Механізми антитілоіндукованої модуляції кальцієвого гомеостазу в клітинах-мішенях

Таким чином, дослідження показали, що антитіла реагують із серцевими саркоплазматичними білками, пригнічуючи АТФ-залежний транспорт Са2+, змінюючи при цьому внутрішньоклітинний кальцієвий гомеостаз. Підтвердженням порушення Са2+-транспортуючої функції СПР при дії антитіл були і досліди із блокуванням останніми Са2+ помпи. Оскільки біохімічним виразником Са2+-помпи, що здійснює АТФ-залежний транспорт Са2+, є Са2+-АТФаза, то виявлені в дослідах її фунціональні зміни при дії антитіл викликають внутрішньоклітинні концентраційні коливання іонів кальцію, які відбивають електрохімічне спряження в серцевому м”язі. Експериментально отримана інгібуюча дія антитіл на Na+,K+-АТФазу і АТФ-залежний транспорт Са2+ фрагментами СПР призводить до зменшення акумуляції даного іону структурами СПР і в подальшому до порушення концентраційного трансмембранного градієнту кальцію.

Дослідження процесів вільнорадикального окислення (ВРО) ліпідів в плазматичних мембранах кардіоміоцитів при дії антитіл.

Відомо (Yamada et.al.,1991), що вільні радикали кисню здатні потенціювати накопичення надлишкового кальцію в міоцитах, викликаючи їх незворотні пошкодження. Є твердження (Меерсон,1983), що зниження активності Na+,K+-АТФази в серцевому м”язі може бути пов”язане із зміною активності перекисного окиснення ліпідів і, як наслідок, виникає пошкодження сарколеми, де локалізований фермент.

Щоб з”ясувати, чи можлива активація антимембранними антитілами процесів перекисного окиснення ліпідів в клітинах міокарду, дослідили їх дію на кардіоміоцити перфузовані розчином Тіроде з додаванням антитіл (0,1-2,0 мг білку на 100 г живої маси). Протягом 10 хв виявлено суттєве збільшення спонтанної хемолюмінесценції (СХЛ) із 204,0±36,0 до 397,2±62,7 імп/хв (n=12, p<0,05), що засвідчує активацію ПОЛ в міокарді. За умов індукції ВРО іонами заліза спостерігалося значне збільшення вмісту гідроперекисних ліпідів (із 41,4±0,7 до 54,8±2,3 імп/хв, n=12, p<0,05), швидкості протікання процесу ПОЛ (із 206,0±18,0 до 290,4±13,4 імп/хв, (n=8, p<0,05). Завдяки цьому суттєво збільшувалась кількість перекисних продуктів вільнорадикальних реакцій в гомогенаті (29061±199 і 35636±130 імп/хв, n=8, p<0,05). Результати дослідів також засвідчили, що специфічні антитіла активують ПОЛ у модельних in vitro фракціях мембран СПР (рис.11). Антитіла в дозі 0,015 мг/мл викликали збільшення рівня СХЛ, а також показників ІХЛ. Особливо зростала кількість утворених гідроперекисів (від 13,19±1,4 до 29,94±2,7 імп/хв, n=10, p<0,001) та загальна світлосума після ініціації ВРО in vitro іонами заліза+аскорбатом. Іонол викликав блокування процесів ПОЛ, про що свідчить зменшення як показників СХЛ, так і ІХЛ. При спільній дії іонолу і антитіл ефект останніх у вигляді активації процесу ПОЛ не розвивався. Отримані результати засвідчують наявність безпосереднього прямого впливу специфічних антитіл на мембрани міоцитів, що реалізується за участю процесу ПОЛ. Вільні радикали, які утворюються в процесі ПОЛ і нагромаджуються в тканинах, як зараз вже відомо (Болдирєв,1995; Маньковська,1999), викликають інгібіцію високолабільної до окиснення Na+,K+-АТФази. Окрім того, ця транспортна АТФаза надзвичайно чутлива до рівня ПОЛ плазматичної мембрани (Сазонтова,1996) і добре відомо, що особливо Na+,K+-АТФаза сарколеми і Са2+-АТФаза СПР, відповідальні за підтримку мембранного потенціалу і Са2+-гомеостазу кардіоміоцитів. Дійсно, як видно із рис.12, антисарколемальні антитіла (1:0,5, 1:1) пригнічували активність транспортної Са2+-АТФази протягом 2-х годинної інкубації з 218,5±4,5 до 91,3±2,3 і 62,4±1,9 нМ Фн мг білку/хв, n=15, p<0,001), що складало, відповідно, 41,1±2,1 і 28,6±1,9 % вихідних величин. Попередня інкубація фрагментованих везикул СПР з іонолом (2.10-5 М) зменшувала пригнічуючу дію антитіл на гідроліз АТФ Са2+-АТФазою. Слід відзначити, що якщо за аналогічних умов дії антитіл у відповідних концентраціях активність Са2+-АТФази складала 41,1 і 28,6 %, то Na+,K+-АТФаза - 14,2 і 4,4 %, тобто остання виявилася більш чутливою до процесів ПОЛ. Подібний захисний ефект проявив і інший антиоксидант - альфа-токоферол. Отже, активацію антитілами процесу ПОЛ в кардіоміоцитах можна вважати одним із головних факторів інгібування транспортних АТФаз. Оскільки специфічні інгібітори процесу ПОЛ - іонол і альфа-токоферол, одночасно із блокуванням ВРО “захищали” Na+,K+-АТФазу і Са2+-АТФазу, то це дозволяє стверджувати, що даний процес ініційований антитілами, відіграє певну роль в імуногенному пошкодженні кардіоміоцитів. І, як недавно стало відомо (Morris,1997), висока концентрація гідроксилрадикалів викликає пряме інгібування Са2+-активуючої АТФази.

Дія антитіл на викликані ПД кардіоміоцитів за умов блокування метаболізму арахідонової кислоти.

