивації описувався постійними часу 7, 3±1, 1 мс при _100 мВ; 21, 8±5, 1 мс при _80 мВ і 43, 7±11, 1 мс при -60 м (n=4) ; при _60 мВ виявлявся також більш повільний компонент із постійної часу 288±30 мс (n=4). Залежність стаціонарної інактивації від потенціалу описувалася кривими Больцмана (рівняння 2) з такими параметрами: V_1/2 -55, 6 і _38, 9 мВ; k 6, 4 і 14, 4 мВ для I_Na и I_Ca, відповідно. Величина V_1/2 для стаціонарної інактивації Na⁺ каналів близька до потенціалу спокою в даних нейронах (у спокої не інактивовано 70% каналів), що припускає функціональну роль Na⁺ каналів у генерації потенціалів дії і в модуляції збудження під час як швидких, так і повільних синоптичних відповідей, що мають у даних нейронах дуже виражений характер. Кінетика інактивації і виходу з інактивації достатньо швидка у порівнянні з кінетикою ЗПСП і ГПСП.

У частині нейронів (біля 30%) в області негативних потенціалів спостерігався невеликий низькопоріговий I_Ca із швидкою кінетикою інактивації (100 мс), що нагадував Т-струм. Високопоріговий Ca²⁺ струм переносився, очевидно, через Ca²⁺ канали N-типу. Цей струм лише частково пригнічувався ніфедипіном (100 mМ на 35±4%, n=6), проте повністю блокувався 2 mМ w-CgTX. При заміні Ca²⁺ на Ba²⁺ вхідний струм значно збільшувався без уповільнення його інактивації. Чутливість до неорганічних блокаторів Ca²⁺ каналів (Gd³⁺>Cd²⁺>Ni²⁺) також відповідала участі N-типу Ca²⁺ каналів.

Даний тип Ca²⁺ каналів є важливою "мішенню" для різноманітних нейропередатчиків. 5-НТ, медіатор повільного збуджуючого і, можливо, гальмівного ПСП у AH/тип 2 нейронах пригнічував I_Ca на 40% (100 М). Агоніст А₁ рецепторів 2_хлораденозін пригнічував I_Ca більш ніж на 50% (IС₅₀=210 нМ). Тести з додаванням до розчину у піпетці ГТФS і ГДФS показали, що у передачі сигналу беруть участь G-білки.

Калієві струми

Були виявлені і досліджені чотири типи K⁺ струмів: повільні струми вхідного і затриманого вихідного випрямлення і швидкі типу I_A і Ca²⁺-залежний струм. Відповідні K⁺ канали відрізнялися по потенціалзалежності і фармакологічних властивостях, що дозволяло здійснювати розділення струмів.

K⁺ струм вхідного випрямлення був ізольований із використанням 200 mМ ТТХ і безкальцієвого зовнішнього розчину з метою пригнічення I_Na, I_Ca і I_{K (Ca).} У цих умовах деполяризуючі імпульси викликали повільний K⁺ струм затриманого випрямлення (I_{K, dr}), тоді як гіперполяризуючі імпульси активували К⁺ струм вхідного випрямлення (рис. 1). Провідність мембрани при 30 мМ K⁺ (E_К=_34 мВ) описувалася рівнянням (2) із величинами V_1/2=_105 мВ і k=_8, 8 мВ. Активація I_{K, ir} прискорювалася у е-раз при гіперполяризації мембрани на 31 мВ.

ТЕА⁺ блокував I_{K, dr}, але не I_{K, ir}, тоді як Cs⁺ селективно пригнічував I_{K, ir} (IC₅₀=58 mМ).

Раніше наявність швидкого I_A у мембрані нейронів міжм'язового плетива передбачалося на підставі виражених ефектів 4-АР на форму потенціалу дії і слідової гіперполяризації (Hirst et al., 1985). I_A реєструвався при _30 мВ, де I_{K, dr} відсутній. Активація і інактивація I_A описувалися рівнянням (2) із такими параметрами: V_1/2 = _95, 5 мВ, k = 7, 2 мВ для інактивації і V_1/2 = _45, 9 мВ, k=_16, 8 мВ для активації. Постійна часу виходу з інактивації зменшувалася в е-раз при гіперполяризації мембрани на 36 мВ, від 1, 4±0, 3 с при _90 мВ до 0, 4±0, 1 с при _140 мВ (n=3). I_A пригнічувався на 40 і 80% при додаванні відповідно 3 і 10 мМ 4_АР, тоді як 10 мМ ТЕА⁺ не впливав на цей струм.

