Кінетичні властивості зародків в’юна у нормі та за впливу іонізуючого випромінювання

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміст

Вступ

1. Огляд літератури

1.1 Динаміка біоелектричних та метаболічних параметрів мембран зародків протягом раннього ембріогенезу тварин

1.2 Na+/K+-АТФаза, як система первинно-активного транспорту іонів Na+ та K+

1.2.1 Молекулярна організація Na+/K+-АТФази

1.2.2 Механізм функціонування Na+/K+-АТФази

1.2.3 Ізоферменти Na+/K+-АТФази

1.2.4 Регуляція активності Na+/K+-АТФази

1.2.5 Зміни активності Na+/K+-АТФази зародків протягом ембріогенезу

1.2.6 Кінетика ферментативної реакції Na+/K+-АТФази

2. Матеріали та методи досліджень

2.1 Особливості отримання ікри і характеристика ембріонального розвитку зародків в'юна

2.2 Методика виділення і очищення бластодерм зародків в'юна

2.3 Визначення Na+/K+-АТФазної активності зародків в'юна

2.4 Реактиви

3. Результати досліджень та їх обговорення

3.1 Активність Na+/K+-АТФази в'юна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різній тривалості інкубації та за умов дії НІЛВ

3.2 Активність Na+/K+-АТФази в'юна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ

4. Безпека життєдіяльності та охорона праці

4.1 Аналіз стану виробничих умов

4.1.1 Характеристика лабораторії

4.1.2 Аналіз методів досліджень та характеристика обладнання

4.1.3 Характеристика об'єкту дослідження та речовин, їх небезпечні властивості

4.2 Організаційно-технічні заходи

4.2.1 Організація робочого місця та роботи

4.2.2 Санітарно - гігієнічні вимоги до умов праці

4.2.3 Заходи безпеки при роботі з обладнанням, об'єктом дослідження та речовинами

4.2.4 Протипожежні заходи у виробничих приміщеннях

4.3 Аналіз впливу виробничих умов на довкілля

Висновки

Список використаної літератури

Вступ

ембріогенез метаболічний зародок в'юн

Актуальність теми. Мембрани - це високо впорядковані структури клітини. Плазматична мембрана відокремлює клітину від навколишнього середовища і є бар'єром з високо вибірковою проникністю [17].

Живі системи на всіх рівнях організації - відкриті системи. Тому транспорт речовин через біомембрани - необхідна умова життя [1]. Плазматичні мембрани містять транспортні системи, що регулюють молекулярний та іонний склад внутрішньоклітинного середовища [17]. Деякі з ферментів каналізують трансмембранні реакції, коли реагенти перебувають по різні сторони мембрани або коли каталітичний акт супроводжується транспортом молекул [9].

Na⁺/K⁺-активована, Mg²⁺-залежна-ATФаза (АТФ-гідролаза, уабаїнчутлива Na⁺/K⁺-ATФаза, Na⁺/K⁺-помпа, ЕС 3.6.1.37) - електрогенний Са²⁺-незалежний, Mg²⁺, Na⁺, K⁺-залежний транспортувальний білок плазматичної мембрани здійснює енергозалежне і протилежно спрямоване перенесення одновалентних іонів Nа⁺ і К⁺ (співвідношення 3:2), внаслідок чого електрохімічні градієнти підтримуються на рівні функціонування клітини у нормі. Однак, Na⁺/К⁺-АТФаза не тільки підтримує співвідношення Na⁺/К⁺ у цитоплазмі, а зумовлює збільшення рівня трансмембранного потенціалу (ТМП) й відповідає за осмотичність бластоцелю зародків в ранньому розвитку в'юна [8].

Мета роботи полягала у дослідженні характеру змін ферментативного гідролізу Na⁺/K⁺-АТФази мембран зародків в'юна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії низькоінтенсивного лазерного випромінювання (НІЛВ).

Для досягнення цієї мети у роботі вирішували такі завдання:

1. Дослідити активність Na⁺/К⁺-АТФази зародків в'юна на ранніх стадіях онтогенезу за нормальних умов;

2. Дослідити активність Na⁺/К⁺-АТФази зародків в'юна in vitro впродовж ембріогенезу за умов впливу НІЛВ;

3. З'ясувати кінетичні характеристики Mg²⁺, Na⁺, K⁺-залежної АТФ-гідролази зародків в'юна Misgurnus fossilis L.;

4. Дослідити температурну залежність Na⁺/K⁺-АТФази зародків в'юна за умов впливу НІЛВ впродовж раннього ембріогенезу.

Для досягнення мети роботи використовували біофізичні, біохімічні та статистичні методи досліджень.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні частини експериментальних досліджень, поданих у дипломній роботі, статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних літератури, а також, за участю наукового керівника, в плануванні напрямків досліджень, аналізі та інтерпретації одержаних результатів, формулюванні висновків.

Публікації за матеріалами роботи. Матеріали роботи були представлені на ІХ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2012-2013). За результатами дипломної роботи 1 тези доповіді у матеріалах міжнародної наукової конференції.

1. Огляд літератури

1.1 Динаміка біоелектричних та метаболічних параметрів мембран зародків протягом раннього ембріогенезу тварин

Плазматичні мембрани зародкових клітин є важливим центром морфогенетичних перебудов у ранньому ембріогенезі. Вони забезпечують вибіркову проникність для речовин, які транспортуються в процесі життєдіяльності клітин [11]. Завдяки клітинному метаболізму підтримується певний розподіл іонів між цитоплазмою та середовищем. Це створює значний заряд потенціальної енергії у вигляді трансмембранних та електрохімічних градієнтів, які можуть бути досить ефективно використані різноманітними формами клітинної активності [4].

У період дроблення для зародків різних тварин зареєстровано закономірну гіперполяризацію мембрани бластомерів з величиною приблизно від -5 - -12 мВ - перед утворенням першої борозни дроблення та до -34 - -67 мВ - на стадії середньої бластули.

Експерименти з додаванням уабаїну в зародках тритона та в'юна дали можливість встановити, що Na⁺/K⁺-АТФаза здійснює певний внесок у гіперполяризацію мембрани під час дроблення. У фізіологічних умовах рівень потенціалу змінюється від -20 до -60 мВ, а при додаванні уабаїну відбувається деполяризація мембрани, величина якої залежить від стадії розвитку [25].

Незрілі ооцити містять багато іонізованого калію і значно менше натрію, а їх мембрана більш проникна для К⁺. Іони натрію нагромаджуються в процесі дозрівання ооцитів. У зрілих ооцитів різко зменшується загальна іонна проникність мембрани. Проте в зигот на перших хвилинах розвитку збільшується проникність мембрани для натрію, яка поступово змінюється високою проникністю для калію [29].

