Цитологічний аналіз клітин корінців рослин-регенерантів (R0), отриманих з різних за рівнем регенераційної здатності калюсних тканин інбредних ліній, не виявив змін рівня плоїдності, появи анеуплоїдів. Таким чином , можна припустити наявність стабілізуючого добору за кількістю хромосом при регенерації рослин з калюсних культур кукурудзи.

Слід зазначити значні фенотипові відхилення від контрольного матеріалу рослин-регенерантів кукурудзи (Rо). Морфологічні зміни торкались всіх наземних органів. Частина змін зникала в наступному поколінні, отриманому з насіння (R1), тобто це були фізіологічні, не спадкові зміни. Наприклад, у значної кількості рослин-регенерантів (Rо) затримувався ріст у висоту і збільшувався вегетативний період. У наступному поколінні висота рослин в більшості випадків повертається до норми, але зберігається певна кількість карликів. Часто траплялась недорозвиненість волоті різного ступеня, аж до її повної відсутності - абсолютна чоловіча стерильність. Спостерігалась асинхронність достигання волоті і качана, відсутність останнього. Зменшення кількості фертильного пилку, його повна стерильність додатково приводили до зменшення кількості насіння. Та вже в поколінні R1 висота рослин, кількість листків, розвиток волоті у більшості випадків досягали рівня контролю, а інколи і перевищували такий за більшою потужністю, висотою та рядом інших практично важливих ознак. Тому облік всіх якісних і кількісних варіацій проводиться в першому насіннєвому поколінні (R1), коли відсутній вплив суто фізіологічних умов культивування in vitro. Слід мати на увазі, що в поколінні R0 можуть бути відбраковані як модифікації так і мутаційні варіанти, які не дали насіння.

Разом з тим значна частина змін лишалась (домінантні зміни). Максимальна кількість спадкових змін проявлялась у R2 поколінні, коли крім домінантних з'явились і рецесивні ознаки, тобто саме в цьому поколінні треба підсумовувати результати сомаклональної мінливості in vitro.

При аналізі сомаклональної мінливості були виявлені змінені рослини-регенеранти у шести тестованих інбредних ліній (П 346, П 502, Oh 43, A 188, SC 65,С 488). Кількість родин із зміненими ознаками варіювала від 23,5% у П 502 до 80% у А 188. Кількість мутантних ознак на родину була від 1 до 4. Слід зауважити, що частота і спектр змінених ознак виявили специфічність за генотипами (табл. 8 ).

Наприклад, у лінії S 65 зміни були у 33,6% рослин і нараховувалось п'ять змінених ознак: стебло без качана, формування волоті на качані, цукровий ендосперм, рисове зерно, зміна окрасу ендосперму. В R2 порівняно з R1 виявлені ознаки, що впливають на структуру і забарвлення ендосперму.

Для таких сомаклональних варіантних ознак, як забарвлення ендосперму, глянцеві проростки, жовта смугастість листя, цукровий ендосперм встановлено розщеплення 3:1 серед самозапилених нащадків , достовірність якого визначалась методом 2. Тобто чітко показано їх рецесивна генетична природа і те, що вони є мутаціями. Крім того, відмічені такі мутації за моногенними признаками: стерильна волоть (П 346), листя яке зрослось (П 502). Знайдено летальні мутації серед родин - регенерантів: наявність альбіносів в двох родинах П 346 та в однієї з Oh 43.

Іноді зустрічались рослини з більш ніж однією мутаційною ознакою. В П 346 була відмічена родина з трьома зміненими ознаками: кущистість, низький зріст, недорозвинута волоть. В П 502 був отримано сомаклональний варіант з чотирма зміненими ознаками: пагоноподібний вирост замість стебла, низький зріст, верхнє листя приросло до стебла, відсутність качана.

