Механізми антитілоіндукованої модуляції кальцієвого гомеостазу в клітинах-мішенях

Размещено на http://www.allbest.ru

Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

03.00.13. - Фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора біологічних наук

Механізми антитілоіндукованої модуляції кальцієвого гомеостазу в клітинах-мішенях

Янчій Роман Іванович

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця

Національної Академії Наук України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, Алексєєва Ірина Миколаївна, Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, завідуюча відділом імунології та цитотоксичних сироваток

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Курський Михайло Дмитрович Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, головний науковий співробітник відділу біохімії сенсорних і регуляторних систем

доктор біологічних наук, академік УААН, Коваленко Віктор Федорович, Полтавський Інститут свинарства УААН, завідувач лабораторії фізіології відтворення і трансплантації

доктор мед.наук, професор, чл.-кор. АПН, Шевчук Віктор Григорович, Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, завідувач кафедри нормальної фізіології

Провідна установа: Київський національний університет ім.Тараса Шевченка, кафедра фізіології людини і тварин, м. Київ

Захист відбудеться 18.09.2001 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-96.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4).

Автореферат розіслано 17.08.2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Експериментальними та клінічними дослідженнями встановлено й неодноразово підтверджено нагромадження в процесі захворювань аутоантитіл, що можуть негативно впливати на функціональний стан організму людини і тварин. Всебічне вивчення імунних факторів у патогенезі багатьох захворювань серця - атеросклероз, інфаркт міокарду, міокардити, ревматизм, кардіоміопатії, імунодефіцитні стани тощо (Климов, 1986; Bestetti, 1989; Носов, 1992; Yuhua et al,1996; Lauer et al, 2000), статевої системи - запальні процеси, розвиток передчасної недостатності яєчників, їх пошкодження після повторних пункцій фолікулів з метою екстракорпорального запліднення, безпліддя тощо (Wheaterolf et. al.,1994; Niauri, 1995; Гоцуляк, 1998) із всією переконливістю розкрило кореляцію між наявністю антитіл, висотою їх титру з одного боку і патоморфологічними змінами в органах і тканинах - з іншого.

З метою моделювання дії аутоантитіл в експерименті успішно використовують гетерологічні та моноклональні антитіла. Зокрема, за допомогою антикардіальних цитотоксинів відтворюють дистрофічні пошкодження серцевого м”язу (Антоненко, 1979; Yamaguchi, 1999), порушення кардіо- і гемодинаміки (Сагач, 1986; Felix et. al, 2000), структурних змін коронарних судин і міокарду під впливом імунної травми (Мойбенко, Сагач, 1992; Laguens et al., 1999). Оваріоантитіла спричиняють вплив на функцію яєчників самок тварин та їх естральний цикл, електрофізіологічні особливості ооцитів (Зеленська, 1987; Jin et al.,1994; Гoцуляк,1998), пригнічують Са2+-струм і гаметогенез (Гоцуляк, 1998; Блашків, 2000). Поруч із вираженою агресивною дією активно вивчаються можливості і практичного використання полі- і моноклональних антитіл як ефективних терапевтичних (Спасокукоцький та ін., 1977; Ільчевич та ін.,1986; Choy,1995; Baron, 2000; Алексєєва, Янчій, 2001), діагностичних засобів (Owens,1994; Голованова, 1995, Павлюк та ін., 2000) та з метою ідентифікації мембранних білків, іонних каналів, рецепторів тощо (Старостіна та ін.,1997; Skok et.al, 1999).

Стає ясним, що вивчення афінності антитіл важливе для з”ясування механізму розвитку реакції антиген-антитіло і її функціонального значення для біології та медицини. Це вимагає детального з”ясування механізму дії антитіл у динаміці цитотоксичної реакції антиген-антитіло з метою пошуку протекторних засобів при імунних пошкодженнях організму. Завдяки науковим здобуткам маємо відомості про вплив супротисерцевих антитіл на зміну біохімічних і ферментативних реакцій у серцевому м”язі (Ігрунова, 1988; Курський та ін.,1992; Schulze et al.,1999), скоротливу здатність та іонну проникливість кардіоміоцитів (Ходоров та ін.,1971; Янчій,1980; Morad, 1988; Yuhua, 1996; Boutjdir et al,1998).

Протисерцеві антитіла можуть виявляти свою дію безпосередньо на білкові структури, що здійснюють іонний транспорт (Schultheiss, 1988), або порушувати проникність мембран шляхом стимуляції комплексом антиген-антитіло фосфоліпазної активності з подальшим утворенням біологічно-активних речовин - ейкозаноїдів (Clancy,1983). Їх дія, як вважають (Hogaboom et al., 1983; Tominada et al., 1993), може бути пов”язана зі зміною трансмембранного транспорту Са2+, відіграючи суттєву роль у порушенні кардіо- і гемодинаміки при імунних реакціях.

Разом із тим зміна електрофізіологічних і біохімічних властивостей серцевого м”яза (Янчій,1980; Чередніченко та ін.,1986; Ільчевич та ін.,1986; Fuch et al.,1997) при дії антитіл засвідчує, що одним із важливих чинників у розвитку цитотоксичного імунного пошкодження серця є прогресуюче підвищення рівня [Са2+]і (Yahua et al.,1996; Wallukat et al.,1999), яке супроводжується розвитком некрозів міокарду (Шаров,1985).

Однак важливі аспекти першочергових молекулярних змін функціонального стану мембрани збудливих клітин, що відіграють вирішальну роль в перерозподілі внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ при формуванні і розвитку цитотропної дії антитіл на клітини-мішені (кардіоміоцити і ооцити) все ще залишаються нез”ясованими. Грунтовного дослідження вимагає також роль біологічно-активних речовин і, зокрема ейкозаноїдів, у даному процесі, оскільки імунні впливи є могутнім стимулом для їх утворення (Сагач, Жукова, 1991).

У той же час вивчення антитілозалежних процесів, які призводять до коливань [Са2+]і, неможливе без достеменного дослідження клітинних механізмів у складному ланцюгу змін кальцієвого гомеостазу, а саме: 1) активного й пасивного транспорту іонів Са2+ в клітину і її енергетичного стану; 2) захоплення і вивільнення Са2+ із внутрішньоклітинних депо при розвитку скоротливих реакцій серцевого м”язу; 3) антитілоіндукованого Са2+-стимулюючого ооцитогенезу.

Мета роботи полягала в з”ясуванні антитілоініційованих механізмів, що впливають на рівень [Са2+]і у цитоплазмі кардіоміоцитів та ооцитів ссавців, а також у вивченні дії специфічних антитіл на гаметогенез та репродуктивну систему тварин.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі конкретні завдання:

1. Дослідити дію ксеногенних поліклональних антитіл, специфічних до мембран кардіоміоцитів і саркоплазматичного ретикулуму, на механічну та електричну активність серцевого м”яза та ініційовані антитілами процеси перекисного окиснення ліпідів і шляхи метаболізму арахідонової кислоти.