Вищеописані експерименти проводилися при 5 мМ ЕГТА у піпеточному розчині. При зменшенні концентрації до 0, 3 мМ виникав також I_{K (Ca)} (рис. 2А). Залежність його амплітуди від мембранного потенціалу була такою ж, як і для I_Ca. I_{K (Ca)} міг тривати до 3, 5 с - це узгоджується з уявленнями про його центральну роль у генерації тривалої слідової гіперполяризації, що є характерною ознакою даного типу нейронів. Дослідження властивостей I_{K, ir} дозволяє припустити його важливу участь, поряд із I_{K (Ca),} у генерації тривалої гіперполяризації, що в свою чергу більш повно пояснює цей складний процес.

Загальна характеристика іонних струмів мембрани ГМК тонкого кишечнику

Характер електричної активності ГМК істотно відрізняється в залежності від їхнього типу, а для однотипних ГМК описані значні видові відмінності (Kuriyama et al., 1998). Розуміння механізмів холінергічного контролю ГМК кишечнику могло базуватися тільки на детальному попередньому дослідженні їх загальних електрофізіологічних властивостей. В цих експериментах були знайдені важливі видові та вікові відміни в природі і властивостях іонних струмів.

Ileum морської свинки

У ГМК, ізольованих із подовжнього ileum морської свинки, у відсутність активації рецепторів вхідний струм переноситься через потенціалкеровані Ca²⁺ канали L-типу і повністю блокується ніфедипіном у концентрації 1 М, а основним компонентом вихідного струму є I_{K (Ca)} (рис. 2Б). При низькій концентрації ЕГТА в піпетці виникали спонтанні вихідні струми (СВС), вперше описані для ГМК jejunum і вушної артерії кролика (Benham & Bolton, 1986). Реверсія СВС спостерігалася при E_K, СВС блокувалися ТЕА⁺, при заміні К⁺ іонами Cs, при підвищенні концентрації ЕГТА у піпеточному розчині або при видаленні Ca²⁺ із зовнішнього розчину, а також при дії блокатора ріанодінових рецепторів рутенієвого червоного. Таким чином, іонна природа і механізм виникнення СВС у ГМК ileum відповідають іншим типам гладеньких м'язів, тобто СВС обумовлені синхронною активацією Ca²⁺-залежних K⁺ каналів у малому фрагменті мембрани при спонтанному локалізованому вивільненні Ca²⁺ із внутрішньоклітинних депо (СР).

Співвідношення між I_Ca і I_{K (Ca)} показане на рис. 2Б. Воно не настільки однозначне, як, наприклад, у нейронах (рис. 2А), і припускало додатковий механізм посилення дії Са²⁺ за рахунок Са²⁺-індукованого вивільнення Са²⁺ (КІВК). Це заслуговувало більш детального аналізу, результати якого описані нижче у порівнянні з властивостями Ca²⁺ струму.

Ileum щура

На відміну від ГМК ileum морської свинки в клітинах подовжнього прошарку ileum щура природа вхідного струму була значно складнішою. Він складався з Na⁺ і Ca²⁺ компонентів. Ca²⁺ канали були представлені двома популяціями, низько- і високопоріговими. Відносний внесок цих популяцій залежав від віку тварини. Амплітуда першого не змінювалася при заміні Ca²⁺ на Вa²⁺, а другого - збільшувалася на 80±10% (n=8). Обидва компоненти I_Ca не змінювалися при додаванні 1 М ніфедипіну. Неорганічні блокатори Ca²⁺ каналів Cd²⁺ і Ni²⁺ по-різному впливали на низько- і високопоріговий I_Сa. Так, Cd²⁺ у концентрації 10 М пригнічував високопоріговий I_Ca на 50% і не впливав на низькопоріговий I_Ca. Навпроти, Ni²⁺ у концентрації 500 М майже повністю блокував низькопоріговий і тільки на 40% - високопоріговий компонент. Істотні відміни спостерігалися також для стаціонарної інактивації. Величини V_1/2 і k були, відповідно, -60, 6 і 8, 8 мВ для низько- і -49, 0 і 13, 6 мВ для високопорігового I_Ca. Відрізнялась також і кінетика відновлення з інактивації: при -80 мВ низькопоріговий I_Ca цілком відновлювався за 2-5 с, тоді як високопоріговий - за 20-30 с. У сумі ці дані свідчили про гетерогенність Ca²⁺ каналів у мембрані ГМК ileum щура. Більш того, було виявлено, що в дорослих тварин зберігається лише високопоріговий I_Ca.