Таблиця 8 Частота змінених рослин і типів змін серед регенерантів кукурудзи R2

У регенерантів, що походять від гібридів, процент змінених рослин складав від 7,1 до 48 %, а кількість змінених ознак варіювала від 2 до 8 (табл. 8). Серед регенерантів, які походять від гібридних рослин, найбільш часто зустрічались такі ознаки, як супротивне розміщення листків, безплідне стебло, нерозгалужена волоть, кущисте стебло. В той же час деякі ознаки, специфічні для окремих генотипів. Так, озернена волоть, зморщене листя зустрічались тільки у регенерантів гібриду Chi 31 x A 188, жовта смугастість листя - у (Oh 43 x A 188) x Chi 311, крупнозернистість - у (Oh 43 x A188) x Chi 312. Отримано результати, які свідчать, що на мінливість ознак у регенерантів впливає не тільки вихідний генотип, але й власне зміни, які відбуваються на клітинному рівні в процесі культивування in vitro. Про це свідчать відмінності двох родин регенерантів, отриманих з одного незрілого зародка гібриду (Oh 43 x A 188) x Chi 31. Ці родини мали по п'ять загальних змінених ознак і по одній-три ознаки, що специфічні для кожної родини. Як випливає з аналізу ознак, що дають менделівське розщеплення, частота виникнення змінених форм серед рослин - регенерантів досить висока. Це узгоджується з даними Едалло та ін. (1981), Зехр та ін. (1987).

Описані сомаклональні мутації зовні схожі з відомими у кукурудзи спонтанними та індукованими мутаціями [Мику, 1984, Моргун 1983]. За роки досліджень ми спостерігали двадцять п'ять змінених ознак. Всього в літературі описано близько 50 сомаклональних варіантів [Phillips та ін.1988].

Для з'ясування принципового питання відносно природи сомаклональних варіантів проведено генетичний аналіз за такими чіткими моногенними ознаками: увігнутий ендосперм (shrunren endosperm sh) та карликовий зріст (brachytic br.). У якості батьківських форм в схрещуваннях використовували лінії ЧК013sh1 та ЧК786br2, ЧК-783br3 (табл. 9). За ознакою sh аналізували дві сім'ї , позначені далі як мутантні регенеранти RM1 і RM2, за ознакою br - RМ3.

Встановлена алельність двох незалежних сомаклональних варіантів мутації за геном sh1, що локалізований у 9 хромосомі сайт 29. Дикий тип - нормальні зернівки в F1 не з'явився, тобто обидва аналізовані сомаклональні варіанти є незалежними істинними мутантами і несуть алель одного й того ж рецесивного гена sh1. У випадку з геном br який викликає для рослин зменшення стебла до 1/2 -1/4 довжини за рахунок коротких міжвузлів відповідь отримана в F2 поколінні (після вирощування гібридного F1 насіння до дорослих рослин). Встановлена алельність отриманої в культурі тканин мутації ''карликовий зріст'' гену br2, локалізованому в 1 хромосомі сайт 81, оскільки дикий тип - рослини нормального зросту - практично не спостерігався.

Таблиця 9 Генетичний аналіз сомаклональних мутантів кукурудзи

У випадку схрещування з генотипом ЧК783br3 серед нащадків були нормальні на зріст рослини. З цього випливає, що проаналізований сомаклональний мутант має мутантний ген br2, неалельний гену br3. Результати проведеного генетичного аналізу мають принципове значення, оскільки прямо свідчать про можливість отримання сомаклональних мутацій в культурі in vitro без використання мутагенів.

Введення в біотехнологічні схеми сомаклональної мінливості передбачає наявність високої регенераційної здатності у вихідних ліній-продуцентів сомаклональних варіантів і можливість отримання достатньої кількості господарсько-цінних ознак.