2. Вияснити механізми функціональних змін внутрішньоклітинного кальцію при дії антитіл у розвитку тонічного напруження серцевого м”яза, трансмембранного пасивного іонного транспорту, фазних змін механічної активності в залежності від концентрації антитіл і тривалості їх дії.

3. З”ясувати вплив антитіл на іонні струми кардіоміоцитів за умов фармакологічного виключення (блокування) Na+, Ca2+ та K+ каналів) та на функціонування транспортних АТФаз (Na+,К+- та Са2+-АТФази) і динаміку вивільнення та захоплення Са2+ ізольованими везикулами саркоплазматичного ретикулуму.

4. Охарактеризувати антитілоопосередковані зміни функціонального стану скоротливих білків міоцитів, ріанодин-чутливих Са2+-депо, інозитол-3 фосфату та активності NO-синтази і їх участі в регуляції скорочення серцевого м”язу. кальцієвий гомеостаз серцевий м'яз

5. Вивчити механізми антитілозалежних змін кальцієвого гомеостазу в ооцитах ссавців та його вплив на гаметогенез (відновлення мейотичного дозрівання ооцитів).

6. На основі отриманих даних щодо Са2+-ініціюючої дії антитіл на кардіоміоцити і ооцити з”ясувати механізм дії оваріоантитіл на фолікуло- і оогенез. Розробити технологію одержання імунного препарату - стимулятора статевої функції, дослідити його дію на репродуктивну систему і відтворюючу здатність тварин.

Наукова новизна. В процесі виконання роботи вперше здійснено системне дослідження дії антисарколемальних та моноклональних антитіл і антитіл до мембран СПР на електричну активність та скоротливу здатність (трансмембранні потенціали дії, іонні струми, ізометричне скорочення та тонічне напруження, активність транспортних АТФаз) смужок серця, ізольованих кардіоміоцитів ссавців. Встановлена фазність в дії антимембранних антитіл на серцевий м”яз щура і морської свинки - їх активуючий і пригнічуючий ефекти, що детермінуються як дозою, так і тривалістю їх дії.

З”ясовано, що первинна реакція клітини-мішені на дію антитіл при утворенні комплексу антиген (клітинна мембрана)-антитіло пов”язана з ініціацією потенціалозалежного входження іонів Ca в клітину. Експериментально вперше досліджено дію антитіл на процеси перекисного окиснення, метаболізм і шляхи окиснення арахідонової кислоти, функціонування іонотранспортних АТФаз. Показано, що антимембранні супротисерцеві антитіла викликають ініціацію процесу перекисного окиснення ліпідів. Фармакологічне блокування перекисного окиснення зменшує пригнічуючу дію антитіл на активність Na+,К+-АТФази i Ca2+-Mg2+-АТФази кардіоміоцитів.

Виявлено, що антисарколемальні та моноклональні антитіла пригнічують функцію Ca2+-Mg2+-АТФази, а також зменшують швидкість захоплення іонів кальцію структукрами СПР. Показано, що внутрішньоклітинне збільшення концентрації іонів кальцію при дії антитіл не пов”язане з ініціацією останніми інозитол-3-фосфатної системи та 5'-нуклеотидази. Блокування NO-синтази посилює дію антитіл в ініціації та розвитку тонічного напруження серцевого м”язу щура.

Уперше досліджено дію антитіл на розвиток тонічного напруження папілярного м”язу серця з використанням демембранізованих смужок і вияснено роль змін функціонального стану скоротливих білків кардіоміоцитів при формуванні механічної активності в розвитку реакції антиген-антитіло. Посилення тонічного напруження серцевого м”яза і збільшення амплітуди скорочення при дії антитіл реалізуються не тільки ініціацією потенціалозалежного входження іонів кальцію, але і їх прямим кальційвивільняючим ефектом із внутріклітинних Са2+ депо СПР.

Дослідженнями вперше встановлена антитілозалежна індукція окислення арахідонової кислоти і участь її метаболітів - ейкозаноїдів у розвитку цитотропної реакції антиген-антитіло на мембрані міоцитів. Так, блокування ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти більшою мірою, ніж циклооксигеназного, але меншою мірою, ніж виключення Ca2+ каналів, запобігало розвитку стимулюючого ефекту антитіл на тривалість ПД і скорочення.

У результаті досліджень впливу антитіл на функціональний стан іонотранспортних систем та пов”язаних з ним змін внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу вперше показано, що початкова реакція на взаємодію антимембранних антитіл з клітиною зумовлена безпосередньою активацією ними вхідного струму, що в поєднанні з ініціацією вільно-радикального окиснення і метаболізму арахідонової кислоти призводить до збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+. Пригнічуюча дія антитіл на електричну активність і скоротливу здатність опосередкована через кальційзалежну активацію калієвих каналів та зниження чутливості скоротливих білків до іонів кальцію.

Експериментально показано, що при дії супротисерцевих антитіл зініційоване ними підвищення внутрішньоклітинної концентрації кальцію є головним чинником в порушенні електро-механічного спряження в міоцитах, розвитку тонічного перенапруження, що супроводжується незворотніми змінами внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу при імуногенному ураженні серця.

Використовуючи методи внутрішньоклітинного мікроелектродного відведення потенціалів дії і фіксації мембранного потенціалу, уперше досліджено дію оваріальних антитіл на електрофізіологічні властивості оолеми яйцеклітин тварин (корів, свиней) і виявлено їхній вплив в посиленні вхідного кальцієвого струму. З”ясовано дію оваріоантитіл і розкрито механізм їх стимулюючого впливу на фолікуло- і оогенез, що має практичне значення для створення допоміжних репродуктивних технологій у медицині і агропромисловому комплексі. Отримані фундаментальні дані щодо антитілозалежної ініціації кальцієвого сигналу в кардіоміоцитах і статевих клітинах та їх впливові на відновлення мейотичного дозрівання жіночих гамет.

