Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Таким чином, властивості поодиноких каналів цілком пояснюють потенціалзалежні релаксації і складну форму вольтамперної характеристики інтегрального I_КАТ.

Механізми десенситизації катіонної провідності

Десенситизація відповідей, що виникають при активації мембранних рецепторів, є важливим фізіологічним захисним і адаптивним клітинним механізмом і являє собою складний і цікавий біофізичний феномен, тому що молекулярні механізми є надзвичайно різноманітними і не цілком з'ясованими (Grady et al., 1997). У експериментах по десенситизації I_КАТ був виявлений принципово новий механізм, обумовленої вичерпанням запасу ГТФ у клітині при її інтенсивному гідролізі у процесі активації G-білків. У дослідженнях на інших типах клітин такий механізм не проявлявся (Mubagwa et al., 1994), що пояснювалося високою спорідненістю G-білків до ГТФ. Значне збільшення I_КАТ при вивільненні ГТФ із “caged” ГТФ у попередніх експериментах свідчило про наявність значного “резерву” катіонних каналів і неактивних G-білків внаслідок обмеженої кількості молекул ГТФ.

Насамперед були проаналізовані залежності амплітуди I_КАТ від концентрації КХ без додавання і з додаванням 1 мМ ГТФ до піпеточного розчину. Криві концентрація-ефект при повторних аплікаціях КХ характеризувалися зменшенням максимальної провідності, що було статистично достовірним тільки при відсутності ГТФ. Спостерігалася лише тенденція до зростання ЕС₅₀. Таким чином, наявність ГТФ мала в основному значення для величини G_max, яке відповідає максимально можливому для даної клітини кількості активних каналів. Функція власне мускаринового рецептора при десенситизації практично не змінювалася. Важливо відмітити, що при наявності ГТФ у внутрішньоклітинному розчині вищеописані зміни форми вольтамперної залежності і величини V_1/2 у процесі десенситизації (рис. 6) були повністю відсутні. Така стабільність спостерігалася і для ГТФS-індукованого струму, що не дивно, оскільки у цьому випадку ГТФ для активації G-білків не потрібен.

З метою більш детального з'ясування ролі G-білків у процесі десенситизації I_КАТ до піпеточного розчину додавалися різноманітні гуанінові нуклеотиди. Слід зазначити, що амплітуда, кінетика і форма вольтамперної залежності I_КАТ на максимумі відповіді залишалися практично без змін, а основні ефекти нуклеотидів виявлялися тільки у часі по мірі десенситизації I_КАТ (рис. 9). Десенситизація значно прискорювалася при додаванні 50 М ГДФS і сповільнювалася при додаванні 1 мМ ГТФ. Найбільше повільним був спад струму, активованого ГТФS. У цих випадках відбувалася зміна лише розміру Gmax без істотних змін положення активаційної кривої на вісі потенціалів.

Важливо також відмітити, що швидкість десенситизації залежала від мембранного потенціалу. Десенситизація була практично відсутня при 80 мВ (за винятком, коли додавався ГДФS), але значно прискорювалася при гіперполяризації мембрани (рис. 9). Це додатково підтверджувало вищезгадану гіпотезу про те, що навіть невелика концентрація активованих G-білків достатня для відкривання катіонних каналів при позитивних потенціалах.

Значний інтерес мало дослідження процесу десенситизації на рівні зміни активності поодиноких каналів. Ці експерименти проводилися в конфігурації “outside-out” із додаванням 1 мМ ГТФ до піпеточного розчину в постійній присутності 50 mМ КХ у зовнішньому розчині. Для макрострумів за таких умов характерним було зменшення максимальної провідності, що звичайно інтерпретується як зменшення кількості активних каналів, без зміни інших параметрів активаційної кривої (V_1/2 або k). Оскільки, як показано вище, активаційна крива визначається залежністю Ро від мембранного потенціалу (рис. 8Б), можна було очікувати постійність Ро при фіксованому потенціалі. Експериментальні результати підтверджували ці припущення. Якщо на початку експерименту у досліджуваному фрагменті мембрани виявлялося як мінімум 4 активних канали, то з часом залишався лише один активний канал, але Ро при цьому не зменшувалася. Провідність каналу також не змінювалася.

Роль підтипів мускаринових рецепторів у розвитку I_КАТ

Дослідження механізмів десенситизації I_КАТ дозволило створити надійну експериментальну систему для проведення кількісних фармакологічних досліджень на поодиноких ГМК. В усіх експериментах даного розділу до піпеточного розчину додавалося 1 мМ ГТФ. Аналіз базувався на вимірах величини ЕС₅₀ для КХ до і після аплікації антагоніста мускаринових рецепторів. Задача визначення типу мускаринового рецептора, що активує катіонний канал, фактично зводилася до з'ясування ролі М₂ і М₃ рецепторів, тому що, як вже відзначалося, у ГМК ileum присутні лише ці два підтипи рецепторів.