При видаленні іонів Ca²⁺ із зовнішнього розчину спостерігався швидкий вхідний струм, ідентифікований як I_Na. Цей струм ефективно блокувався ТТХ (IC₅₀=4, 5 нМ). Стаціонарна інактивація I_Na характеризувалася параметрами: V_1/2=-60 мВ і k=10 мВ. Відновлення з інактивації було швидким (постійна часу 18-47 мс у діапазоні потенціалів від -90 до -60 мВ). Слід зазначити, що I_Na, на відміну від I_Ca, зустрічається лише в деяких типах гладеньких м'язів (Kuriyama et al., 1998), а для ГМК кишечнику цей струм нами був виявлений вперше.

У ГМК новонароджених тварин спостерігався затриманий і швидкий вихідні струми. Останній був подібним до I_A у нейронах. ТЕА⁺ переважно блокував затриманий K⁺ струм, тоді як 4-АР селективно блокував швидкий компонент. Ефект 4-АР був складним і посилювався в часі при гіперполяризації мембрани. Стаціонарна інактивація I_A характеризувалася V_1/2=-70, 8 мВ і k=7, 7 мВ. Постійна часу відновлення з інактивації зменшувалася при гіперполяризації мембрани і складала 90±5 мс (n=13) при -80 мВ. I_A спостерігався в 93% досліджуваних ГМК (n=240). На відміну від ГМК ileum морської свинки СВС спостерігалися лише в одній клітині. Очевидно, у ГМК новонароджених щурів Ca²⁺-залежні K⁺ канали практично відсутні. Навпроти, у ГМК дорослих щурів СВС спостерігалися частіше, а властивості I_A не змінювалися.

ГМК тонкого кишечнику людини

В ГМК тонкого кишечнику людини (91 клітина, пасажі 16-17) I_Ca і I_{K (Ca)} були відсутні, що очевидно пов'язано з деякою модифікацією властивостей клітин у культурі (Owens, 1995). У свіжеізольованих клітинах присутні Ca²⁺ канали L-типу (Xiong et al., 1995), але Ca²⁺-залежні K⁺ теж відсутні (Farrugia et al., 1993). Іонні струми в цій культурі клітин були практично не вивченими. Заміна Na⁺ на Cs⁺ призводила до повного пригнічення вхідного струму, незважаючи на присутність у зовнішньому розчині 10 мМ Ca²⁺ або Ba²⁺. Крім того, вхідний струм блокувався ТТХ з IC₅₀=56 нМ. По своїм властивостям I_Na був подібним до I_Na в ГМК ileum щура.

Однієї з цікавих особливостей цих клітин був розвиток вхідних катіонних струмів при видаленні двовалентних катіонів із зовнішнього розчину. Перший компонент активувався при гіпер- (I_HA), а другий - при деполяризації мембрани (I_DA). Оскільки ці струми розвивалися значно повільніше, ніж це було потрібно для зміни зовнішнього розчину, можна було припустити як можливий механізм їхньої активації пасивне виснаження внутрішньоклітинних Ca²⁺ запасників (CRAC-подібні канали). На користь цього свідчила і блокуюча дія SK&F 96365. Такий механізм входу Ca²⁺ є основним у клітинах різних типів, особливо в незбудливих клітинах при відсутності інших типів Ca²⁺ каналів (Parekh & Penner, 1997). Для ГМК цей механізм раніше був запропонований на підставі вимірів [Ca²⁺]_i при дії агоністів рецепторів і тапсигаргіна, але спроби виміру відповідного іонного струму виявилися безуспішними. I_DA був більш чутливим до [Ca²⁺]_о у порівнянні з I_HA. Величини IC₅₀ складали 20 М для I_HA і 311 нМ для I_DA. Відрізнялась і іонна селективність: K⁺ > Cs⁺ > Na⁺ для I_HA і Na⁺ > K⁺ >> Cs⁺ для I_DA.