Практична цінність роботи полягає у встановленні механізмів внутрішньоклітинних антитілозалежних змін кальцієвого гомеостазу в клітинах скоротливого міокарду та ооцитах ссавців. Отримані в роботі дані про ініційоване антитілами потенціалозалежне входження іонів Са2+ в клітину та індукована ними дія на Са2+-депо дають основу для пошуку і розробки нових лікарських засобів для профілактики і лікування серцево-судинних недуг імуногенної етіології. Натепер найпоширенішим терапевтичним засобом для лікування серцево-судинних розладів імунного генезу є Са2+-обмежуючі і блокуючі засоби та пошук нових мембраностабілізаторів клітинних фосфоліпідів. Виявлена в дослідах ініціація антитілами вільно-радикального окислення в клітинах міокарду дає основу для використання інгібуючих засобів при посиленні перекисного окиснення ліпідів з метою запобігання неконтрольованого входження іонів Са2+ в клітину при її збудженні та пригнічення функції транспортних АТФаз. З”ясовано, що блокування ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти є недостатнім засобом для запобігання антитілозалежного пошкодження міокарду. Тільки комплексне, поєднане застосування блокаторів ПОЛ і іонотранспортних систем ефективно запобігає розвитку цитотоксичного Са2+ перевантаження кардіоміоцитів, що може бути зініційоване циркулюючими в крові аутоантитілами. Встановлення нових факторів дії оваріоантитіл на здатність ооцитів відновлювати in vivo мейоз має практичне значення для розробки нових методичних підходів для регуляції репродуктивної функції ссавців та слугувати базою для прикладних досліджень з метою розробок допоміжних біотехнологій у репродуктивній медицині та тваринництві. Розроблений і отриманий на основі фундаментальних досліджень препарат - антиоваріальна цитотоксична сироватка, специфічна для корів (АОЦС-к) - (Патент України за №19904 від 25.12.1997 р.) успішно пройшов виробничі випробовування на тваринницьких комплексах України, Білорусі та Росії і рекомендований Фармакологічним комітетом (реєстраційне посвідчення №10.07.22-92 ОВФП-е) для використання. Отримані результати були використані при читанні курсу нормальної фізіології на кафедрі Медичного інституту УАНМ, на кафедрі фізичної і біомедичної електроніки Національного технічного університету “Київський політехнічний інститут” та природничому факультеті університету “Києво-Могилянська академія”.

Апробація роботи. Основні положення дисертації викладено та обговорено на Х Міжнародному конгресі з досліджень серця (Москва, 1980); III Республіканській науковій конференції молодих вчених-медиків України (Чернівці, 1981); Всесоюзній конференції “Актуальні проблеми сучасної патофізіології (Київ, 1981); III Всесоюзному з”їзді патофізіологів (Тбілісі, 1982); XIV Всесоюзному з”їзді фізіологів (Баку, 1983); “Всесоюзному симпозіумі “Фізіологія і патофізіологія серця і коронарного кровообігу (Київ, 1983; 1987; 1992); Всесоюзній конференції “Фізіологічні проблеми втомлення і відновлення” (Черкаси, 1985); Міжнародному симпозіумі “Імунологія репродукції” (Київ, 1987; 1990; 1993; 1996); IV З”їзді фізіологів Узбекистану (Ташкент, 1988); в Центрі післядипломної підготовки ветеринарного факультету Белградського університету “Механізми дії специфічних антитіл на кардіоміоцити і репродуктивну систему тварин” (Белград, Югославія, 1989); XIII, XIV, XV з”їздах Українського фізіологічного товариства (Харків, 1990; Київ, 1994; Донецьк, 1998); Міжнародному конгресі патофізіологів (Москва, 1991); З”їзді патофізіологів України (Дніпропетровськ, 1992); III Інтернаціональному симпозіумі з порівняльної електрокардіографії (Сиктивкар, Комі, Росія,1993); I Конгресі світової федерації Українських фармакологічних товариств (Львів, 1994); II Конгресі патофізіологів України (Київ, 1996); Пленумі товариства патофізіологів України (Київ, 1998); Міжнародному симпозіумі “Безпліддя: допоміжні репродуктивні технології 2000” (Київ, 1999); Міжнародній конференції “Механізми функціонування вісцеральних систем” (Санкт-Петербург, Росія, 1999; 2001); III Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одеса, 2000); відділі імунології і цитотоксичних сироваток; секторі вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України; Київському відділенні Українського товариства патофізіологів України (2001).

Публікації. На тему дисертації опубліковано 60 праць, колективну монографію відзначену премією ім.О.О.Богомольця НАН України, 2 Патенти України, видано 1 методичну рекомендацію, 1 методичний листок.

Структура та обсяг дисертації. Роботу викладено на 262 сторінках друкованого тексту та проілюстровано 51 рисунком і 8 таблицями. Дисертація складається зі вступу, опису сучасного стану досліджень, методів дослідження, експериментальної частини, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних літературних джерел із 410 найменувань.

ОБ”ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об'єктом дослідження були ізольовані серця щурів лінії Вістар, папілярні м”язи правого шлуночка, спонтанно-активне праве і ліве вушко передсердя морської свинки. Використовувано фрагменти плазматичних мембран, саркоплазматичного ретикулуму, ізольовані кардіоміоцити щурів, ооцити статевозрілих мишей лінії СВА, корів і свиней; корови і телиці, свиноматки та підсвинки тваринницьких комплексів України і Росії.

Мембранні антикардіальні поліклональні антитіла (АТ) виділювано із цитотоксичної сироватки, яку одержувано від кролів шляхом їх попередньої імунізації антигеном плазматичних мембран або мембран саркоплазматичного ретикулуму (СПР). Високоочищені фракції плазматичних мембран (ПМ) отримувано методом диференційного центрифугування в градієнті щільності сахарози (Jones, 1979). Введення антигену проводилося за спеціально розробленою комбінованою схемою (внутрішньовенне, підшкірне і внутрішньочеревне введення з використанням адьюванта Фрейнда, “Serva”).

Отримані сироватки володіли високою органною специфічністю і реагували в РЗК із аналогічним антигеном в розведеннях 1:400 - 1:1280, а в реакції кольцепреципітації - із зазначеним антигеном, розведеним за білком до 4-16 мкг. Концентрація антитіл в імунних сироватках після стандартизації титру (змішування декількох сироваток) складала в РЗК 1:640, а в реакції кольцепреципітації із аналогічним антигеном, розведеним за білком - 10 мкг. Всього отримано 54 серії імунних сироваток, специфічних до ПМ серця морських свинок (12) і щурів (42). Використовувано гама-глобулінову фракцію кардіальної антимембранної сироватки (Фримель, 1987). Виділення гама-глобулінів із сироватки крові здійснювано за допомогою сульфату амонію.

У дослідах використаний клон 4В4 моноклональних антитіл, специфічних до везикул СПР, який найефективніше пригнічував захоплення Са2+ везикулами СПР (до 95%). Антиоваріальні антитіла виділювано із цитотоксичної сироватки, яку отримувано шляхом імунізації кролів-продуцентів антигеном, приготовленим із яєчників мишей. Загальний принцип імунізації був близький до наведеного вище для отримання антикардіальних антитіл. Однак, враховуючи токсичність антигену, 5-разова імунізація проводилася з інтервалом в 7 днів, а між 1 і 2 імунізаціями - 30 днів. Титр специфічних антитіл в РЗК складав 1:160-1:320. В дослідах використовувано гама-глобулінову фракцію, виділену з імунної сироватки шляхом осадження сірчано-кислим амонієм (Фримель, 1987).

Антиоваріальну цитотоксичну сироватку, специфічну для корів (АОЦС-к), отримувано шляхом імунізації чистопородних коней верхового напрямку антигеном, приготовленим із яєчників корів. Співвідношення фолікулярної тканини і жовтих тіл складало 2:1. Отримана АОЦС-к володіла вираженою видовою і органною специфічністю, обмеженою видом тварини і реагувала в РЗК в розведенні не менше 1:160.