Для аналізу були використані М₂-селективні антагоністи метоктрамін, гімбацин і тріпітрамін і М₃-селективні антагоністи p-F-HHSiD, 4-DAMP і заміфенацин. Потреба використання декількох антагоністів обумовлена відсутністю абсолютної селективності. Кількісний аналіз проводився з використанням рівняння Шилда, наведеного на рис. 10, де DR - це відношення ЕС₅₀ при дії антагоніста і у контролі, [B] - концентрація і Kb - константа дисоціації антагоніста. На рис. 10 показано, як приклад, експеримент по визначенню величини Kb для метоктраміну і його аналіз у рамках теорії Шилда. Усі інші М₂-селективні антагоністи діяли аналогічним чином, тобто спостерігався паралельний зсув концентраційної кривої без суттєвого зменшення максимальної відповіді. Це свідчило про конкурентний тип блокування, а співставлення отриманих величин констант дисоціації із відомими для зв'язування з М₂ і М₃ рецепторами (рис. 11) беззаперечно свідчило про принципову роль М₂ рецепторів у відкриванні катіонних каналів.

Навпаки, усі М₃-селективні антагоністи у низьких концентраціях значно зменшували максимальну відповідь, практично не змінюючи величину ЕС₅₀ для КХ, а при більш високих концентраціях викликали деяке збільшення ЕС₅₀, що можна було пояснити неселективною дією на М₂ рецептори. Цікаво, що атропін, класичний неселективний конкурентний блокатор, викликав обидва типи ефектів. Як і антагоністи М₂ рецепторів, атропін приводив до паралельного зсуву концентраційної кривої відповідно до Kb1 нМ і одночасно, як і антагоністи М₃ рецепторів, сильно пригнічував максимальну відповідь.

Таким чином, катіонні канали відкриваються у результаті взаємодії агоніста з рецепторами M₂ типу (пусковий механізм), проте одночасна активація М₃ рецепторів сильно впливає на цей процес і визначає максимальну кількість функціональних каналів (дозвільний механізм).

Модель катіонного струму

Потенціалзалежність чутливості до агоністу і кінетики катіонного струму

Потенціалзалежність здатності активованих G-білків підтримувати катіонний канал у відкритому стані могла відображатися у різній чутливості до агоністу, а також у різній кінетиці струму в залежності від величини мембранного потенціалу. Дійсно, тести показали, що при зміні потенціалу від -50 до 50 мВ спостерігався значний зсув концентраційної залежності амплітуди I_КАТ убік менших концентрацій КХ. Величина ЕС₅₀ зменшувалася приблизно у 20 разів, від 11 М при _50 мВ до 0, 55 М при 50 мВ. Цей ефект був цілком зворотним і легко відтворювався на одній і тій же клітині.

Зменшення уявної константи дисоціації при деполяризації, у даному випадку вірогідніше усього для реакції утворення комплексу активований G-білок/катіонний канал, теоретично повинно супроводжуватися прискоренням активації й уповільненням деактивації струму. На одній і тій же клітині КХ (50 М) подавався при потенціалах -50 і 50 мВ за допомогою надшвидкої п'езоелектричної системи. При деполяризації кінетика активації I_КАТ прискорювалася приблизно у 4 рази, а кінетика деактивації I_КАТ при відмиванні КХ уповільнювалася приблизно у 5 разів. Цікаво відзначити, що сумарний ефект прискорення активації й уповільнення деактивації давав чинник 20, що близько відповідає 16-20 кратному зменшенню ЕС₅₀ при тих же потенціалах. Латентний період відповіді також залежав від мембранного потенціалу і зростав приблизно від 160 мс при 50 мВ до 360 мс при -50 мВ.

Раніше Інове і Ізенберг (1990) для формального опису потенціалзалежності катіонної провідності застосували мінімальну схему реакції, запропоновану Кастіло і Катцем (1957), відповідно до якої потенціалзалежні переходи відбуваються лише між двома станами каналу, закритим і відкритим (рис. 12, зліва). Наведені вище результати дослідження активності поодиноких каналів свідчать, що така схема є дуже сильним спрощенням реальної ситуації, тому що є принаймні два закритих і два відкритих стани каналу. Проте, для кінетики релаксацій макроструму вирішальне значення мають переходи між двома довготривалими станами, закритим (інтервал між пачками) і відкритим. Для розрахунків (константа швидкості закривання каналу) і ' (ефективна константа швидкості відкривання каналу) були використані дані експерименту, показаного на рис. 7. Такий аналіз показав, що при активації G-білків головним чином відбувається зменшення , що відповідає збільшенню часу життя каналу у відкритому стані (у даній схемі цей час відповідає 1/). При всіх спрощеннях, цей підхід дозволяє пояснити уповільнення релаксацій катіонного струму при одночасному паралельному зсуві активаційної кривої в область менш негативних потенціалів як єдиний процес.

Аналогічно прямій активації G-білків при дії ГТФS, збільшення концентрації КХ призводило до зменшення V_1/2 і уповільненню деактивації I_КАТ під час гіперполяризуючих імпульсів, а десенситизація викликала протилежні ефекти (рис. 6). І в цих випадках, у рамках вищезгаданої мінімальної схеми реакції, відбувається в основному зміна константи швидкості закривання каналу (рис. 12, нижня панель).