Мінливість сомаклональних ліній за кількісними ознаками мало вивчена і практично відсутні відомості що до їх комбінаційної здатності. У нащадків рослин-регенерантів нами виявлена сомаклональна мінливість і за кількісними ознаками, які пов'язані з врожайністю. Під час польових дослідів були знайдені рослини-регенеранти з успадкованим варіюванням важливих агрономічних ознак. Достовірні відмінності за ознаками качанів знайдено в інбредної лінії S65: збільшення довжини качана, кількості зерен в ряду, в результаті чого підвищився і середній врожай на рослину. Крім того, досить часто рослини-регенеранти були не тільки більші на зріст, але й більш могутні, що узгоджується з даними інших авторів [Earle, Gracen, 1985].Проведено вивчення кількісних ознак сомаклональних інбредних ліній кукурудзи з підвищеною РЗ (табл.10), отриманих та відібраних з відомих інбредних ліній Oh 43, П 346, ВС 2923, гібриду Chі 31 х S 65.

Таблиця 10 Сомаклональні інбредні лінії кукурудзи з підвищеною регенераційною здатністю

При одночасному посіві всього матеріалу за рахунок реалізації сомаклональної мінливості отримані більш ранньостиглі інбредні лінії кукурудзи (рис. 1 а, б, в, г). Усі лінії, отримані з П 346, показали достовірне зменшення періоду від посіву до появи сходів та більш ранню і дружню їх появу.

Рис. 1 Мінливість вихідних і сомаклональних інбредних ліній кукурудзи за міжфазними періодами: а) посів-сходи, б) сходи-цвітіння волоті, в) сходи-воскова стиглість, г) сходи-повна стиглість. 1-12 - вихідні ( 1, 7, 10) і сомаклональні інбредні лінії: 1 - П 346, 2 - УКЧ 5, 3 - УКЧ 6, 4 - УКЧ 7, 5 - УКЧ 8, 6 - УКЧ 9, 7 - ВС 2923, 8 - УКЧ 3, 9 - УКЧ 11, 10 - Oh 43, 11 - УКЧ 2, 12 - УКЧ 10

Для ліній УКЧ6, УКЧ7, УКЧ8, УКЧ9 встановлено достовірне скорочення періоду від сходів до повної стиглості на 3-6 днів, за рахунок зменшення міжфазних периодів від появи волоті до воскової і далі до повної стиглості. Найбільше скорочення часу від появи сходів до молочної, воскової і повної стиглості відмічено для сомаклональної лінії УКЧ 10 в порівнянні з вихідною Oh 43. Виявлено варіювання за комплексом ознак які визначають придатність сомаклональних інбредних ліній до механізованого збирання. Значні коливання виявлено за ознакою “висота рослин”. Обидві сомаклональні лінії з Oh 43, УКЧ 10 і УКЧ 2 характеризувались достовірно меншою висотою рослин всередньому на 20 сантиметрів (рис. 2). У випадку з ВС 2923 одна сомаклональна лінія була вищою за контроль, відмінність другої не суттєва.

Серед сомаклональних ліній, отриманих з кожного з вихідних генотипів були зразки з комплексною стійкістю проти вилягання рослин, поникання качанів і враження пухирчатою сажкою. Вцілому отримані сомаклональні інбредні лінії з варіаціями ознак структури урожаю як у позитивний так і у негативний бік (рис. 2).

Середньостиглі сомаклональні лінії УКЧ6 і УКЧ9 з П346, показали достовірно високу продуктивність зерна з рослини, яка корелювала з підвищеною масою 1000 зерен. Середньорання сомаклональна лінія УКЧ11 характеризувалась більшою продуктивністю і підвищеною масою 1000 зерен порівняно з вихідною ВС 2923.

Що до ознаки “ зернова продуктивність рослин”, то для однієї сомаклональної лінії з ВС 2923 вона вища за контроль. Крім того, біотехнологічна лінія з Oh 43 УКЧ 10 відзначалась найвищою інтенсивністю накопичення сухої речовини в зерні. Інші сомаклональні лінії за ознакою “зернова продуктивність рослин” знаходились на рівні контролю (П 346) або навіть нижче.

