Спонтанна та індукована мінливість кукурудзи in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут фізіології рослин і генетики

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

03.00.15. - Генетика

Спонтанна та індукована мінливість кукурудзи in vitro

Чеченєва Тетяна Миколаївна

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України, м.Київ

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, член - кореспондент НАН України Кунах Віктор Анатолійович Інститут молекулярної біології і генетики НАН України завідувач відділу генетики клітинних популяцій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Кучук Микола Вікторович Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України заступник завідувача відділу генетичної інженерії

доктор біологічних наук, професор Горбатенко Ігор Юрійович Миколаївський державний аграрний університет професор кафедри генетики

доктор біологічних наук Галкін Анатолій Павлович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України завідувач відділу біоінженерії

Провідна установа: Інститут агроекології та біотехнології УААН, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 15 “ січня 2004р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і

генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська 31/17.

Автореферат розісланий “ 9 “ грудня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

1. Загальна характеристика роботи

генетичний кукурудза популяція регенерація

Актуальність теми. Кукурудза - одна з провідних злакових культур важлива як харчовий продукт для людей і тварин. Однак слід відмітити, що генетична варіабельність для комерційного виробництва кукурудзи, що вирощується в зоні помірного клімату, обмежена. Абсолютна більшість генетичної різноманітності кукурудзи базується на тропічному фотоперіодочутливому матеріалі з Південної і Центральної Америки. З таким матеріалом складно працювати у зонах помірного клімату, до яких належать більша частина території України. Слід відмітити, що виробництво гібридної кукурудзи базується на гібридному насінні, що має походження з обмеженої кількості інбредних ліній. Недостатня генетична різноманітність відкриває шлях до росту захворюваності й обмежує поліпшення кукурудзи помірного клімату. Актуальною науковою проблемою є дослідження можливостей створення нового вихідного матеріалу для генетико-селекційних потреб і комерційного виробництва кукурудзи біотехнологічним шляхом.

Традиційними джерелами спадкової мінливості, що використовуються в генетично-селекційній практиці кукурудзи, є гібридизація з наступним добором і мутагенез (спонтанний та індукований). Разом з тим, останнім часом дедалі більше значення почали мати рослини різних видів, створені за допомогою біотехнологічних методів, які базуються на використанні культури in vitro рослинних тканин: сомаклональної мінливості, генетичної інженерії, андрогенезу, клітинної селекції. Тобто активно ведеться пошук нових нетрадиційних шляхів впливу на геном рослин з метою створення більш продуктивних і стійких до несприятливих умов генотипів рослин.

Особливо велика увага до кукурудзи як до об'єкта досліджень у генетиці соматичних клітин з'явилась у 80-і роки. Інтерес стимулювало повідомлення про важливі в генетичному відношенні наслідки реалізації спонтанної мінливості клітин в культурі in vitro як на клітинному, так і на організм енному рівнях. Для такої мінливості запропонували назву сомаклональна [Larkin,Scowcroft, 1981]. Спонтанна мінливість клітин рослин в умовах in vitro була відома значно раніше, але в більшості випадків вона розглядалась як небажане явище при клональному розмноженні певних генотипів. Незадовго перед тим, в 1975 році Green і Phillips запропонували достатньо вдалий підхід до отримання тотипотентної калюсної тканини і регенерації рослин у кукурудзи. Далі досить тривалий час зусилля фахівців були направлені на оптимізацію умов культивування та складу живильного середовища з метою підвищення регенераційного потенціалу.

Для реалізації можливостей сомаклональної мінливості та інших біотехнологічних методів для злаків і, зокрема, для кукурудзи, необхідно здолати три основні етапи: перший - одержання клітинних культур з високим і тривалим довгий час регенераційним потенціалом з селекційно-цінних інбредних ліній; другий - регенерація повноцінних рослин з таких ліній; третій - генетичне вивчення та наступне використання виявленої мінливості.

Кращі за вказаними ознаками лінії А 188 [Green, Phillips, 1975], Сhi 31 [Novak та ін. 1983] широко використовують для фундаментальних досліджень, але вони не підходять для вирішення конкретних генетико-селекційних задач з поліпшення кукурудзи помірного клімату внаслідок, в першу чергу, їх пізньостиглості. Селекційно-цінні інбредні лінії часто мають незадовільний морфогенетичний потенціал, тому не можуть бути використані як вихідний матеріал для біотехнологічного поліпшення кукурудзи.

На сьогодні ще недостатньо відомостей про генетичну природу проявлення і успадкування ознак “індукція калюсоутворення” і “регенераційна здатність” в культурі in vitro в ряду поколінь та при гібридизації альтернативних за цими ознаками інбредних ліній кукурудзи. Практично відсутні відомості про порівняльні генетичні дослідження рослин-регенерантів, отриманих внаслідок реалізації сомаклональної та індукованої різними чинниками спадкової мінливості in vitro.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. В основу дисертаційної роботи покладені результати, отримані автором при виконанні розділів планів наукових досліджень за бюджетними темами відділів: цитогенетики і поліплоїдії Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, цього ж відділу та відділу молекулярної генетики Інституту фізіології рослин і генетики НАНУ “Вивчення генетичних і цитогенетичних механізмів, які підвищують фертильність і продуктивність поліплоїдних рослин та контролюють структуру клітинних популяцій”(№ держ.реєстрації 76020014 1977-1981рр.), “Вивчення закономірностей мінливості соматичних клітин і рослин під впливом екзогенних нуклеїнових кислот і фізіологічно - активних сполук” (№ держ.реєстрації 81017890 1981-1983рр.), “Індукована мінливість в культурі клітин рослин” (№ держ.реєстрації 01840010695 1984-1987рр.), “Мінливість клітин рослин під впливом чужорідної генетичної інформації і стресових факторів середовища” (№ держ.реєстрації 0188005653 1988-1992рр.), “Експериментальна мінливість в культурі тканин рослин” (№ держ.реєстрації 01930004923 1993-1996рр.), “Клонування і вивчення генів, які обумовлюють стійкість рослин до фітопатогенів і гербіцидів” (№ держ.реєстрації 01930002841 1993 - 1997рр.), “Дослідження сімейства гомологічних шаперонінів бульбочкових бактерій і їх ролі в фіксації азоту в симбіозі з рослинами” (№ держ.реєстрації 0198U00800 1998-2000рр.), “Молекулярно-генетичні основи якості зерна зернових культур” (№ держ.реєстрації 0101U000626 2001-2003рр.), ДНТ програм Комітету по НТП при Кабінеті Міністрів України “Розробка методів клітинної селекції щодо стійкості до стресових факторів середовища, токсинів, фітопатогенних грибів та бактерій, з поліпшеним складом амінокислот”( № проекту 3.1.15.15, 1992-1994рр.),”Розробка методів клітинної селекції злаків з поліпшеним складом амінокислот” (№ проекту 1993-1994рр.), “Розробка на основі досягнень клітинної біології нових вихідних форм рослин з цінними сільськогосподарськими ознаками” (№ проекту 3.1.15.16, 1992-1994 рр.), Державного Фонду фундаментальних досліджень Міннауки України “Дослідження взаємозв'язку регенераційної здібності культури клітин in vitro із сформованістю фотосинтетичного апарату “ (№ проекту 5.3/263, 1993-1995рр.).

