Кінетичні властивості зародків в’юна у нормі та за впливу іонізуючого випромінювання

Для отримання маси клітин зародків на певному періоді клітинного циклу, що являється необхідною умовою для проведення багатьох біохімічних та біофізичних досліджень, використовували штучну синхронізацію поділів клітин. Синхронізація клітинних поділів короткочасною зміною температури, на прикладі ембріональних клітин, здійснюється за допомогою температурних шоків. Зародки в'юна на стадії середньої бластули, які розвивалися при температурі 180С, поміщали на дві години в холодильник (⁺30С). Через 15 хв після підвищення температури до 180С, спостерігали максимум мітотичного індексу клітин зародків (50%). Наступний пік мітотичної активності спостерігався через 25-30 хв після першого і був значно нижчий (18%).

Після одногодинної інкубації зародків при температурі 21,50С появляються перші 2 бластомери, борозна першого поділу проходить меридіально. У подальшому вік зародків вимірюється величиною фо - умовних одиниць "Детлаф". Величина фо - тривалість одного мітотичного циклу в період синхронних поділів бластомерів становить 31±2 хв. Через півтора години після запліднення зародки представлені 4 бластомерами; борозна другого поділу проходить теж меридіально, але перпендикулярно борозні першого поділу. Вісім бластомерів з'являються на стадії 4фо, 16 бластомерів - на стадії 5ф_о. Через 3 години після запліднення зародки представлені 32 бластомерами, але борозни 5 поділу проходять паралельно екватору жовтка, в результаті чого утворюється "шапочка" на анімальному полюсі, тобто бластодиск, клітини якого не відділені від жовтка мембраною. Після цієї стадії клітини нижнього шару дотикаються до жовтка безпосередньо своєю базальною частиною, а верхні оточені зі всіх сторін ПМ. Вперше проявляються якісні відмінності між бластомерами на стадії 7фо, коли зародки представлені 64 бластомерами, які розміщенні у 2-3 шари, утворюючи "високу шапочку". На стадії 8ф_о зародки складаються із 128, а на стадії 9ф_о - 256 бластомерів, які утворюють морулу. Після цієї стадії спостерігається десинхронізація каріокінезу в клітинах. Через 6 годин після запліднення розпочинається асинхронний поділ ядер [11].

2.2 Методика виділення і очищення фракції бластодерм зародків в'юна

Виділення бластодерм із зародків та їх дисоціацію до ізольованих клітин проводили по методиці, яка опублікована раніше. Ікру без оболонок попередньо відмивали декілька раз безкальцієвим розчином Стейнберга (5 ммоль буфер трис-Cl (рН=7,4), 120 ммоль NaCl, 1,3 ммоль KCl, 2 ммоль MgSO₄7H₂O), потім поміщали в пробірки для центрифугування, у яких попередньо з допомогою нашаровування створювали градієнт сахарози: нижній шар має концентрацію 0,5 моль, верхній - 1 моль. У градієнті сахарози ікра занурюється на границі між шарами і в такому стані центрифугують 2-3 хв при 6500 g. Такої швидкості достатньо для того, щоб бластодерми відділилися від жовтка. Ізольовані бластодерми переміщуються в верхній шар сахарози, а жовток осаджується на дно пробірки. Ізоляти забирають із сахарози кінчиком піпетки і відмивають безкальцієвим розчином Стейнберга (у співвідношенні 1:10), залишають стояти 5 хв і потім повторюють процедуру 2 рази [18].

Виділення гетерогенної фракції ПМ із клітин зародків в'юна здійснювали при 0-4оС. Клітини, зібрані центрифугуванням при 100 g протягом 2 хв, суспендували в десятикратному об'ємі безкальцієвого розчину Стейнберга. Гомогенізацію проводили за допомогою гомогенізатора Поттера-Ельвенгейма в розчині, котрий містив 10 ммоль трис-Cl (рН=7,4), 5 ммоль MgCl2, 130 ммоль KCl (позначається дальше як ТМК) до руйнування не менше 95% клітин. До ТМК додавали сахарозу до кінцевої концентрації 40% (густина 1,18), після чого суміш центрифугували 20 хв при 10 000 g на центрифузі Jouan MR1812. Надосадову рідину, в якій знаходилася гетерогенна фракція ПМ, відбирали, а осад, котрий містив ядра та інші субклітинні компоненти з густиною вище 1,18 відкидали.

Слід зазначити, що на вихід ПМ суттєвий вплив здійснював спосіб зберігання клітин зародків в'юна і режим їх обробки. Оптимальним є збереження ізольованих клітин не більше 12-14 годин у безкальцієвому розчині Стейнберга в холодильнику. Після їх гомогенізації процес очищення мембран необхідно завершити в один день. Збереження клітин, гомогенату чи продуктів на проміжних етапах очищення суттєво понижує вихід мембран, який визначається по кількості білка. Очищенні ПМ можна зберігати при -20-70^оС декілька місяців [12].