Рис. 2 Мінливість вихідних і сомаклональних інбредних ліній кукурудзи за: а) висотою рослин, б) зерновою продуктивністю, в) масою 1000 зерен. 1-12 - вихідні (контроль 1, 7, 10) і сомаклональні інбредні лінії: 1 - П 346, 2 - УКЧ 5, 3 - УКЧ 6, 4 - УКЧ 7, 5 - УКЧ 8, 6 - УКЧ 9, 7 - ВС 2923, 8 - УКЧ 3, 9 - УКЧ 11, 10 - Oh 43, 11 - УКЧ 2, 12 - УКЧ 10

Вивчені сомаклональні інбредні лінії в порівнянні з вихідними лініями кукурудзи виявили генетичну варіабельність за різними агрономічними ознаками в залежності від генотипу. Досліджені лінії є першими лініями, створеними біотехнологічними методами (сомаклональна мінливість і спрямований добір in vitro), які зареєстровані в Національному центрі генетичних ресурсів рослин України.

Наступним кроком до практичного використання сомаклональних інбредних ліній було вивчення комбінаційної здатності. Сомаклональна лінія УКЧ 10, отримана з з Oh 43 була включена в тестерну схему схрещувань з трьома тестерами (табл. 11).

Цвітіння жіночих генеративних органів співпадало або на 1-3 дні затримувалось в порівнянні з чоловічими. Дисперсійний наліз ЗКЗ і СКЗ показал, що за господарсько-цінними ознаками експериментальні гібриди були близькі або перевищували стандартні гібриди рівнозначної групи стиглості. Так, за кількістю зерен на качані, кількістю рядів зерен гібрид УКЧ10ЧР502 мав перевагу над стандартом Харківський 311 МВ.

Таблиця 11 Тривалість міжфазних періодів у тест-гібридів, інбредних ліній, районованих гібридів, дні

*Достовірно на 5%-му рівні значущості при попарному порівнянні ознак: посів - сходи ( 1,2,3 - 4; 7 -8; 4-8 ), сходи - воскова стиглість (1,2,3 - 10; 6,7 -10; 4-8),сходи - повна стиглість (4 - 8).

Підвищеною продуктивністю зерна з рослини відзначився трьохлінійний гібрид УКЧ 10 Ч ІРА. Підвищена маса 1000 зерен характерна за даними 2000 і 2001 років для гібрида УКЧ 10 ЧВС5b порівняно з УКЧ 10 ЧП502. При вивченні комбінаційної здатності для сомаклональної лінії УКЧ 10 встановлена середня група ЗКЗ за масою 1000 зерен і середні значення ефектів СКЗ.

Таким чином, самозапилені сомаклональні лінії, дозволяють розширити різноманіття вихідного матеріалу кукурудзи та можуть бути використані в селекційних програмах.

ІНДУКОВАНА МІНЛИВІСТЬ ІНБРЕДНИХ ЛІНІЙ КУКУРУДЗИ В КУЛЬТУРІ IN VITRO

Відносно застосування хімічних і фізичних мутагенів в культурі тканин злаків і, зокрема, кукурудзи наявні поодинокі праці і практично відсутні дані з одночасного використання сомаклональної мінливості і експериментального мутагенезу з наступним аналізом рослин в ряді поколінь. Дослідження проведено з метою вивчення можливості одночасного використання експериментального мутагенезу та сомаклональної мінливості у кукурудзи in vitro. В якості мутагенних факторів використовували водні розчини хімічних мутагенів: НМС, НДМС і ДАБ та фізичний мутаген - гамма-опромінення. У серії попередніх дослідів були визначені критичні, оптимальні концентрації і експозиції хімічних мутагенів, дози гамма-опромінення. При обробці хімічними мутагенами апробовували три способи: 1)замочування качанів з незрілими зародками у водному розчині мутагену; 2) ін'єкція водного розчину мутагену під обгортки качана з триденними зародками; 3) пряма обробка мутагенами попередньо виділених незрілих зародків. Кращім виявися перший спосіб, тому що ін'єкція мутагену під обгортки качана дала значне пригнічення у розвитку зародка і самого качана, крім того неможливо чітко контролювати експозицію (табл. 12). При прямій обробці незрілих зародків в рідкому живильному середовищі відмічається значне їхнє травмування при відмивці від мутагену у всіх тестованих лініях П 346, Oh 43, BC 2923, П 502.