Таким чином, у ГМК тонкого кишечнику існують істотні відміни в експресії тих або інших іонних каналів в залежності від виду і віку тварини, а також при зміні клітинного фенотипу в процесі культивування клітин. Вхідні струми можуть переноситися через ТТХ-чутливі Na⁺ канали і Ca²⁺ канали різних типів, а також через неселективні катіонні канали, що активуються при спустошенні СР. Вихідні K⁺ струми представлені потенціалкерованими затриманим і швидким (типа I_A) струмами, а також потенціал- і Ca²⁺- залежним I_{K (Ca).}

Механізми вивільнення Ca²⁺ із внутрішньоклітинних депо ГМК

При холінергічній активації ГМК паралельно із деполяризацією мембрани та входом Ca²⁺ ззовні відбувається також вивільнення Ca²⁺ із СР, що включає як КІВК, так і InsP₃-індуковане вивільнення Ca²⁺ (ІІВК) (Karaki et al., 1997). У досліджуваних ГМК ileum морської свинки Ca²⁺ депо є спільним для обох процесів (Komori et al., 1995). Посилення входу Ca²⁺ за допомогою КІВК і фізіологічна значимість цього механізму в різноманітних ГМК зараз не викликає сумніву, а розвиток методів реєстрації [Ca²⁺]_i за допомогою конфокальної флуоресцентної мікроскопії показав високу просторову і тимчасову структурованість Ca²⁺ сигналу. Проте до моменту початку даних досліджень для гладеньких м'язів фізіологічна роль КІВК лише передбачалася, в основному на підставі реєстрації скорочувальних реакцій при дії агоністів і кофеїну (Karaki et al., 1988). Експерименти на скінованих сапоніном ГМК свідчили про те, що КІВК може активуватися при [Ca²⁺]_i>1 M, що таким чином виключало його фізіологічну значимість (Iino, 1989).

Як можливу стратегію дослідження було використано зіставлення I_Ca і I_{K (Ca),} або I_Ca і катіонного струму, що виникає при активації мускаринових рецепторів (I_КАТ). I_КАТ корелює із змінами [Ca²⁺]_i навіть більш тісно у порівнянні з I_{K (Ca)} (Komori et al., 1993), і, таким чином, обидва струми могли бути інтерпретовані як якісний показник рівня [Ca²⁺]_i.

Регенеративний характер КІВК

При тривалій деполяризації мембрани розвивався затриманий вихідний струм (рис. 2Б). Аналогічний струм виникав і при аплікації кофеїну або фотолізі "caged" InsP₃ усередині клітини, що послужило підставою для припущення про участь іонів Ca²⁺, що вивільнюються з СР, в активації цього струму, ідентифікованого як I_{K (Ca).} Зіставлення кінетики I_Ca і I_{K (Ca),} а також відповідних вольтамперних залежностей (рис. 2Б) свідчило про непряму роль входу Ca²⁺ в активації затриманого I_{K (Ca).} Кофеїн широко використовується як фармакологічний інструмент для подібного роду досліджень, проте крім активації ріанодінових рецепторів у мембрані СР він може викликати й інші ефекти. Дійсно, було знайдено, що у концентрації 10 мМ кофеїн викликав пригнічення I_Ca приблизно на 30%. Такий ефект не міг пояснити повне блокування затриманого I_{K (Ca)} у присутності кофеїну, яке вірогідно виникало внаслідок спустошення СР. Рослинний алкалоїд ріанодин (5 М), рутенієвий червоний (10 mМ) і підвищення внутрішньоклітинної концентрації Mg²⁺ до 6 мМ практично цілком блокували затриманий I_{K (Ca).} Було очевидним, що цей струм виникає внаслідок КІВК, що активується входом Ca²⁺ при деполяризації мембрани.