Антиоваріальну сироватку, специфічну для свиней (АОЦС-с), отримували за аналогією АОЦС-к, тільки для імунізації використано антиген із яєчників свиней. Одержані сироватки консервували хінозолом (0,02%), розливали в ампули місткістю 3 мл на заводі “Біофарма”, де була створена напівпромислова лінія для їх випуску. Перед введенням тваринам препарат розводили стерильним 0,89% розчином хлориду натрію в співвідношенні 1:5 (АОЦС-к) і 1:10 (АОЦС-с).

У дослідах використовувано папілярні м”язи серця щура, праве і ліве вушка серця щура та морської свинки. Із субендокарда правого шлуночка виділювано папілярні м”язи діаметром 0,2-0,5 мм і довжиною 3-5 мм та трабекули лівого шлуночка, які пізніше переносили в експериментальну плексигласову камеру (об”єм 1 см3) із протічним розчином Тироде. Стимуляцію м”яза здійснювано за допомогою прямокутних імпульсів струму силою, що в 2 рази перевищувала поріг, тривалістю 5 мс з частотою, яку, залежно від завдання, змінювано в діапазоні 0,5-3,0 Гц.

У дослідах реєструвано ізометричні скорочення і швидкість зміни сили скорочення (першу похідну сили - dF/dt). Електричну активність, потенціали дії (ПД), відводили за допомогою “плаваючих” мікроелектродів у нашій модифікації з опором кінчика 30-40 МОм. Тривалість потенціалів дії вимірювано на трьох рівнях фази реполяризації - 30%, 70% та 80% (відповідно ПД30, ПД70 та ПД80). Першу похідну ПД (dU/dt) реєстровано за допомогою диференціатора. Препарати перфузовано розчином Тіроде такого складу (мМ): NaCl 140, NaHCO3 2, KCl 3, NaH2PO4 0,5, трис-ОН 2 (рН 7,4), глюкоза 11, CaCl2 2, рН розчину після насичення карбогеном 7,3-7,4. Досліди проводили при 36-37 оС та при кімнатній температурі 20-22 оС.

Для реєстрації вхідного струму використано метод “мікровідведення” (Sigworth, 1980). Ізольовані міоцити серця щура виділювано за методом (Powell, 1980). Кардіоміоцит фіксовано на порі V-подібної трубки (Кришталь О.О., 1975). Реєстрацію вхідного іонного струму проводили після досягнення його постійної амплітуди у відповідь на один і той самий тестуючий імпульс з амплітудою 60 мВ і тривалістю 10 мс. Величина підтримуючого потенціалу складала 50 мВ. Для пригнічення вихідного струму застосовувано BaCl2 в концентрації 1 мМ, для блокування вхідного - тетродотоксин 5?10-6 г/мл.

Препарати скінованих папілярних м”язів серця щурів із лівого шлуночка вирізувано у вигляді смужок діаметром 0,2-0,5 мм і довжиною 3-5 мм, які пізніше переносили в експериментальну плексигласову камеру (об`ємом 1 см3) з протічним розчином Тiроде. Один кінець м”яза за допомогою лігатури з”єднували з механоелектричним перетворювачем сили типу 6МХ1С, а другий кінець - з мікрометричним гвинтом, що дозволяє регулювати довжину і силу розтягу препарату. Стимуляцію скорочення здійснювано за допомогою імпульсів струму силою, що в 2 рази перевищує поріг, тривалістю 5 мс частотою 0,5 Гц. У такому режимі препарат “впрацьовувався” до стабілізації скорочення.

Для дослідження кальційвивільняючої дії антитіл на структури СПР використовували 4 різних розчини: нормальний розчин Тироде; релаксуючий безкальцієвий розчин, що містив 10 мМ ЕГТА; безкальцієвий розчин з сапоніном (50 мкг/мл); тестуючий розчин, у якому були іони Са та антисарколемальні антитіла.

Основні розчини, в яких волокна розслаблювалися, а сарколема ставала гіперпроникливою, складалися (в мМ) з вільного Mg2+ 3, Mg2+-ATФ 5, фосфокреатину 15, імідазолу 20, ЕГТА 10, дитіотрейтолу 0,5 і 50 мкг/мл сапоніну. Іонна сила розчинів доводилася до 160 мМ шляхом додавання метасульфонату калію. У розчинах кальцій перебував у поєднанні з ЕГТА і становив (0,6-1,2)?10-5 М. Сапонінову демембранізацію здійснювано протягом 50 хв. Ступінь демембранізації тестували за активністю мембранних маркерів - оубаїнчутливої АТФази (Болдырев, 1978) і 5'-нуклеотидази (Song, 1967).

Для дослідження впливу антитіл на чутливість міофібрил до іонів Са використовувано різні його концентрації (від 0,5 до 10 мкМ), які для зручності виражалися за допомогою від”ємного логарифму (рСа). Для отримання інкубаційних розчинів з необхідними концентраціями іонів Са2+, їх розраховувано за допомогою рівнянь (Fabiato, 1978). Використовувано загальну гама-глобулінову фракцію, виділену із сироватки крові імунізованих кролів у 3-х концентраціях (за білком) - 0,1, 1,0, 5,0 мг білку/мл. В контрольних дослідах використовувано гама-глобулінову фракцію білку, в аналогічних концентраціях, виділену із сироватки крові неімунізованих кролів. З метою блокування вивільнення Са2+ із СПР, мітохондрій і примембранних структур використовували рутеній червоний (3 мкМ), а для його ініціації - кофеїн (4 мМ) або ріанодин (1 мкМ).

Для дослідження впливу антитіл на процеси перекисного окиснення в ізольованих серцях та плазматичних мембранах щурів експерименти проведено на ізольованих серцях щурів-самців лінії Вістар, перфузованих за Лангендорфом розчином Тіроде насиченим киснем (100% О2, 37 оС). Після 15 хв перфузії (необхідної для стабілізації частоти скорочення і метаболізму міокарду) в розчин додавали мембранні антикардіальні антитіла (0,1-2,0 мг білку/мл) або неімунний гама-глобулін в аналогічних концентраціях.

Стан ПОЛ в гомогенаті міокарду оцінювано за інтегральним показником, що характеризує співвідношення вільнорадикальних окислювальних процесів при індукованій Fe2+ та Н2О2 хемілюмінесценції (Лопухин, 1985). Біохемілюмінесцентний аналіз здійснювано на серійному приладі ХЛМ1Ц-0,1 (Серкиз, 1984). Індукцію процесу ПОЛ in vitro ініційовано в мембранних суспензіях з концентрацією білку 1 мг/мл залізо-аскорбатною системою (10 мкМ Fe2SO4+, 0,2 мМ аскорбату). ПОЛ досліджувано за методом індукованої хемілюмінесценції на хемілюмінометрі ХЛМ-1 з”єднаного з комп”ютером і оцінювано за загальними показниками, що характеризують кінетику вільнорадикальних процесів (Серкіз, 1984). Осадження пухирців саркоплазматичного ретикулуму проводилося у середовищі з 15 мМ АТФ, 15 мМ MgCl2, 10 мМ азиду натрію, 0,3 М КСl, 20 мМ оксалату калію, 60 мМ трис-НСl, рН 7,0 з поступовим їх насиченням оксалатом кальцію (Levitsky, 1981).