Мета і задачі дослідження. Головною метою дослідження було встановлення генетичних особливостей і закономірностей проявлення сомаклональної та індукованої впливом різних чинників мінливості в клітинних популяціях соматичних тканин та в рослинах - регенерантах кукурудзи.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні задачі:

1. Дослідити морфогенетичні процеси, що мають місце при культивуванні in vitro різних за походженням соматичних тканин інбредних ліній і гібридів кукурудзи;

2. Провести порівняльне дослідження впливу генетичних та епігенетичних факторів (генотипу донорних рослин, гібридизації генотипів і видів, типу та стадії розвитку вихідного експлантата, складу живильного середовища, фізичних умов та інш.) на процеси калюсоутворення і регенерації рослин;

3. Виявити і провести класифікацію ліній-донорів за ознаками “індукція калюсоутворення” і “регенераційна здатність”, довести генетичний характер контролю, успадкування та можливість штучного добору за цими ознаками;

4. Дослідити особливості сомаклональної мінливості за якісними і кількісними ознаками в культурі in vitro і в нащадків рослин - регенерантів кукурудзи;

5. Дослідити особливості впливу різних мутагенних чинників (хімічні мутагени, гамма - опромінення) та бактеріальних плазмід на калюсну культуру та проявлення індукованої мінливості серед рослин - регенерантів;

6. Встановити можливості використання сомаклональної мінливості та клітинної селекції in vitro в дослідах з селекції на поліпшений амінокислотний склад білка кукурудзи.

Об'єкт досліджень - гетерогенні клітинні популяції (калюс), отримані внаслідок дедифференціації клітин в культурі in vitro з соматичних тканин різного походження (незрілі, зрілі зародки, проростки) інбредних ліній, міжлінійних і віддалених гібридів кукурудзи.

Предмет досліджень - особливості індукції різних типів калюсоутворення і шляхів регенерації рослин in vitro, можливості реалізації сомаклональної та індукованої мутагенними чинниками мінливості серед калюсних культур і рослин-регенерантів кукурудзи.

Методи досліджень. Основними були методи генетики соматичних клітин рослин in vitro, які базуються на можливостях ізольованого культивування соматичних клітин на штучних живильних середовищах з наступною диференціацією рослин - регенерантів de novo.

Рослини вихідних генотипів (інбредних ліній і гібридів) вирощували головним чином в польових умовах при застосуванні контрольованої примусової ізоляції та запилення як прийнято в селекційно - генетичних дослідах. Рослини - регенеранти (R0) культивували в умовах: світлових кімнат, камер штучного клімату, теплиць. Наступні покоління регенерантів вирощували в польових умовах.

Для виявлення гетерогенності клітинних популяцій і підрахунку числа хромосом в корінцях рослин - регенерантів використовували цитологічні методи.

Для з'ясування впливу світла на морфогенетичні реакції проростків застосовували опромінення аргоновим лазером.

Стан фотосинтетичного апарату в калюсних тканинах характеризували методами дослідження біохімії фотосинтезу за структурними і функціональними показниками (спектри флуоресценції, індукційні криві).

Амінокислотний аналіз калюсів та насіння рослин-регенерантів проводили на амінокислотному аналізаторі ААА-339.

Методи варіаційної статистики і генетичного аналізу було використано для оцінки достовірності і особливостей прояву певних закономірностей.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що міжлінійна варіабельність, яка зумовлює індукцію калюсоутворення трьох різних типів та двох шляхів регенерації рослин de novo в ізольованій культурі має генетичну природу і обумовлюється генотипом вихідних інбредних ліній кукурудзи.

Вперше доведена можливість штучного добору ознаки “індукція тотипотентного калюсоутворення” серед гетерогенних за ознакою клітинних популяцій (калюсів) різних інбредних ліній та подальше її успадкування після регенерації рослин в ряду насінневих поколінь. Внаслідок чого вперше отримані унікальні сомаклональні лінії з успадковано-підвищеним регенераційним потенціалом з селекційно - цінних ліній з низьким регенераційним потенціалом.

Використання саме таких ліній забезпечило отримання суттєвих успіхів при індукції тотипотентного калюсоутворення з зрілих зародків, клітинної селекції до аналогу лізину - АЕЦ, підвищення компетентності генотипів при трансформації.

При аналізі виділених нами альтернативних за регенераційним потенціалом інбредних ліній кукурудзи вперше встановлено, що реалізація регенераційної здатності залежить від сформованості і функціональної активності фотосинтетичного апарату в калюсних культурах.

Вперше проведено генетичний аналіз сомаклональних рослин-регенерантів і експериментально доведено наявність стабільних сомаклональних мутантів.

Вперше показано, що низькі дози хімічних мутагенів позитивно впливають на зміну спектра ростових реакцій в культурі in vitro інбредних ліній.

Вперше проведено порівняльний аналіз та встановлено відмінності спектрів сомаклональної і індукованої впливом хімічного мутагенезу мінливості.