Подальші експерименти були спрямовані на з'ясовування властивостей КІВК, аналізуючи при цьому затриманий I_{K (Ca)} і його співвідношення з амплітудою I_Ca. Вихідний струм, чутливий до рутенієвого червоного, починав зменшуватися при потенціалах, значно більш позитивних, ніж можна було б очікувати для “градуального“ КІВК, пропорційного входові Ca²⁺ (рис. 2Б). У інших серіях експериментів була досліджена залежність амплітуди I_{K (Ca)} від частково інактивованого або частково блокованого ніфедипіном I_Ca (рис. 3). Виявилося, що затриманий I_{K (Ca)} починає зменшуватися по амплітуді лише після пригнічення I_Ca на 80-95%. Ці результати, отримані з використанням різних експериментальних підходів, вказували на регенеративний характер процесу КІВК у ГМК ileum морської свинки. Вхід Ca²⁺, навіть невеликий, може відігравати роль пускового механізму, що активує КІВК. Сама наявність вихідного струму, що активується при виникненні КІВК, свідчила про істотне підвищення [Ca²⁺]_i на додаток до викликаного безпосередньо вхідним Ca²⁺ струмом, і таким чином фізіологічну значимість КІВК.

Ca²⁺-залежна модуляція ІІВК

У ГМК формування InsP₃ при дії різноманітних агоністів пов'язано зі скороченням, що обумовлено підвищенням [Ca²⁺]_i у наслідок ІІВК. Іони Са²⁺ також можуть зв'язуватися з InsP₃ рецепторами і модулювати їхню активність, у такий спосіб регулюючи ІІВК за принципом зворотного зв'язку (Bezprozvanny & Ehrlich, 1995). У стаціонарних умовах залежність активності InsP₃ рецепторів від концентрації Са²⁺ є -образною з максимумом біля 300 нМ. Важливо відзначити, що кінетика дії Ca²⁺ на ІІВК також є складною і у цілому вивчена набагато гірше. У більшості робіт дослідження проводилися з використанням неклітинних експериментальних моделей (везикули СР, скіновані клітини, InsP₃ рецептори у біслоях) або ж на незбудливих клітинах (наприклад, ооцити Xenopus). Такі підходи мають свої переваги, проте вони не дозволяють відповісти на запитання про можливу модуляцію ІІВК іонами Са²⁺, що входять у клітину через потенціалзалежні Са²⁺ канали.

З метою з'ясування цих питань InsP₃ раптово вивільнювався з інертного «caged» InsP₃ при спалаху світла і одночасно реєструвався I_{K (Ca),} по амплітуді якого оцінювали зміни концентрації іонів Са²⁺ з внутрішньої поверхні мембрани. В залежності від інтенсивності світла спостерігалися моно- або двофазні відповіді. Однієї з можливих причин генерації двофазних відповідей могла бути активуюча дія Са²⁺, що вивільняється на ранній стадії ІІВК, на наступний процес його вивільнення. Дійсно, деполяризуючий імпульси, що супроводжувалися входом Са²⁺, підсилювали дію InsP₃. Цей ефект починався на протязі 30-100 мс після завершення деполярізації, досягав максимуму приблизно за 250 мс, а потім змінявся пригніченням відповіді на InsP₃. У дослідах з двома спалахами якщо час між ними становив 0. 5-1 с, друга відповідь була значно більшою; при часі 3-6 с спостерігалося її повне пригнічення. Повне відновлення у середньому відбувалося за 60 с, але у кожній окремій клітині відновлення було по типу «усе або нічого» і могло бути більш швидким (10-20 с). Аналогічно цьому, після вивільнення InsP₃ СВТ пригнічувалися, а потім поступово відновлялися, що свідчило про заповнення внутрішньоклітинних Ca²⁺ депо і можливість спонтанного вивільнення Ca²⁺ за участю ріанодинових рецепторів. Проте відповіді на InsP₃ були відсутні набагато більш тривалий час, а їхнє відновлення знову таки відбувалося раптово і, як правило, за принципом “усе або нічого” (Рис. 4А). Результати цих експериментів вказують на важливу роль потенціалзалежного входу Са²⁺ через Са²⁺ канали L-типу у модуляції InsP₃-індукованого вивільнення Са²⁺ і, таким чином, у виникненні осциляцій [Ca²⁺]_i при холінергічному збудженні вісцеральних гладеньких мязів. На користь цього свідчили і експерименти, в яких InsP₃ вивільнявся у різні фази осциляцій I_КАТ, що безпосередньо пов'язані з осциляціями [Ca²⁺]_i. Так, на максимумі осциляції відповідь була відсутня (F1 і F3 на рис. 4Б), тоді як у проміжку між осциляціями відповідь звичайно була такої ж амплітуди, як і спонтанні осциляції (F2 і F4 на рис. 4Б).