Основна мета даного розділу дослідження була обумовлена: 1. регуляцією активності іонотранспортних систем кардіоміоцитів, коли антитілоіндукована арахідонова кислота (АК) може слугувати первинним чи вторинним месенджером; 2. опосередкований ефект, при якому АК, під впливом АТ, ензиматично окислюючись до фізіологічно активних продуктів, модулює активність іонних каналів і скоротливу здатність серцевого м”яза. Узагальнені результати наведені на рис.13, із яких видно, що АТ (0,5 мг/мл) викликали видовження низхідної фази плато ПД, виміряної на двох рівнях реполяризації (50 і 80 % - ПД50 і ПД80), відповідно із 16,7±2,3 до 22,4±2,1 мс та із 42,9±3,8 до 57,4±5,1 мс (n=18, p<0,05). Амплітуда ПД збільшувалася в середньому на 3,5 мВ. Зміна електричної активності при дії АТ супроводжувалася збільшенням амплітуди ізометричного скорочення. Дія блокатора циклооксигеназного шляху окиснення АК, індометацину, зменшувала позитивний хроно-інотропний ефект на 18,6±3,4 % (n=8, p<0,05). Блокування ліпоксигеназного шляху метаболізму АК нордигідрогуаяретовою кислотою (НДГК) та лінолеатгідроксамовою кислотою (0,5 мкг/мл) в більшій мірі, ніж індометацином, але в меншій - ніж блокатором Са2+-струму (D-600), запобігало розвитку стимулюючого ефекту АТ на тривалість ПД. При спільному блокуванні ліпо- і циклооксигенази антитіла не викликали вірогідних змін в потенціало-залежному поступанні іонів Са2+ в клітину. Подібні результати були отримані на деполяризованих міоцитах (20 мМ КСl), а, як відомо (Крутецька,1992), в такому розчині наступає блокування синтезу простагландинів. При цьому наступала інактивація Na+ каналів і на стимули клітина відповідала градуальними відповідями (ГВ). За таких умов досліду АТ (0,1-0,5 мг/мл) викликали вірогідне збільшення амплітуди з 26,5±3,9 до 42,1±4,5 мВ (n=8, p<0,01) і тривалості градуальних відповідей. Це свідчить про прямий безпосередній вплив досліджуваних факторів на потенціалозалежний вхід Са2+ в клітину. Блокування процесів ПОЛ іонолом запобігало розвитку стимулюючих ефектів антитіл на ГВ. Амплітуда останніх складала 30,6±6,1 мВ проти вихідної величини 26,1±4,5 мВ (n=6, p>0,05). При тривалій дії АТ (30-40 хв), коли розвивався незворотній виражений від”ємний хроноінотропний ефект, ЛГК, як і НДГК, в більшій мірі, ніж індометацин, запобігав розвитку цитотропної дії антитіл.

Фармакологічна блокада ліпоксигенази і, відповідно, утворення лейкотрієнів, запобігає розвитку позитивного інотропного ефекту антитіл, тоді як блокада циклооксигенази - посилює їх пригнічуючу дію на кардіоміоцити. Сама АК в модельних дослідах викликала ріст амплітуди серцевих скорочень. Однак ця дія не була пов”язана із потенціалозалежним входженням Са2+ в клітину. Вона обумовлюється Na+-Ca2+ обміном (Schmitt,1993). Окрім того, є дані, що АК індукує відкривання Са2+-активованих К+ каналів, метаболіти ліпоксигенази посилюють, а продукти циклооксигеназного окиснення зменшують активність К+ каналів (Scherer,1990). В даній реакції кардіоміоцитів на дію АТ лежить їх біфазна скоротлива відповідь, яка медіюється як концентрацією, так і тривалістю їх дії. Перша фаза пов”язана з ініціацією кальцієвого сигналу потенціалозалежним шляхом, а друга, що розвивається пізніше, - викликається швидкою реполяризацією ПД клітини завдяки збільшенню активності К+ каналів. Таким чином, отримані дані підтверджують участь метаболітів окиснення АК, ініційованого антитілами в зміні скоротливої здатності і електричних властивостей кардіоміоцитів. А утворені при цьому ейкозаноїди є додатковим чинником (крім прямої дії АТ на іонні струми) модуляції внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ в міоцитах.

Дослідження впливу антитіл на Са2+-транспортуючу функцію cаркоплазматичного ретикулуму папілярного м”яза серця щура.

Передбачалося, що одним із додаткових чинників у зміні Са2+ гомеостазу при дії антитіл може бути їх кальційвивільняючий ефект із структур СПР. Для його дослідження використана модель перфоративного пошкодження клітинної мембрани (скінування сапоніном), що забезпечує доступ антитіл до мембран СПР. Як видно із рис.14, додавання до тестуючого розчину специфічних антитіл викликало посилення ізометричного напруження. Чутливість міофібрил до антитіл проявлялась при концентрації 0,1 мг/мл. Максимальне напруження розвивалося за умов, коли концентрація АТ в омиваючому розчині складала 1-2 мг/мл. Додатковий приріст ізометричного напруження при дії АТ становив 39,9±6,1% (n=10, р<0,01). Збільшення концентрації до 5 мг/мл не викликало додаткового посилення амплітуди ізометричного напруження, а навпаки - її зменшення.

При дослідженні дії АТ на кальцієву спорідненість скоротливих білків було встановлено, що антисарко-лемальні антитіла не підвищують, а, навпаки - знижують чутливість міофібрил до іонів Са2+, зсуваючи криву напруження-концентрація Са2+ вправо на 0,4 рСа2+ (в бік більших концентрацій). Максимальне напруження волокон знижувалося на 16,4±3,1% (n=12, р<0,01) і не розвивалося при дії іонів Са2+, коли їх концентрація була 1,0 мкМ, тоді як при дії гама-НКС і тестуючого розчину скорочення скінованих м”язів ініціювалося при 0,6-0,8 мкМ вільного Са2+ рис 15. Це свідчить, що антитілам властива і пряма специфічна дія на міофібрили, знижуючи їх чутливість до іонів Са2+. На наш погляд, це може бути пов”язано з екрануванням місць взаємодії Са2+ з білком тропоніном позитивно заряженими центрами молекул антитіл. Подібні результати отримані при дії протимозкових антитіл (Солнцева, 1987). Останні, як стверджує автор, знімали блокаду Са2+ каналів іонами Cd2+, через послаблення зв”язування блокатора із селективним фільтром каналу в присутності антитіл.

Доказом внутрішньоклітинної кальційвивільняючої дії антитіл із структур СПР були досліди із використанням як активаторів (кофеїн 4 мМ або ріанодин 1 мкМ), так і блокаторів (рутеній червоний 3 мкМ). Кофеїн і ріанодин викликали осциляції напруги скінованого папілярного м”яза. Амплітуда скорочення збільшувалася і відповідно складала 40-50% та 55-65% від вихідних значень. Перфузія папілярного м”язу антитілами (0,1-5,0 мг/мл) після кофеїнового або ріанодинового ефекту не викликала вірогідних додаткових змін у прирості тонічної напруги.

Оскільки кофеїн, як відомо (Miller,1997), викликає скорочення серцевого м”яза шляхом мобілізації депонованого субклітинними структурами іонізованого кальцію, то відсутність такого ефекту в дії антитіл після кофеїніндукованого вивільнення Са2+ із СПР засвідчують, що в основі їх реалізації лежать подібні механізми. Це було підтверджено і в дослідах з використанням блокатора вивільнення Са2+ із цистерн СПР - рутенію червоного (рис.16). За таких умов антитіла (0,1-5,0 мг/мл) не спричинювали ініціацію скорочення релаксованого папілярного м”яза. Однако після зняття блокуючої дії рутенію червоного на вивільнення Са2+ із СПР антисарколемальні антитіла ініціювали розвиток скорочення.

Таким чином, можна вважати, що окрім мембранних потенціалозалежних механізмів активуючої дії АТ на активацію скоротливої здатності м”яза і посилення його тонічної напруги має місце додатковий кальцій-вивільняючий ефект із внутрішньоклітинних депо, що зумовлює збільшення концентрації іонів Са2+ біля міофібрил і, відповідно, амплітуди скорочення і тонічної напруги.

Застосування антитіл з метою підвищення репродуктивної функції тварин.