Загальну АТФазну активність везикул сарколеми кардіоміоцитів щурів визначувано двома методами: за нагромадженням неорганічного фосфату в період інкубації (Rathbun, Betlach, 1969) і безперервно - за виділенням протону при дисоціації фосфат-іону (зміни рН) із використанням потенціометрії (Болдирєв, 1977). Вимірювання проваджено в інкубаційному середовищі (кінцевий об”єм 3 мл) такого складу (мМ): NaCl 100, KCl 20, MgCl2 3, натрієва сіль АТФ 3, EGTA 0,5, Na2EDTA 0,1, азид натрію 5, трис-НСl 50, до якого додавали 10 мкг білка плазматичних мембран (1 частина) і антимембранних антитіл (у співвідношенні за білком 1:0,25-1:4 у 3 мл проби), рН 7,4 при 37 оС. Na+,K+-АТФазну активність обчислювано за різницею між загальною і Mg2+-АТФ-залежною активностями та виражали в наномолях неорганічного фосфору (Фн) на 1 мг білка мембранного препарату за 1 хв. При визначенні АТФазної активності потенціометричним методом зміни рН вимірювано за допомогою рН-метра марки рН-340 і реєстровано на самописці КСП-4.

Використано реактиви: Na2АТФ, Na2EDTA “Reanal” (Угорщина), NaN3, оуабаїн фірми “Serva” (Німеччина), EGTA, трис-НСl фірми “Sigma” (США). Решта реактиви - “Союзреактив” (СРСР) класифікації “ХЧ”, а неорганічні солі - “ОЧ”. Всі розчини готовано на деіонізованій воді.

Транспорт Са2+ через мембрани СПР вимірювано за допомогою Са2+-селективного електроду 93-20 фірми “Orion Research” (США) на іономірі “Orion EA-940” (Meerson, 1990) і оцінювали за швидкістю акумуляції Са2+ везикулами СПР при 37 оС у середовищі: 100 мМ КСl, 15 мМ оксалату К+, 20 мМ трис-Hepes (pH 7,0), 6 мМ MgCl2, 5 мМ NaN3 і 100 мМ фосфокреатину. Визначення активності Са2+-АТФази провадилося і за гідролізом n-нітрофенилфосфату (Inegi, 1971) в середовищі, що містило 10 мМ трис-MOPS (pH 7,0), 100 мМ КСl, 5 мМ MgCl2, 10 мкМ СаСl2, 5 мМ n-нітрофеніляту за допомогою спектрофотометра Спекорд М-40 (НДР). Активність Са2+-АТФази виражалося в мкМ Фн/хв мг білку, швидкість поглинання Са2+ везикулами СПР - в нМ Са2+/хв мг білку.

Оваріальні ооцити корів, свиней і мишей виділювано із фолікулів шляхом їх проколювання препарувальними голками в живильному середовищі ДМЕМ. Під мікроскопом МБС-9 підраховувано кількість ооцитів. виділених із кожного яєчника, а за допомогою окулярного мікрометра - морфометричні величини.

Реєстрацію електричної активності здійснювано за допомогою модифікованого підсилювача з підведенням зовнішнього струму, зібраного на інтегральних мікросхемах (Первіс, 1983). Фіксацію потенціалу на мембрані здійснювали за допомогою одного мікроелектроду (мікропіпетки) з використанням модифікованої схеми підсилювача, куди додатково включено підсилювач фіксації. Більшість експериментів виконано на ооцитах з інтактною блискучою прозорою оболонкою, частина дослідів - без неї. Останню виділювано ферментативно, з використанням розчину пронази (5 мг/мл).

Для дослідження дії антиоваріальних цитотоксичних сироваток, специфічних для корів і свиней (відповідно, АОЦС-к і АОЦС-с) препарати були отримані за розробленою нами технологією на Київському підприємстві з бактеріальних і вірусних препаратів (“Біофарма”). Було отримано 10 серій сироваток із титром антитіл в РЗК 1:160 - 1:320. Експерименти проводили на тваринницьких фермах державних і колгоспно-кооперативних гоподарств України, Білорусі і Росії. АОЦС-к вводили внутрішньом”язово одно-дворазово в дозах 1-2,5 мл (розведеної фізіологічним розчином 1:5) на 100 кг живої маси тіла. АОЦС-с вводили внутрішньом”язово в дозах 1,5-3,0 мл (розведеної 1:10) на 100 кг живої маси тіла. Одночасно формувалися дослідні і контрольні групи тварин, аналогічні за породою, віком, утриманням, годівлею, способом осіменіння, а для корів і телиць - ще за захворюваністю репродуктивної системи (гіпофункція яєчників, фолікулярна киста, ендометрити, наявність персистентних жовтих тіл відповідно до ветеринарного обстеження). Для корів і телиць визначувано час настання в них охоти, запліднюваність, тривалість сервіс-періоду, естрогенну насиченість організму, неспецифічну резистентність (Фрімель, 1979). Для свиноматок і підсвинків - стимуляцію овуляції, запліднюваність, синхронізацію опоросів, молочність маток (за вагою поросят у гнізді після відлучення), масу ембріонів, довжину рогів матки, кількість зигот, жовтих тіл. Статистичну обробку експериментальних результатів здійснювано з використанням t-критерію Стьюдента або непараметричним методом з використанням критерію Уайта (Мінцер, 1982).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дія антимембранних антитіл на механічну активність смужок серця морських свинок і щурів

Ефект антитіл (0,1-2,0 мг/мл) на серцеву смужку ізольованого папілярного м”язу, яку ритмічно стимулювали з частотою 1-2 Гц характеризувався динамічністю і фазністю в розвитку ізометричних скорочень. Як видно на рис.1, початкова реакція при дії антитіл (АТ) проявлялася в посиленні амплітуди скорочень на 21,5±2,4 % (n=18, p<0,01). Максимальний позитивний інотропний ефект АТ розвивався на 5-8 хв їх аплікації. Подальша дія АТ супроводжувалася поступовим пригніченням скоротливої фунції м”яза: амплітуда фазних скорочень зменшувалася на 50-60 % вихідних величин. Спостерігалося повільне та неухильне зростання тонічної напруги (ТН) м”яза, максимальне значення якої складало 95-150 % від вихідної амплітуди фазних скорочень. Збільшення концентрації антитіл в омиваючому серцевий м”яз розчині до 5 мг/мл посилювало пригнічуючу дію на механічну активність: максимальна швидкість скорочення і розслаблення зменшувалася відповідно на 26,3±2,9 і 22,3±2,5 % від вихідних величин (n=18, p<0,05). Слід зазначити, що за таких умов тривалої експозиції (більше 30 хв) або високої концентрації АТ (5,0 мг/мл) зміна ТН досягала 100-150% з одночасним зменшенням амплітуди фазних скорочень. У контрольних дослідах гама-глобулінова фракція НКС в аналогічних концентраціях і часових параметрах не викликала вірогідних змін скоротливої активності серцевого м”язу. Реакція кардіоміоцитів на дію антитіл, специфічних до мембран СПР, в аналогічних концентраціях в основному збігалася із попередньо отриманими ефектами: спостерігалася зміна скоротливої активності. Однак зміна ТН мала виражений характер уже на 3-5 хв дії антитіл і складала до 75% вихідної амплітуди фазних скорочень. Збільшення частоти стимулюючих імпульсів з 1 до 2 Гц посилювало пригнічуючу дію АТ.