Вперше встановлено доцільність використання мутантних ліній, отриманих шляхом експериментального мутагенезу in vivo, в разі низького рівня калюсоутворення в вихідного матеріалу.

Вперше показана можливість отримання біотехнологічним шляхом, реалізуючи спонтанну мінливість клітин in vitro, зразків кукурудзи з підвищеним синтезом білка і незамінних амінокислот в насінні сомаклональних рослин-регенерантів.

Практичне значення результатів. Шляхом поєднання спонтанної мінливості та штучного добору з гетерогенних калюсних популяцій кукурудзи виділено генетично-стабільні сомаклональні інбредні лінії з успадкованим в ряді поколінь підвищеним рівнем регенераційного потенціалу. Отримані лінії, крім того, є носіями цінних господарських ознак в порівнянні з вихідними лініями. Сомаклональні інбредні лінії виділені з селекційно-цінних для природнокліматичних умов України інбредних ліній (Піонер 346, Оh 43, ВС 2923). Вказані вихідні лінії внаслідок низькогo регенераційного потенціалу раніше не могли бути залучені до біотехнологічного поліпшення кукурудзи.

Використання сомаклональних інбредних ліній як вихідного матеріалу дозволило суттєво підвищити ефективність експериментальної роботи в напрямках: клітинної селекції проти аналога лізину - АЕЦ, генетичної трансформації, культивування зрілих зародків і експериментального мутагенезу in vitro. Біотехнологічним шляхом, реалізуючі спонтанну мінливість клітин in vitro, можливо отримати зразки кукурудзи з підвищеним синтезом білка і незамінних амінокислот.

Сомаклональні інбредні лінії кукурудзи (УКЧ 1- УКЧ 12) передані і зареєстровані в Національному центрі генетичних ресурсів України (довідка № 60 від 6 березня 2001р.), Свідоцтва про реєстрацію зразка генофонду рослин в Україні (№ 83, 84 від 5 грудня 2002р.).

Тим самим створено необхідні передумови для переходу від дослідницької роботи в генетиці соматичних клітин і біотехнології кукурудзи з піздньостиглими модельними лініями з високою регенераційною здатністю (А188, Chi31) до селекційно-цінних. У зв'язку з цим, матеріали дисертації можуть представляти інтерес для наукових закладів генетико - селекційного напрямку та бути використані при викладанні генетики і біотехнології рослин в вузах.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто. Здобувач розробила робочі гіпотези, спланувала, провела основні експериментальні дослідження, здійснила аналіз, інтерпретацію і узагальнення одержаних результатів, запропонувала шляхи впровадження результатів досліджень в генетико-селекційний процес. Окремі експерименти і аналізи виконані спільно з співробітниками відділів експериментального мутагенезу, цитогенетики і поліплоїдії, біохімії фотосинтезу, лабораторії інструментальних методів дослідження Інституту фізіології рослин і генетики НАНУ, відділом механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, лабораторії генетичних ресурсів кукурудзи Національного центра генетичних ресурсів України. У проведенні досліджень і їх узагальненні частка автора складає 75%.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались та були представлені на IV (Одеса,1981), V (Київ,1986), VI (Полтава,1992), VII ((Крим,2002) з'їздах УТГС, XIV (Москва,1978), XV (New Delhi,1983) Міжнародних генетичних конгресах, V Міжнародній конференції “Биология культивируемых клеток и биотехнология” (Новосибирск,1988), Всесоюзній нараді “Генетика соматических клеток в культуре” (Звенигород,1989), VII International Congress of Plant Tissue and Cell (Amsterdam,1990), II International Conference “Plant Biology and Biotechnology in Vitro”(Almaty,1993), I (Kyiv, 1994), II (Kyiv,1998) International Symposium “Plant Biotechnology and Genetics Engeneеring”, VI Міжнародній науково-технічній конференції “Проблеми створення і впровадження нових ресурсо- та енергощадних технологій” (Київ,2000), International Symposium “ Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology” (Moscow, 2001), науковій конференції ”Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми” (Київ, 2002), IV International conference “Plant Genome” (Odessa,2003). Матеріали дисертації неодноразово доповідались на науково-теоретичних семінарах Інституту фізіології рослин і генетики НАН України та Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 44 наукових праці, в тому числі 21 стаття у провідних фахових виданнях, 1 патент України, 2 авторські свідоцтва.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 302 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, 6 розділів, узагальнення, висновків та списку використаної літератури (380 джерел). Робота містить 64 таблиці та 43 рисунки.

2. Основний зміст роботи

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури розглядаються публікації, присвячені індукції культури і регенерації рослин in vitro в кукурудзи та інших злаків. Узагальнюються відомості відносно отримання і вивчення сомаклональної та індукованої різними чинниками мінливості в культурі in vitro і в нащадків рослин - регенерантів, а також особливості клітинної селекції злаків.

МАТЕРІАЛИ, УМОВИ І МЕТОДИКИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальні дослідження проводилися у відділах цитогенетики і поліплоїдії, молекулярної генетики Інституту молекулярної біології і генетики та Інституту фізіології рослин і генетики НАН України у 1978-2002 роках.

Як матеріал досліджень використовували різні за походженням генотипи кукурудзи (Zea mays L.) з різних еколого-географічних груп: центрально-американської, мексиканської, китайської, балканської, східно-європейської. В якості вихідного матеріалу в дослідах використано 22 інбредні лінії ВС 2923, W 64A, SC 90, ЧК 218, Піонер 346 (П346), Піонер 502 (П502), S 65, Oh 43, А 188, С 761, С 488, С 455, C 456, pls 72, Chi 31, ВІР 27 і одержані з неї мутантні лінії ЧК 218, 27-1 (за геном bl), 27-2 (за геном ws), мутантні лінії, одержані з інбредної лінії ВІР 40, такі, як ЧК 4 і ЧК 5, мітчик Мангельсдорфа, мітчик Чейза, шість комерційних гібридів W629BC190, Акорд 72, ЧК24ЧК205, Ювілейний 60, Київський 8, Дніпровський 247 МВ, сорт Шиндельмайзер. Вихідний матеріал було отримано з відділу експериментального мутагенезу ІФРГ (раніше з ІМБГ), Інституту рослинництва (Санкт-Петербург), Інституту експериментальної ботаніки (Чехія). Насіння однорічного теосинте (Zea mexicana L.) отримано з відділу експериментального мутагенезу. В якості модельного об'єкта в попередніх дослідах генетично-інженерного напрямку використовували тютюн (Nicotiana tabacum L.) сорт Самсун.