На зародках Misgurnus fossilis L. показано, що до стадії 32 бластомерів (включно) калієва селективність мембрани періодично змінюється протягом клітинних поділів. В результаті роботи Na⁺/K⁺-помпи відбувається формування осмотичної рідини бластоцелю. Деякі автори припускають, що перерозподіл йонів може суттєво впливати на інтенсивність макромолекулярних синтезів у клітинах зародків протягом раннього ембріогенезу. Кафіані та Маленковим запропоновано гіпотезу, згідно якої саме іонний гомеостаз клітин є одним із найважливіших факторів регуляції функцій та процесів [3].

Однак, електрогенні катіони є не лише головним фактором електрогенезу, а також суттєво впливають на процеси внутрішньоклітинних синтезів і функціонування ферментативних систем [6].

Зниження концентрації внутрішньоклітинного калію веде до зупинки поділів бластомерів, гальмує синтез РНК і білка. Збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів калію є не тільки тригером синтезу ДНК та дроблень, а і певною компонентою мембраноспряжених процесів, які переводять клітину у новий режим функціонування [42].

У перші хвилини після запліднення різко збільшується провідність зародкових мембран для К⁺, проте активуючим фактором для яйцеклітин є “хвиля” кальцію, яка спочатку виникає на анімальному полюсі зародкової клітини і поширюється до вегетативного полюса [11]. Власне іонам кальцію відводять провідну роль у процесах раннього ембріогенезу, як універсальному месенджеру при передачі сигналів через регуляторні системи зародкових клітин. Важлива роль Са²⁺ полягає і в їх здатності до регуляції перебігу різноманітних внутрішньоклітинних процесів [30]. Із зміною концентрації внутрішньоклітинного кальцію пов'язана також і регуляція мітозу: виявлено, що Са²⁺ бере участь в процесах організації мітотичного апарату [20].

До регуляторів багатьох процесів (поділів клітин, мембранного транспорту, активності ферментів) належить внутрішньоклітинний показник протонів - pH [5]. При заплідненні яйцеклітини морського їжака виявлено періодичні коливання pH цитоплазми. Подібні результати виявили при заплідненні яйцеклітин шпорцевої жаби X. laevis. Встановлено кореляцію між рівнем pH та швидкістю поділу клітини: чим вищий pH, тим менший період поділу [28].

Протягом раннього ембріогенезу спостерігається зміна інтенсивності енергетичного метаболізму зародкових мембран [12]. Встановлено коливний характер швидкості поглинання кисню протягом синхронних поділів еластомерів зародків в'юна. Інтенсивність поглинання О₂ посилюється на стадії інтерфази, досягає свого максимуму в профазі, а його зменшення інтенсивності поглинання спостерігається на стадії телофази клітинного циклу [10]. Репін та співроб. виявили циклічні зміни метаболізму SH- груп у період дроблення морських їжаків, а також зв'язок між змінами тіолів та швидкістю синтезу білка [26].

Отже, періодичні зміни біоелектричних процесів у період дроблення зародків тварин тісно спряжені з мембранними процесами та процесами, що відбуваються у цитоплазмі та мають властивості автоколивних систем [25].

1.2 Na⁺/K⁺-АТФаза, як система первино-активного транспорту Na⁺ й K⁺

Активний транспорт - це транспорт неелектролітів та іонів проти градієнта хімічного та електрохімічного потенціалів. Цей вид транспорту пов'язаний з енергетичними затратами [17]. Розрізняють три основні типи активного транспорту іонів: натрій-калієва помпа - Na⁺/K⁺-аденозинтрифосфатаза (АТФаза); кальцієва (Са²⁺) помпа - Са²⁺-АТФаза, яка транспортує Са²⁺ із клітини або цитозолю в ендоплазматичний ретикулум; протонна помпа - Н⁺-АТФаза [2]. Активний транспорт іонів проти градієнта концентрації потребує енергії, яка виділяється при гідролізі АТФ до АДФ: АТФ = АДФ⁺Ф (неорганічний фосфат). Для активного транспорту, як і для полегшеної дифузії, характерні: специфічність, обмеження максимальної швидкості (тобто кінетична крива виходить на плато) і наявність інгібіторів.

Na⁺/K⁺-АТФазу виявлено у плазматичній мембрані фактично всіх тваринних клітин. Вона підтримує К⁺ у високій і Na⁺ в низькій концентраціях всередині клітини (порівняно із зовнішнім середовищем) [17]. Відомо, що Na⁺/K⁺-АТФаза може гідролізувати також інші нуклеотиди - ГТФ, УТФ - і забезпечувати в ході цієї реакції активний транспорт іонів натрію та калію [35]. Однак АТФ є не тільки субстратом, але і модулятором Na⁺/К⁺-АТФази, регулюючи її спорідненість до транспортуючих катіонів. Інші нуклеотиди не здатні модулювати спорідненість до транспортуючих іонів, хоча їх гідроліз також призводить до активного транспорту [7].

Іонний склад клітин (проявляють властивості живого) відрізняється від іонного складу навколишнього середовища. Найбільш істотною відмінністю є асиметрична розподіл одновалентних іонів натрію і калію.

Високе співвідношення концентрації калію у поза- і внутрішньоклітинному середовищі (1:38) підтримується завдяки роботи Nа⁺/К⁺-АТФази, активно переносить іони калію в клітину, а іони натрію - з неї (у співвідношенні 2:3 відповідно) (внаслідок активного виведення натрію з клітин Na⁺/K⁺-АТФази 85-90% всього натрію, що міститься в організмі, знаходиться в позаклітинній рідині і з цієї причини визначає її обсяг) [23].

Na⁺/K⁺-АТФаза - б/в-гетеродимерний інтегральний білок плазматичних мембран, що здійснює АТФ-залежний трансмембранний перенос Na⁺ і К⁺ в клітинах еукаріотів та прокаріот, що забезпечує підтримання електрохімічного і осмотичного градієнтів одновалентних іонів, необхідних для нормального функціонування клітин. Фермент відіграє ключову роль у реалізації численних клітинних функцій і процесів, пов'язаних з іонними градієнтами [34].

Na⁺/K⁺-АТФаза представлена глобулою, утвореною із двох пептидних ланцюгів - б/в-субодиниць [7]. Загальна молекулярна маса близько 280 кДа. У процесі роботи АТФаза поводить себе як справжня молекулярна машина [41]. Вона здійснює певні конформаційні рухи (тобто зміни просторової орієнтації структури молекул), переходячи зі стану Е₁ в стан Е₂. У результаті цього відбувається трансмембранний переносення іонів і створення активної компоненти мембранного потенціалу [23].