2.3 Визначення Na⁺/K⁺-АТФазної активності зародків в'юна

Перед початком експерименту аліквоти суспензії мембранного препарату переносили в стандартне середовище інкубації наступного складу (ммоль/л): NaCl - 125,0; KCl - 30,0; MgCl2 - 3,0; CaCl2 - 0,01; АТР-Na2 - 3; Трис-HCl - 50,0 (рН 7,4; 21 0С). Питому активність Na⁺/K⁺-АТФази визначали за умов додавання до цього середовища відповідних інгібіторів: 1 мМ NaN3 (інгібітор АТФази мітохондрій, 0,1 мМ тапсигаргіну (інгібітор Ca²⁺, Mg²⁺-АТФази ендоплазматичного ретикулума) та 1 мМ уабаїну (інгібітор Na⁺/K⁺-АТФази плазматичної мембрани). У стандартне середовище інкубації також додавали 1 мМ EGTA для хелатування ендогенних іонів Са²⁺.

Як контроль на кількість ендогенного неорганічного фосфору у мембранах зародків використовували суспензію мембранного препарату у середовищі Гольтфретера. Ферментативну реакцію ініціювали введенням у реакційне середовище аліквоти (10 мкл) суспензії мембранного препарату, а зупиняли додаванням 10% ТХО.

Питому активність АТФазної системи досліджуваних клітин оцінювали за різницею вмісту неорганічного фосфату (Р_н), що утворився в середовищі інкубації різного складу за наявності та відсутності фрагментів мембран з урахуванням поправки на вміст ендогенного Р_і в мембранному препараті й виражали в мкмолях Р_і у перерахунку за год на 1 мг білка. Кількість продукту реакції Р_і визначали за модифікованим методом Фіске-Суббароу. Вміст білка в суспензії мембранного препарату визначали за методом О. Lowry [31].

Питому Na⁺/K⁺-ATФазну активність мембран зародків (у мкмолях Рі/год на 1 мг білка) розраховували за формулою [12]:

A = 6P_н/аМ,

де: Р_н - вміст фосфору в пробі, знайдений по кривій;

а - вміст білка в пробі;

М - молекулярна маса фосфору.

Статистичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакета для персональних комп'ютерів Microsoft Excel. Визначали такі основні статистичні показники, як середнє арифметичне значення (М), стандартну похибку (m) та середнє квадратичне відхилення ().Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

Стимуляцію риб проводили гонадотропіном хоріогонічним виробництва Московського ендокринного заводу. У дослідженнях використовували реактиви вітчизняного виробництва кваліфікації х.ч., а також Трис (SERVA), EGTA (ACROS), оуабаїн (FLUKA), ATФ-Na₂ (ACROS), тапсиргагін (SIGMA), ортованадат, NaN₃ (MERK). Перед використанням всі розчини фільтрували через фільтр діаметром пор 0,22 мкм (SIGMA) [12].

2.4 Реактиви

3. Результати досліджень та обговорення

3.1 Активність Na⁺/K⁺-АТФази в'юна misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різній тривалості інкубації та за умов дії НІЛВ

Встановлено, що залежність ферменту від співвідношення [Na⁺/K⁺] змінюється під впливом низькоінтенсивного лазерного випромінювання (НІЛВ, гелій-неонове випромінювання), як прикладу фізичного фактора [24]. З'ясування механізмів регуляції поділу клітин - один з важливих напрямків досліджень сучасної біології. Особливої уваги заслуговують зародкові клітини - бластомери, початкові стадії дроблення яких є чітко синхронізованим ритмічним процесом, що протікає з максимальною швидкістю для кожного виду тварин [11].

Згідно даних літератури, для Na⁺/K⁺-помпи характерний складний механізм регуляції її ферментативної активності, який в більшості випадків in vivo проходить на рівні біосинтезу, тобто підвищення інтенсивності експресії молекул ферменту з пропорційним їх вмонтуванням у плазматичних мембран клітин.

Встановлено, що активність Na⁺/K⁺-активованої, Mg²⁺-залежної -АТФази зародків в'юна в нормальних умовах зростає протягом ранніх етапів ембріогенезу [7]. Подібні результати були отримані на зародках морських їжаків при вивчені характеру змін Na⁺/K⁺-АТФазної активності зародків [5].