Індукцію калюсу з проростків здійснювали на модифікованому живильному середовищі MC [Murashige, Skoog, 1962]. При індукції калюсу з незрілих зародків в якості основного використовували модифіковане за Green, Phillips (1975) живильне середовище МС, до якого додавали фітогормони та інші добавки, в залежності від варіанту дослідів. Регенерацію здійснювали при 16-годинному фотоперіоді, освітленості 2000-2500 люкс (люмінесцентні лампи ЛД-20), температурі 22-24о С вдень і 18о С вночі.

В дослідах з вивчення впливу якості світла на калюсоутворення для опpомiнення тканини синім світлом (СС) застосували аpгоновий лазеp з довжиною хвилi випpомiнення 488 нм.

Особливості функціонування фотосинтетичного апарату калюсних клітин досліджували на універсальному спектрофотометрі. Індукційні криві флуоресценції у калюсній тканині вимірювали на приладі, який був зібраний в відділі біохімії фотосинтезу ІФРГ НАН України. У якості збуджуючого світла використовували синю область спектра лампи ДРШ-250, що була виділена світлофільтром.

В дослідах з впливу мутагенних чинників використовували: фізичний мутаген - гамма-опромінення, водні розчини хімічних мутагенів: нітрозометилсечовини (НМС), нітрозодиметилсечовини (НДМС) і діазоацетилбутану (ДАБ).

В якості векторів в дослідах генетично - інженерного напрямку використовували плазміди рвR 322, pCV 16, які були виділені з E. coli в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, та Agrobaсterium tumefaciens з плазмідами рGV 3850 neo ЙI, pB1N19 з Інституту генетики і цитології, Білорусь. Плазміди мали в якості селективного маркера ген стійкості до антибіотика канаміцину. Трансформацію експлантатів проводили як за допомогою A. tumefaciens, так і безпосередньо „голими” плазмідами.

Амінокислотний аналіз калюсів та насіння рослин-регенерантів проводили на амінокислотному аналізаторі ААА-39.

Обробку експериментальних даних проводили різними методами варіаційної статистики і генетичного аналізу в залежності від цілей дослідів за Доспеховим (1973), Рокицьким (1973), Літуном, Проскурніним (1992).

ГЕНЕТИЧНА ОБУМОВЛЕНІСТЬ КАЛЮСОУТВОРЕННЯ І РЕГЕНЕРАЦІЙНОЇ ЗДАТНОСТІ У КУКУРУДЗИ

В першому експериментальному розділі представлені результати порівняльних досліджень впливу генетичних та епігенетичних чинників на індукцію калюсоутворення, типи калюсів і шляхи регенерації рослин кукурудзи.

Калюсні культури у кукурудзи були ініційовані з різних експлантатів: тканин проростків (мезокотиль, верхівка пагона, основа листка, корінці), незрілих і зрілих зародків з інбредних ліній, гібридів і сортів трьох підвидів кукурудзи: кременистого, зубовидного і цукрового.

На першому етапі досліджень (1978-1981р.) вивчали ефективність калюсоутворення з тканин проростків. Представниками зубовидного підвиду були інбредна лінія ВІР 27 і одержані з неї мутантні лінії ЧК 218, 27-1 (за геном bl) , 27-2 (за геном ws); мутантні лінії , одержані з інбредної лінії ВІР 40, такі, як ЧК 4 і ЧК 5 і гібрид Ювілейний 60. З представників цукрового підвиду використовували гібрид Акорд 72 і мітчик Мангельсдорфа, а з кременистого - сорт Шиндельмайзер і мітчик Чейза. Гібриди Київський 8 і Дніпровський 247 МВ були кременисто-зубовидними. Застосовували живильне середовище, яке складалось з макро- і мікросолей по МС, вітамінів за Уайтом, мезоінозиту (100 мг/л), гідролізату казеїну (300 мг/л), 2% сахарози, 0,8% агару, рН 5,5-5,7 (середовище 1). До цього основного середовища додавали фітогормони (в мг/л): 2,4Д - 5 (середовище 2), 2,4 Д - 10 (середовище 3), 2,4 Д - 10 і кінетин - 1 (середовище 4), 2,4 Д - 5 і кінетин - 1 (середовище 5).

Ефективність калюсоутворення у досліджених генотипів кукурудзи представлена в табл. 1, з якої випливає, що здатність до калюсоутворення характерна для всіх вивченних зразків, але з різною частотою. При оцінці загальної здатності до калюсоутворення у різних генотипів кукурудзи не встановлено істотних відмінностей, які пов'язані з належністю зразків до різних підвидів.

Таблиця 1 Інтенсивність калюсоутворення in vitro у різних генотипів кукурудзи на експлантатах, отриманих з тканин проростків

Встановлені відмінності в інтенсивності калюсоутворення у різних зразків кукурудзи пояснюються, мабуть, іншими особливостями генотипу. Гібридний матеріал, за винятком Ювілейного 60, перевищував за інтенсивністю калюсоутворення інбредну лінію ВІР 27 (найменша різниця достовірна при Р 0,01). У той же час експериментально одержані з гомозиготної лінії ВІР 27 індуковані мутантні лінії ЧК 218, 27-1 і 27-2 переважали за інтенсивністю калюсоутворення вихідний матеріал в середньому в три рази (найменша різниця достовірна при Р 0,01). У цих мутантних ліній, а також у мутантів ЧК 4, ЧК 5, які були одержані з інбредної лінії ВІР 40, інтенсивність калюсоутворення в деяких випадках навіть перевищувала за цією ознакою гібридний матеріал. Таким чином, ці наші перші дослідження наштовхують на думку про доцільність використання гібридизаціі і індукованих мутантів в тих випадках, коли інтенсивність калюсоутворення у вихідного матеріалу низька. Наявність таких мутантів дає змогу підвищити ефективність одержання калюсних тканин.