Додавання до розчину Тіроде, в якому перебували смужки передсердя, що володіли автоматією, специфічних антитіл (0,1-2,0 мг/мл) призводило до розвитку позитивного хроно-інотропного ефекту: частота спонтанної ритмічної активності збільшувалася і 1,5-2,0 рази, амплітуда скорочень - в 2-3 рази. Зменшення міжімпульсного інтервалу (при збільшенні частоти) із 350-450 мс (в нормальному розчині Тироде) до 260-300 мс (при дії антитіл) супроводжувалося змінами тривалості низхідної фази скоротливого циклу з 60,5±9,1 мс до 71,4±10,4 мс (n=18, p<0,05), а тривалість потенціалів дії (ПД), виміряна на двох рівнях реполяризації, збільшувалася із 40,6±9,6 до 54,0±11,4 мс (на рівні 30%) та із 48,7±6,0 до 72,8±9,1 мс (на рівні 70 %; n=18, p<0,05). При дії АТ на пейсмекерні клітини передсердя в період максимального збільшення частоти ПД встановлена зміна тривалості повільної діастолічної деполяризації (ПДД), швидкості її наростання. При цьому тривалість ПДД зменшилась із 360,0±11,5 до 192,18,9 мс, а її швидкість збільшувалась до 72 проти 22 В/с за нормальних умов. Рівень порогового потенціалу із збільшенням частоти знижувався.

Для подальшого дослідження позитивного і від”ємного хроно- і інотропного ефектів дії антимембранних антитіл на динаміку завантаження внутрішньоклітинних депо іонами Са2+ використана феноменологія драбини Боудича. Так, уже на 3-5 хв від початку дії антитіл приріст скорочення у біфазній драбині як першого, так і останнього складав відповідно 171,6±10,1 і 142,5±11,2 % (n=11, p<0,001) їх початкової величини. Подальша аплікація антитіл (30-40 хв) викликала зменшення приросту амплітуди скорочень у драбині як першого, так і особливо наступних. Оскільки головною іонотранспортуючою системою в забезпеченні скорочення іонами Са2+ і їх поповнення в період збудження є Са2+-проникливі іонні канали (Reuter, 1986), то додаткове збільшення концентрації Са2+ може бути пов”язане з активацією згаданих мембранних структур. Разом з тим, це не виключає інших можливих шляхів поповнення запасів іонів Са2+, його внутрішньоклітинних змін, наприклад, через обмінний Na+-Ca2+ взаємотранспорт. Є підстави вважати, що посилення амплітуди в процесі ритмічного скорочення може бути пов”язане з поповненням внутрішньоклітинних запасів іонів Са2+ за період розвитку плато ПД (Gambassi,1991). Оскільки амплітуда скорочення кардіоміоцитів, згідно теорії електромеханічного спряження (Fabiato,1985), визначається тривалістю плато потенціалів дії, то хронотропну реакцію кардіоміоцитів можуть спричинити антитіла і через їх вплив на бета-адренорецептори. Одначе за наших умов блокування бета-рецепторів не запобігало розвитку як стимулюючого, так і пригнічуючого ефектів антитіл.

Слід відзначити, що на фоні максимального розвитку пригнічуючого ефекту антитіл, коли амплітуда ізометричних скорочень складала лише 5-15 % початкової величини, позитивна реакція клітин на дію норадреналіну зберігалася. Це засвідчує, що фіксація антитіл на клітинній мембрані не запобігає входженню екстрацелюлярного кальцію - ініціатора скоротливого процесу. Можна вважати, що накопичення в цитоплазмі вільних іонів Са2+ при дії антитіл залежить меншою мірою від пасивного входу іонів Са2+ через канали, що детермінуються рецепторами, а вірогідніше ініційований перерозподіл двовалентних катіонів є результатом порушення функції мембранних енергозалежних іонообмінних структур і, можливо, внутрішньоклітинних депо.

Тонічна напруга папілярних м”язів щура при дії антитіл.

Зростання тонічної напруги папілярного м”язу під впливом антитіл засвідчує, що в цитоплазмі кардіоміоцита в стані спокою здійснюється поступове збільшення концентрації іонів Са2+. Які все ж таки механізми лежать в основі розвитку ТН при дії антимембранних антитіл? Модельні досліди із зміною позаклітинного Na+, Ca2+, функції Na+-H+-обміну не дали відповіді на поставлене питання.Зміна концентрації іонів Са2+ в цитоплазмі можлива і за рахунок ініційованого антитілами їх вивільнення із внутріклітинних депо інозитол 1,4,5-трисфосфатом (IP3) (Loirand et.al.,1992). Як засвідчили результати дослідів, попередня часткова заміна іонів Na+ іонами Li+ (2,0 мМ LiCl), блокатора синтезу ІР3, не запобігала розвитку ТН серцевого м”язу при аплікації антитіл. Зміна клітинного кальцієвого гомеостазу можлива і за інших умов. Зокрема, якщо припустити, що антитіла впливають на виділення медіаторів із ендокардіального ендотелію. Оскільки, як відомо (Brutsaert,1992), такими можуть бути NO, простациклін, простагландин F2, ендотелін-1 та інші, які здатні впливати на функціональний стан кардіоміоцитів. Як видно із проілюстрованого матеріалу (рис.3), хімічна деендотелізація (0,1% розчин сапоніну) папілярного м”язу, так і блокування NO-синтази не запобігало розвитку антитілозалежного напруження серцевого м”яза. Модельними дослідами із використанням інгібіторів Na+-K+-помпи (строфантину-к та оуабаїну) вдалося отримати ефекти подібні до тих, що викликалися антитілами, а саме, зростання ТН та пригнічення фазних скорочень. Отже, отримане в дослідах збільшення тривалості плато ПД, ріст амплітуди скорочення і приріст в ритмічному ряду та посилення ТН при дії антитіл засвідчують зміну внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+. А що це так, засвідчують розрахунки (Palendo,1991), згідно яких амплітуда ізометричного скорочення і особливо його швидкість наростання є функцією вмісту вільних іонів Са2+ в міоплазмі.