Активність Nа⁺/К⁺-АТФази зростає при підвищенні внутрішньоклітинної концентрації іонів натрію. Зниження її активності спостерігається при передозуванні дигоксину, а також при серцевій і нирковій недостатностях [11]. Опосередковано підвищує активність Na⁺/К⁺-АТФази інсулін. Він сприяє надходженню калію в м'язові клітини і клітини печінки, причому цей ефект не пов'язаний з впливом інсуліну на транспорт глюкози. При недостатності інсуліну, навпаки, калій виходить з клітин [19].

Катехоламіни впливають на розподіл калію по різному. В-2-адреностимулятори підвищують активність Nа⁺/К⁺-АТФази, стимулюють секрецію інсуліну і підсилюють надходження калію в клітини, а альфа-адреностимулятори надають протилежну дію [27].

1.2.1 Молекулярна організація Na⁺/K⁺-АТФази

Більшість АТФаз Р-типу, які виявлені в еукаріотичних організмів - це інтегральні мембранні білки з молекулярною масою приблизно 100 кДа [39].

Na⁺/K⁺-АТФаза входить до складу зовнішніх плазматичних мембран всіх тваринних клітин у якості інтегрального білка. Він забезпечує перетворення енергії АТФ в енергію градієнтів одновалентних іонів натрію ті калію у стехіометрії 1АТФ: 3 іони натрію: 2 іони калію [7].

Дві субодиниці - б і в - складають структурну і функціональну основу Na⁺/K⁺-АТФази [31]. Первинна структура обох субодиниць, які входять до складу Na⁺/K⁺-АТФази розшифрована завдяки методам генної інженерії в поєднанні з методами білкової хімії [41].

б-субодиниця (каталітична, молекулярна маса 90-100 кДа) пронизує ліпідний матрикс мембрани, утворюючи 10 б-спіральних трансмембранних сегментів протяжністю 4 нм кожен, які складаються приблизно з 20 амінокислотних залишків. Аналіз профілю гідрофобності показує, що поліпептидний ланцюг б-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази містить від 6 до 10 трансмембранних фрагментів, які складаються з 17-25 амінокислот, утворюють конформацію б-спіраль [41]. При цьому С- та N-кінці спрямовані у цитоплазму, й гідрофільні петлі між 2-м і 3-м та між 4-м і 5-м трансмембранними сегментами. На останній петлі розміщений активний центр ферменту. Іонні центри також розміщені на б-субодиниці [7].

N-кінцева частина поліпептидного ланцюга являє собою гнучку неспіралізовану ділянку, збагачену залишками лізину, яка бере участь у конформаційних переходах і, можливо, регулює чутливість ферменту до катіонів. У N-кінцевій частині б-субодиниці наявні 4 трансмембранні фрагменти (М1 - М4), а С-кінцевій частині - ще шість (М4 - М10). У зв'язуванні іонів беруть участь карбоксильні групи дикарбонових амінокислот, локалізованих на 3-му та 6-му трансмембранних сегментах [25].

Рис. 1 Молекулярна організація Na⁺/K⁺-АТФази у плазматичній мембрані [38]

б-субодиниця відіграє важливу роль в процесі раннього розвитку зародків. Ін'єкція зародкам шпорцевої жаби X. leavis гібридизованої мРНК каталітичної субодиниці призводить до інгібування гаструляції, а при введенні в дорзальні бластомери - до зупинки диференціації головного відділу [44].

в-субодиниця Na⁺/K⁺-АТФази (~ 40-60 кДа) забезпечує модуляцію спорідненості ферменту до іонів K⁺ та Na⁺. Вона представлена трьома ізоформами. в-1 і в-2 знайдені в різних тканинах ссавців, коли в-3-ізоформа була виявлена в амфібій, гризунів і у людини [17]. в-субодиниця представлена глікопротеїном [7]. Згідно сучасних уявлень, вона забезпечує вихід б-поліпептиду з ендоплазматичного ретикулуму, його вмонтування і правильну орієнтацію в цитоплазматичній мембрані, а також формування активного ферменту [37]. в-субодиниця також модифікує каталітичні характеристики Na⁺/K⁺-АТФазного комплексу, відповідає зо його антигенні властивості і бере участь в нейрогліальній адгезії. Безпосередньої участі в каталізі і транспорті катіонів в-субодиниця не бере, однак вона необхідна для нормального функціонування Na⁺/K⁺-АТФази, вона відіграє певну роль в регуляції зв'язування K⁺ з ферментом, разом з б-субодиницею бере участь в конформаційних переходах, які індукують зв'язування Na⁺/K⁺- АТФази з різними лігандами [15].

N-кінцевий домен в-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази розташований в цитоплазмі, а С-кінцевий домен - із зовнішньої сторони мембрани. Більша частина в-субодиниці розташована на зовнішній стороні цитоплазматичної мембрани. Поліпептидний ланцюг в-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази пронизує мембрану один раз; трансмембранний сегмент знаходиться поблизу N-кінцевого домену [34].

У зовнішньоплазматичній частині поліпептидного ланцюга в-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази є від 3 до 6 залишків аспарагіну в послідовності Asp-Ser/Thr, які потенційно можуть бути глікозильовані. Розгалужені вуглеводневі ланцюги в1-субодиниці Na⁺ /K⁺-АТФази містять в основному галактозу, манозу і N-ацетилглюкозамін, причому для складу цукрів (вуглеводів) характерна тканина специфічність. Ступінь глікозилювання відбивається на гетерогенності в-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази, тому при електрофорезі в-субодиниця представлена набором білкових смуг з М = 50 - 60 кДа [35,36].

Експресія екзогенної мРНК в1-субодиниці (мишей, курчат, щурів) в ооцити X. leavis призводили до часозалежного збільшення оуабаїн-звязуючих сайтів як в плазматичних мембранах, так і внутрішньоклітинних мембранах. Дані, отримані з використанням біфункціональних агентів, свідчать про взаємодії трансмембранного сегменту в-субодиниці з М8-М10 сегментами б-субодиниці [11].

Третій білок, г-субодиниця, також був виявлений у очищених препаратах ферменту. г-субодиниця являє собою невеликий, гідрофобний поліпептид 8-14 кДа, який вважався забруднювачем при очищенні. Однак було показано, що він може бути ковалентно поміченим фотоафінними похідними уабаїну. Інші докази того, що г-субодиниця є складовою частиною Na⁺/K⁺-помпи в тому, що ця субодиниця локалізується з б-субодиницею у нефроні сегментів. Крім того, високий ступінь гомології між г-субодиницею в декількох видів дає змогу припустити, що ця структура може бути важливою у Na⁺/K⁺-АТФазі.