Математичне моделювання потенціалзалежності латентного періоду і кінетики активації, десенситизації і деактивації катіонного струму

Оскільки мембранна провідність, а отже й амплітуда току, відповідно до рівняння Больцмана (2) є нелінійною функцією V_1/2, можна очікувати, що як стаціонарні вольтамперні характеристики, так і кінетика струму при зсуві V_1/2 повинні істотно змінюватися. Експериментально можна було поміряти стаціонарну амплітуду I_КАТ при двох різних потенціалах, V₁ і V₂, з високою роздільністю у часі шляхом подачі серії імпульсів з інтервалом в 1 с. Далі шляхом нескладних алгебраїчних перетворювань можна показати, що величини V_1/2 і Gmax визначаються таким чином:

(3)

(4)

де k - фактор нахилу активаційної кривої. На рис. 13А показано результат подібних розрахунків на основі вимірювання амплітуди I_КАТ при -40 і -120 мВ під час аплікації 50 М КХ.

Важливою перевагою математичного опису струму є можливість його відтворення при різних потенціалах (рис. 13Б) із наступним аналізом отриманих кривих. Такий аналіз показав залежність T_1/2 активації I_КАТ (час досягнення 0, 5Imax) (рис. 13В) і швидкості десенситизації струму (рис. 13Г) від мембранного потенціалу. У моделі також наявні як феномен “перетинання” струмів при різних потенціалах, так і залежність латентного періоду від потенціалу (рис. 13Б). Таким чином, добре відтворюються всі кінетичні властивості I_КАТ, які спостерігалися у вищеописаних експериментах. Дана модель генерації I_КАТ свідчить про те, що розглянуті кінетичні особливості I_КАТ по своїй природі є вторинними і цілком пояснюються основним первинним процесом - зсувом кривої активації по вісі потенціалів.

Холінергічний контроль потенціалкерованого входу Ca²⁺

Крім відкривання катіонних каналів активація мускаринових рецепторів викликає також модуляцію потенціалкерованих Ca²⁺ каналів L-типу. Раніше повідомлялося, що пригнічення I_Ca у ГМК ileum морської свинки не чутливе до коклюшного токсину (Unno et al. 1995). За фізіологічних умов пригнічення I_Ca, поряд з активацією гіперполяризуючого I_{K (Ca)} при вивільненні Ca²⁺ і десенситизації I_КАТ може служити ще одним важливим адаптивним і захисним механізмом для обмеження входу Ca²⁺ у клітину при холінергічній деполяризації.

Метою даних досліджень було з'ясування участі G-білків і порівняння ефектів КХ у відсутність ГТФ і при його додаванні до піпеточного розчину у процесі десенситизації при повторних аплікаціях КХ.

Для визначення типу G-білка, що викликає пригнічення I_Ca при активації мускаринових рецепторів, використовувався коклюшний токсин, який селективно інактивує G-білки сімейств G_i/G_o (Katada & Ui, 1982), роз'єднуючи їх зв'язок із рецептором. Коклюшний токсин блокував I_КАТ і не впливав на амплітуду I_Ca у контролі, тобто у відсутності КХ (рис. 14). У 23 клітинах I_Ca у контрольній групі був _474±48 пА (n =11), а після обробки клітин токсином амплітуда I_Ca складала _384±55 пА (P>0, 2). Амплітуда I_КАТ при аплікації КХ (50 М) у цих клітинах була _776±154 пА (n=11) і _29±12 пА, відповідно (P<0, 0001).

При аплікації КХ пригнічення I_Ca у клітинах, оброблених коклюшним токсином, було відсутнім або значно меншим (рис. 14). У контролі ефект складав 61, 9±10, 2% (n=11), а після обробки токсином - 8, 9±2, 2% (n=12) (P<0, 0001).

З метою порівняльної характеристики I_КАТ вимірювався при підтримуваному потенціалі _50 мВ, при якому Ca²⁺ канали деактивовані, а I_Ca вимірювався під час коротких імпульсів до 0 мВ, що відповідає E_rev I_КАТ. У такий спосіб досягалося надійне розділення досліджуваних струмів.

Без фіксації рівня [Ca²⁺]_i аплікація КХ викликала одночасно пригнічення I_Ca і генерацію I_КАТ. Обидва ефекти за таких умов були двофазними. Початкова швидка фаза більшої амплітуди очевидно була обумовлена вивільненням Ca²⁺ із СР, що викликало Ca²⁺-залежну інактивацію Ca²⁺ каналів (Ganitkevich et al., 1987) і додаткову активацію катіонних каналів (Inoue & Isenberg, 1990). Крім того, таке початкове підвищення Ca²⁺ мало значення і для наступного стаціонарного пригнічення I_Ca. Так, у даних експериментах стаціонарне пригнічення при першій аплікації КХ складало 50±10% (n=5), тоді як при фіксації [Ca²⁺]_i на рівні 100 нМ і при всіх інших рівних умовах I_Ca зменшувався на 27±4% (n=14) (P<0, 02).