На ініціацію калюсу значний вплив справляли, крім генотипу, концентрація фітогормонів і вихідні експлантати. Більш висока здатність до калюсоутворення відмічена у експлантатів мезокотилю порівняно з ділянками стебла і листка. Калюс з ділянок листків одержаний лише у одного з вивчених генотипів - мутантної лінії ЧК 218.

Вивчені зразки кукурудзи виявили індивідуальну реакцію на концентрацію фітогормонів в середовищі. Негативний вплив кінетину на калюсоутворення спостерігали у гібрида цукрового підвиду - Акорд 72. Для лінії ВІР 27 необхідною умовою формування калюса є присутність в середовищі як ауксину, так і кінетину.

Органогенез частіше всього виявлявся в ризогенезі з калюсів стеблевого походження, тобто спостерігали утворення калюсу III типу. Інтенсивність росту субкультивованої калюсної тканини зменшувалась у напрямку ЧК 218>Акорд 72>Київський 8>мітчик Мангельсдорфа>ВІР 27 (дані по п'ятий пасаж включно). Більш чітко проявилась реакція генотипів на концентрацію фітогормонів у середовищі, ніж при індукції калюсу.

Виходячи з того, що в калюсній культурі соматичних тканин проростків най частіше утворюється калюс III типу, значні зусилля далі були спрямовані на пошук експлантатів і умов культивування, які б забезпечили отримання тотипотентного калюсу і регенерації рослин.

До цього часу була відома вдала спроба отримання регенераційно-здатного калюсу з незрілих зародків. Успіх в значній мірі залежав від генотипу. З п'яти дослідних зразків регенеранти отримані лише у лінії А 188 та гібрида за її участю [Green, Phillips, 1975]. Підхід, знайдений авторами, полягав у використанні в якості експлантата незрілих зародків оптимального розміру та у вдалому варіанті модифікованого живильного середовища із застосуванням 2 мг/л фітогормону 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4Д). В наступному пасажі вміст 2,4-Д зменшували до 0,25 мг/л. Пересадка калюсу далі на варіант живильного середовища без 2,4-Д стимулювала регенерацію рослин. Наступний пасаж на тому ж середовищі відокремлених від калюсу регенерантів забезпечив інтенсивне коренеутворення, тобто таким чином були отримані повноцінні рослини.

Наші досліди (1982-1985р.) були спрямовані на оптимізацію умов культивування, складу живильного середовища, розміру та віку незрілих зародків, пошук селекційно-цінних генотипів. В якості вихідного матеріалу в цій серії дослідів використали 15 інбредних линій, 19 прямих і обернених дволінійних гібридів, одержаних нами, та три комерційних гібриди. Культивування недозрілих зародків кукурудзи провели на 12 варіантах модифікованого (Green, Phillips, 1975) живильного середовища з варіацією вмісту 2,4-Д (0,25-2,0 мг/л), сахарози (20-60 г/л) і додаванням 1 г/л аспарагіну. Кращим щодо калюсоутворення і наступної регенерації рослин виявилось середовище з 1 мг/л 2,4-Д, 30 г/л сахарози, 1 г/л аспарагіну. Більшість дослідів проведено саме на такому варіанті живильного середовища, про певні зміни буде зазначено окремо. Наш підхід дозволяв прискорити початок регенерації на один пасаж, оскільки відпадала потреба в пасажі з 0,25 мг/л 2,4-Д.

На кожному варіанті живильного середовища культивували 30-40 зародків дослідних генотипів (всього в цих дослідах було понад 10000 зародків).

Встановлено, що найкращим є розмір незрілого зародка 1,0-1,5 мм, що відповідає в більшості ліній віку 14 днів після примусового запилення в умовах польових і тепличних дослідів. Незрілий зародок краще розміщувати щитковою стороною вгору.

Незрілі зародки дослідних ліній з різними частотами дали такі ростові реакції: калюсоутворення, коренеутворення, проміжна реакція (формування одночасно калюсу і недорозвиненого пагона), проростання , відсутність розвитку. Проміжна реакція виділена окремо в зв'язку з тим, що калюс в цьому випадку формується з колеоризної частини зародка і далі є нездатним до регенерації.На відміну від інших авторів, ми запропонували застосовувати індукцію калюсоутворення на світлі. Використання 16-годинного фотоперіоду при температурі 22-240С дало змогу в ранні терміни (до двох тижнів) вибраковувати пророслі і нерозвинуті зародки, а також зародки, які давали лише коренеутворення.

В культурі тканин кукурудзи нами отримано формування калюсу трьох типів: I - компактний, щільний білий калюс з зеленкуватими ділянками морфогенезу de novo, іноді зустрічаються зони соматичних ембріоїдів; ІІ - пухкий світложовтий з численними ділянками позеленіння, в якому при спостереженні під мікроскопом виявляли ембріоїди, які інтенсивно росли; ІІІ - безколірний калюс різної щільності. Калюсна тканина І і ІІ типів при подальшому культивуванні була здатна до регенерації рослин (тотипотентна), ІІІ - не мала регенераційного потенціалу, або в кращому випадку продукувала тільки коренеутворення.

Калюсоутворення трьох названих вище типів з різною частотою характерне для всіх досліджуваних генотипів кукурудзи. Сумарна частота калюсоутворення варіювала від 20 до 80 % у інбредних ліній і від 30 до 97% у гібридів. Збільшення проявлення ознаки “індукція калюсоутворення” у гібридів порівняно з ліній матеріалом складало у різні роки спостережень 10-20%. Це дозволяє говорити про виявлення гетерозису за ознакою “індукція калюсоутворення.”