Деякі дослідження показали, що г-субодиниця не потрібна для нормального функціонування Na⁺/K⁺-АТФази. Проте, останнім часом було показано, що г-субодиниці можуть змінювати залежність активації б1/в1-ізоферменту від K⁺-струму при експресії в ооцитах X. leavis [36]. Крім того, виявлено, що г-субодиниця може стабілізувати E₁ конформацію ферменту та необхідна для кавітації в мишачих ембріонах. Цікаво, що г-субодиниця належить до родини малих мембранних білків, що беруть участь при проходженні іонів через плазматичну мембрану. Це родина білків, яка здатна індукувати активність іонних каналів при експресії в ооцитах X. leavis. Фізіологічне значення цієї діяльності і чи вимагає воно інших Na⁺/K⁺-АТФазних субодиниць невідомо. Хоча з'являється все більше доказів, що г-субодиниця може змінити Na⁺/K⁺-помпу. Точна роль субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази очікує подальших експериментів [31].

1.2.2 Механізм функціонування

Як типова АТФаза Р-типу, Na⁺/K⁺-АТФаза володіє здатністю перебувати у двох основних конформаціях, володіючих високою спорідненістю до іонів натрію (Е₁) або калію (Е₂). Вихідною конформацією можна вважати Е₁, оскільки близько 70% цих молекул у цій конформації в середовищі, де відсутній і натрій, і калій [9].

Нехай спочатку в насосі «сидять» три іони натрію на своїх сайтах зв'язування і один протон на глутаматному залишку. Іони натрію можуть вийти у позаклітинне середовище тільки тоді, коли С-кінець білка поміняє своє положення і перестане затикати іонний канал і по цьому каналу піде вода, яка протонує залишок аспартату (де знаходиться сайт зв'язування для натрію). Коли іони натрію виходять у позаклітинне середовище, їм змінюють іони калію. Той протон, що був на глутаматі, переходить на аспартату, а той, що був на аспартаті, покидає білок через відкритий іонний канал. Іони калію входять у внутріклітинне середовище через один канал, а протон, який був на аспартаті, ? через інший. На зміну іонам калію приходять іони натрію. На глутаматний залишок приєднується протон, і цикл повторюється [41].

1.2.3 Ізофенменти Na⁺/K⁺-АТФази

У 1959 році Маркерт і Моллер вперше використали термін «ізоферменти» для опису окремих білків, які каталізують ті ж біохімічні реакції. З тих пір вчені шукали структурні варіанти ферментів, щоб зрозуміти їх фізіологічні функції. У деяких випадках дублювання генів або альтернативної посттранскрипційної обробки повідомлень гена призводить до утворення ізоферментів з унікальними біологічними властивостями. Розвиток декількох ізоферментів часто забезпечує функціональну універсальність клітин необхідну для виконання своїх фізіологічних потреб.

Як і у випадку багатьох інших основних білків у клітині, Na⁺/K⁺-АТФаза виражається у вигляді декількох ізоферментів. Дійсно, існують різні гени, що кодують різні молекулярні форми як б-, так і в-поліпептидів. Найбільш ранні свідоцтва структурних варіантів Na⁺/K⁺-помпи було знайдено в Artemia. У цих ракоподібних, б-субодиниці розділені на дві різні форми у SDS-поліакриламідному гелі. Вперше продемонстрував ізоформи Na⁺/K⁺-АТФази у ссавців Сведнер, який виявив дві форми б-субодиниці: вже відому ниркову б-форму і форму мозку, що назвали б⁺. Ця нова каталітична субодиниця повільніше переміщувалася SDS-поліакриламідному гелі, але була чутливішою до уабаїну. Таким чином, було показано що б⁺ відзначалася більш високою реакційною здатністю по відношенню до N-етилмалеміду, більш високою чутливістю до похідних вітаміну піротіаміну, і підвищеною стійкістю до трипсину порівняно з б-ізоформою. Ці властивості відзначали різні структурні відмінності між ізоформами. Пізніше, було продемонстровано відмінності у NH₂-кінцях б⁺ і б і запропоновано різницю у генетичних основах ізоформ. Поява методів молекулярної біології привела до ідентифікації щонайменше трьох б-поліпептидів у хребетних. В даний час відомо як б1, б2, б3. Зовсім недавно, Шамрай та Лінгрел визначили четверту б-ізоформу (б4) у насінниках щурів [36].

б-ізоформи Na⁺/K⁺-АТФази клоновані з декількох видів ссавців. Аналіз філогенетичного розподілу б-білків з використанням антитіл, спрямованих до консервативних і конкретних ділянок ізоформ вказує, що, можливо, ізоформи існують у всіх ссавців, у тому числі і плацентарних і сумчастих видів. Ідентифікація Na⁺/K⁺-помпи б-ізоформ в курячих і костистих риб показує їх повсюдну наявність серед хребетних [44]. Крім того, відкриття б-ізоформ у ракоподібних, гідри і плоских червів показує, що розбіжність генів Na/K-АТФази, можливо, сталася на початкових етапах еволюції.

Подальші дослідження показали, що молекулярна різноманітність Na⁺/K⁺-помпи також поширюється на його в-субодиницю. В даний час в трьох різних Na⁺/K⁺-АТФазах були ідентифіковані в-ізоформи. Дві ізоформи, в1 і в2, були знайдені в різних тканинах ссавців і птахів, тоді як в3 була виявлена в амфібій, миші, щура та людини.

Повну амінокислотну послідовність б-ізоформи було встановлено з кДНК, що кодують поліпептиди у щура, курчати і людини. б3-ізоформа є найменшою і складається з 1014 амінокислотних залишків, б1 - 1024, б2 - 1021, і б4 - 1028. Дослідження амінокислотної послідовності, сайт-специфічного маркування та імунологічного та протеолітичного розщеплення забезпечило деяке уявлення про можливу орієнтацію трансмембранної б-субодиниці. Ці дослідження виявили NH₂-кінцевій сегмент з чотирьох трансмембранних проміжних областей, великий цитоплазматичний домен, що складається з, приблизно, однієї третини поліпептиду і карбокси-кінцеву ділянку, що містить 6 мембранних проміжних областей.

У всіх видів ступінь ідентичності по б1- і б2-ізоформах складає ~ 92%, і більше 96% з б3. Існує також високий ступінь ідентичності (? 87%) серед б1-, б2-і б3-ізоформ. На противагу цьому, б4 є найбільш суперечливою, оскільки ступінь ідентичності з б1-ізоформою становить 78%.