Встановлено, що оптимальними дозами при обробці незрілих зародків є низькі концентрації мутагенів (0,001, 0,0001%) при експозиції дві години. Більш високі дози і триваліші експозиції знижують життєздатність вихідних експлантатів, стимулюють небажане на першому етапі культивування підвищення коренеутворення. Особливо чітко це було з'ясовано при використанні ДАБ. Обробка незрілих зародків ДАБ в концентрації 0,001% дозволила подовжити у два рази термін введення експлантатів в культуру, забезпечивши отримання тотипотентного калюсу у лінії ВС 2923 (з 14 по 18 день). В контролі ця лінія характеризується можливістю отримання тотипотентного калюсу від незрілих зародків лише 14 - денного віку з низькою частотою. Виявлена пряма залежність інтенсивності калюсоутворення від мутагена, яка зменшувалась у напрямку ДАБ >НДМС>НМС. Були отримані рослини - регенеранти після мутагенної обробки калюсів з ліній П 346, Oh 43, BC 2923, П 502. Звертає на себе увагу ослабленість таких рослин-регенерантів у порівнянні з їх сомаклональними варіантами, з контрольними рослинами з пророщених незрілих зародків. Відмічено негативний вплив мутагенів в першу чергу на розвиток кореневої системи, зменшення її гущини при дії НМС і НДМС. Під впливом ДАБ ще додатково з'являються потовщені аномальні корені. Звичайно, що пригнічуюча дія мутагенів на кореневу систему приводить до додаткових ускладнень у порівнянні з сомаклональними варіантами при переході від умов in vitro до in vivo. Застосування мутагенів вплинуло і на зовнішній вигляд надземних органів рослин: пагону, стебла, листка. Відмічено такі морфологічні зміни: відсутність пагона, пагони трубкоподібного вигляду, слаборозгорнуте листя, кущиння. Життєздатними серед рослин зі зміненою морфологією виявились лише рослини із здатністю до кущиння.

Таблиця 12 Вплив хімічних мутагенів на культуру незрілих зародків інбредної лінії П346

* Достовірно на 5%-му рівні значущості при попарному порівнянні ознак (1-2; 3-4, 2,4,5; 6-7; 12-13).

Було встановлено, що дози гамма-опромінення вище 1,0 Гр виявляють значний пригнічуючий вплив на калюсоутворення. У дослідах в якості оптимальних використовували дози 0,5 і 1,0 Гр, при цьому зберігаються всі реакції незрілих зародків в культурі. Для дослідів з гамма-опроміненням особливо підходить варіант середовища з 2 мг/л 2,4 Д і манітом, який у більшості випадків забезпечує достовірне підвищення частоти калюсоутворення при дозах 0,5 і 1,0 Гр порівняно з контролем.

Слід відмітити, що в цьому випадку, не дивлячись на опромінення, у лінії П 346 зберігається на рівні контролю кількість морфогенних з ділянками позеленіння калюсів. Після пересадки таких калюсів на регенераційний варіант живильного середовища вдалось отримати рослини-регенеранти. У випадку з регенерантами після гамма-опромінення відмічено появу значної кількості альбіносів та рослин з смугастим листям.

Рослини-регенеранти після обробки мутагенними чинниками характеризувались більш чітко виявленим депресивним ростом, більш низькою озерненістю качанів порівняно з сомаклональними варіантами цих же ліній.

Таблиця 13 Спектр та частота змінених ознак в нащадків рослин-регенерантів лінії Oh 43 , (%)

Порівняльне дослідження спектрів і частоти сомаклональної (R2) і індукованої мутагенами мінливості (табл. 13 ) проведено на рослинах-регенерантах, отриманих з лінії Oh 43 після обробки ДАБ 0,001% ( M2 R2).