Початкова фаза була відсутня в експериментах, у яких [Ca²⁺]_i фіксувався на рівні 100 нМ із використанням 10 мМ BAPTA (рис. 14). Спостерігалося декілька істотних розходжень у кінетиці цих двох відповідей. По-перше, I_КАТ досягав максимуму звичайно через 5-10 с, тоді як I_Ca продовжував зменшуватися протягом 1 хвилини. По-друге, у присутності КХ I_КАТ десенситизувався (0 мМ ГТФ у піпетці), а I_Ca залишався на тому ж рівні. По-третє, після відмивання КХ I_КАТ деактивувався протягом декількох секунд, тоді як відновлення I_Ca вимагало принаймні 2-3 хвилин. Це могло свідчити про участь різних G-білків або, за умови участі у відповіді того самого підтипу мускаринового рецептора і G білка, про істотні розходження у чутливості до активованих субодиниць G-білків. З метою з'ясування цих питань були проведені експерименти з повторними аплікаціями агоніста і порівняння ефектів без ГТФ і при додаванні 1 мМ ГТФ або ГДФS до піпеточного розчину. У присутності ГТФ обидва типа відповідей були стабільні у часі. Без додавання ГТФ спостерігалася швидка десенситизація I_КАТ, але не пригнічення I_Ca. Результати експериментів з додаванням ГДФS теж співпадали з уявленнями про різницю у чутливості до активованих G-білків - генерація I_КАТ повністю блокувалася при 1 мМ ГДФS, тоді як ефект пригнічення I_Ca зникав лише при 5 мМ ГДФS.

Оскільки тип мускаринового рецептора, що активує I_КАТ, був визначений, задача його ідентифікації для ефекту КХ на I_Ca зводилася до порівняльного аналізу дії мускаринових антагоністів на I_КАТ і I_Ca. У цих експериментах використовувалися М₂ селективні антагоністи гімбацин і метоктрамін, а також М₃ селективний антагоніст 4-DAMP. Порівняння ефектів для 10 досліджуваних клітин при паралельній реєстрації I_КАТ і I_Ca дало практично ідентичні результати. Це дозволяло зробити висновок, що, як і у випадку активації I_КАТ, пригнічення I_Ca викликається активацією М₂ рецепторів. Цей висновок також цілком узгоджується з чутливістю обох відповідей до дії коклюшного токсину, оскільки цей токсин не впливає на G-білки, що активуються М₃ рецепторами.

АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ацетилхолін - це основний збуджуючий нейропередатчик, за участю якого здійснюється парасимпатичний контроль скорочувальної активності усіх вісцеральних і деяких судинних гладеньких м'язів. В останні роки інтерес до вивчення механізмів дії ацетилхоліну значно зріс, що обумовлено декількома причинами. З'ясувалося, що мускаринові рецептори належать до сімейства 7-ТМ рецепторів, які передають сигнал за участю G-білків. Це припускає можливість більш складних принципів регуляції у порівнянні з іонотропними рецепторами, де іонний канал є інтегральною частиною молекули рецептора. Крім того, мускаринові рецептори практично у всіх досліджених типах гладеньких м'язів виявилися гетерогенними, в основному представленими підтипами М₂ і М₃. У зв'язку з цим виникнула необхідність визначення функції кожного з підтипів рецептора. Ставало також очевидним, що холінергічна активація - це надзвичайно складний процес з одночасним залученням багатьох ефекторів (іонні канали, ензими, вторинні посередники). Первинний сигнал від активованих агоністом рецепторів може для різних ефекторів посилюватися або послаблятися за рахунок зворотних зв'язків. Крім того, одночасна активація двох типів рецепторів залучає різні класи G-білків (як правило, G_q/11 для М₃ і G_i/G_o для М₂ рецептора) із різною специфічністю стосовно тих або іншим ефекторів.

При всій складності шляхів і механізмів передачі сигналу, можна упевнено стверджувати, що в основі холінергічного збудження і скорочення лежать деполяризація мембрани, вхід Ca²⁺ у клітину і вивільнення Ca²⁺ із внутрішньоклітинних депо. Відповідно, у даній роботі основна увага приділялася дослідженню механізмів активації катіонної провідності мембрани і холінергічного контролю Ca²⁺ каналів, а також механізмів вивільнення Ca²⁺. Як передумова, електрофізіологічний аналіз збуджуючої дії ацетилхоліну міг засновуватися тільки на детальному вивченні і розумінні властивостей іонних каналів мембрани ГМК. Були виявлені значні видові і вікові особливості в експресії тих або інших іонних каналів у ГМК кишечнику. Вхідний струм міг переноситися як через потенціалкеровані Ca²⁺, так і ТТХ-чутливі Na⁺ канали. Крім того, у культивованих ГМК кишечнику людини при пасивному виснаженні внутрішньоклітинних Ca²⁺ депо виникав вхідний струм, подібний до I_CRAC у незбудливих клітинах. В ГМК I_CRAC раніше не був зареєстрований. У ГМК ileum морської свинки Na⁺ канали відсутні, тому при холінергічній деполяризації відкриваються тільки Ca²⁺ канали L-типу. Вони ж, очевидно, виконують і основну роль підтримки рівня Ca²⁺ у внутрішньоклітинних запасниках. K⁺ канали в ГМК кишечнику представлені в основному каналами вихідного випрямлення, в ГМК ileum щура домінуючим виявився компонент швидкого вихідного току (I_A), а в ГМК ileum морської свинки - Ca²⁺-залежний компонент. Останній добре корелює із зміною [Ca²⁺]_i і виконує важливу роль реполяризації мембрани як при генерації потенціалів дії, так і для обмеження і припинення холінергічної деполяризації.