Вплив оваріальних антитіл на фолікуло- і оогенез. В експериментах на статевозрілих самках мишей лінії СВА внутрішньовенне введення специфічних антиоваріальних антитіл (1-10 мкг/мл) викликало через 72 год дозозалежні зміни в кількості ооцитів виділених із одного яєчника (відповідно, 19,8±1,9 та 22,0±0,9 шт/яєчник, тоді як в контролі ця величина складала 15,5±0,2 шт/яєчник (n=30; p<0,02 та p<0,01). При цьому відбувалися зміни розподілу фолікулів за розмірами в яєчнику, а також і зміни розмірів самих фолікулів. При дослідженні впливу антитіл на мейотичне дозрівання ооцитів після 2-х год культивування було встановлено, що останні в дозі 1 і 10 мкг/мл викликали індукцію у відновленні мейотичного дозрівання (втрата зародкового пухирця) відповідно в 55,6±0,7 і 64,3±6,4 % ооцитів, тоді як в контролі - лише 39,3±1,4 % (р<0,01). Збільшення концентрації антитіл до 100-800 мкг/мл викликало пригнічення мейотичного дозрівання, хоча ініціація процесу все таки відбувалася. Таким чином, проведеними дослідженнями з”ясовано, що антиоваріальні антитіла дозозалежно викликають в організмі тварин збільшення кількості ооцитів, зміну розподілу фолікулів за розмірами в яєчнику, а також - зміну самих фолікулів та ооцитів, дозозалежне збільшення кількості ооцитів, які відновлювали перший поділ мейозу in vitro. Однак залишається не з”ясованим питання - яким чином досліджувані антитіла можуть впливати на процес дозрівання ооцитів, враховуючи те, що для їх нормального мейотичного дозрівання необхідна наявність іонів Са2+ (Kline,1992).

Вплив антитіл на потенціал-керовані Са2+ канали оолеми тварин. Електрична відповідь оолеми свиней і корів на прикладений імпульс струму виявлялася у вигляді анод-розмикальних відповідей або потенціалів дії. Їх швидкість наростання складала 1 В/с, амплітуда - 75-85 мВ. На рис.17 наведені дані зміни електрофізіологічних показників оолеми зареєстровані після додавання специфічних антитіл. Із наведеного ілюстративного матеріалу видно чітке збільшення амплітуди генерованих ПД. Їх амплітуда збільшувалася на 25,4±4,9 % (n=18, p<0,01). Активуюча дія антитіл на викликані ПД досягала своєї максимальної величини на 15-20 хв. При цьому амплітуда ПД збільшувалася на 34,9±5,1 % (n=12, p<0,001). Опір мембрани зменшувався на 12,6±3,2 %, а рівень мембранного потенціалу - на 9,1±2,9% (n=9, p<0,05). Оскільки, як відомо (Humez,1995), збудливість в ооцитах є кальцієвої природи, то збільшення амплітуди трансмембранних ПД при аплікації антитіл засвідчує про їх посилений вхід при ініціації активності. Наочне підтвердження такої дії досліджуваних антитіл було отримане в експериментах із реєстрацією вхідного Са2+ струму (рис.18). Так, вже на 5 хв дії антитіл (1 мкг/мл) спостерігалося прогресивне збільшення амплітуди вхідного струму на 18,1±2,8 %, а на 10 хв його величина складала 34,6±4,5 % (n=12, p<0,001). Збільшення концентрації антитіл до 20 мкг/мл не викликало додаткового посилення вхідного Са2+ струму, а після 5-6 хв аплікації, навпаки - розвивалося поступове його пригнічення.

Таким чином, отримане в дослідах ініційоване антитілами входження екстрацелюлярного Са2+ в ооцити здійснюватиме стимулюючий вплив на подальший гаметогенез, запліднення і розвиток зиготи. Оскільки відомо, що коливання Са2+ концентрації в ооцитах при заплідненні є результатом звільнення його із внутрішньоклітинних запасників. Разом з тим, цей процес потребує додаткового позаклітинного Са2+ (Igus,1983; Kine,1992). А досліджувані специфічні антиоваріальні антитіла, завдяки викликаним внутрішньоклітинним змінам в кальцієвому гомеостазі, можуть бути використані як один із екзогенних факторів впливу на відтворюючу здатність тварин. Підтвердженням цьому є досліди із розробленими нами антиоваріальними цитотоксичними сироватками, стимуляторами репродуктивної системи корів (АОЦС-к) і свиней (АОЦС-с). Розроблена технологія їх отримання і досліджені оптимальні режими застосування. Показано, що внутрім”язове введення АОЦС-с свиноматкам і ремонтним підсвинкам в дозі 2,0 мл на 100 кг живої маси розведеної 0,9% розчином хлористого натрію стимулює, порівнюючи з контролем, збільшення кількості маток з проявом еструсу за перші 8 днів на 60-95%, підвищенню заплідненості в першу охоту на 5-24%, збільшенню багатоплідності на 1,6±0,8 поросяти на одну свиноматку (p<0,01), вірогідному збільшенню кількості зигот - 2,4±0,5 штук на матку. Введення АОЦС-с свиноматкам на 109-110 день супоросності сприяє збільшенню синхронного опоросу маток за перші 24 год на 11-82 %, скороченні періоду супоросності на 3,1±0,9 доби (n=87, р<0,01), підвищенню багатоплідності на 0,8±0,1 поросяти через зменшення кількості мертвонароджених поросят (р<0,05).

Оптимальною терапевтичною дозою АОЦС-к було її дворазове з інтервалом 48-72 год внутрішньом”язове введення в організм коровам і телицям в дозі 1,5 мл розведеної фізрозчином (1:5) сироватки на 100 кг живої маси тіла. Введення препарату коровам і телицям (із гіпофункцією яєчників різної етіології) сприяло за перші 10 днів після іньєкції АОЦС-к проявленню охоти в 59 % тварин, тоді як в контрольних дослідах - 28 %. Відповідно, за 30 днів - 91% і 66%. Заплідненість у тварин дослідної групи була вищою і складала 67 %, тоді як в контрольній групі - 43%. Застосування АОЦС-к на коровах і телицях, що тривалий час багаторазово перегулювали після осіменіння, сприяло гормональному насиченню організму, що проявлялося в зменшенні анестрального періоду і формуванні повноцінного еструсу та профілактики ембріональної смертності. Введення препарату підвищувало неспецифічну резистентність організму, скорочувало сервіс-період на 30,5±8,1 день та індепенденс-період.

Таким чином, антиоваріальні антитіла in vitro викликають посилення вхідного Са2+ струму в ооцитах корів і свиней, збільшують амплітуду ПД, ініціюють мейотичне дозрівання, стимулюють фолікуло- і оогенез. При введенні АОЦС-с і АОЦС-к, відповідно свиноматкам і ремонтним свинкам, коровам і телицям препарати виявляють виражену стимулюючу дію на репродуктивну систему тварин і можуть бути рекомендовані для використання на великих промислових комплексах з виробництва свинини і яловичини та кооперативних і фермерських господарствах.

Аналіз і узагальнення результатів дослідження.