Амінокислотні послідовності в-ізоформ були вивчені з кДНК пацюків, людини, курки, жаби і миш [39]. У щурів в1-ізоформа містить 304, в2-ізоформа - 290 і в3-ізоформа - 279 амінокислот. Всі в-ізоформи мають спільну основну структуру. в-ізоформи складаються з короткої NH₂-кінцевої цитоплазматичної ділянки, трансмембранного сегменту, а також великого позаклітинного домену. Гомологія в1-і в2-ізоформи для всіх видів ссавців складає ~ 95%. У інших тварин ця величина падає до 60%. У порівнянні з в1-, в2-поліпептид демонструє 58% подібності (34% ідентичністю 24% функціональною подібністю), тоді як в3-субодиниці становить 68% гомології з ідентичністю 39%. Подібність між в2 і в3 досягає 61%, при цьому 49% залишків зберігається. Цікаво, що у в2-субодиниці первинна структура більш тісно пов'язана з в-ізоформою H⁺/K⁺-помпи, ніж до в1-ізоформи, припускаючи, що гени в2 і в-ізоформи Н⁺/К⁺-АТФази розійшлися пізніше, ніж в1 і в2. Трансмембранний домен в-субодиниці є найбільш консервативною областю, як серед ізоформ, так і серед видів [31].

Усі в-ізоформи сильно глікозильовані. в1-ізоформи у ссавців мають три N-пов'язаних сайти глікозилювання. Ймовірні N-пов'язані сайти глікозилювання до в2-ізоформи варіюють залежно від виду. Таким чином, субодиниця курки має чотири потенційних сайти глікозилювання, щур має сім, людина має вісім, і миша має дев'ять в2-поліпептидів [44]. Інгібування глікозилювання в1-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази з тунікаміцину призводить до утворення Na⁺/K⁺-АТФази з нормальною спорідненістю до уабаїну. Експресія ферменту, в якому всі в-субодиниці N-пов'язаних сайтів глікозилювання мутують також робить його активним зберігаючи спорідненість до K⁺ і уабаїну. Проте, зниження в здатності неглікозильованої в-субодиниці збирати б-субодиницю і вища чутливість ферменту до протеолізу свідчать, що глікозилювання, можливо, грає роль у згортанні білка.

Ще однією важливою особливістю в структурі в1-субодиниці є наявність трьох дисульфідних містків, які в щура поліпептиду розміщені між Cys125-Cys148, Cys158-Cys174 і Cys212-Cys275. Все це цистеїн, але їх відносні позиції в послідовності зберігаються в в2 і в3-ізоформ, що свідчить про подібність у третинній структурі поліпептидів. Вплив на Na⁺/K⁺-АТФазу відновників призводить до її інактивації, тим самим припускаючи, що дисульфідні зв'язки, необхідні для функції ферменту. Видалення всього лише одного з дисульфідних зв'язків шляхом сайт-спрямованого мутагенезу із залученням цистеїну було показано, що цього достатньо, щоб зруйнувати належну структуру б/в-субодиниці.

б1-ізоформу пов'язану з в1-субодиницею виявлено майже в кожній тканині [36].

Ферментативні властивості ізоферментів Na⁺/K⁺-АТФази. Розуміння ферментативних властивостей окремих ізоферментів може допомогти у визначенні основ для складної молекулярної різноманітності, яка характеризує Na⁺/K⁺-АТФазу.

Першою спробою оцінити каталітичні властивості ізоферментів Na-насосу було порівняння спорідненості субстрату у ферментах, отриманих з клітин нирок і мозку. Ця рання робота дала змогу припустити, що Na⁺/K⁺-АТФазні ізоферменти мають чіткі відмінності в їх спорідненості до Na⁺, K⁺, і АТФ. Сведнер [31] порівняв властивості Na⁺/K⁺-помпи з клітин аксолемми та нирок щурів. У ниркового б1/в1-ізоферменту виявлено, що спорідненість до АТФ - нижча, але до K⁺ і Na⁺ - вища, ніж у нейронів, що складаються з б2 і б3-субодиниць. Також, відмінності у спорідненості до Na⁺ або K⁺ були знайдені між частково очищеними Na⁺/K⁺-АТФазами артемії та різних тканин щура.

Інші відмінності ферментативних властивостей були знайдені в б3/в2-ізоформах Na⁺/K⁺-АТФази шишкоподібної залози, яка має більш високу Na⁺-спорідненість, ніж ниркова б1/в1-ізоформа. З іншого боку, подібна кінетика спорідненості до Na⁺ і К⁺ була у Na⁺/K⁺-помпи мозочка та гіпокампа на різних стадіях розвитку, незважаючи на варіації в кількості виражених ізоформ.

Хоча деякі дослідження свідчать про відмінності у ферментативній поведінці ізоферментів Na/K-помпи, розбіжності в результатах кінетичних параметрів призводять до невизначеності у функціональних характеристиках ізоферментів. Однак, реакційні здатності ізоформ даного ферменту до уабаїну є менш суперечливими. При широкій чутливості до кардіотонічну стероїду, це особливо очевидно на ізоферментах Na⁺/K⁺-АТФази гризунів. У щурів, наприклад, б1, як повідомлялося, в 100 разів більш стійкіша до уабаїну, ніж б⁺ (б2 та б3) [44]. На основі диференціальної чутливості до трипсину, у ранніх експериментальних даних також зазначено, що б3-ізоформа має високу спорідненість до уабаїну. Працюючи з частково очищеною Na⁺/K⁺-АТФазою зі стовбура головного мозку щурів, дослідники визначили три популяції Na⁺/K⁺-помпи з різною чутливістю до уабаїну, які можливо відповідають б1, б2 і б3 [31]. У кролика, свині, собаки і людини, відмінностей в спорідненості до кардіотонічного стероїда, можливо, немає, оскільки б1-ізоформа у цих видів є набагато більш чутливою до уабаїну.