При низькій концентрації антитіл (0,1-1,0 мг/мл) і малій тривалості їх дії (до 15 хв) нагромадження іонів Са2+ в клітині буде незначним і фізіологічно допустимим, що проявиться через помірну стимуляцію функції клітини. При тривалій дії антитіл або при наростанні їх концентрації внутрішньоклітинний вміст іонів Са2+ зростатиме, що призведе до зростання ТН, розвитку контрактури і цитотоксичного кальцієвого пошкодження серцевого м”язу. Оскільки відомо (Костюк, 1998), що підвищення [Са2+]і може призвести до патологічних впливів, включаючи ліполіз, протеоліз, втрату цілісності цитоскелету і, нарешті, смерті клітини. Отримані антитілозалежні зміни механічної і електричної активностей міоцитів можна трактувати виходячи із двох позицій: із впливу на пасивну потенціалозалежну іонну проникливість (на стан Na+, Ca2+, К+ каналів і, можливо, Na+-Ca2+ обмінника) та із впливу на активний іонний транспорт (енергозалежні транспортні Na+-K+- i Ca2+-Mg2+-АТФази). Доказом цьому будуть наступні результати.

Вплив антитіл на трансмембранні потенціали дії кардіоміоцитів.

Якщо виходити із сучасних уявлень про механізми генерації ПД в клітинах і про електромеханічне спряження в них, то природньо передбачити, що ефекти позитивної хроноінотропії обумовлені активацією Са2+ каналів. Дійсно, як видно із рис.4, збільшення тривалості ПД, амплітуди і швидкості зростання ізометричного напруження за умов дії антитіл (1 мг/мл) засвідчують посилення вхідного Са2+ струму при збудженні міоцитів. Збільшення тривалості дії антитіл до 30-40 хв або їх концентрації до 5 мг/мл супроводжувалося зменшенням тривалості ПД. Амплітуда ПД в більшості дослідів (14 із 21) знижувалася на 20-28 %. Потенціал спокою (ПС) теж зменшувався і складав на 30 хв дії антитіл 71,2±1,6 мВ проти вихідних 78,9±0,8 мВ (n=20, p<0,01). Зниження тривалості ПД супроводжувадося розвитком розчленування в процесах електромеханічного спряження.

Посилюючий ефект АТ на відновлення збудливості кардіоміоцитів досягав свого максимального значення на 10-15 хв. Викликана антитілами активація Са2+--каналів проявлялася у формуванні електричної відповіді подібної до ПД і супроводжувалася розвитком скоротливих актів. Блокування Са2+-каналів зменшувало активуючий ефект антитіл. Таким чином, результати дослідження дії антитіл за умов фармакологічного блокування Na+ i Ca2+ провідності засвідчують про її роль в розвитку цитотоксичного ефекту на міокардіальній клітині. Активація антитілами Са2+ каналів сприяє посиленому входженню Са2+ в клітину в період її збудження. Це узгоджується сучасними уявленнями про роль Са2+ струму в активації скорочення в серцевому м”язі (Reuter,1984,1999). Оскільки, як показано іншими авторами, процеси спряження між збудженням і скороченням медіюються вхідним Са2+-струмом, який ініціює Са2+ вивільнення (Fabiato, 1989) через Ca2+ вивільняючі канали СПР (Beuckelmanu, Wier, 1988). Ще більш наочно Са2+-ініціююча дія антитіл на клітини скоротливого міокарду підтвердилася в дослідах із реєстрацією вхідного струму (рис.6). Антимембранні антитіла в концентрації 0,1 мг/мл приводили до збільшення амплітуди вхідного струму на 30% в порівнянні з його вихідною величиною. Отримана в дослідах стимулююча дія антитіл на серцевий м”яз пов”язана з їх активуючим впливом на вхідний інтегральний струм міоцитів, що посилює вхід іонів Са2+ в клітину в період її збудження. Це призводить до збільшення внутрішньоклітинної концентрації Са2+, що супроводжується посиленням ізометричного скорочення і швидкості наростання сили, приростом амплітуди скорочень в ритмічному ряду на повторний стимул, збільшенням частоти спонтанної активності та швидкості розвитку повільної діастоличної деполяризації. Якщо ця початкова активуюча фаза в дії антитіл на кальцієвий струм добре узгоджується з сучасними уявленнями про механізм їх стимулюючого впливу (фаза активації), то пригнічуючий ефект вимагає всестороннього вивчення і аналізу. Його не можна пов”язати із блокуючим впливом на Са2+ струм, оскільки зберігалася позитивна інотропна реакція кардіоміоцитів на дію катехоламінів та кофеїну після прикладання антитіл. Це підтверджується даними, в яких показано підвищення швидкості наростання Са2+-залежних ПД під впливом альфа-адреноагоністів (Sancher-Chapula,1981; Trautwein,1990).

Якщо дія антитіл, поруч із пригнічуючими ефектами на скоротливу активність міоцитів, викликає зменшення реполяризаційної фази плато ПД та швидкості ПДД, то чи не є це результатом зміни провідності не лише для іонів Na+, Ca2+, що відіграють основну роль в генезисі електричної відповіді, але також зміни функціонального стану К+ каналів? Зараз є переконливі дані, які доводять існування Са2+ залежної калієвої провідності в мембранах нейронів (Kostuk et al., 1986, Гаращук, 2000) та м'язових клітинах (Резніков, Шуба, 2001). Якщо це так, то Са2+-залежна активація К+ провідності мембрани кардіоміоцитів при дії антитіл призведе до зменшення реполяризаційної фази плато ПД і тим самим його загальної тривалості. А це, відповідно - до зменшення поступання іонів кальцію в клітину в період генерації ПД. Це було підтверджено в дослідах із використанням блокатора К+ каналів тетраетиламонію (ТЕА). Зменшення вихідного калієвого струму при дії ТЕА на фоні розвитку цитотоксичного ефекту антитіл, що проявлялося в розладі електромеханічного спряження в міоцитах призводило до відновлення низхідної фази плато ПД та амплітуди ізометричних скорочень. А виміряна на двох рівнях реполяризації тривалість ПД за даних умов досліду мало змінювалася і відповідно складала 41,3±6,7 та 63,1±6,2 мс, тоді як в нормальному розчині Тироде відповідно - 41,1±9,6 і 54,1±10,5 мс (n=62, p>0,05). Цікаво, що за умов попереднього блокування калієвої провідності антимембранні антитіла не викликали пригнічуючого ефекту на міоцити. Переконливо активуюча дія антитіл на калієвий струм була отримана в дослідах із прямим його вимірюванням . Характерною рисою дії антитіл на калієвий струм є тривалий латентний період, що складав 5-10 хв від початку їх аплікації, що дозволяє розглядати активацію калієвих каналів як складний багатоступеневий процес, що мабуть необхіний для попереднього збільшення внутріклітинної концентрації Са2+. Такий висновок добре узгоджується із даними при локальній фіксації потенціалу на ізольованій ділянці мембрани (Callewa et al., 1986, Гаращук, 2000), де вірогідність відкриття калієвих каналів залежить від концентрації іонів Са2+ з її внутрішнього боку.