При дослідженні кінетики накопичення продукту (Р_і) Na⁺/K⁺-активованого, Mg²⁺-залежного гідролізу АТФ, впливаючи НІЛВ протягом п'яти хвилин, тривалість інкубації змінювали в діапазоні 4ч20 хв (інтервал часу інкубації становив 1 хв). Відомо, що досліджуваний фермент має два активні центри з різною спорідненістю до нуклеозидтрифосфату на різних стадіях ембріогенезу. Одержані результати свідчать про те, що лінійна залежність ферментативного гідролізу АТФ під впливом НІЛВ виходить на плато після 10 хв (час інкубації 11-20 хв.), що відбувається набагато швидше, у порівнянні з гідролізом АТФ за нормальних умов.

На стадії 2 бластомерів сопстерігається поступове підвищення активності ферменту за тривалості інкубації від 4 до 10 хв. При 10-11 хв ферментативного гідролізу АТФ відбувається повне насичення першого активного центру Na⁺/K⁺-АТФази за нормальних умов. Починаючи з 12 хв, імовірно, насичується субстратом другий активний центр АТФази зародків. Ці ж зміни ферментативної активності відбуваються і на опроміненій НІЛВ Na⁺/K⁺-АТФазі, однак повне насичення першого, та початок насичення другого активного центру спостерігається на 9-10 хв. Максимальну активність АТФази зародків виявлено на 17 хв ферментативного гідролізу, яка становить 13,5±0,297 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для нормального ферменту, та на 13 хв - 9,079±0,127 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для опроміненого. Активність виходить на плато на 17 хв, для нормальної Na⁺/K⁺-АТФази, а опроміненої - 13 хв.

Рис. 3 Активність Na⁺/K⁺-АТФази зародків в'юна на стадії першого поділу під впливом НІЛВ протягом 5 хв.: тут і надалі вірогідні зміни у порівнянні з контролем (15 хв)

* - Р >0,05;** - Р >0,01; *** - Р >0,001.

Виходячи з даних досліджень, ми можемо стверджувати що спорідненість активних центрів до субстрату знижується у опроміненого ферменту, порівнюючи з активністю ферментативного гідролізу нормальної Na⁺/K⁺-АТФази.

Аналогічні зміни відмічено і на стадії 64 бластомерів при інкубації від 4 до 11 хв. При 11-12 хв ферментативного гідролізу АТФ відбувається повне насичення першого активного центру Na⁺/K⁺-АТФази за нормальних умов. Починаючи з 13 хв, насичується субстратом другий активний центр АТФази зародків. Такі ж зміни ферментативної активності відбуваються і на опроміненій НІЛВ Na⁺/K⁺-АТФазі, однак повне насичення першого, та початок насичення другого активного центру спостерігається на 9 хв. Максимальну активність АТФази зародків виявлено на 15 хв ферментативного гідролізу, яка становить 17,7±0,2 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для нормального ферменту, та на 13 хв - 8,672±0,179 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для опроміненого. Активність виходить на плато на 15 хв, для нормальної Na⁺/K⁺-АТФази, а опроміненої - 12 хв.

Рис. 4 Активність Na⁺/K⁺-АТФази зародків в'юна на стадії шостого поділу під впливом НІЛВ протягом 5 хв

Рис. 5 Активність Na⁺/K⁺-АТФази зародків в'юна на стадії десятого поділу під впливом НІЛВ протягом 5 хв

На стадії 2 бластомерів сопстерігається поступове підвищення активності ферменту за тривалості інкубації від 4 до 6 хв. Починаючи з 9 хв, насичується субстратом другий активний центр АТФази зародків. Ці ж зміни ферментативної активності відбуваються і на опроміненій НІЛВ Na⁺/K⁺-АТФазі, однак повне насичення першого, та початок насичення другого активного центру спостерігається на 8 хв. Максимальну активність АТФази зародків виявлено на 14 хв ферментативного гідролізу, яка становить 12,7±0,2 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для нормального ферменту, та на 10 хв - 7,94±0,11 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для опроміненого. Активність виходить на плато на 14 хв, для нормальної Na⁺/K⁺-АТФази, а опроміненої - 10 хв.

3.2 Активність Na⁺/K⁺-АТФази в'юна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ

Проведено оцінку визначення температурної залежності активності ферменту за умов впливу низькоінтенсивного лазерного випромінювання (НІЛВ) червоного діапазону, тривалістю експозиції 5 хв, як прикладу фізичного фактору. При дослідженні кінетики накопичення продукту (Р_і) Na⁺/K⁺-активованого, Mg²⁺-залежного гідролізу АТФ, за умов впливу НІЛВ протягом п'яти хвилин, температуру змінювали у діапазоні 19ч26°С (тривалість інкубації становила 15 хв).

Рис. 6 Активність ферментативного гідролізу Na⁺/K⁺-АТФази мембран зародків в'юна Misgurnus fossilis L. на стадії 2-х бластомерів при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ

На стадії 2 бластомерів спостерігається куполоподіна залежність активності ферменту за інкубації при значеннях температури середовища від 19 до 26 °С. Максимальну активність АТФази зародків виявлено при температурі 23 °С, яка становить 11,609±0,867 мкмоль Рі/год на 1 мг білка, n=9.