Сукупність отриманих експериментальних даних та їх аналіз з урахуванням відомостей літератури дають можливість запропонувати гіпотетичну схему мембранних механізмів змін кальцієвого гомеостазу в клітинах скоротливого міокарду і гаметах ссавців під впливом специфічних антитіл (рис.19).Безперечно, що місцем взаємодії антитіл із відповідними антигенами є, в першу чергу, плазматична мембрана, структурні елементи якої виконують різні функції в забезпеченні життєдіяльності клітини. Антитіла, взаємодіючи із мембранною антигенною детермінантою (за принципом реакції антиген-антитіло), до якої вони вироблені в організмі донора, викликають активацію Са2+ каналів, що проявляється в ініціації вхідного струму. Окрім того антитіла викликають одночасно активацію процесів ПОЛ і окиснення арахідонової кислоти, а утворені при цьому метаболіти пригнічують енергозалежний іонний транспорт (Na+,K+- та Ca2+-АТФази), порушення Na+-Ca2+ обміну та ініціюють додатковий вхід кальцію в клітину потенціалозалежним шляхом. Сумарно, названі чинники призводять до збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+. Таким чином, мобілізація антитілоіндукованого Са2+, пригнічення Na+-Ca2+ обміну і утворення продуктів ПОЛ та метаболітів арахідонової кислоти стоять в одному ланцюгу подій, що регулюють вхід іонів Са2+ в клітину. За період короткочасної дії специфічних антитіл або при малих їх дозах збільшена таким чином в фізіологічних межах концентрація іонів Са2+ викличе стимулюючий ефект, що виявиться в розвитку позитивної хроноінотропії серцевого м”яза, а на ооцитах - індукцією гаметогенезу, стимуляцією репродуктивної функції у тварин. Оскільки, як відомо (Kline, 1992), при заплідненні вхід іонів Са2+ в клітину є необхідним, то Са2+ є тим первинним сигналом, що звільняє незрілого ооцита від мейотичного арешту (Homa, 1991).

Антитілоініційоване зростання внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ буде достатнім для активації Са2+ активованих К+ каналів, що, поруч із зниженням чутливості скоротливих білків міоцитів до іонів Са2+, призведе до розвитку від”ємного інотропного ефекту серцевого м”яза. Згідно новітнім літературним даним (Гаращук, 2000, Рєзніков, Шуба 2001) викид Са2+ із внутрішньоклітинних депо відбувається в безпосередній близькості від клітинної мембрани, так що викликане збільшення (Са2+)і є достатнім для активації Са2+ активованих К+ каналів. З іншого боку, відкривання К+-каналів сприяє більш швидкій реполяризації мембрани, що обмежує вхід Са2+ і захищає клітину від пошкодження надлишковим кальцієм (Kim, 1989). В той же час, подальше нагромадження іонів Са2+ в клітині при дії антитіл, поруч із їх блокуючим впливом на Са2+-АТФазу СПР і активацію викиду Са2+ із внутрішньоклітинних ріанодин-чутливих Са2+ депо, призведе до неконтрольованого його зростання, що виявиться через розвиток тонічної напруги серцевого м”яза, формування контрактури, пошкодження та загибелі клітини. Таким чином, перша фаза в дії антитіл пов”язана із активацією потенціалозалежного входу Са2+, що призводить до збільшення внутрішньоклітинної концентрації Са2+, а друга - відображає динамічний баланс між входом Са2+ і його виходом із клітини. Підвищення (Са2+)і при дії антитіл на клітини-мішені є важливим фактором, що ініціює електричні розлади і контрактуру, приводячи до незворотніх змін при імунному пошкодженні серця. Це добре узгоджується із даними отриманими іншими дослідниками на ізольованих кардіоміоцитах і скінованих волокнах і гладеньком”язових клітинах (Ganote,1985; Nickols,1990; Шевчук та ін.,1999), які показали, що розвиток контрактури є не лише наслідком неконтрольованого поступання Са2+, але і здатне викликати механічне пошкодження сарколеми, що призводить до смерті клітини, оскільки відомо, що підвищення (Са2+)і потенційно здатне контролювати не лише розвиток і формування скорочення (Lamb etal.,2001), але і експресію генів (Ghosh,1994), забезпечує виконання генетичних програм детермінації та програмованої смерті клітини (Spitzer, 1994).

ВИСНОВКИ

1. Використовуючи сучасні електрофізіологічні, молекулярно-біологічні та імунологічні методи, проведено розгорнуте дослідження механізмів зміни кальцієвого гомеостазу в кардіоміоцитах, ізольованих м'язах серця морських свинок і щурів та ооцитах ссавців під впливом специфічних полі- і моноклональних антимембранних антитіл, а також вплив антиоваріальних антитіл на Ca2+-індукований ооцитогенез та репродуктивну систему тварин.

2. В роботі вперше безпосередньо виміряно вхідний Са2+ і вихідний К+ струми в кардіоміоцитах і Са2+-струм в ооцитах ссавців при дії специфічних гетерологічних антитіл. Уперше досліджено антитілоопосередковані пасивні потеціал- і енергозалежні зміни Са2+-гомеостазу та антитілоіндуковані процеси вільнорадикального окиснення ліпідів клітинних мембран. 3"ясовано роль метаболітів арахідонової кислоти в клітинному кальцієвому перевантаженні при розвитку реакції антиген-антитіло.

3. Досліджено дію антимембранних антитіл на електричну активність - трансмембранні потенціали дії і скоротливу здатність ізольованих смужок папілярних м”язів серця ссавців і встановлено фазність у розвитку імунної реакції на мембрані збудливих клітин, що виявляється через зміну їхніх електрофізіологічних властивостей і детермінується як дозою, так і тривалістю дії антитіл.

4. 3"ясовано, що первинна реакція збудливої клітини на дію антитіл супроводжується розвитком стимулюючого ефекту, про що свідчить збільшення амплітуди фазних скорочень, їх приросту при ритмічній стимуляції та зростанні частоти спонтанної активності, збільшення швидкості розвитку повільної діастолічної деполяризації, що пов”язане з посиленням входу екстрацелюлярного Са2+ через активовані антитілами високопорогові Са2+ канали.

5. Показано, що антитіла в дозах 0,1-1,0 мг білку/мл при тривалій дії (більше 15 хв) або збільшенні їх концентрації до 5.0 мг білку/мл викликають пригнічення амплітуди фазних скорочень, їх приросту при ритмічній стимуляції, посилення тонічного напруження, зменшення тривалості плато потенціалів дії та швидкості наростання повільної діастолічної деполяризації в клітинах-пейсмекерах.

6. Виявлено, що антитіла викликають активацію вільнорадикального окиснення ліпідів в ізольованих серцях і везикулах плазматичних мембран та ініціюють окиснення арахідонової кислоти, а утворені при цьому вільні радикали і ейкозаноїди активують вхід іонів Са2+ через високопорогові Са2+ канали кардіоміоцитів. Блокування антитілоініційованого процесу перекисного окиснення ліпідів та метаболізму арахідонової кислоти вірогідно запобігало посиленому поступанню іонів кальцію в клітину при генерації потенціалів дії, захищаючи таким чином міоцит від цитотоксичної дії надлишку Са2+.