Регенерація рослин кукурудзи з калюсу І типу відбувалась головним чином шляхом пагоневого морфогенезу та, рідше, шляхом соматичного ембріогенезу, з калюсу ІІ типу - шляхом соматичного ембріогенезу. Два шляхи регенерації рослин - пагоневий морфогенез та соматичний ембріогенез забезпечують отримання рослин-регенерантів, які істотно відрізняються одна від одної. Пагоневий морфогенез відбувається при формуванні de novo меристем з гетерогенних калюсних тканин (І типу) і забезпечує одержання генетично різних рослин-регенерантів. Таким чином можливо отримати генетично і цитологічно різноманітні рослини, тобто сомаклональні варіанти. Численні рослини - регенеранти, які були отримані з соматичних ембріонів, що активно ростуть (калюс ІІ типу), ідентичні вихідному фенотипу, тому можуть бути використані для дослідів по індукованому мутагенезу, генетичної інженерії. При культивуванні in vitro більш ніж 6 - 8 місяців і серед регенерантів, отриманих шляхом соматичного ембріогенезу, можливі відхилення від вихідного фенотипу. Особливу цінність мають так звані змішані морфогенні культури, регенерація в яких триває досить довгий час шляхом як пагоневого морфогенезу, так і соматичного ембріогенезу. Генотип гібридної лінії істотно впливає на реакції експлантатів in vitro.

За частотою формування тотипотентного калюсу від загальної кількості первинних експлантатів, інтенсивністю регенераційної здатності (РЗ), як видно з табл.2, вивчені нами інбредні лінії поділяються на три групи.

Таблиця 2 Калюсоутворення і регенерація рослин з незрілих зародів інбредних ліній кукурудзи

Перша група - лінії, регенераційна здатність яких обмежена двома місяцями, частота тотипотентного калюсу (головним чином тип I) низька 2 - 10% (П 346, П 502,SC 90, ВС 2923). Друга група, для яких характерні коливання вказаних ознак в 2-3 рази в залежності від погодних умов, тобто для них властива велика паратипічна варіанса, частота тотипотентного калюсу середня (типи I, II) 10 - 30% (Оh 43,C 761,C 456, plS 72). Третя група - лінії, які стабільно зберігають здатність формувати рослини не меньше півроку, частота тотипотентного калюсу висока ( тип II) - більш 30% ( C 488, C 455, Chi 31, A 188, S 65). Кількість регенерованих рослинок на один калюс варіювада від 2 до 30 (табл.2).

Ознака РЗ стабільно проявлялась у вказаних групах протягом 5-7-річних спостережень, що свідчить про її генетичну природу.

З метою вивчення можливості збереження і передачі ознаки РЗ були проведені прямі і зворотні схрещування між лінією ВС 2923 з низькою РЗ і лініями з середньою (Oh 43) і високою (Chi 31) РЗ. У гібридів від прямих (ВС 2923 х Oh 43, ВС 2923 х Chi 31) і зворотних (Oh 43 х ВС 2923, Chi 31 х ВС 2923) схрещувань відмічено достовірне підвищення рівня загального калюсоутворення і утворення тотипотентного калюсу порівняно з інбредною лінією ВС 2923 (табл.3), що дає змогу зробити припущення про виявлення на рівні калюсної тканини ефекту гетерозису за регенераційною здатністю.

Представлені дані свідчать про домінантну природу ознаки РЗ. Крім того, кращі результати отримані, коли лінія з більш високою РЗ використовувалась у якості материнської, що дає змогу передбачити участь у контролюванні ознаки не тільки ядерних, але і цитоплазматичних генів.

Таблиця 3 Інтенсивність калюсоутворення з незрілих зародків інбредних ліній кукурудзи та їх гібридів

Ознака РЗ передається у роді Zea не тільки при внутрішньовидових, але і при міжвидових схрещуваннях.

Встановлено, що на відміну від кукурудзи, значно легше відбувається регенерація у її дикого родича-теосинте (ТС). Вивчені гібриди двох ліній кукурудзи і диплоїдного однорічного теосинте (ВС 2923 х ТС і plS 72 x ТС) характеризувались достовірно підвищеним рівнем формування морфогенного і ембріогенного калюсів порівняно з вихідними лініями (табл. 4).

Одержані дані по регенерації рослин з калюсної тканини з незрілих зародків гібридів між кукурудзою і теосинте підтверджують, що ознака РЗ у кукурудзи є домінантною. Схоже явище описано при схрещуванні дикого і культурного томатів, у яких РЗ є домінантною ознакою і контролюється двома генами [Koorneef та інш.,1987].

Таблиця 4 Інтенсивність калюсоутворення з незрілих зародків кукурудзи, теосинте і їх гібридів

*Достовірні на 5%-му рівні значущості середні значення та попарні порівняння ознак: 1-3,4; 2-3,5.

Ознака РЗ успішно піддається штучному добору, про що свідчать досліди з отримання так званих “вторинних” регенерантів.

Оскільки тестовані протягом трьох-п'яти років модифікації живильного середовища і умов культивування не забезпечили для багатьох селекційно-цінних генотипів достатнього рівня регенераційного потенціалу, то були проведені досліди з штучного добору з гетерогенних калюсних культур калюсів з підвищенною регенераційною здатністю та з'ясування можливостей збереження та передачі такої ознаки в ряду статевих поколінь. Добір проводили серед калюсів ліній П 346, Оh 43, П 502 та інцухтованого гібриду Сhi 31 S 65 (I6) в кінці першого пасажу. Лінії П346, П 502 характеризуються низьким регенераційним потенціалом, в Оh 43 він середнього рівня, в гібриду наближається до високого. Таким чином, добір здійснювали з альтернативних за ознакою ліній. Калюсні культури вказаних ліній мали певну спонтанну мінливість за ознакою РЗ. Відбирали калюсні культури другого пасажу з максимально чітким виявом регенераційного потенціалу (візуально поверхня калюсу максимально зелена, під світловим мікроскопом чітко видно зони позеленіння). З ліній П 346, Оh 43 відбирається цінний змішаний морфогенний калюс головним чином типу I, який має певну кількість ембріогенних та морфогенних зон ( не менше 5-10). В гібрида Сhi 31S65 позеленіння спостерігається головном чином серед характерного для нього ембріогенного калюсу II типу (практично вся поверхня калюсу вкрита зонами позеленіння , їх не менше 10). Для лінії П502 характерна мала кількість зон позеленіння (2-3) на калюс. Індукували рослини - регенеранти (R0), які самозапилювали и отримували насіння. З насіння вирощували рослини (R1), незрілі зародки яких вводили в культуру і отримували каллюс, оцінювали регенераційний потенціал.