На стадії 64 бластомерів також спостерігається куполоподіна залежність активності ферменту. Максимальну активність АТФази зародків виявлено при температурі 22 °С, яка становить 23,127±0,571 мкмоль Рі/год на 1 мг білка, n=9, та є значно вищою, за активність при нормальних умовах.

Рис. 7 Активність ферментативного гідролізу Na⁺/K⁺-АТФази мембран зародків в'юна Misgurnus fossilis L. На стадії 64-х бластомерів при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ

Рис. 8 Активність ферментативного гідролізу Na⁺/K⁺-АТФази мембран зародків в'юна Misgurnus fossilis L. На стадії 10-го поділу бластомерів при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ

Подібні зміни спостерігаються на стадії 10-го поділу, проте активність дослідного ферменту є значно нижчою, порівняно з контролем, на усіх етапах дослідження. Максимальну активність АТФази зародків виявлено при температурі 23 °С, яка становить 10,190±0,102 мкмоль Рі/год на 1 мг білка, n=9.

4. Безпека життєдіяльності та охорона праці

Науково-технічний прогрес, характерний для сучасного розвитку будь-якої галузі народного господарства країни, пов'язаний з інтенсифікацією праці, використанням більш складної техніки, що вимагає підвищення рівня профілактичної роботи для запобігання впливу небезпечних і шкідливих факторів на працюючих. Робота в сучасно обладнаних лабораторіях теж пов'язана з певною небезпекою. Саме тому для уникнення цієї небезпеки кожен співробітник повинен свідомо дотримуватися правил техніки безпеки праці.

4.1 Аналіз стану виробничих умов

4.1.1 Характеристика лабораторії

Дана дипломна робота була виконана у лабораторії кафедри біофізики та біоінформатики біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка. Приміщення лабораторії займає площу 20м². Освітлення лабораторії комбіноване: природнє і штучне. Штучне здійснюється лампою розжарювання, потужність 300 лк, природнє - через вікно, розміри якого 21,5 м². Лабораторія обладнана центральним опаленням, завдяки чому в приміщеннях підтримується стала температура +18-+20^оС, вологість повітря 40-60%, центральним водопостачанням підлога покрита лінолеумом, а стіни плиткою. У лабораторії є електрична мережа напругою 220 В, а також вентиляційна шафа для роботи з отруйними і хімічними сполуками. Встановлено 1 лабораторний і 3 письмових столи. Вентиляція приміщення здійснюється через кондиціонер, який вмонтовано у вікно і підключено до електромережі. Шум негативно впливає на функціональний стан працівника. За встановленими нормами під час роботи з мікро-електродною технікою шум в лабораторії не повинен перебільшувати 45-55 дБ (мах. 65 дБ). Швидкість руху повітря не повинна перевищуватися на рівні об'єкту і обладнання 0,1 м/с.

4.1.2 Аналіз методів досліджень та характеристика обладнання

Для одержання експериментальних даних під час виконання дипломної роботи використовуються наступні прилади і обладнання: спекторофотометр СФ-26, сушильна шафа, термостат ТС-80 М-2,центрифуги “Eppendorf 5414”, pH- метр, аналітична вага, піпетки(0,1 - 10 мл), лабораторні мікро дозатори, пробірки, чашки Петрі.

Прилади заземленні і працюють від електромережі з напругою 220 В, тому робота вимагає виконання відповідних правил техніки безпеки. Прилади і обладнання необхідно щоразу перед застосуванням оглянути і при виявленні несправностей ними заборонено користуватись. Під час експлуатації електроприладів необхідно повністю унеможливити виникнення електричного джерела згоряння внаслідок короткого замикання та перевантаження електромережі, обмежити застосування електроприладів. Електропроводи повинні мати апаратуру захисту від струму короткого замикання та інших аварійних режимів. Необхідний також вільний доступ до вимикачів електроенергії.

При виконанні даної дипломної роботи та для проведення статистичної обробки експериментальних даних використовувався персональний комп'ютер “Celeron /600”.

Правила експлуатації ПК встановлюють вимоги безпеки та санітарно - гігієнічні вимоги до обладнання робочих місць користувачів ПК працівників, що виконують обслуговування, налагодження і ремонт ПК, та роботи із застосуванням ПК, відповідно до сучасного стану техніки та наукових досліджень у сфері безпечної організації робіт з експлуатації ПК та з урахуванням положень нормативно - правових актів з цих питань (директиви Ради Європейського союзу 2005/270 СЕС, 2000/391/СЕС,98/654СЕС, 89/655СЕС, стандарти ISO).