З впровадженням методів молекулярної біології в області дослідження Na⁺/K⁺-АТФази, стало можливим більш детальне розуміння функції кожної ізоформи. Наявність кДНК для різних ізоформ ферменту дало можливість здійснити дослідження у гетерологічних експресуючих системах. Деякі дослідники використовували клітини ссавців окремо виразивши кожну ізоформу Na⁺/K⁺-АТФази [31]. Через вивчення молекулярної основи різниці чутливості до серцевих глікозидів між клітинами приматів і гризунів, було показано, що б1-ізоформа щурів, може забезпечити опірність до уабаїну уабаїн-чутливих CV-1 клітин. Використавши відмінності в уабаїн-чутливості у гризунів та інших ссавців, Джервел і Ліндгрел досліджували кінетичні властивості б1-, б2-, і б3-субодиниці щурів [44]. Змінюючи два залишки в позаклітинній петлі між першим і другим трансмембранним сегментами, б2- і б3-ізоформи стають уабаїн-стійкими. Аналіз окремих ізоферментів показав, що б1/в1 і б2/в1 показують однакову спорідненість до Na⁺, К⁺ і АТФ, тоді як б3/в1-ізофермент володіє більш низькою спорідненістю до Na⁺, в порівнянні з б1/в1 і б2/в1. Згодом, високу уабаїн-чутливість встановили для б3/в1 Na⁺/K⁺-АТФази головного мозку пацюка та серця собаки, однак, мають нижчу спорідненість до Na⁺. Щоб ідентифікувати структурну основу Na⁺-залежних ізоформ, серії химерних б1/б3-субодиниць було експресовано у клітинах HeLa. Аналіз на Na⁺-спорідненості кожної химери не дав змоги виявити області відповідальної за відмінності в Na⁺-залежності між ізоформами, однак, вказав на те, що кілька залишків охоплюють б-поліпептид, які, можливо, співпрацюють зв'язуючи і транспортуючи катіон.

Експресія гібридних Na⁺/K⁺-АТФази молекул у вигляді б- і в-ізоформ у різних видів в ооцитах Xenopus також допомагає в поясненні характеристик ізоферментів Na⁺/K⁺-АТФази. Використавши гетерологічну експресію в дріжджах, які не мають ендогенної Na⁺/K⁺-АТФази, Фарлей і його колеги успішно отримали молекулу каталітично компетентної Na⁺/K⁺-АТФази шляхом експресії б1-субодиниці від овець і в-субодиниці від собаки. Пізніше, вони встановили, що константу зв'язування уабаїну для б1 (овець) і б3 (щурів) становить від 5 до 10 нм. Крім того, спільна експресія б1- та б3-ізоформи з химерних молекул між Na⁺/K⁺- і Н⁺/К⁺-АТФазами в-субодиниць показали, що в-поліпептид модулює K⁺- і Na⁺-залежність ферменту [31].

1.2.4 Регуляція активності ферменту

Активність Na⁺/K⁺-АТФази регулюється багатьма факторами. На першому місці стоїть співвідношення Na⁺/K⁺ в клітині і доступність АТФ - це фактори так званої короткотривалої регуляції активності. Вміст АТФ в клітині, як правило, мало змінюється в нормальних умовах, хоча може різко знижуватись при патологічних порушеннях. В такому випадку зниження рівня АТФ буде критичним для підтримання достатньої активності Na⁺/K⁺-помпи. Співвідношення Na⁺/K⁺ в клітині залежить від багатьох факторів і, в свою чергу, являється фактором, який регулює функціонування Na⁺/K⁺-АТФази [28].

Внутрішньоклітинні месенджери також можуть впливати на Na⁺/K⁺-АТФазу. Залежно від тканин, активація протеїнкінази може викликати збільшення або зниження активності Na⁺/K⁺-помпа. Агенти, що підвищують клітинний циклічний аденозинмонофосфат, а також екзогенні похідні цАМФ призводять до гальмування Na⁺/K⁺-АТФази в мозковій товстій висхідній гілці петлі Генле і кіркового каналу збору і стимуляції Na⁺/K⁺-АТФази в проксимальних канальцях. Фосфорилювання б-субодиниці Na⁺/K⁺-помпа зворотнє, про що свідчить зниження активності Na⁺/K⁺-АТФази після активації допамін- та цАМФ-регуляторів фосфопротеїнів (DARPP-32), ендогенного інгібітора білка фосфатази 1 (РР1). Це показує, що процес фосфорилювання/дефосфорилювання може динамічно регулювати активність Na⁺/K⁺-АТФази. Крім того, в проксимальному нефроні і в культурі клітин нирки собаки, Na⁺/K⁺-помпа інгібується форболовим ефіром або аналогами диацилгліцерину, в процесі, який включає в себе активацію протеїнкінази С (РКС) і, можливо, фосфорилювання б-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази в Ser16. Крім того, встановлено декілька інших механізмів, які пов'язані з впливом протеїнкінази на діяльність Na⁺/K⁺-АТФази. Наприклад, в клітині нефрона амфібій, PKC інгібує Na⁺/K⁺-помпу за рахунок збільшення ендоцитозу клітин та інтерналізації молекул Na⁺/K⁺-АТФази, а в окремих сегментах нефрона PKA може стимулювати фосфоліпазу А2 (PLA2), виробництво арахідонової кислоти і його метаболітів.

Активація протеїнкінази С призводить до гальмування всіх ізоферментів, активація PKA стимулює активність Na⁺/K⁺-АТФази б3/в1 і пригнічує її у б1/в1- і б2/в1-ізоферменту. Активація PKG зменшує активність б1/в1- і б3/в1- та не змінює у б2/в1-ізоферменту. Регулювання активності ізоферментів Na⁺/K⁺-АТФази викликане PKA, PKC і не залежить від змін у швидкості синтезу або деградації поліпептидів Na⁺/K⁺-помпи, а скоріше в результаті зміни молекулярної активності Na⁺/K⁺-АТФази [31].

Цікаву проблему представляє інгібування Na⁺/K⁺-ATФази серця уабаїном та іншими серцевими глікозидами. Механізм дії уабаїну і споріднених йому алкалоїдів рослинного походження на організм людини і тварин був довгий час неясним, хоча їх тривале застосування в медицині як кардіотонічних препаратів виправдовувало присвоєння їм назви серцевих глікозидів. Ізоформа Na⁺/K⁺-АТФази, що виявляють у клітинах серця, набагато більш чутлива до уабаїну, ніж, наприклад, ізоформа ферменту, що виявляють у ниркової тканини.

Інгібування Na⁺/K⁺-АТФази серцевого м'яза призводить до посилення серцевих скорочень, тобто до позитивного інотропного ефекту. Більш того, часткове інгібування Na⁺/K⁺-помпи серця викликає посилення синтетичних процесів у міокарді і збільшення м'язової маси, що важливо для збільшення ефективності роботи серцевого м'яза [33]. Чому ж Na⁺/K⁺-АТФази серця тварин має виборчої чутливістю до з'єднань, що є типовими представниками рослинного світу?