Механізми холінергічної деполяризації ГМК

Загальна характеристика катіонного струму при активації мускаринових холінорецепторів

За фізіологічних умов холінергічна деполяризація супроводжується як входом Ca²⁺ ззовні, так і його вивільненням із СР. Виникаючі осциляції [Ca²⁺]_i викликають осциляції I_КАТ (рис. 4Б). Детальний біофізичний і фармакологічний аналіз властивостей I_КАТ був можливий тільки при стаціонарних умовах. Таким чином, у подальших експериментах концентрація Ca²⁺ у клітині фіксувалася на рівні 100 нМ, що приблизно відповідає рівню у стані спокою, із використанням 10 мМ ВАРТА/4, 6 мМ CaCl₂ у піпеточному розчині. Слід зазначити, що при використанні 10 мМ ВАРТА без додавання Ca²⁺, тобто в умовах неприродно низької концентрації Ca²⁺ у цитоплазмі клітини, як генерація I_КАТ, так і пригнічення I_Ca цілком блокувалися. Таким чином, обидва механізми потребують деякого мінімального рівня Ca²⁺ у клітині.

Оскільки досліджувані канали не селективні для одновалентних катіонів, експерименти проводилися з використанням симетричних Cs⁺ розчинів (E_Cs=0 мВ) з метою блокування K⁺ струмів. Крім того, у більшості експериментів двовалентні катіони видалялися з зовнішнього розчину, щоб виключити їх вплив.

Карбахолін (КХ) збільшував амплітуду I_КАТ відповідно до рівняння (1) з середніми параметрами: ЕC₅₀=7, 8 mМ, максимальна провідність G_max=23, 3 нС, p=1, 4 (n=114). Гістограми розподілів цих параметрів добре описувалися кривими Гауса, що свідчило про відсутність різних популяцій клітин.

Значний інтерес являли собою потенціалзалежні релаксації I_КАТ при раптових зміщеннях мембранного потенціалу, природа яких залишалася маловивченою (рис. 5). Релаксації струму описувалися одною експонентою з постійними часу для різних клітин від декількох десятків до декількох сот мілісекунд. У системі рецептор - G білок - іонний канал можуть виникати значно складніші взаємодії у порівнянні з більш простою ситуацією, коли іонний канал і місце зв'язування агоніста представлені однієї макромолекулою. Перша ланка в ланцюзі подій, що веде до відкривання каналу, тобто взаємодія агоніста і рецептора, у принципі могло б пояснити релаксації I_КАТ за умови потенціалзалежності зв'язування агоніста. Проте таке припущення було малоймовірним, оскільки швидкості активації і деактивації струму при аплікації і відмиванні КХ були в 10-100 разів повільніші у порівнянні з його потенціалзалежними релаксаціями (рис. 5).