Для доказу прямої безпосередньої активуючої дії антитіл на клітини міокарду, а не опосередкованої через ініційовані виділення біологічно активних речовин присвячена наступна серія дослідів. Найбільш ефективним таким активатором Са2+ струму, при утворенні комплексу антиген-антитіло виступає гістамін (Гущин, 1973, Ігнат'єва, 1980). Окрім того, через відповідні рецептори його дія спряжена із калієвими каналами (Sato, 1986). Як показали результати дослідження, блокування вивільнення гістаміну (клемастином 0,5?10-7 г/мл) не запобігало розвитку хроноінотропного ефекту антимембранних антитіл. Кардіостимулююча дія антитіл на тривалість ПД і ізометричне скорочення перевищувала ефекти гістаміну, ініційованого речовиною 48/80. Отже, антимембранні антитіла, фіксуючись на клітинній мембрані, викликають посилений вхід іонів Са2+ в міокардіальні клітини, що в свою чергу викликає активацію кальцієвої провідності, якій належить важлива роль в формуванні ПС, фази плато і реполяризації ПД. Кальцій залежна активація калієвих каналів призводить до анормального протікання реполяризації ПД в клітинах міокарда, розвитку від'ємного хроно- і інотропного ефектів антимембранних антитіл.

Дослідження дії антитіл на активний іонний транспорт мембран кардіоміоцитів.

Ефект антитіл на активність Na +,K+-АТФази. Результати одержані в дослідах з прямим визначенням активності Na+,K+-АТФази свідчать, що специфічні антитіла викликають дозо- і часозалежне пригнічення транспортної АТФази. Найбільше виражена пригнічуюча дія антитіл на активність мембранної АТФази фрагментів везикул спостерігалася при їх співвідношенні 1:1 і 2:1. Активність Na+,K+-АТФази після 30 хв інкубації антимембранних антитіл із везикулами сарколеми кардіоміоцитів щура відповідно, становила 27,6±6,2 % і 7,4±2,7 % вихідної величини (n=12, p<0,001). Тільки при співвідношенні 1:0,25 і менше (везикул і АТ) антимембранні антитіла не викликали статистично вірогідних змін в активності Na+,K+-АТФази за 30 хв інкубації. При дослідженні активності Na+,K+-АТФази плазматичних мембран кардіоміоцитів щурів в залежності від часу їх інкубації з антитілами (рис.8) виявлено, що АТ у концентрації 1:2 повністю пригнічують роботу Na+,K+ -помпи за 2 год, а при співвідношенні 1:0,5 за 3 год інкубації. Необхідно відзначити, що після 3 год інкубації АТ із везикулами 1:0,25 активність Na+,K+-АТФази зменшилась від 60,0±1,8 до 36,3±5,7 нМФнмг білку/хв (n=8, p<0.01), тоді як при співідношенні 1:0,5 за даний проміжок часу - до 8,66±0,64 нМФнмг білку/хв (n=6, p<0,001).

У підсумку, наведені дані свідчать, що АТ, специфічні до сарколеми, пригнічують активність Na+,K+-АТФази в результаті чого відбувається взаємопов'язане накопичення в цитоплазмі клітини іонів Na+ і Ca2+. В залежності від концентрації АТ і тривалості їх дії накопичення іонів може бути помірним (при цьому спостерігається їх стимулююча дія на функції клітин) або надмірним (при великих дозах або тривалій дії), що призводить до збільшення ТН і зниження амплітуди фазних скорочень.

Дія антитіл на транспорт кальцію в ізольованих везикулах саркоплазматичного ретикулуму та фосфоензимну активність Са2+-АТФази. АТФ-залежний транспорт кальцію в везикулах СПР щурів, визначений за допомогою Са2+-селективного електроду (модель 9320 фірми Orion Research, USA) в контрольних дослідах складав 298,1±0,67 нМ Са2+ мг білку/хв (рис.9). Додавання до інкубаційного середовища специфічних антитіл викликало пригнічення транспорту Са2+, що знаходилося в прямій залежності від їх концентрації (зменшення співвідношення антитіло до СПР, вираженого через білок в мг/мл) за 30-ти хвилинний період їх дії. При співвідношенні 1:0,25 транспорт Са2+ за даний період інкубації зменшувався до 275,5±1,04 нМ Са2+ мг білку/хв (n=10, p<0,05), відповідно, при співвідношеннях 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4 АТФ-залежний транспорт складав 125,4±0,52, 84,5±0,50, 65,1±0,30 і 38,62±1,20 нМ Са2+ мг білку/хв (n=6 по кожному показнику, p<0,001). Слід відзначити, що моноклональні антитіла 4В4 інгібували Са2+ транспорт СПР за той же час інкубації до 29,1±0,50 нМ Са2+ мг білку/хв (n=4, p<0,001). Збільшення концентрації моноклональних антитіл (до 1:4) суттєво не впливало на АТФ-залежний Са2+ транспорт, зменшуючи його до 28,5±0,6 нМ Са2+ мг білку/хв за 30-ти хвилинну експозицію. При дослідженні впливу АТ на часозалежне захоплення Са2+ везикулами СПР встановлено, що після 2-х годинної інкубації Са2+-транспортуюча активність зменшилась із 298,85±0,64 до 85,04±0,15 нМ Са2+ мг білку/хв при співвідношенні 1:0,25 (n=12, p<0,001) при 0,5:1 і 1:1, відповідно, 22,04±0,40 і 4,35±0,8 нМ Са2+ мг білку/хв. При співвідношенні 2:1 транспорт Са2+ за період 2-х годинної інкубації припинявся повністю, а при співвідношенні 4:1 інгібіція Са2+ наступала вже на 60-й хвилині дії антитіл.

Моноклональні антитіла 4В4 викликали миттєве пригнічення транспорту Са2+ протягом 10 хв. Як антимембранні, так і моноклональні антитіла дозозалежно викликали блокуючу дію на активність Са2+-АТФази везикул СПР. Їх активність виміряна рН-метричною технікою (Болдирєв,1977) та за гідролізом n-нітрофенилфосфату (Inegi,197) складала 2-3 мкМ Фн мг білку/хв, що відповідає даним, отриманим іншими дослідниками (Levitsky,1987). Слід відзначити, що моноклональні антитіла викликали різке зниження активності ферменту (на 80-85 %) вже за 10-15 хв. Однак навіть 3-х годинна преінкубація фрагментів СПР із моноклоном 4В4, в порівнянні із антисарколемальними антитілами не викликала повного блокування Са2+-АТФази, її активність за таких умов досліду складала 5-8 % вихідних величин. На рис.10 представлений порівняльний графічний запис активності АТФази при дії однакових концентрацій моно- і поліклональних антитіл. Видно, що моноклон 4В4 різко знижує гідроліз АТФ. За період 5-ти хвилинної експозиції вираженість його пригнічуючої дії була в 2-3 рази більшою, ніж поліклональних антимембранних антитіл.