Було природно припустити, що дія уабаїну імітує ефект природних сполук, що виробляються твариною організмом і циркулюючих в кров'яному руслі. Дійсно, сироватка крові людини володіє вираженою здатністю інгібувати Na⁺/K^+-АТФазу. Інгібуючий ефект сироватки підвищується у пацієнтів з порушеннями водно-сольового обміну, що спостерігається при гіпертонії. Дослідження показали, що стероїдні сполуки, подібні уабаїну, виробляються і служать для регуляції активності Na⁺/K⁺-АТФази в організмі людини і тварин. В даний час виявлено також пептидні інгібітори Na⁺/K⁺-помпи, біологічні ефекти яких спрямовані на регуляцію активності цього ферменту в серці, нирках та інших тканинах. Наявність множинних шляхів регуляції підтверджує важливість Na⁺/K⁺-АТФази для метаболізму клітини [27].

1.2.5 Зміни активності Na⁺/K⁺-АТФази зародків протягом ембріогезу

Зміни іонного гомеостазу запускають метаболічні процеси в ядрі і цитоплазмі зигот та зародків. Електрофізіологічні дослідження свідчать про схожість плазматичних мембран ооцитів і диференційованих клітин, що пояснюється наявністю в них подібних структур і властивостей [11].

Експерименти з додаванням уабаїну в зародках тритона та в'юна встановили, що Na⁺/K⁺-АТФаза здійснює певний внесок у гіперполяризацію мембрани під час дроблення. У фізіологічних умовах рівень потенціалу змінюється від -20 до -60 мВ, а при додаванні уабаїну відбувається деполяризація мембрани, величина якої залежить від стадії розвитку [25].

Na⁺/K⁺-АТФазна активність мембран та катіонна провідність низькі у незаплідненій яйцеклітині та в зрілого ооцита, що узгоджується з низькою біосинтетичною активністю. Не випадкове і синхронне зростання мембранозв'язаних процесів після запліднення, як і короткочасне зниження рівня ТМП та активності уабаїнчутливої ATФази після завершення формування морули. Оскільки ця стадія характеризується низьким мітотичним індексом та морфогенетичною активністю ядер, підвищеними коефіцієнтами асинхронності і електричного зв'язку, то до цього моменту розвиток зародків здійснюється за рахунок генетичної інформації, яка нагромаджується протягом оогенезу в материнському організмі. У кінці періоду синхронних поділів бластомерів активуються макромолекулярні синтези, особливо масивний синтез нових мРНК, що вимагає значних енерговитрат і призводить до перерозподілу макроергів [3].

Встановлено, що активність Na⁺/K⁺-помпи змінюється періодично протягом циклу: вона максимальна в інтерфазі, та мінімальна під час мітозу [25]. Вивчення роботи Nа⁺/К⁺-АТФази на зародках морських їжаків показало, що активність цього мембранного ферменту для незаплідненої яйцеклітини та при заплідненні залишаються на одному рівні, а швидке збільшення активності Nа⁺/К⁺-АТФази відбувається від стадії бластули до стадії ранньої гаструли. Проте активність уабаїнчутливої ATФази залишається незмінною до стадії вилуплення. Подібні зміни Nа⁺/К⁺-АТФазної активності до стадії ранньої гаструли описано і для іншого виду морського їжака Hemicentrotus pulcherrimus [12].

Протягом раннього ембріогенезу зародків морського їжака S. purpuratus експериментально показано, що в порівнянні між загальною Nа⁺/К⁺-АТФазною активністю і активністю in vivo в середньому лише 51% загальної Nа⁺/К⁺-АТФазної активності є фізіологічно активною. Це виявлено при додаванні в середовище монензину, який викликає вхід Na⁺ у клітину й in vivo активує Nа⁺/К⁺-АТФазу, внаслідок чого відновлюються іонні градієнти. У зародків морського їжака додавання в середовище інкубації монензину in vivo стимулювало Nа⁺/К⁺-АТФазу, активність якої досягала максимуму. Різниця між загальною та in vivo Nа⁺/К⁺-АТФазною активністю представляє фізіологічно активний резерв ферменту в зародках [20].

1.3 Кінетика ферментативної реакції Na⁺/K⁺-АТФази

Специфічним механізмом розпізнавання іонів калію і натрію має Na⁺/K⁺-АТФаза. Вперше цей фермент був виявлений Йенсом Християном Скоу в 1957 році. За кілька років до цього (у 1953 році) Г. Шатцман описав ефект групи сполук, які називаються серцевими глікозидами, що полягає в придушенні АТФ-залежного переносу іонів натрію і калію через мембрану еритроцитів. Автор показав, що в результаті витримування клітин в середовищі з цими сполуками різниця в концентрації відповідних одновалентних катіонів по обидві сторони мембрани зменшується. Він припустив, що це відбувається внаслідок придушення активного транспорту катіонів, який у присутності глікозидів переставав компенсувати їх пасивний витік. Найбільш ефективним представником цієї групи глікозидів був строфантин G (уабаін) [35].

Й. Скоу вирішив виявити ту ферментну систему, яка забезпечує активний транспорт іонів Na⁺ та K⁺ через клітинну мембрану. Вона повинна була, на його думку, задовольняти таким умовам: здійснювати гідроліз АТФ, використовуючи цей процес як джерело енергії для перенесення іонів Na⁺ та K⁺ проти їх концентраційних градієнтів; активуватися переносяться нею іонами; інгібувати уабаїном. Для досліджень Скоу вибрав аксони краба: в нервових клітинах активний транспорт іонів яскраво виражений. Дійсно, виявилося, що гомогенат нервових клітин гідролізують АТФ і спільне присутність іонів натрію і калію активує цей процес, а уабаїн пригнічує його. З'ясувалося, що активність ферменту регулюється одновалентними катіонами - зміна співвідношення Na⁺/K⁺ в реакційній середовищі специфічно змінює активність ферменту. Оптимум активності припадає на 130 мМ Na⁺ та 20 мМ K⁺ при їх сумі 150 мМ, типової для нервових клітин.

Проте в клітині співвідношення концентрацій іонів натрію і калію протилежне тому, яке необхідне для максимальної активності Na⁺/K⁺-АТФази. У цих умовах вона становить лише 10-12%. Проте варто трохи пошкодити клітинну мембрану або іншим способом активувати вхід в клітку натрію і вихід з неї калію, як відбудеться активація АТФази та її робота буде відновлювати іонну асиметрію. Таким чином, Na⁺/K⁺-ATФаза працює в клітці як молекулярна машина з перекачування іонів натрію і калію, тому її також називають Na⁺/K⁺-помпою. Гідролізуючи АТФ, щоб забезпечити енергією активний транспорт іонів, Na⁺/K⁺-ATФаза здійснює складну багатостадійну реакцію, в якій беруть участь іони натрію, калію і магнію, а також АТФ. Фермент має лабільну структуру. Він легко змінює свою конформацію (так називають взаємне розташування та упаковку окремих частин молекули білка в просторі) залежно від того, який іон до нього приєднується.