Робочий стілець має бути підйомно - поворотним і регульованим за висотою і кутами нахилу сидіння і спинки, а також за віддалю спинки до переднього краю сидіння, при цьому регулювання кожного параметра має бути незалежним, легко здійснюваним і мати надійну фіксацію. Екран відеомонітора повинен знаходитися від очей користувача на оптимальній віддалі 600 - 700 мм, але не ближче 500 мм з урахуванням розміру алфавітно цифрових знаків символів. Висота робочої поверхі столу повинна становити 680-800 мм. Робочий стіл повинен мати простір для ніг висотою не менше 600 мм, шириною не менше 500 мм, глибиною на рівні колін не менше 450 мм і на рівні витягнутих нг не менше 650 мм. Робоче місце повинно бути обладнане підставкою для ніг, шириною не менше 300 мм, глибиною не менше 400 мм, регульованою за висотою в межах 150 мм і за кутами нахилу опорної поверхні підставки до 20⁰. Клавіатуру треба розміщувати на поверхні столу на віддалі 100 - 300 мм від краю, поверненого до користувача, чи на спеціальній, регульованій за висотою, робочій поверні столу.

Персональний комп'ютер - прилад, який випромінює електромагнітні хвилі і створює власне магнітне поле. Тому обов'язковою при роботі є наявність захисних екранів.

4.1.3 Характеристика об'єкту дослідження та речовин, їх небезпечні властивості

Об'єктом наших досліджень були яйцеклітини та зародки прісноводних риб Misqurnus fossilis L., які отримували за Нейфахом. У лабораторних умовах риб тримали в холодильнику при температурі +4 -+5^оС. Для отримання ікри, самкам внутрішньом'язево вводили гонадотропін хоріогонічний за 24-48 годин до проведення експерименту (250-500 одиниць). Овуляція наступала через 36 годин при температурі +19- +20^оС. Запліднення ікри проводили в чашках Петрі, добавляючи відстояну водопровідну воду із подрібненими сім'яниками. Вважають, що для задовільного запліднення ікри потрібен її контакт із спермою 5-10 хв. Потім запліднену ікру відмивають від сперматозоїдів і інкубують при температурі +20 - +22^оС в розчині Гольтфретера, або у відповідному середовищі, що містить досліджувані речовини, також приготовленому на розчині Гольтфретера.

При добуванні риб у водоймах (озерах, водосховищах) звичайно використовувалися плавзасоби: човни, катери, боти та ін. Плавзасоби повинні мати документи, що містять необхідні експлуатаційні характеристики і дані про райони та допустимі умови плавання. Всі особи, що виконують, які б то не були роботи на суднах повинні вміти плавати і знати прийоми рятування потопаючих.

Суттєве значення для безпеки життя мають біологічні фактори. У даному випадку об'єкт наших досліджень не є небезпечним, не створює прямої загрози здоров'ю. Проте поруч з рибою, ми постійно контактуємо з дійсно шкідливими і небезпечними чинниками природного походження - бактеріями, грибками, мікро- та макроорганізмами, які можуть бути збудниками різноманітних захворювань.

У роботі використовували розчини хімічних сполук: гонадотропін хоріогонічний (гормон), антибіотики фторхінолонового ряду, солі важких металів, серцевий інгібітор - оуабаїн, фізіологічний розчин для холоднокровних тварин - розчин Гольтфретера, який складається із наступних градієнтів (в грамах на літр): NaCl-29,221; CaCl₂- 5,549; KCl - 3,727; MgCl₂6H₂O-10,160; NaHCO₃- 4,200; EDTA (C₁₀H₁₄O₈N₂ Na₂2H₂O) - 1,860; дистильована вода. Всі вони належать до безпечних речовин.

До можливих небезпек при роботі у цій лабораторії можна віднести: отруєння (гостре або хронічне) при роботі з розчинами, поранення осколками лабораторного посуду, виникнення пожеж, а також контакт із збудниками захворювань.

4.2 Організаційно - технічні заходи

4.2.1 Організація робочого місця та роботи

Дана робота проводилася відповідно до обраної методики. У відділеннях лабораторного стола повинні бути чисті і впорядковано складені всі пристосування для кращої організації праці. Уся теоретична робота проводилася за письмовим столом, де зберігаються книжки та робочі зошити. Щоб запобігти попаданню шкідливих речовин на одяг, працювати в лабораторії слід в халаті.

До роботи в лабораторії допускаються особи, які пройшли попередній медичний огляд та інструктаж з безпеки праці. У лабораторії заборонено проводити будь-які роботи, які не пов'язані із проведенням експерименту, забороняється залишати без нагляду включені прилади. Перед виходом із лабораторії слід переконатися у тому чи виключені електроприлади.