Потенціалзалежність I_КАТ могла відображати властивості самого каналу, але навіть перші тести показали, що взаємодія агоніста з рецептором відіграє ключову роль. Так, кінетика релаксацій струму змінювалася в залежності від концентрації КХ і від часу після його додавання або видалення. Крім того, відбувалися істотні зміни у формі стаціонарної вольтамперної характеристики (рис. 6). При 3 mМ струм при _120 мВ практично повністю деактивувався, тоді як при 300 mМ вольтамперна залежність із U_подібної перетворювалася у більш лінійну, а процес деактивації струму при _120 мВ дуже сповільнювався. Аналіз у термінах кривих активації катіонної провідності показав, що при підвищенні концентрації агоніста крива зміщувалася в область більш негативних потенціалів, а в процесі десенситизації при високої концентрації КХ вона поступово поверталася до свого вихідного положення на вісі потенціалів (рис. 6В). Величина V_1/2 у середньому зміщалася на _36 мВ (варіації від 17 до 89 мВ) від _70±5 мВ до _106±5 мВ при підвищенні концентрації КХ від 3 до 300 М (n=16). При цьому нахил кривої не мінявся (k=_19, 3±0, 9 мВ). Відповідні зміни спостерігалися і у кінетиці релаксації струму під час скачку потенціалу до _120 мВ: величина збільшувалася від 94±12 мс (3 mМ КХ) до 178±14 мс (300 mМ КХ), а потім поступово зменшувалася в процесі десенситизації до 112±13 мс (n=20).

Роль G-білків в активації катіонних каналів і в модуляції їх властивостей

Можна було припустити, що вплив концентрації КХ на швидкість і ступінь релаксації і на положення активаційної кривої опосередкований активацією G-білків. Концентрація активних G-білків визначається при всіх інших рівних умовах наявністю і концентрацією у клітині ГТФ, а їх активація ефективно блокується негідролізуємим аналогом ГДФ - ГДФS. Найбільше прямим тестом даної гіпотези було б додаткове активування або блокування G-білків при постійній концентрації КХ. При додаванні 1 мМ “caged” ГТФ до піпеточного розчину 3 спалахи світла з невеличким інтервалом вивільняли приблизно 0, 4 мМ ГТФ. Це супроводжувалося значним збільшенням I_КАТ. Спостерігалися зміни форми вольтамперної залежності, характерні для підвищення концентрації КХ. Вивільнення ГДФS викликало протилежні ефекти.

Відомо, що при дії ГТФS G-білки активуються повільно і практично не зворотно, що давало можливість більш детально дослідити роль активованих G-білків у модуляції властивостей катіонної провідності. При додаванні ГТФS до піпеточного розчину (0, 2 мМ) фаза активації I_КАТ звичайно тривала 3-5 хвилин після прориву мембрани під піпеткою, після чого струм лишався дуже стабільним на протязі десятків хвилин. При цьому спостерігалася потенціалзалежність кінетики активації, що була дуже подібною до активації I_КАТ карбахоліном: струм наростав швидше усього при 80 мВ, повільніше при _40 мВ і ще більш повільно при _120 мВ. Спостерігався цікавий феномен перетину амплітуд I_КАТ при -40 і 120 мВ. Такий же перетин спостерігався і у вищеописаних експериментах при дії КХ - ранній на початку дії агоністу і пізній у процесі десенситизації рецепторів.

Кінетика розвитку струму відповідала припущенню про різні вимоги стосовно активованих G-білків при різних потенціалах. Відповідно до цієї гіпотези, при 80 мВ I_КАТ найкраще відображає власне процес збільшення їхньої концентрації, тоді як при _40 і _120 мВ спостерігається процес кооперативної взаємодії декількох активованих молекул G-білка з каналом. Як відомо, кооперативність взаємодій у системі припускає сигмовидну кінетику, саме це і спостерігалося в даних експериментах при від'ємних потенціалах. По своїм амплітудним, кінетичним і потенціалзалежним властивостям обидва струми при їхній максимальній активації (максимальна відповідь на КХ або 3-5 хвилин після початку дії ГТФS) практично не відрізнялися.

Вольтамперні залежності для I_КАТ при дії ГТФS, отримані з інтервалом 20 с, показані на рис. 7А. Очевидно, що як і у випадку підвищення концентрації КХ форма кривих змінюється, а лінійна ділянка характеристики прогресивно подовжується в область від'ємних потенціалів. Відповідні активаційні криві показані на рис. 7В - спостерігалося поступове збільшення максимальної провідності і паралельний зсув у негативну область. Релаксації струму при _120 мВ теж зазнавали змін, характерних для описаних вище при підвищенні концентрації КХ, які могли пояснюватися зміною V_1/2 (рис. 7Б).