Електрична активність міентеральних нейронів також входила в коло досліджуваних проблем, тому що саме вона є тією початковою ланкою, що приводить до звільнення ацетилхоліну й інших передатчиків у нервових закінченнях, які регулюють скорочувальну активність ГМК. Іонні струми в цих нейронах були досліджені недостатньо. Особливий інтерес представляли властивості I_{K, ir}. Дослідження цього струму важливе для розуміння природи тривалої слідової гіперполяризації, характерної для нейронів AH/тип 2.

Події на мембрані і усередині ГМК, що наступають після отримання клітиною холінергічного стимулу від нейрона, логічно простежити у послідовності від активації рецептора до підвищення [Ca²⁺]_i, як показано на узагальнюючий схемі на рис. 15. Взаємодія ацетилхоліну з мускариновими М₂ рецепторами призводить за допомогою активації чутливих до коклюшного токсину G_i/G_o білків до відкривання катіонних каналів, чим обумовлена основна збуджуюча дія. Важливо відзначити, що раніше роль М₂ рецепторів вважалася непрямою і зводилася до антагонізму активації _адренорецепторів шляхом пригнічення аденелілциклази і зниження рівня цАМФ. Роль М₂ рецепторів у вісцеральних ГМК дискутується давно, а їх велика кількість (біля 80%) без визначеної прямої функції вважалася парадоксом. Слід зазначити і те, що ileum морської свинки вважається класичним “М₃-селективным“ препаратом, що широко використовується у фармакологічних дослідженнях. З'ясовування прямої ролі більшості М₂ рецепторів у цій тканині змушує переглянути такі уявлення.

Другою функцією М₂ рецепторів є пригнічення входу Ca²⁺ через канали L-типу. На перший погляд може показатися, що така дія суперечить загальному збуджуючому ефекту, але це може виконувати важливу роль обмеження входу Ca²⁺ при холінергічній деполяризації. При вході Ca²⁺ включаються декілька механізмів, що посилюють сигнал - КІВК і початкове посилення ІІВК, а зростання [Ca²⁺]_i підсилює активацію катіонних каналів, що призводить до посилення деполяризації і ще більшому збільшенню входу Ca²⁺ (рис. 15). Крім того, деполяризація збільшує як Р_о катіонного каналу, так і чутливість до агоністу. Таким чином, у даній складній системі є декілька позитивних зворотних зв'язків, що гарантують розвиток деполяризації, а сам характер потенціалзалежності I_КАТ визначає її регенеративний характер.

Механізми, що обмежують активацію, не настільки багаточисельні - це в основному розвиток I_{K (Ca)} і затримана інактивація ІІВК. Десенситизація I_КАТ, очевидно, відіграє певну роль, але у порівнянні з іншими процесами вона розвивається набагато повільніше, особливо при наявності достатньої кількості ГТФ. Вірогідно, що при багатьох патологічних станах, пов'язаних із підвищеною чутливістю до холінергічної стимуляції, порушуються саме процеси гальмування. Пригнічення I_Ca таким чином можна вважати важливим регуляторним механізмом. Цікаво при цьому відзначити, що при спільності пускових ланок (М₂-G_i/G_o) кінетика I_КАТ і пригнічення I_Ca істотно різняться. Останній розвивається повільніше і триває після відмивання агоніста набагато довше, як би даючи тим самим проявитися збудженню, а потім його припинити. Така модуляція I_Ca може бути пов'язаною з участю повільного внутрішньоклітинного посередника, який поки не ідентифіковано.

Важливо відзначити, що виявлені принципи регуляції катіонного каналу припускають, за аналогією з активацією, регенеративний характер деактивації. Якщо почалася гіперполяризація мембрани, зменшення входу Ca²⁺, потенціалзалежна деактивація каналу відповідно до кривої Больцмана, зниження чутливості до агоністу і менш тісний зв'язок з активованими G-білками є тими факторами, що будуть прискорювати закривання катіонних каналів.

Регуляція активності катіонного каналу має виражений компонент, пов'язаний із концентрацією активованих G-білків у клітині. З'ясувалося, що активовані G-білки при взаємодії з каналом не просто його відкривають, а виконують активну роль модуляції властивостей каналу. При цьому відбувається великий, на десятки мілівольт, зсув кривої активації убік від'ємних потенціалів при підвищенні концентрації агоністу і убік позитивних потенціалів при десенситизації. При цьому суттєво змінюються як форма стаціонарної вольтамперної залежності, так і кінетика струму, а запропонована модель дозволили пояснити ці зміни як похідні від первинного основного процесу зміни діапазону потенціалів активації провідності.

На закінчення можна відзначити, що зіставлення отриманих результатів з даними літератури дозволяє виявити загальні закономірності регуляції іонних каналів у мембрані ГМК при активації мускаринових рецепторів. Іони Ca²⁺, які вивільняються при активації системи М₃/G_q/11/ фосфоліпаза С, активують катіонні, Cl^- і ВК_Са канали і інактивують Ca²⁺ канали. М₂ рецептори модулюють активність каналів безпосередньо, із залученням G-білків, чутливих до коклюшного токсину (вірогідно G_i/G_o). Це призводить до відкривання катіонних каналів, пригнічення ВК_Са каналів і модуляції активності Ca²⁺ каналів.