4.2.2 Санітарно - гігієнічні вимоги до умов праці

До основних санітарно-гігієнічних вимог при роботі належать: добре освітлення і вентиляція приміщення, підтримання чистоти, наявність індивідуальної медичної аптечки. Вентиляція приміщення забезпечується наявністю вентиляційної шафи та кондиціонера, освітлення - лампами розжарювання. Чистота в лабораторії підтримується постійним вологим прибиранням, своєчасним миттям посуду після закінчення експерименту. Індивідуальна медична аптечка міститься в кутку медичної допомоги. Після закінчення роботи необхідно добре помити руки, використовуючи миючі засоби. Щоб запобігти отруєнню, в приміщенні лабораторії забороняється їсти та зберігати харчові продукти.

Режим роботи за персональним комп'ютером залежить від характеру виконуваної роботи. Наслідком довготривалої праці за комп'ютером є почервоніння очей, тремтіння повік, відчуття пощипування з подальшим зменшенням гостроти зору. Запобігти цьому можна використовуючи регламентовані перерви з метою зниження нервово-емоційного напруження, втоми зорового аналізатора, усунення впливу гіподинамії і гіпокінезії. Працюючи за комп'ютером, необхідно щогодинно робити перерву на 5 -10 хвилин, а через дві години - на 15 хвилин. Безперервна тривалість роботи за персональним комп'ютером не повинна перевищувати чотири години при восьмигодинному робочому дні.

Недотримання цих вимог приводить до неправильної постави користувача при роботі за комп'ютером, може негативним чином позначитись на стану здоров'я - болі голови, шиї, плечей.

4.2.3 Заходи безпеки при роботі з обладнанням, об'єктом дослідження та речовинами

Перед початком роботи з установкою, яка підключена до електромережі, було здійснено перевірку заземлення усіх приладів та ізоляції відкритих ділянок електромережі. Недотримання цих вимог могло привести до ураження електричним струмом. У зв'язку з цим, що в дипломній роботі використовувалися розчини антибіотиків, на колби наклеювалися етикетки з назвою даних речовин. Використані речовини і їх залишки зливались у спеціальний посуд.

На поверхні тіла риб, особливо вражених різними захворюваннями, можуть, знаходитися шкідливі мікроорганізми. Тому при огляді і обробці риби контакт з нею слід обмежити до мінімуму, а також використовувати засоби захисту рук, а після закінчення роботи провести дезінфекцію.

Для профілактики захворювання шкірних покривів використовують захисні дерматологічні засоби - мазі, пасти, креми, очисники шкіри.

4.2.4 Протипожежні заходи у виробничих приміщеннях

Під час проведення експерименту з ряду причин може виникнути пожежа. До небезпечних факторів пожежі, що діють на людину, належать: відкритий вогонь та іскра, підвищення температури повітря та предметів, токсичні продукти згоряння, дим, зниження концентрації О₂. Щоб уникнути пожежі, слід виконувати правила протипожежної безпеки: перевіряти справність електроприладів та електроустановки, ізоляцію електродротів, проводити вентиляцію приміщення, щоб запобігти збиранню вибухонебезпечних летючих речовин, не ставити поряд із нагрівними приладами легкозаймистих речовин, не допускати перегрівання приладів, не загороджувати проходів до щитків та виходу з лабораторії, користуватися заводськими запобіжниками.

На випадок виникнення пожежі необхідно мати засоби гасіння пожежі (в даній лабораторії - пісок, вода та ручний пінний вогнегасник ОХП-10), вчасно застосовувати засоби пожежної сигналізації та засоби оповіщення про пожежу.

4.3 Аналіз впливу виробничих умов на довкілля

Об'єкт дослідження, обладнання та реактиви у тих мікрокількостях, що використовуються у даній дипломнй роботі, не мають негативного впливу на оточуюче середовище. Однак, в сукупності всі ці речовини можуть шкідливо впливати на довкілля.

Висновки

У дипломній роботі відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження Na⁺/K⁺-активованого, Mg²⁺-залежного гідролізу АТФ плазматичних мембран зародків в'юна протягом періоду синхронного дроблення бластомерів в залежності від тривалості інкубації:

Ш встановлено, що залежність активності досліджуваної Na⁺/К⁺-АТФази зародкових клітин в'юна від тривалості інкубації є лінійною;

Ш максимальна активність Na⁺/К⁺-АТФази спостерігається на 14-17 хв ферментативного гідролізу АТФ (в залежності від стадії поділу зародка);

Ш встановлено, що збільшення тривалості інкубації фракції мембран зародків (від 15 до 20 хв) призводить до формування залежності ферментативного гідролізу АТФ від часу з виходом на плато;

Ш отримані результати підтверджують існування двох активних центрів АТФази зародків з різною спорідненістю до субстрату.