Найбільш чіткі результати отримані для П 346 і Oh 43. Загальна кількість тотипотентних калюсів у нащадків регенерантів з ліній П 346 , Oh 43 була у 2,5 - 3 рази більше, ніж у вихідних форм, як це видно з табл.5.

Таблиця 5 Генетичний ефект спрямованого добору на підвищення інтенсивності калюсоутворення

Такими ж суттєвими були і інші показники динаміки добору: фенотиповий зсув популяції за ознакою (Rф) склав 13,8% для П 346 і 20,8% для Oh 43. Генетичний ефект добору (G =Rф /Х) - 62 і

66% відповідно. Ефективне генетичне поліпшення ознаки можливо лише при достатньо високому рівні її успадковування. Коефіцієнт успадковуваності у вузькому значенні був (h 2 = 0,7 та 0,6) достатньо високим, що свідчить про наявність високої генотипової мінливості, яку забезпечила адитивна компонента варіації. Разом з тим, крім переважно адитивних ефектів генів, у варіюванні ознаки певну роль відіграє полігенна генетична система, оскільки після добору лишився ще значний розмах варіювання.

Рослини - регенеранти, які були отримані внаслідок штучного добору з калюсних культур з спонтанною мінливістю за ознакою, успадкували цінну якість в ряду поколінь. Далі їх позначено літерою с, як наприклад П 346с. Запропонована і вдало використана нами схема штучного добору на підвищення рівня тотипотентного каллюсоутворення обов'язково включала фазу регенерації рослин та отримання насіння, чим вона відрізняється від схем інших авторів [Rosati, Landi, Tuberosa, 1994, Белоусов, Замбриборщ, Игнатова, 1998].

Тобто проведений нами штучний добір включив спільні елементи генетичного контролю фаз індукції калюсоутворення і регенерації рослин.

Регенераційна здатність калюсної тканини кукурудзи може бути значно модифікована за рахунок змін у складі живильного середовища, але в цьому випадку не можна отримати спадкових змін за ознакою.

Компонентами живильних середовищ, які істотно впливають на калюсоутворення і регенерацію у кукурудзи, є 2,4-Д і сахароза. Дані по включенню інших стимуляторів росту у регенераційні середовища недостатні і не завжди однозначні. Обмежене застосування цитокінінів (кінетину, 6-бензиламінопурину) у ряді випадків дає позитивний вплив на регенерацію.

Збільшити загальну частоту калюсоутворення і ефективність пасивування вдалось за рахунок додавання до середовища маніту (табл. 5), який підвищував осмотичний тиск середовища. Встановлено, що найбільша частота індукції калюсу і найвища у подальшому частота тотипотентного калюсу виявляється при додаванні 30 г/л маніту. Інші дози були менш або зовсім не ефективними.

У трьох досліджуваних генотипів встановлено достовірне підвищення рівня загального калюсоутворення (типи І+ІІ+ІІІ). При цьому на поверхні калюсу при спостереженні під світовим мікроскопом можна було розрізнити утворення поодиноких соматичних ембріонів, які практично були відсутні у контролі. Слід вказати, що при тестуванні варіанта середовища з манітом у дослідах для генотипів з високою частотою утворення тотипотентного калюсу (А 188, Chi 31, S 65 x Chi 31) статистично достовірного ефекту не спостерігалось.

З метою отримання рослинок-регенерантів калюси після культивування протягом двох-трьох пасажів переносили на регенераційний варіант живильного середовища без 2,4-Д, але з додаванням БАП (3,5 і 5 мг/л). При цьому на середовищі з БАП на світлі калюси доцільно витримували всього 7-8 днів (це так зване субкультивування). На поверхні калюсної тканини були виявлені численні зони позеленіння (БАП 3,5 мг/л), близькі за частотою утворення й інтенсивністю забарвлення до ліній другої й третьої груп. Далі такі калюси переносили на стандартний варіант живильного середовища без БАП і 2,4-Д, де до кінця пасажу спостерігали завершення утворення рослин-регенерантів. Використання більш високих концентрацій БАП (5 мг/л) і більш тривалий час стимулювало значне коренеутворення, небажане на даному етапі регенерації. За нашими спостереженнями кращий результат таке субкультивування дає на калюсній тканині, отриманої й вирощуваної попередньо на середовищі з манітом.

Таблиця 6 Вплив маніту на індукцію калюсоутворення у кукурудзи

*Достовірно на 1%-ному рівні значущості при попарному порівняння ознак (1-2, 3-4, 5-6).

Описаних двох методичних підходів - додавання маніту і субкультивування з БАП звичайно достатньо для високоефективної роботи з “примхливими” інбредними лініями протягом перших місяців культивування. Якщо необхідне збереження регенераційного потенціалу на більш тривалий час, то у такому випадку нами застосовано пасивування на середовищі з 7,5 мг/л AgNO3 після культивування на середовищі з манітом. Потім такі калюси пересаджували на стандартний варіант регенераційного середовища, де вдавалось отримати регенерацію рослин. Концентрація AgNO3 більш 10 мг/л додатково регенерацію не підвищувала. Концентрації менше 7,5 мг/л не давали стабільного результату.

Розроблені методичні прийоми: додавання до середовища маніту, субкультивування з БАП, використання в якості вихідного експлантата насіння з відібраних за підвищеною РЗ сомаклональних варіантів дозволило змінити співвідношення ростових реакцій та отримати індукцію тотипотентного калюса і подальшу регенерацію рослин з зрілих зародків (табл. 7).