ВИСНОВКИ

З використанням методики patch-clamp реєстрації інтегральних струмів і струмів через поодинокі іонні канали були досліджені основні ланки у складній послідовності подій, що відбуваються при М-холінергічній активації ГМК тонкого кишечнику.

Збуджуюча дія ацетилхоліну опосередкована головним чином його взаємодією з М₂ рецепторами, що шляхом активації чутливих до коклюшного токсину (КТ) G-білків призводить до відкривання катіонних каналів. М₃ рецептори визначають максимальне число активних каналів.

Вхід Ca²⁺ через канали L-типу призводить до регенеративного Ca²⁺-індукованого вивільнення Ca²⁺ із внутрішньоклітинних депо, за рахунок чого Ca²⁺ сигнал значно подовжується. Підвищення [Ca²⁺]_i викликає початкове посилення і затримане пригнічення InsP₃-індукованого вивільнення Ca²⁺. Цим визначається виникнення осциляцій [Ca²⁺]_i і катіонного струму при активації мускаринових рецепторів. Додатковий рівень регуляції Ca²⁺-залежних процесів включає пригнічення Ca²⁺ струму, опосередковане активацією М₂ рецепторів і чутливих до КТ G-білків.

Двовалентні катіони і протони модулюють катіонну провідність, проте її потенціалзалежність не пов'язана з можливим потенціалзалежним блокуванням Ca²⁺, Mg²⁺ або Н⁺.

Дослідження властивостей катіонних каналів показало, що основним є канал із провідністю біля 40 пС. Вірогідність його знаходження у відкритому стані знижується при гіперполяризації мембрани внаслідок зменшення часу життя у відкритому стані і значному збільшенні часу життя у закритому стані.

При взаємодії активованих G-білків із катіонними каналами відбувається значна модуляція їх потенціалзалежних властивостей. Активаційна крива зміщується паралельним чином на десятки мілівольт в область негативних потенціалів при підвищенні концентрації активованих G-білків і у протилежному напрямі при десенситизації. Останній процес є ГТФ-залежним. Зсув активаційної кривої в усіх випадках супроводжується істотними змінами кінетики релаксації струму.

Зсув величини V_1/2 пояснює потенціалзалежність основних кінетичних фаз катіонного струму, а саме: латентного періоду, швидкостей активації, десенситизації і деактивації, а також феномен подвійного (раннього і пізнього) “перетинання” амплітуд струму при різних потенціалах.

Холінергічна активація ГМК є складним динамічним процесом, в якому рівень мембранного потенціалу, внутрішньоклітинного Ca²⁺ і концентрація активованих G-білків є основними взаємодіючими факторами.

Практичне значення роботи заключається у встановленні функціональної ролі М₂ типу холінорецепторів і сильної потенціалзалежності чутливості до агоністу (20-кратне зменшення ЕС₅₀ при деполяризації на 100 мВ), що варто враховувати при лікуванні різноманітних захворювань, обумовлених підвищеною реактивністю до холінергічних стимулів.

Роботи, в яких опубліковані матеріали дисертації:

Байдан Л.В., Жолос А.В. Апамин - высокоспецифический и эффективный блокатор некоторых кальцийзависимых калиевых проводимостей // Нейрофизиология. - 1988. - 20, №6. - С. 833_846.

Жолос А.В., Байдан Л.В. Участие внутриклеточного кальция в активации кальцийзависимых калиевых токов в изолированных клетках кишечника морской свинки // Биологические мембраны. - 1989. - 6, №4. - С. 431-433.

Шуба М.Ф., Жолос А.В., Байдан Л.В. Угнетающее действие кофеина на потенциалозависимый кальциевый ток изолированных гладкомышечных клеток кишечника // Доклады Академии наук СССР. - 1989. - 309, №1. - С. 240-243.

Жолос А.В., Байдан Л.В., Шуба М.Ф. Калиевый ток в мембране изолированной гладкомышечной клетки, активируемый при высвобождении кальция из внутриклеточных депо // Биологические мембраны. - 1990. - 7, №3. - С. 306-316.

Шуба М. Ф., Жолос А. В., Байдан Л. В. Действие активаторов и блокаторов высвобождения Са²⁺ из внутриклеточных депо на трансмембранные ионные токи изолированной гладкомышечной клетки // Биологические мембраны. - 1990. - 7, №3. - С. 317-325.

Zholos A. V., Baidan L. V., Shuba M. F. Inhibitory action of caffeine on calcium current in intestinal isolated smooth muscle cell // Pflgers Archiv. - 1991. - 419. - P. 267-273.

Zholos A. V., Baidan L. V., Shuba M. F. Properties of the late transient outward current in isolated intestinal smooth muscle cell of the guinea-pig // Journal of Physiology. - 1991. - 443. - P. 555-574.

Жолос А. В., Шуба М. Ф. Регенеративное кальцийиндуцируемое высвобождение кальция из внутриклеточных депо гладкомышечной клетки // Доклады Академии наук СССР. - 1991. - 317, №3. - С. 735-738.