Проведено дослідження ферментативного гідролізу Na⁺/К⁺-АТФази зародків в'юна протягом періоду синхронного дроблення бластомерів під впливом червоного низькоінтенсивного лазерного випромінювання:

Ш максимальна активність Na⁺/К⁺-АТФази спостерігається на 10-13 хв ферментативного гідролізу АТФ (в залежності від стадії поділу зародка);

Ш спорідненість активних центрів щодо субстрату знизилась, що і призвело до сумарного зниження активності АТФази;

Ш виявлено, що температурний оптимум активності даного ферменту мембран зародків в'юна становить 22-23°С;

Ш порівнявши отримані результати з контролем, ми спостерігаємо неоднаковий вплив НІЛВ на активність ферментативного гідролізу Na+/K+-АТФази, однак куполоподібний характер зберігається.

Список використаної літератури

1. Антонов В. Ф., Черныш А. М., Пасечник В. И., Вознесенский С. А., Козлова Е. К. Биофизика. М.:Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, 2003. 288с.

2. Белоусов Л.В., Дабяган Н.В., Чунаэва М.З. Пособие к большому практикуму по эмбриологии. М., Изд-во МГУ, 1990. Ч.1 104 с.

3. Бериташвили Д.Р., Кутателадзе Т.В., Маршани Д.О. и др. Аденозинтрифосфаты в эмбриональном развитии вьюна // Онтогенез. 1974. Т. 5, № 4. С. 363-371.

4. Божкова В. П., Литинская Л. Л., Сидорова В. Ю. и др. Изменения внутриклеточного рН в клеточном цикле зародишей морских ежей в период делений дробления // Онтогенез. 1987. T.18, № 2. -С. 134-140.

5. Божкова В. П., Петряевская В. Б. Литинская Л. Л. и др. Внутриклеточный рН и темп развития у зародышей двух видов морских ежей и их гибридов // Онтогенез. 1987. T18, №6. -С.651-656.

6. Божкова В.П., Розанова Н.В. Современное состояние проблемы щелевых контактов и представление об их роли в развитии // Онтогенез. 1998. Т. 29, №1. С. 5-20.

7. Болдырев А. А. Роль Na/K-насоса в возбудимых тканях (обзор)//Journal of Siberian Federal Universiti. 2008. Т. 3, №1. С. 206-225

8. Бура М. В. Вплив рН середовища на активність Na/K-АТФазив'юна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу// Фізика живого. 2009. Т. 17, №2. С. 44-48

9. Геннис Р. Б. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. С англ. М.: Мир, 1997. 624 с. ил.

10. Гойда Е.А., Медына И.Р., Чабан В.В. и др. Роль активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы и уровня pH в регуляции ионной проводимости мембран эмбриональных клеток // Цитология. 1990. Т. 32, №9. С. 924-925.

11. Гойда О.А. Биофизические аспекты раннего онтогенеза животных. К.: Наук. думка, 1993. 224 с.

12. Голиченков В.А. Методы эмбриологических исследований: Учеб. Пособие. М.: Изд-во МГУ, 1996. 177 с.

13. Ємчик Л.Ф., Кміт Я.Я. Медична і біологічна фізика. Львів: Світ, 2003. 592 с.

14. Жидецький В.Ц., Джигерей В.С. Безпека життєдіяльності.Львів: Афіша, 2000. 246 с.

15. Жидецький В.Ц., Джигерей В.С., Мельников О.В. Основи охорони праці.Львів: Афіша, 1999. 348 с.

16. Захаров Я.І. Техническая безопасность в химической лаборатории. М.: Химия, 1986. 182 с.

17. Костюк П.Г., Гродзинський Д. М., Зима В. Л., Магура И. С., Сидорик Е. П., Шуба М. Ф. Биофизика К.: Выща шк. Гол. изд-во, 1988. 504 с.

18. Луцик М.Д., Кусень С.И., Лук'яненко А.В. Очистка и частичная характеристика плазматических мембран клеток зародышей вьюна // Онтогенез. 1986. Т. 17, №3. С. 314-321.

19. Медына И. Р., Гойда Е. А., Брежестовский П. Д. Механочувствительные калиевые каналы один из факторов колебаний потенциала покоя в раннем эмбриогенезе вьюна // Биол. мембраны. 1988. Т. 5, № 9. С. 960-969.

20. Нейфах А. А., Тимофеева М. Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологии развития. М.: Наука. -1978. 336 с.

21. Пожежна безпека. Нормативні акти та інші документи. В 2-х т.-К.: Основа, 1997. т.2. 448 с.

22. Правила охорони праці під час експлатації електроннно-обчислювальних машин.К., 1999.

23. Репин В.С. Критические факторы химической регуляции развития. М.: Медицина, 1980. 244 с.