Підвищення кількості змінених рослин - регенерантів внаслідок мутагенної обробки вихідних експлантів в порівнянні з сомаклональним варіантом досліду статистично достовірне (2 =0,42). Частота змінених рослин після мутагенної обробки незрілих зародків ДАБ близька до отриманої після традиційної обробки насіння мутагенами [Ларченко, Моргун, 2000]. Різниця полягає в суттєво меншій концентрації використаного мутагену. Не спостерігалось додавання ефектів сомаклонального і хімічного мутагенезу in vitro. Різна варіабельність при спонтанній і мутаційній мінливості in vitro може бути використана в селекційно-генетичній практиці.

Сучасним дослідженням з отримання трансгенних рослин за допомогою векторів з А. tumefaciens передував етап з'ясування можливостей введення, збереження та реплікації бактеріальних плазмід з E.coli в клітинах рослин, який розпочався в кінці 70-х років. Цей етап, оскільки він заклав основи не тільки для генетичної інженерії рослинних, а також і тваринних клітин. Одними із перших досліди з бактеріальними плазмідами і клітинами рослин були розпочаті в Інституті молекулярної біології і генетики АН УССР і далі продовжені в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України. Слід зауважити, що досить тривалий час трансформація за участю А.tumefaciens вважалась придатною тільки для дводольних. Ситуація поліпшилась в кінці 80-х на початку 90-х років за рахунок методичних доробок і зараз можливо трансформувати чимало рослин, в тому числі таких практично важливих як злаки і бобові [Кучук, 1997]. Успішне створення трансгенних рослин обумовлене, як створенням рекомбінантних ДНК-конструкцій, так і розробкою методів введення цих конструкцій в клітини з подальшою регенерацією рослин, а також тестуванням і доказом експресії перенесених генів.

Нами проведено порівняльне вивчення ефективності різних методів введення ДНК плазмід в різні типи експлантатів з кукурудзи.

На перших етапах досліджень проводили досліди по введенню плазмідної ДНК в ізольовані протопласти кукурудзи, так званий метод ”прямого переносу генів”, аналогічно тому, як це було попередньо отримано і протестовано на модельній системі - ізольованих протопластах тютюну. Вплив і концентрації антибіотиків як маркерів трансформації попередньо вивчали на тютюні. Було встановлено успішне введення ДНК плазмід pBR322, pCV 16 в протопласти кукурудзи, її збереження не менше двох діб, на один протопласт припадало біля 106 молекул ДНК. На жаль в цій серії дослідів не було досягнуто стійкого утворення колоній з протопластів і, як наслідок, не отримано регенераційноздатний калюс. Тому далі зусилля були спрямовані на пошук інших експлантатів, зокрема увага була зупинена на незрілих зародках. Перші декілька шарів клітин щитка незрілих зародків оптимального віку мають дуже тонку клітинну оболонку. Внаслідок чого було висунуто припущення, що саме такі експлантати будуть кращими для генетичної трансформації кукурудзи.

На незрілі зародки і калюс наносили суспензію A. tumefaciens. Після 1 год. інкубації агробактерії видаляли з поверхні експлантатів, а самі експлантати поміщали на живильне середовище без сахарози, манніту, з додаванням ацетосирингону. Подовження терміну інокуляції вело до значного травмування експлантатів. Ацетосирингон використовували як індукційний агент, який суттєво підвищує частоту трансформації. Субкультивування на такому середовищі тривало дві доби в темряві при температурі 20є С. Для елімінації агробактерій з поверхні експлантатів використовували антибіотик клофаран.

Після двох діб ко-культивування незрілі зародки і калюс переносили на живильне середовище з нормальним вмістом сахарози і наявністю в середовищі антибіотика канаміцину, для подальшого культивування. Канаміцин використовували як селективний агент для добору трансформованих незрілих зародків і клітин в калюсі кукурудзи.