7. Показано, що антимембранні антитіла та ініційовані ними радикали перекисного окиснення ліпідів і метаболіти арахідонової кислоти викликають пригнічення активності транспортних Nа+,К+- та Са2+-АТФаз, що, опосередковано впливаючи на інтенсивність Nа+- Са2+ обміну, призводить до накопичення іонів Са2+ в клітині.

8. Встановлено, що антимембранні антитіла ініціюють вивільнення іонів Са2+ із ріанодин-чутливих Са2+ -депо СПР, що, разом із їх пригнічуючим впливом на активність Са2+-АТФази саркоплазматичного ретикулуму та АТФ-залежний транспорт Са2+, призводять до збільшення концентрації вільних іонів Са2+ біля міофібрил. Це є домінуючим фактором зростання тонічної напруги і зменшення швидкості розслаблення серцевого м”язу при дії антитіл.

9. Досліджено, що антимембранні антитіла викликають Са2+-залсжну активацію калієвих каналів, яка виявляється через зменшення тривалості плато потенціалів дії міоцитів, що, поруч зі зниженням чутливості скоротливих білків до іонів Са2+, спричиняє пригнічення амплітуди фазних скорочень при одночасному зростанні тонічного напруження папілярного м”яза. Деендотелізація папілярних м”язів і блокування активності NO-синтази посилює від”ємний інотропний ефект антитіл.

10. Дослідженнями встановлено, що антитілозалежна індукція окиснення арахідонової кислоти призводить до утворення її метаболітів - ейкозаноїдів, які ініціюють вхід Са2+ через потенціалозалежні Са2+ канали міоцитів. Блокування ліпоксигеназного шляху окиснення арахідонової кислоти більшою мірою, ніж циклооксигеназного, але меншою, ніж “виключення” Са2+ каналів, запобігало перевантаженню міоцитів іонами Са2+.

11. Виявлено, що антиоваріальні антитіла викликають збільшення амплітуди кальцій-залежних потенціалів дії в ізольованих ооцитах ссавців, що відображається на посиленні вхідного Са2+-струму. Показано, що антитіло ініційоване входження іонів Са2+ в ооцит стимулює процеси ооцитогенезу і мейотичного дозрівання культивованих ооцитів.

12. Розроблено технологію отримання препаратів - антиоваріальних цитотоксичних сироваток, специфічних до яєчників корів і свиней (відповідно, АОЦС-к і АОЦС-с), та експериментально з”ясовано оптимальні дози і режими їх застосування з метою стимуляції репродуктивної системи тварин.

ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ильчевич Н. В., Лисяный Н.И., Янчий Р. И. Антитела и регуляция функции организма. - Киев.: “Наукова думка”, 1986. - 248 с.

2. Ilchevich N. V., Yanchiy R. I. Effect of anticarial antibodies on the electrical and mechanical activity of the cells//J. of Molecular and Cellular Cardiology. - 1980. - V. 12, №1.- P. 60.

3 Ильчевич Н. В., Спасокукоцкий Ю. А., Алексеева И. Н., Барченко Л.І., Янчий Р. И. И др. Развитие идей А. А. Богомольца в области эспериментального изучения и применения в практике цитотоксических сывороток//Физиол. журн. АН УССР. - 1981.- №3. - С. 339-346.

4. Янчий Р. И. Ритмо-инотропные соотношения в миокардиальных волокнах при действии специфических антител//Актуальные проблемы современной патофизиологии.- Киев.: “Наукова думка”, 1981. - С. 424-425.

5. Янчий Р. И. Мембранные механизмы действия антикардиальных антител// Тезисы докл. Актуальные вопросы кардиологии, иммунологии и неотложной хирургии.- Черновцы: 1981. - С. 309-310.

6. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И. К анализу механизма стимулирующего действия противосердечных антител//В кн.: Повреждение и регуляторные процессы организма.- М., 1982. - С. 16-17.

7. Ніщіменко О. В.,Ільчевич М. В., Ступак І. І., Янчий Р. І. Вплив антисироватки специфічної до яєчників на відтворюючу здатність у свиноматок//Мат. ІІ-го з'їзду Українського фізіол. тов. ім. І. П. Павлова. - Дніпропетровськ. - 1982. - С. 304-305.

8. Янчий Р. І. Дія антикардіальних антитіл на клітини пейсмекери.//Мат. ІІ-го з'їзду Українського фізіол. тов. ім. І. П. Павлова. - Дніпропетровськ. - 1982. - С. 463-464.

9. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И. О механизме активирующего действия противосердечных антител на электрическую и сократительную активность миокардиальных клеток//Физиол. журнал. АН УССР. - 1982. - №4. - С. 401-409.

10. Ильчевич Н. В., Ступак И. И., Нищименко О. В., Янчий Р. И. Действие овариальной антисыворотки и гамма-глобулина на воспроизводительную функцию свиноматок//Мат. 5-го Межд. конгресса по иммунологии воспроизводства. - Варна. (Болгария) - 1982. - С. 343-345.

11. Янчий Р. И. Об участиии гистамина в развиии активирующего действия антител на мышечные волокна предсердия морской свинки//Физиол. журн. АН УССР. - 1982.-№5. - С. 626-629.

12. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И. Антикардиальные антитела как регуляторы сократительной функции сердечной мышцы//Мат. 14-го Всевоозного съезда физиологич. общества им. И. П. Павлова. Баку.-1983. - С. 56-57.

13. Ильчевич Н. В., Нищименко О. В., Янчий Р. И., Шарапа Г.С. Влияние овариальной антисыворотки на воспроизводительную функцию коров.//Физиол. журнал АН УССР. - 1983.- №3. - С. 353-358.

14. Ильчевич Н. В., Нищименко О. В., Янчий Р. И. Особенности сердечной мышцы на кофеин при действии антикардиальных антител//Мат. 1-го Всесоюзного симп.: Физиология и патофизиология сердца и коронарного кровообращения. Киев.. - 1983. - С. 135.

15. Ilchevich N. V., Yanchiy R. I. Membrane mechanismes of specific antibodies action of myocardial cells//Proc. 4 - Intern. Soc. Pathophysiol. DDR, (Leipzig) - 1984. - Р. 196.

16. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И. Влияние антимембранных антител на трасмембранный потенциал покоя и потенциал действия кардиомиоцитов//Физиол. журнал АН УССР. - 1984.- №5. -С. 625-634.

17. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И., Бидзиля Ю. П. Угнетение механической активности сердечной мышцы крысы под влиянием антимембранных антител//Мат. Всесоюзн. научн. конф. “Физиологические проблемы утомления”. Черкассы. - 1985. -С. 52-54.

18. Янчий Р. И. Бидзиля Ю. П. Изменение ионной проводимости кардиомиоцитов при действии антимембранных антител//Мат. 2-го симп. по сравнит. электрокардиологии. Сыктывкар. - 1985. -С. 15.

19. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И., Ступак И. И., Швецов С. В. и др. Эффективность разных методов и средств в повышении воспроизводительной способности у свиноматок//Физиол. журнал. АН УССР. - 1985. - №3. -С. 331-336.

20. Ильчевич Н. В., Алексюк Л. И., Янчий Р. И., Доротюк Э.Н. и др. Использование цитотоксической сыворотки АОЦС-с для улучшения воспоизводства стада в мясном скотоводстве//Сб.:”Молочно-мясное скотоводство”. Киев. - 1986.-№68. -С. 19-22.

21. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И., Доротюк Э. Н., Ступак И. И. Применение овариоцитотоксинов в животноводческой практике // ”Актуальные вопросы современной физиологии”. К.: “Наукова думка”, 1986. - С. 146-147.

22. Ільчевич М. В., Ступак І. І., Янчий Р. І., Швецов В. С., та інш. Регуляція овуляції та опоросів у свиноматок препаратами АОЦС-с та гамма-глобуліном//Мат. 12-го з'їзду фізіол. т-ва ім. І. П. Павлова. Львів.- 1986. - С. 161.

23. Ступак И. И., Янчий Р. И., Швецов В. С., Ильчевич Н. В., Натаров В. В. и др. “Методические рекомендации по применению в условиях промышленной технологии биологически активных препаратов с целью повышения воспроизводительных способностей свиноматок” ЮОВАСХНИЛ. Харьковская гор. тип. №16, НИИ Животноводства Лесостепи и Полесья УССР. -Харьков, 1986. - 14 с.

24. Янчий Р. И., Кошель М., Ильчевич Н. В. Электрофизиологические свойства мембраны ооцитов и зигот//Мат. 3-го Всесоюзн. симп. по иммунологии репродукции. - Киев - 1987. - С. 84-85.

25. Ilchevich N. V., Yanchiy R. I., Zelenskay T. M., Bidziliya Yu. P., Alexyuk L. I. The effect of antiovarian antibodies on morfo-functional characteristics of rat, pig and cow ovaries with hypogonadism of different origin. //Gen. Comp. Endocrinol.. - 1987.- Vol. 66, №1. - Р. 25.

26. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И., Бидзиля Ю. П. Реакция сердечной мышцы на воздействие специфических антител//“Иммунология и алергия”. Киев.: “Здоровье”.- 1987. - С. 90-93.

27. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И., Бидзиля Ю. П., Волощенко Ю. В. Стимулирущее действие антиовариальных антител на половую функцию и оплодотворяемость коров//Тез. науч. сооб. 4-го съезда физиологов Узбекистана. -Ташкент- 1988. - С. 124-125.

28. Ильчевич Н. В., Янчий Р. И., Бидзиля Ю. П. К механизму иммунного поражения сердечной мышцы// Тез. науч. сооб. 4-го съезда физиологов Узбекистана. -Ташкент - 1988. -С. 118.

29. Ilchevich N. V., Zelenskaya T. M., Yanchiy R. I., Bidzilya Yu. P. Specific antibodies action on reproductive system of different animal species.//14 Conference of European Comparative Endocrinologists. -Zalzburg. - 1988. - Р. 102.

30. Ільчевич М. В., Янчій Р. І., Бідзіля Ю. П. та інш. До застосування специфічних імунних сироваток у тваринництві//Мат. 12-го з'їзду Укр. Фізіол. Т-ва ім. І. П. Павлова.-Харків. - 1990. - С. 129.

31. Фокшей М. М., Янчий Р. И. Новые препараты для стимуляции воспроизводительной функции у свиней//Информ. листок о передовом производственно-техническом опыте. № 90-27. Ивано-франковск, - 1990, выпуск №3.

32. Янчий Р. И., Гоцуляк Я. Н. Влияние специфических антител на биофизические свойства оолемы//Мат. Всесоюзн. Конф. “Современные методы исследования в свиноводстве”. - Полтава. - 1990. - С. 100.

33. Gotsulyak Ya.N., Yanchiy R.I., Ilchevich N.V., Romanyuk M.B., Bidzilya Yu.P., Megedyn I.V. Аntibodies alter oocyte excitability // Immunology of reproduction: Thesis of 4-th All-Union Symposium with international participation. (October 24-26,1990), Kiev.-1990.-p. 30-31.

34. Гоцуляк Я. М., Янчій Р. І., Ільчевич М. В., Юрах Г. Ю. Вплив специфічних антитіл на електрофізіологічні властивості мембрани ооцитів миші.//Физиол журнал АН УССР. - 1991.- т. 37, №1. - С. 106-109.

35. Yanchiy R.I., Bidzilya Yu.P., Aleksyuk L.I., Gotsulyak Ya.N., Lushnikova I.V., Spirkina I.E. Influence of antibodies against membrane fragments on ionic transport in cardiac myocytes and oocytes // Proc.Intern. Soc. Pathophysiol.: Constituent Congress Intern.Soc.Pathophysiol., Moscow, May 28-June 1,1991.- Abstracts N9.1.20.-P.217.

36. Бідзіля Ю. П., Янчій Р. І. Лушнікова І. В. Антитіла викликають підвищення тонічної напруги серцевого м'яза щурів//Фізіол. журн.-1992.-т. 30, №4. - С. 89-92.

37. Gotsulyak Ya. N., Yanchiy R. I. Role of antibodies in the atretic process//I. Immunol. Immunopharm. -1992.- v. 12, №2. - Р. 97.

38. Янчій Р. І., Бідзіля Ю. П., Алексюк Л. І., Ільчевич М. В. Антикардіальні антитіла впливають на траспорт кальцію в кардіоміоцитах щурів//”Фундаментальні механізми розвитку патол. процесів”. - Дніпропетровськ. - 1992. - С. 149-150.

39. Yanchiy R. I., Gotsulyak Ya. N., Bidzilya Yu. P. Morpho-physiological alteratins in oocytes under the actin of specific antibodies.//8-th Intern. Congress of Immynology. August 23-28, Budapest (Hungary) -1992. - Р.

40. Янчий Р. И., Бидзиля Ю. П., Гоцуляк Я. Н., Стежка В. Н. Антитела ингибируют траспортные АТФазы сердца крыс.//Тез. Докл. 3-го Всесоюзн. Симпозиума “Физиология и патофизиология сердца и коронарного кровообращения”. - Киев.-1992. - С. 202.

41. Алексюк Л. І., Янчій Р. І., Бідзіля Ю. П., Сухіна В. С. Вплив антитіл специфічних до сарколеми кардіоміоцитів щурів на активність 5'нуклеотидази//Фізіол. журн.- 1993. Т. 39, №5-6. - С. 82-85.

42. Gotsulyak Ya. N.,Yanchiy R. I. Influence of specific antibodies on oolema Ca-channels//In.: Abstr. Intern. Symp. Immunology of Reproduction. - Кiev. (Ukraine) - 1993. - С. 18.

43. Yanchiy R. I., Gotsulyak Ya. N. Antibodies depress Ca-current of mouse eggs. //2-nd International forum of reproductive immunology, Magdeburg. - 1993. - Р. 68.