24. Романюк М., Мандзинець С., Бура М., Санагурський Д. Оцінка кінетичних параметрів зв'язування іонів Na+/K+-АТФазою зародків в'юна впродовж раннього ембріогенезу// “Молодь і поступ біології”, Львів, 3-6 квітня, 2012 р.

25. Санагурський Д. І. Об'єкти біофізики: Монографія. Львів. Видавничий центра ЛНУ імені Івана Франка, 2008. 522 с.

26. Умарова Ф.Т., Белоногова О.В., Лихтенштейн Г.И. Влияние сердечных гликозидов на внутримолекулярную динамику Na⁺, K⁺ АТФази // Биологические мембраны. 1995. Т.12, №1. С. 39-49.

27. Целевич М. В. Мандзинець С. М., Санагурський Д. І. Кінетичні характеристики Na⁺, K⁺-АТФази клітин зародків в'юна // Вісник Харків. ун-ту ім. В. Н. Каразіна. Серія Біофізичний вісник 2008. Вип. 1 (20). С. 28-36.

28. Целевич М. В., Мандзинець С. М., Санагурський Д. І. Na⁺, K⁺-АТФ-азна активність мембран зародків в'юна Misqurnus fossilis L. при дії антибіотиків // Фізіол. журн. 2004. Т. 50, №5. С. 64-68.

29. Целевич М. В., Фафула Р. В., Галан М. Б., Санагурський Д. І. Ідентифікація Ca2⁺-активованої, Mg2⁺-залежної АТP-гідролазної ферментативної активності мікросомної фракції мембран зародків в'юна (Misgurnus fossilis L.) // Укр. біохім. журн. 2007. Т. 79, №1. С. 53-57.

30. Albers R.W., Koval G.J. Sodium-Potassium-activated Adenosine Triphosphatase. VII. concurrent inhibition of na⁺-k⁺-adenosine triphosphatase and activation of k⁺nitrophenylphosphatase activities. // J. Biol. Chem.1972. Vol. 247.P. 3088-3092.

31. Blanco G., Mercer RW., Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function // Am J Physiol Renal Physiol 275:F633-F650, 1998.

32. Doris P.A. Regulation of Na, K ATPase by endogenous ouabain like materials // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1994. Vol. 205. P. 202-212.

33. Eakle K.A., Kabalin M.A., Wang S.G. et al. Influence of beta subunit structure on the stability of Na⁺/K(⁺)ATPase complexes and interaction with K⁺ // J. Biol. Chem.1994. -Vol. 269. P. 6550-6557.

34. Feschenko M.S., Sweadner K.J. Structural basis for species-specific differences in the phosphorylation of Na⁺, K⁺-ATPase by protein kinase C // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 14072-14077.

35. Fiedler B., Scheiner-Bobis G. Transmembrane Topology of б and в Subunits of Na⁺, K⁺-ATPase Derived from в-Galactosidase Fusion Proteins Expressed in Yeast // J. Biol. Chem. -1996. Vol. 271. P. 29312-29320.

36. Geering K., McDonough A.A., Farley R.A. The sodium pump needs its beta subunit // FASEB J. 1990. Vol. 4. P. 1598-1605.

37. Goldshleger R, Tal D.M., Karlish S.J. Topology of the б-subunit of
Na⁺, K⁺-ATPase based on proteolysis. Lability of the topological organization // Biochemestry. 1995. Vol. 34. P. 8668-8679.

38. http://themedicalbiochemistrypage.org/membranes.php

39. Jorgensen P.L., Deguchi N., Maunsbach A.B. Ultrastructure of the sodium pump: сomparison of thin sectioning, negative staining, and freeze-fracture of purified, membrane-bound (Na⁺, K⁺)-ATPase // J. Cell Biol. 1977. Vol. 75. P. 619-634.

40. Leong P. K., Manahan D. Metabolic importance of Na⁺ / K⁺-ATPase activity during sea urchin development // J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200. P. 2881-2892.

41. Poulsen H., Khandelia H., Morth J. P., Bublitz M., Mouritsen O. G., Egebjerg J., Nissen P. Neurological disease mutations compromise a C-terminal ion pathway in the Na+/K+-ATPase. // Nature. V. 467. P. 99-102. 02 September 2010.

42. Souza M.M., Gross S., Boyle R.T. et al. Na⁺ / K⁺-ATPase inhibition during cardiac myocyte swelling: involvement of intracellular pH and Ca2⁺ // Mol. Cell Biochem. 2000. Vol. 210 (1-2). P. 173-183.

43. Therien A. G., Blostein R. Mechanisms of sodium pump regulation // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. Vol. 279. P. 541-566.

44. Woo A. L., James P. F., Lingrel J. B. Sperm motility is dependent on a unique isoform of the Na, K-ATPase // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, No 27. P. 20693-20699.

Размещено на Allbest.ru