Встановлено, що краще всі описані вище маніпуляції переносять незрілі зародки 16-денного віку в усіх тестованих генотипах: П 346, П 346с, П 3978, С 488. 16 - денні зародки зберігають усі притаманні незрілим зародкам ростові реакції і є більш стійкими при випадкових пошкодженнях на етапах дослідів. 18 - денні зародки не дають калюсу і зберегли лише здатність до прямого ембріогенезу (пророщування). Трансформація калюсів A. tumefaciens була більш ефективна для лінії з високим регенераційним потенціалом С 488, для якої властива висока частота індукції тотипотентного калюсу ( не менше 30%).

Зважимо, що для отримання такої ж кількості тотипотентного калюсу як з П 346с з лінії П 346, потрібно використати в якості первинних експлантатів в три-чотири рази більше незрілих зародків, звідки випливає доцільність використання в дослідах по трансформації кукурудзи наявних сомаклональних варіантів інбредних ліній з підвищеною регенераційною здатністю.

Після одного пасажу на середовищі з канаміцином трансформовані тканини далі переносили на регенераційний варіант живильного середовища з канаміцином. На протязі одного-двох місяців була регенерована значна кількість зелених пагонів. Нетрансформовані пагони з контрольного варіанта на середовищі з канаміцином мали жовтий колір.

В дослідах з „голими” плазмідами використали незрілі зародки 16 - денного віку і калюс I пасажу. Кращім відносно індукції калюсоутворення і наступної регенерації виявився варіант з обробкою незрілих зародків 200мкг/мл плазмідної ДНК, де було зафіксовано задовільний приріст біомаси калюсу і наступна регенерація на середовищі з канаміцином. Рослини-регенеранти зберегли зелений колір на вище вказаному середовищі протягом двох місяців, що дає можливість передбачити, як мінімум транзієнтну експресію гену стійкості до канаміцину як маркера трансформації.

КУЛЬТУРА IN VITRO В СЕЛЕКЦІЇ КУКУРУДЗИ НА ПОЛІПШЕНУ ЯКІСТЬ БІЛКА

Для кукурудзи актуальним є підвищення вмісту загального білка та незамінних в харчуванні людини амінокислот, в першу чергу лізину та триптофану.

На шляху використання наявних в генетичних колекціях інбредних ліній з генами непрозорого (О2,О7) та борошнистого (fl2) ендосперму, які підвищують вміст лізину в зернівках, стало погіршення інших біологічних властивостей гібридів за участю таких ліній. Тому було проведено дослідження можливості використання біотехнологічних методів.

Актуальним є пошук нових генів-модифікаторів і генних комбінацій, які забезпечили б одночасно високий рівень білка та лізину при нормальній консистенції зернівок (кременистий та напівкременистий ендосперм). Такі можливості забезпечують методи культури in vitro: сомаклональна мінливість і ступінчаста клітинна селекція на стійкість до амінокислотного аналога лізину S - (2 аминоетіл-L-цистеїну (АЕЦ). Ступінчасту селекцію сформованих калюсів проводили на середовищах з 0,125-0,4 мМ АЕЦ. Клітинна селекція кукурудзи тривала біля одного року і проведена згідно представленої схеми (табл. 14).

Таблиця 14 Схема ступінчастої селекції калюсу кукурудзи на стійкість проти аналога лізину - АЕЦ

АЕЦ виявляє інгібуючий вплив на регенерацію рослин. Завдяки модифікації живильного середовища (додавання маніту), субкультивуванню з БАП на поверхні калюсу з'являлися зони позеленіння. Внаслідок використання таких методичних підходів, можливо отримати рослини-регенеранти з клітинних ліній кукурудзи, стійких до АЕЦ. Далі такі рослини-регенеранти R0 переносили з умов культивування in vitro до in vivo.