44. Yanchiy R. I., Bidzilya Yu. P., Gotsulyak Ya. N. The antibodies initiate the Ca relese from the sarcoplasmic reticulum of the rat hart. // III Internat. Symposium on comparative electrocardiology. Syktyvkar, Komy, Russia. - 1993. - С.21.

45. Мойбенко О. О., Янчій Р. І., Марченко Г. І., Чередніченко Г. О. і др. Механізм протекторної дії інгібітора ліпооксигенази-лінолеїл гідроксамової кислоти при імунному пошкодженні серця//Між. симпозіум з фармакології, Львів. - 1994.- С. 27-28.

46. Янчій Р. І., Бідзіля Ю. П., Гоцуляк Я. М. Вплив антимембранних антитіл на процес перекисного окислення ліпідів в серцях щурів//Мат.14 з'ізду Укр. товариства ім. І.П. Павлова - 1994. - С. 208-209.

47. Бідзіля Ю. П., Янчій Р. І., Янчій О. Р. До мембранних механізмів розвитку тонічної напруги серцевого м'яза щура при дії антимембранних антитіл//Фізіол. журнал - 1995. -№3-4. - С. 67-75.

48. Янчій Р. І., Бідзіля Ю. П., Гоцуляк Я. М., Ільчевич М. В. і др. Дія специфічних антитіл на визвані потенціали кардіоміоцитів в умовах блокади метаболізму арахідонової кислоти //Фізіол. журнал - 1996. -Т. 42, № 3-4. - С. 53-54.

49. Yanchiy R. I. The influence of the antimembrane antibodies on ATP-dependent Ca2+ transport in rat cardiac sarcoplasmatic reticulum (SPR) vesicles//IV International Symposium on Comparative Electrocardiology, June 3-5.- Syktyvkar, Komi, Russia. - 1997. - С. 14.

50 Стежка В. А., Янчій Р. І., Бідзіля Ю. П. Речовина , що має пригнiчуючу дію на міокард//Патент України. Бюл. №1, 28.02.97.

51. Янчій Р. І. Активуючий ефект антисарколемальних антитіл на скоротливі реакції папілярних м'язів серця щура//Фізіол. журнал. - 1997. -Т. 43, №5-6. - С. 11-16.

52. Ільчевич М. В., Ніщіменко О. В., Янчій Р. І., Волощенко Ю. В. і др. Спосіб отримання антиоваріальної цитотоксичної сироватки специфічної для корів//Патент України №19904, Бюл. №6, 25.12.97.

53. Янчій Р. І. Вплив антисарколемальних антитіл на внутріклітинне входження іонів кальцію в міоцитах серця щура//ТезиXV з'їзду фізіологів України. - Фізіол. журн. - 1998. - Т.44, №3. -С. 202.

54. Янчій Р. І., Бідзіля Ю. П., Гоцуляк Я. М., Янчій І. Р. Антитіла змінюють внутрішньоклітинний кальцієвий гомеостаз//Фізіол. журнал. - 1998. - Т. 44, №4. - С. 128.

55. Янчій Р. І. Вплив антитіл на вихід кальцію із саркоплазматичного ретикулуму папілярного м'язу серця щура//Фізіол. журнал. - 1998. - Т. 44, №1-2. - С. 11-19.

56. Yanchiy R. I., Bidziliya Yu. P., Yanchiy O. R., Goisulyak Ya. M. The antibodies as triggers of the tension oscilations in rat papilary muscles // III International Congress of Patophysiology. - Lahti. (Finland). - 1998. - P. 138.

57. Гоцуляк Я. М., Янчій Р. І. Антитіла пригнічують мейотичне дозрівання ооцитів in vitro//Фізіол. журнал. - 1999. т.45, №3 - С. 28-34.

58. Янчій Р. І, Вознесенська Т. Ю., Блашків Т. В. Вплив кальцію на відновлення першого поділу мейозу та на формування першого полярного тільця in vitro ооцитами мишей на стадіях проеструс та еструс// Експер. та клін. фізіол. і біохім.- Львів.- 1999. -№2 - С. 21-25.

59. Гоцуляк Я. М., Янчій Р. І. Антиоолемальні антитіла як причина імунного безпліддя//Бесплодие: вспомогательные репродуктивные технологии 2000. - Киев - 1999. - С. 152-155.

60. Алексєєва І.М., Вознесенська Т.Ю., Блашків Т.В., Янчій Р.І. Відновлення in vitro мейотичного дозрівання та формування першого полярного тільця ооцитами мишей на різних стадіях естрального циклу.// Фізіол.журн., 1999, т.45, №5, С. 55-59.

61. Янчій Р. І., Блашків Т. В., Вознесенська Т. Ю., Бідзіля Ю. П. і др. Вплив верапамілу на відновлення першого поділу мейозу та формування першого полярного тільця ооциттами мишей in vitro//Фізіол. журнал. - 2000, т. 46, № 1, -С. 52-57.

62. Блашків Т.В., Алексєєва І.М., Янчій Р.І., Портниченко А.Г. Участь кальцієвих каналів L-типу у відновленні мейозу ооцитами мишей та вплив антитіл на цей процес. // Нейрофізіологія, 2000, т. 32, №3, -С. 187-189.

63. Блашків Т. В., Алексєєва І.М., Янчій Р.І., Портниченко А.Г. Бідзіля Ю.П. Морфометричні зміни фолікулів ооцитів миші після внутрішньовенної ін”єкції великих доз оваріальної цитотоксичної сироватки та антиоваріальних антитіл. // Експер. та клін. фізіол. і біохім.- Львів.- 2000, № 4 - С. 23-28.

64. Блашкив Т.В., Корнийчук А.А., Вознесенская Т.Ю., Алексеева И.Н, Янчий Р.И. Роль оксида азота в овуляции, мейотическом созревании ооцитов и имплантации у мышей. // В кн.: Механизмы функционирования висцеральных систем. Санкт-Петербург, 2001, С. 36-37.

65. Алексєєва І.М., Янчій Р.І. Від антиретикулярної цитотоксичної сироватки Богомольця до моноклональних антитіл. Фізіол.журн., 2001, т.47, №2, С. 3-12.