Таблиця 7 Реакція in vitro зрілих зародків кукурудзи

З літератури відомо, що окрім тестованих вище чинників: генотип, живильне середовище, експлантат важливу pоль в індукції калюсоутворення i морфогенезу відіграють фізичні фактоpи, до яких вiдноситься свiтло [Бутенко, 1964, Копель, Бутенко, 1992]. Аналiз літературних даних надав нам пiдстави видiлити синє свiтло (СС) як ефективний чинник зpостання активностi i вмiсту ауксину (ІОК) в калюснiй тканинi. Пpипустили, що СС може бути викоpистане як фактоp впливу на частоти калюсогенезу i pизогенезу у соматичних тканин кукурудзи in vitro. З практичної доцільності має сенс застосування короткочасного СС-опpомiнення культуpи тканин в пpоцесi калюсоутвоpення pегенеpацiя pослини як коpегуючого фактоpа.

Було проведено дослiдження впливу iмпульсу СС на частоти калюсоутвоpення i pизогенезу в культуpi соматичних тканин мезокотилю, стебла i кореня двох контрастних за регенераційним потенціалом лiнiй С 488 i ВС 2923, з, вiдповiдно, високим i низьким рiвнем морфогенностi, а також гiбрида Chi 31 S 65, у якого, в порiвняннi з обома лiнiями, вiдмiчено бiльшу здатнiсть до калюсоутворення.

В якості зразків використані калюси третього пасажу. Після пересадки тканини на свіже живильне середовище її, до початку експерименту, вирощували в темряві протягом 8 діб. Термін темнового культивування вибpано з метою одержання калюсiв в лаг-фазi pосту.

Результати дисперсійного аналізу впливу короткочасного опромінення СС на калюсоутворення в культурі соматичних тканин кукурудзи дають підстави стверджувати наступне: а) існують 2 типи дії опромінення на калюсогенез: інгібуючий і стимулюючий; б) ефект стимуляції визначається взаємодіями опромінення з генотипом і експлантатом, а інгібування - практично залежить від чинника опромінення.

Наслідки впливу опромінення на ризогенез у досліджуваній культурі тканин кукурудзи відрізняються якісно і кількісно від результатів, одержаних при дослідженні дії опромінення на калюсоутворення. Отримані частоти утворення ризогенних калюсів в досліді і контролі, та їх співвідношення, свідчать, що опромінення СС призвело до зменшення частоти ризогенезу незалежно від походження зразків.

Виявлена залежність калюсоутворення і ризогенезу у культурі соматичних тканин кукурудзи від короткочасного опромінення синім світлом надає підстави вважати за практично можливе його використання в якості корегуючого фактора в процесі калюсоутворення морфогенез.

Регенерація нормальних рослин відбувається, як правило, з тотипотентних калюсів, які мають інтенсивне зелене забарвлення при культивуванні на світлі. У мало забарвлених калюсних тканин регенерація сповільнена. Тому ми припустили, що РЗ залежить від рівня розвитку фотосинтетичного апарату. Для перевірки припущення досліджували структурні і функціональні показники, які характеризували стан фотосинтетичного апарату калюсних тканин різних інбредних ліній кукурудзи, що відрізнялись за ознакою РЗ.

У якості об'єкта дослідження за даними попередніх дослідів були вибрані калюсні тканини інбредних ліній кукурудзи С 455,П 346, П 502. Для ліній С 455 і П 346 спектральні криві були подібні спектрам хлоропластів. Спектр флуоресценції калюсної тканини лінії П 502 істотно відрізнявся від спектрів ліній П 346 і С 455. Результати розгляду спектра флуоресценції калюсної тканини лінії П 502 і його тонкої структури дають змогу зробити наступні висновки. Популяція клітин гетерогенна і складається в основному з клітин двох типів. У перших фотосинтетичний апарат не розвинутий і відповідає такому у повністю етіольованих листків. У клітин другого типу фотосинтетичний апарат, очевидно, сформований з порушеннями взаємної просторової орієнтації пігмент-білкових комплексів. Можливо, в цій популяції є окремі клітини з нормально сформованим фотосинтетичним апаратом. Але їх кількість незначна, оскільки вони не дають помітного вкладу у спектр флуоресценції.

Таку точку зору підтримують виміри індукційних кривих флуоресценції, за параметрами яких можна судити про функціональну активність фотосинтетичного апарату. За результатами вимірювань тонкої структури спектра низькотемпературної флуоресценції, можна зробити такі висновки. Калюсні тканини лінії С 455 містять в основному клітини з нормально сформованим фотосинтетичним апаратом. Для лінії П 346 також можна відмітити досить високий вміст нормально фотосинтезуючих клітин. Але він, нижче, ніж у лінії С 455. Популяція клітин калюсу лінії П 502 містить низьку кількість нормальних клітин. Співставляючи ці дані з частотами утворення тотипотентних калюсів і РЗ, можна зробити висновок, що високі значення цих показників, мабуть, досягаються в тих випадках, коли у гетерогенній популяції калюсній популяції є досить велика кількість клітин з нормально розвинутим фотосинтетичним апаратом, який має високу функціональну активність. Ці досліди пояснюють як низьку РЗ, так і практично відсутність реакції калюсу лінії П 502 на спрямований штучний добір за ознакою.

СОМАКЛОНАЛЬНА МІНЛИВІСТЬ В КУЛЬТУРІ IN VITRO I СЕРЕД НАЩАДКІВ РОСЛИН-РЕГЕНЕРАНТІВ

За сучасними уявленнями сомаклональне варіювання є наслідком впливу умов ізольованого культивування клітин , які виступають як фактори мутагенезу in vitro, а також реалізації передіснуючих змін в вихідних експлантах. Цю подвійну природу (передіснування і індукція) потрібно мати на увазі під час розгляду результатів.

Розуміння феномена сомаклональної мінливості значно поглиблилось внаслідок вивчення його молекулярно-біологічної і цитогенетичної природи. На кукурудзі отримано докази того, що культивування in vitro виступає як поштовх до транспозиційних змін [Peschke,Phillips,1985] і, таким чином, підтверджується думка, що культура тканини може впливати як середовищний стрес. За допомогою молекулярних маркерів встановлено високий ступінь відмінності сомаклонів від вихідної лінії А 188, яка варіювала від 64 до 70% [Гостимский, Долгих та ін., 2001]

Проведений нами цитогенетичний аналіз з десяти різних за генотиповим походженням штамів калюсної тканини, отриманої з різних тканин проростків, показав їх порівняльну стабільність. Понад 60% клітинних п...