Починається гідролітичні цикл з взаємодії білка з іонами натрію. "Натрієва" конформація ферменту (або Na-конформери) позначається як Е₁. Конформація, що володіє високою спорідненістю до калію, позначається як Е₂ (К-конформери). Перехід від К⁺- до Na⁺-конформації (Е₂-Е₁) зумовлено приєднанням натрію (витісненням калію), що й прискорює гідроліз АТФ.

Вже в перших експериментах було показано, що в присутності натрію фермент легко взаємодіє з АТФ, в результаті чого термінальний фосфат АТФ переноситься на карбокси аспарагінової кислоти білкового ланцюга, утворюючи фосфорильованний фермент (скорочено Е-Р), де Е позначає молекулу білка-ферменту, а Р - фосфорний залишок. Було показано, що гідроліз зв'язку з цим (дефосфорилювання ферменту) активується калієм, і перша схема гідролізу АТФ, що каталізується Na⁺/K⁺-ATФазою (P_i - неорганічний фосфат):

E₁ + АТФ > АДФ + E₁-P > E₂-P > E₂ + P_i [32].

При аналізі кривих доза-відповідь стосовно Na⁺, K⁺, АТФ і інгібітора уабаїну, були визначені ферментативні властивості різних ізоферментів Na⁺/K⁺-АТФази [43]. Показано, що спорідненість до Na⁺ міняється залежно від рангу системи б2/в2> б2/в1> б1/в1 = б3/в2> б3/в1. Крім того, спорідненість до K⁺ відрізняється серед ізоферментів, слідуючи послідовності б1/в1> б2/в1 = б2/в2> б3/в1 = б3/в2. При активації молекулою АТФ ферменту, що складається з б2- і б3-ізоформ значення K_m приблизно в чотири рази нижчі, ніж у б1/в1. В основному, ці результати показують те, що основні кінетичні труднощі виникають між Na⁺/K⁺-АТФазами, які відрізняються за б-субодиничним складом. Такі властивості було проспостережено у пацюків, з експресованими б1-, б2- і б3-ізоформами в клітинах HeLa [31].

2. Матеріали і методи досліджень

2.1 Особливості отримання ікри і характеристика ембріонального розвитку зародків в'юна

Об'єктом досліджень були зародки прісноводної риби в'юна Misgurnus fosslis L., які широко використовуються при дослідженні ряду проблем сучасної біології, у тому числі в ембріологічних, біохімічних, цитологічних, біофізичних та інших дослідженнях [11].

Відносно коротка тривалість періоду ембріогенезу цього виду, легкість одержання статевих продуктів і відсутність особливих труднощів в утриманні цих риб у лабораторних умовах пояснюють його популярність.

В'юн Misgurnus fossilis L. відноситься до родини в'юнових Cobitidae, ряду Карпоподібних Cypriniformes, надряду кісткових риб Teleоstei.

У природних умовах в'юн нереститься в першій половині травня при температурі води 13-140С. Відлов особин проводять з жовтня. У лабораторних умовах ікру можна отримати регулярно з жовтня по червень.

Яйцеклітини в'юна по характеру розподілу в них цитоплазми та жовтка відносяться до типу телолецитальних, а по співвідношенню цих компонентів - до поліплазматичних. Діаметр зрілої яйцеклітини (без оболонки) складає 1,17 - 1,30 мм. Оболонка яйця складається з добре розвинутої zona radiata і зовнішньої оболонки ворсинчастої будови. Ворсинки маленькі, злегка виступають над поверхнею оболонки, а при попаданні у воду стають клейкими і служать для прикріплення яєць до субстрату. Оболонка дозрілого ооцита в'юна, білкового походження, але між zona radiata і ворсинчастим шаром є тонка оболонка, яка містить багато полісахаридів. Білки, які входять до складу zona radiata, нерозчинні в водних і сольових розчинах, але розчиняються під дією трипсину [11].

У ділянці анімального полюса яйцеклітини в'юна знаходиться одне мікропіле, і являє собою лійкоподібне заглиблення поверхні оболонки, яке переходить в короткий канал. Цей каналець відкривається в цитоплазму на внутрішній поверхні zona radiata, причому діаметр кінцевого каналу відповідає діаметру головки спермія в'юна.

На анімальному полюсі, у ділянці мікропіле, розташоване ядро на стадії метафази ІІ, а біля поверхні цитоплазми знаходиться шар кортикальних альвеол. Центральна частина яйцеклітини заповнена дейтоплазматичним включенням (жовтком). В ооциті білковий жовток накопичується у вигляді гранул, які можуть досягати діаметру 4,5-4,8 мкм, а при дозріванні яйцеклітин вони залишаються у вигляді окремих структур. Жирові крапельки в жовтку відсутні.

Запліднення у в'юна зовнішнє, моноспермне. У перші секунди після запліднення жовткова оболонка відділяється від поверхні яйця і утворює перивітеліновий простір. Одночасно розпочинається стягування цитоплазми до анімального полюса яйця й утворення цитоплазматичного горбика. Тонкий шар цитоплазми оточує жовток, і, крім того, тонкі її тяжі пронизують жовток, анастомозують між собою та утворюють у середині жовтка тонку сітку. Після відділення оболонки і утворення перивітелінового простору діаметр заплідненого яйця дорівнює 1,69 мм, а діаметр власне яйця (без оболонки) 1,1 - 1,3 мм. Висота бластодиска складає 0,35 - 0,45 мм [6].

Для експерименту використовували яйцеклітини і зародки в'юна Misgurnus fossilis L., які отримували і запліднювали за методикою А.А. Нейфаха. У лабораторних умовах риб тримали в холодильнику при температурі +4-50С. Для отримання ікри самкам внутрішньом'язово вводили хоріогонічний гонадотропін за 36 годин до проведення експерименту. Залежно від пори року і розмірів самки доза гормону складала від 500 з жовтня до 250 міжнародних одиниць з лютого по червень. Овуляція наступала через 36-40 годин при температурі ⁺19ч⁺200С. Самця декапітували, сім'яники подрібнювали і заливали відстояною водопровідною водою. Запліднення ікри проводили в чашках Петрі, добавляючи суспензію сперміїв. Для задовільного запліднення ікри потрібен її контакт із спермою 5-10 хв. Потім запліднену ікру відмивали від сперміїв і інкубували при температурі ⁺21 - ⁺220С в розчині Гольтфретера. Стадії розвитку контролювали візуально під бінокулярним мікроскопом МБС-9 [18].