АНОТАЦІЇ

Янчій Р.І. Механізми антитілоіндукованої модуляції кальцієвого гомеостазу в клітинах-мішенях. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено з”ясуванню механізмів антитілоіндукованої модуляції кальцієвого гомеостазу в кардіоміоцитах і ооцитах, включаючи мембранні механізми входу Са2+ в клітину-мішень, а також механізми його вивільнення із внутрішньоклітинних депо СПР, що має фундаментальне і прикладне значення для розкриття патогенної ролі антитіл при імуногенному пошкодженні серцево-судинної та репродуктивної систем. Поєднуючи сучасні електрофізіологічні, імунологічні і молекулярно-біологічні методи дослідження, отримано нові дані про дію полі- і моноклональних антитіл на пасивний і активний іонний транспорт, ізометричне скорочення, антитілоініційовані процеси перекисного окиснення, метаболізм арахідонової кислоти і гаметогенез. Уперше показано, що антитілоіндукована мобілізація Са2+, пригнічення транспортних АТФаз, порушення Na+-Ca2+ обміну, утворення продуктів ПОЛ і ейкозаноїдів є головними факторами у регуляції внутрішньоклітинного Са2+ в клітинах-мішенях. З”ясовано, що перша фаза у дії антитіл пов”язана із активацією потенціалозалежного входу Са2+, що призводить до збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+, а друга - відображає динамічний баланс між входом Са2+ ззовні (зініційованого процесами ПОЛ, ейкозаноїдами, активацією Са2+-активованих калієвих каналів) і виходом із клітини-мішені. Антиоваріальні антитіла викликають Са2+-залежну індукцію гаметогенезу, активацію репродуктивної системи ссавців. Запропоновано, що тільки комплексне, поєднане застосування блокаторів іонотранспортних систем і ПОЛ ефективно запобігає розвитку імуногенного пошкодження серцевого м”яза, викликаного Са2+ перевантаженням. Розроблена технологія отримання і досліджені оптимальні дози та режими застосування антиоваріальних сироваток, специфічних до яєчників корів і свиней (відповідно, АОЦС-к і АОЦС-с) з метою стимуляції репродуктивної функції.

Ключові слова: антитіла, кардіоміоцит, Са2+ канали, кальцієвий гомеостаз, транспортні АТФази, Са2+ - активовані К+-канали, ПОЛ, ооцит, гаметогенез, репродукція.

Янчий Р.И. Механизмы антителоиндуцированной модуляции кальциевого гомеостаза в клетках-мишенях. - Рукопись.

Дисертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Институт физиологии им.А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена выяснению антителоиндуцированной модуляции кальциевого гомеостаза в кардиомиоцитах и ооцитах, включая мембранные механизмы входа Са2+ в клетки-мишени, а также механизмы его высвобождения из внутриклеточных депо СПР, имеющие фундаментальное и прикладное значение для раскрытия патогенной роли антител при имуногенном повреждении сердечно-сосудистой и репродуктивной систем. Сочетание современных электрофизиологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования разрешило получить новые данные о действии специфических антимембранных поли- и моноклональных антител на активный и пассивный транспорт в кардиомиоцитах, изометрическое сокращение, антителоиндуцированные процессы свободно-радикального окисления, метаболизм арахидоновой кислоты, гаметогенез. Впервые показано, что специфические антитела, взаидействуя с мембранной антигенной детерминантой (по принципу реакции антиген-антитело) вызывают активацию кальциевых каналов кардиомиоцитов и ооцитов, что проявляется в инициации входного кальциевого тока. Кроме того, антителоиндуцированная мобилизация Са2+ (снижение активности Na+,K+- и Са2+-АТФаз, нарушение Na+/Ca2+ обмена, образование продуктов ПОЛ и эйкозаноидов является главным фактором в изменении внутриклеточного кальция в клетках-мишенях. Установленные факторы приводят к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+. За время кратковременного действия специфических антител или при малых их дозах увеличена таким образом в физиологических пределах клеточная концентрация ионов Са2+ вызывает стимулирующий эффект, который проявляется в развитии положительной хроно-инотропии сердечной мышцы. Антиовариальные антитела в таких условиях действия вызывали Са2+-зависимую индукцию гаметогенеза, стимуляцию репродуктивной функции животных. Антителоиндуцированное повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ вызывает активацию Са2+ -активированных К+ каналов, что вместе со снижением чувствительности сократительных белков к ионам Са2+ приводит к развитию отрицательного хроно-инотропного эффекта. Дальнейшее накопление ионов Са2+ в клетке при действии антимембранных кардиальных антител наряду с их блокирующим влиянием на Са2+-АТФазу и активацией выброса Са2+ из внутриклеточных рианодин-чувствительных Са2+ депо приводит к неконтролированному увеличению концентрации Са2+, что проявляется через развитие тонического напряжения сердечной мышцы, формирование контрактур, повреждение и гибель клетки. Таким образом, первая фаза в действии антител связана с активацией потенциалзависимого входа Са2+, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+, а вторая - отображает динамический баланс между входом Са2+ из вне (инициированного продуктами ПОЛ, эйкозаноидами, активацией Са2+-активированных К+ каналов) и их выходом из клеток-мишеней. Установлено, что блокирование липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в большей степени, чем циклооксигеназного, но в меньшей мере, чем ингибирование кальциевых каналов, предотвращало развитие цитотоксического действия антител на сердечную мышцу. Предложено, что только комплексное, сочетанное применение блокаторов ПОЛ и ионотранспортных систем эффективно предотвращает развитие иммуногенного повреждения сердечной мышцы, вызванного кальциевой перегрузкой. Разработана технология получения и установлены оптимальные дозы и режимы применения антиовариальных сывороток, специфических к яичникам коров и свиней (соответственно, АОЦС-к и АОЦС-с) с целью стимуляции репродуктивной функции.

Ключевые слова: антитела, кардиомиоцит, Са2+ каналы, кальциевий гомеостаз, транспортные АТФазы, Са2+ - активированные К+ - каналы, ПОЛ, ооцит, гаметогенез, репродукция.

Yanchiy R.I. Mechanisms of the antibody-induced calcium homeostasis modulation in the cell-targets. - Manuscript.

Thesis for the degree of Doctor of Biological Sciences (the second degree) 03.00.13 - human and animal physiology. - O. O. Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The thesis is devoted to the investigation of the antibody-induced calcium homeostasis modulation in cardiomyocytes and oocytes, involving membrane mechanisms of Ca2+ influxes to the cell-target and mechanisms of calcium release from intracellular pools of SPR, what has fundamental and applied importance for understanding of pathogenic role of the antibodies during the immune damage of the cardio-vascular and reproductive systems. Combining modern techniques of the researches from electrophysiology, immunology and molecular biology the new data about the influence of poly- and monoclonal antibodies on the passive and active ionic transport, isometric contraction, antibody-induced processes of free radical oxidation, metabolism of arachidonic acid and gamete-genesis were received. It was the first shown that antibody-induced mobilization of the Ca2+, inhibition of the transport ATPase, distortion of the Na+-Ca2+ exchanger, generation of the LP products and eicosanoids are the main factors for intracellular calcium concentration regulation in cell-targets. It's proved that the first phase of the antibody influence deals with activation of voltage-activated Ca2+ influx, what resulted intracellular Ca2+ increase, and the second - dynamical balance between Ca2+ influx (initiated by LP processes, eicosanoids, Ca2+-acivated K+-channels) and calcium outward current. Anti-ovarian antibodies cause Ca2+-dependent induction of the gamete-genesis with further mammalian reproductive system activation. It's proposed to use complex blockade of LP and ion-transport systems to effectively prevent immune damage of the myocardium caused by Ca2+ overload. Developed new technology for the receiving and studying of the use of optimal doses of anti-ovarian serums, specific to cow and swine ovaries (accordingly, AOCS-c and AOCS-s) for reproductive system stimulation.

Key words: antibody, cardiomyocytes, calcium channels, calcium homeostasis, transport ATPase, Са2+-activated K+-channels, LP induction, oocytes, gametogenesis, reproduction.

Размещено на Allbest.ru