Результати даних експериментів показують, що при активації G-білків катіонні канали не тільки відкриваються, але і відбувається модуляція їх властивостей. Єдиний процес, що залежить від концентрації активованих G-білків, визначає кількість активованих каналів (G_max), положення активаційної кривої на вісі потенціалів і відповідно кінетику релаксації при даному потенціалі (рис. 7Г).

Для різних типів каналів (наприклад, NMDA рецептори у нейронах) показано, що нелінійні вольтамперні характеристики можуть виникати внаслідок потенціалзалежної блокуючої дії двовалентних катіонів або протонів. В контрольних дослідах було знайдено, що зовнішні іони Ca²⁺, Mg²⁺ і Н⁺ досить сильно пригнічують I_КАТ, але детальний аналіз показав, що дані ефекти обумовлені лише зміною величини поверхневого потенціалу в результаті титрування негативно заряджених груп поблизу каналу. Деякі відміни у дії Ca²⁺ і Mg²⁺ (наприклад, зміна крутизни активаційної кривої при додаванні Ca²⁺) можна було пояснити проникністю каналу до Ca²⁺ і активуючою дією до того, як Ca²⁺ встигає зв'язатися з BAPTA усередині клітини.

Властивості поодиноких катіонних каналів

Найбільш прямі докази потенціалзалежності катіонних каналів можна було б одержати на рівні реєстрації активності поодиноких каналів. На рис. 8А показані приклади таких реєстрації при різних потенціалах. Крім основного каналу з провідністю біля 40-50 пС у деяких випадках був присутній канал меншої провідності, 8_9 пС, проте його активність не аналізувалася, тому що його внесок був незначним.

Розподіл часів закритого і відкритого станів мав дві постійних часи, що свідчить про наявність як мінімум двох закритих і двох відкритих станів. Слід зазначити, що спад макроструму при зсуві мембранного потенціалу добре описувався однієї експонентою (рис. 5, 7Б) із постійною часу звичайно в межах 20-200 мс, що відповідає довготривалому відкритому стану. Питома вага короткотривалого відкритого стану, очевидно, невелика, а його час життя 1-2 мс лише в 2-3 рази перевищує постійну часу ємнісного артефакту при реєстрації від цілої клітини.

Провідність каналу при потенціалах від _70 до _20 мВ була у середньому 42, 1±3, 7 пС (n=14) і не відрізнялася для умов активації каналу КХ (38, 5±6, 9 пС, n=6) або ГТФS (44, 8±4, 1 пС, n=8) (P>0, 4). Залежність вірогідності відкритого стану (Р_о) від мембранного потенціалу описувалася рівнянням Больцмана (рис. 8Б) з V_1/2 для різних клітин у межах від _45 до _140 мВ і k від _18 до _24 мВ. Це добре співвідносилося із відповідними параметрам активаційних кривих макроструму.

Великий інтерес являло з'ясовування причини зниження Р_о при гіперполяризації мембрани. Для макроструму це відповідало релаксації при _120 мВ до рівня, менше ніж амплітуда струму при _40 мВ (рис. 5), і виражалося в U-подібній формі вольтамперної характеристики (рис. 6Б). На рис. 8 Р_о при _10 мВ була 0, 9 при відсутності подвійних відкривань на протязі досить тривалого часу спостереження, тобто у фрагменті мембрани знаходився лише один канал. Таким чином, можна було аналізувати його кінетику. Залежність постійних часу, що описують розподіли часів життя каналу у відкритому і закритому станах, показана на рис. 8 В і Г, відповідно. Обидва постійні часи для відкритого стану зменшувалися при гіперполяризації, але не настільки істотно (приблизно в 2 рази) у порівнянні зі збільшенням повільної постійної часу для закритого стану (у 34 рази). Швидка постійна часу для закритого стану практично не залежала від рівня мембранного потенціалу, що припускає постійні часові інтервали усередині пачки. Таким чином, основний ефект зниження мембранного потенціалу полягає в збільшенні часу життя каналу в тривалому закритому стані, що відповідає збільшенню інтервалу між пачками. При цьому час життя у відкритому стані зменшується - для макроструму це призводить до прискорення кінетики релаксації при збільшенні амплітуди гіперполяризуючих імпульсів.