Zholos A. V., Baidan L. V., Shuba M. F. Some properties of Ca²⁺-induced Ca²⁺ release mechanism in single visceral smooth muscle cell of the guinea-pig // Journal of Physiology. - 1992. - 457. - P. 1-25.

Smirnov S. V., Zholos A. V., Shuba M. F. Potential-dependent inward currents in single isolated smooth muscle cells of the rat ileum // Journal of Physiology. - 1992. - 454. - P. 549-571.

Smirnov S. V., Zholos A. V., Shuba M. F. A potential-dependent fast outward current in single smooth muscle cells isolated from the newborn rat ileum // Journal of Physiology. - 1992. - 454. - P. 573-589.

Baidan L. V., Zholos A. V., Shuba M. F., Wood J. D. Patch clamp recording in myenteric neurons of guinea-pig small intestine // American Journal of Physiology. - 1992. - 262. - P. G1074-G1078.

Zholos A. V., Bolton T. B. G-protein control of voltage-dependence as well as gating of muscarinic metabotropic channels in guinea-pig ileum // Journal of Physiology. - 1994. - 478. - P. 195-202.

Zholos A. V., Komori S., Ohashi H., Bolton T. B. Ca²⁺ inhibition of inositol trisphosphate-induced Ca²⁺ release in single smooth muscle cells of guinea-pig small intestine // Journal of Physiology. - 1994. - 481. - P. 97-109.

Zholos A. V., Bolton T. B. Effects of divalent cations on muscarinic receptor cationic current in smooth muscle from guinea-pig small intestine // Journal of Physiology. - 1995. - 486. - P. 67-82.

Baidan L. V., Zholos A. V., Wood J. D. Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine // British Journal of Pharmacology. - 1995. - 116. - P. 1882-1886.

Zholos A. V., Bolton T. B. (1996). Properties of the muscarinic cationic channel in longitudinal smooth muscle of guinea-pig small intestine // Smooth Muscle Excitation. - London: Academic Press. - 1996. - P. 155-173.

Zholos A. V., Bolton T. B. A novel GTP-dependent mechanism of ileal muscarinic metabotropic channel desensitization // British Journal of Pharmacology. - 1996. - 119. - P. 997-1005.

Zholos A. V., Bolton T. B. Effects of protons on muscarinic receptor cationic current in single visceral smooth muscle cells // American Journal of Physiology. - 1997. - 272. - P. G215-G223.

Bolton T. B., Zholos A. V. Activation of M₂ muscarinic receptors in guinea-pig ileum opens cationic channels modulated by M₃ muscarinic receptors // Life Sciences. - 1997. - 60. - P. 1121-1128.

Zholos A. V., Bolton T. B. Muscarinic receptor subtypes controlling the cationic current in guinea-pig ileal smooth muscle // British Journal of Pharmacology. - 1997. - 122. - P. 885-893.

Pucovsky V., Zholos A. V., Bolton T. B. Muscarinic cation current and suppression of Ca²⁺ current in guinea pig ileal smooth muscle cells // European Journal of Pharmacology. - 1998. - 346. - P. 323-330.

Zholos A. V. Muscarinic effects on ion channels in smooth muscle // Neurophysiology. - 1999. - 31 (3). - C. 212-228.

Zholos A. V. Modulation of the voltage operating range of ion channels: theoretical considerations and experimental studies // Доповіді Академії наук України. - 1999. - 8. - C. 170-175.

Bolton T. B., Prestwich S. A., Zholos A. V. & Gordienko D. V. (1999). Excitation-contraction coupling in gastrointestinal and other smooth muscles // Annual Reviews in Physiology. - 1999. - 61. - P. 85_115.

Жолос А. В. Потенциирующее действие Са²⁺ на инозитол 1, 4, 5-трисфосфат-индуцируемое высвобождение Са²⁺ в гладкомышечных клетках тонкого кишечника морской свинки // Физика живого. - 1999. - 7 (1). - С. 59-69.

Zholos A. V., Baidan L. V., Starodub A. M. & Wood J. D. Potassium channels of myenteric neurons in guinea-pig small intestine // Neuroscience. - 1999. - 89 (2). - P. 603-618.

Жолос О. В. Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком'язових клітин тонкого кишечнику. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 1999.

З використанням методів фіксації потенціалу, внутрішньоклітинної перфузії і фотолізу “caged” речовин досліджувалися механізми деполяризації мембрани і підвищення внутрішньоклітинної концентрації Ca²⁺ у процесі спряження збудження і скорочення при холінергічній активації гладеньком'язових клітин тонкого кишечнику. Виявлено суттєві видові і вікові особливості в експресії і властивостях різних іонних каналів, а також дана характеристика іонних струмів у мембрані нейронів міжм'язового плетива. Надійність відповіді клітини при активації мускаринових холінорецепторів забезпечується взаємодією декількох процесів. Деполяризація мембрани внаслідок активації катіонних каналів (М₂ ефект) викликає вхід Ca²⁺ через канали L-типу, що ініціює Ca²⁺-індуковане вивільнення Ca²⁺ із внутрішньоклітинних депо. Це супроводжується додатковою Ca²⁺-залежною активацією катіонних каналів і початковим посиленням InsP₃-індукованого вивільнення Ca²⁺. Розвиток деполяризації мембрани додатково активує катіонні канали внаслідок зменшення часу їх життя в закритому стані і збільшення - у відкритому стані, а також шляхом підвищення чутливості до агоністу. Захисні процеси і деактивація забезпечуються ГТФ-залежною десенситизацією катіонної провідності, пригніченням Ca²⁺ струму (М₂ ефект), затриманою тривалою Ca²⁺-залежною інактивацією InsP₃ рецепторів і активацією гіперполяризуючого I_{K (Ca).} Діапазон активації катіонних каналів динамічно міняється у залежності від рівня активованих G-білків. На цій підставі запропонована модель генерації катіонного струму, яка пояснює його кінетичні і потенціалзалежні властивості.

Ключові слова: гладеньком'язові клітини, ацетилхолін, мускаринові рецептори, G-білки, катіонний струм, Ca²⁺ струм, Ca²⁺- і InsP₃-індуковане вивільнення Ca²⁺, десенситизація.

Жолос А. В. Мембранные и внутриклеточные механизмы М-холинергической активации гладкомышечных клеток тонкого кишечника. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03. 00. 02 - биофизика. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1999.

С использованием методов фиксации потенциала, внутриклеточной перфузии и фотолиза “caged” веществ исследовались механизмы деполяризации мембраны и повышения внутриклеточной концентрации Ca²⁺ в процессе сопряжения возбуждения и сокращения при холинергической активации гладкомышечных клеток тонкого кишечника. Обнаружены существенные видовые и возрастные особенности в экспрессии и свойствах различных ионных каналов, а также дана характеристика ионных токов в мембране нейронов межмышечного сплетения. Надежность ответа клетки при активации мускариновых холинорецепторов обеспечивается взаимодействием нескольких процессов. Деполяризация мембраны вследствие активации катионных каналов (М₂ эффект) вызывает вход Ca²⁺ через каналы L-типа, который инициирует Ca²⁺-индуцируемое высвобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо. Это сопровождается дополнительной Ca²⁺-зависимой активацией катионных каналов и начальным усилением InsP₃-индуцируемого высвобождения Ca²⁺. Развитие деполяризации мембраны оказывает дополнительный активирующий эффект на катионные каналы вследствие укорочения времени их жизни в закрытом состоянии и увеличения - в открытом состоянии, а также путем повышения чувствительности к агонисту. Защитные процессы и деактивация обеспечиваются ГТФ-зависимой десенситизацией катионной проводимости, угнетением Ca²⁺ тока (М₂ эффект), задержанной длительной Ca²⁺-зависимой инактивацией InsP₃ рецепторов и активацией гиперполяризующего I_{K (Ca).} Диапазон активации катионных каналов подвержен сложным динамичным изменениям в зависимости от уровня активированных G-белков. На этом основании предложена модель генерации катионного тока, объясняющая его кинетические и потенциалзависимые свойства.

Ключевые слова: гладкомышечные клетки, ацетилхолин, мускариновые рецепторы, G-белки, катионный ток, Ca²⁺ ток, Ca²⁺- и InsP₃-индуцируемое высвобождение Ca²⁺, десенситизация.

Zholos A. V. Membrane and intracellular mechanisms of the M-cholinergic activation of smooth muscle cells from the small intestine. - Manuscript.

Thesis for a doctor's degree by speciality 03. 00. 02 - biophysics. - A. A. Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.

The mechanisms underlying membrane depolarization and intracellular Ca²⁺ rise during cholinergic excitation-contraction coupling in intestinal smooth muscle cells were studied by use of patch-clamp techniques and flash photolysis of various “caged” substances. Important species- and age-related differences in the expression and properties of various ion channels have been found in non-stimulated cells. Ionic currents in myenteric neurones have also been characterised. Reliable cell response following muscarinic acetylcholine receptors stimulation occurs as a result of the interaction of several processes. Membrane depolarization due to cationic channel opening (M₂ receptor-mediated) evokes Ca²⁺ entry via L-type channels which initiates Ca²⁺-induced Ca²⁺ release from the intracellular store. This in turn produces an additional Ca²⁺-dependent activation of the cationic channels and an initial augmentation of the InsP₃-induced Ca²⁺ release. Developing depolarization further activates cationic channels due to the closed state shortening and the open state prolongation, as well as by sensitizing the cell to the agonist. Protective processes and deactivation involve GTP-dependent desensitization of the cationic conductance, Ca²⁺ current inhibition (an M₂ effect), delayed long-lasting Ca²⁺-dependent inactivation of the InsP₃ receptors and hyperpolarizing I_{K (Ca)} activation. The voltage range of cationic channel activation is dynamically altered depending on the level of activated G proteins. On the basis of these observations a mathematical model of the muscarinic receptor-gated cationic current generation is presented which explains its kinetics and voltage-dependent properties.

Key words: smooth muscle cells, acetylcholine, muscarinic receptors, G-proteins, cationic current, Ca²⁺ current, Ca²⁺- and InsP₃-induced Ca²⁺ release, desensitization.

канал мембрана нейрон кишечник

Размещено на Allbest.ru