Рослини-регенеранти дорощували до дорослого стану, примусово запліднювали та отримували зернівки в умовах кліматичних камер та теплиці. Всі рослини, отримані після клітинної селекції, гірше переносили цей період, ніж контрольні регенеранти, але в умовах штучного клімату можливо доростити їх до дорослого стану і отримати зернівки R1. Окремі аномалії розвитку рослин R0 зникали в наступному насіннєвому поколінні. Сомаклональна мінливість кукурудзи підвищується з подовженням терміну перебування калюсу в умовах in vitro , а регенераційна здатність зменшується. Тому, крім недозрілих зародків вихідних ліній доцільно використовувати незрілі зародки сомаклональних варіантів, попередньо відібраних за ознакою високої регенераційної здатності. Без цього попереднього етапу дуже важко отримувати рослини-регенеранти після дев'яти місяців культивування іn vitro.

За допомогою амінокислотного аналізу в зернівках з сомаклонів інбредних ліній П 346 (П 346-с) та Oh 43 (Oh 43-c) встановлено порівняно з контролем розширення мінливості за вмістом білка і лізину в позитивний і в негативний бік (табл. 15).

Таблиця 15 Мінливість за вмістом білка і незамінних амінокислотах в зернівках сомаклонів кукурудзи

Розширення спектра мінливості в позитивний бік у деяких сомаклонів вказує на можливість отримання практично-важливих варіантів. Слід відмітити залежність такого варіювання від генотипу вихідної лінії. Серед сомаклонів лінії CS 38 ( з Chi 31ЧS 65)нами не виявлено підвищення вмісту білка та лізину над контролем. В таблиці 14 наведено дані амінокислотного аналізу білка і деяких важливих незамінних амінокислот (лізин, триптофан, фенілаланін, треонін) в найбільш цікавих сoмaклонах, отриманих з ліній П 346 та Oh 43.

Отримано два сoмaклони з Оh 43, зернівки яких містять на 30% більше лізину при підвищеній кількості білка. При цьому за консистенцією ендосперму зернівки дослідних варіантів аналогічні контрольним.

Амінокислотний аналіз показав значні спонтанні коливання за вмістом не лише лізину, але й інших амінокислот в зернівках сомаклонів, що вказує на істотний вплив власне тривалого культивування in vitro на склад білка. Встановлено достовірне підвищення вмісту лізину, треоніну, триптофану у одного сомаклону інбредної лінії Оh 43 у порівнянні з контролем. Достовірно різнився по білку у позитивний бік від контролю дев'ятий сомаклон з лінії П 346. В той же час отримано вісімнадцятий сомаклон з лінії П 346 з достовірно зниженою кількістю білка і ряду незамінних амінокислот, крім триптофану.

Таким чином, біотехнологічним шляхом, реалізуючі спонтанну мінливість клітин in vitro, можливо отримати зразки кукурудзи з підвищеним вмістом білка і незамінних амінокислот.

Узагальнення

В наслідок проведеного дослідження вдалось суттєво полегшити та здолати основні етапи на шляху реалізації можливостей генетики соматичних клітин в напрямку біотехнологічного поліпшення кукурудзи: одержати клітинні культури з високим регенераційним потенціалом з селекційно - цінних інбредних ліній, отримати регенерацію рослин з таких культур, провести порівняльне генетичне вивчення спонтанної (сомаклональної) і індукованої впливом різних чинників мінливості in vitro.

Притаманна інбредним лініям кукурудзи різного походження генотипова спеціфічність відносно типів калюсоутворення і шляхів регенерації рослин може бути певною мірою модифікована за рахунок змін у складі живильних середовищ і умов культивування. Спадкові зміни за ознаками калюсоутворення і регенерації в бік їх підвищення, а саме такі необхідні для успіхів клітиної і генетичної інженерії кукурудзи, отримані нами за рахунок штучного добору з гетерогенних за ознакою калюсних клітин. Проведений добір включив спільні елементи контролю фаз індукції калюсоутворення з незрілих зародків і регенерації рослин, отримання насіневого покоління та наступне тестування ознак. Використання отриманих таким чином сомаклональних рослин - регенерантів з підвищеною регенераційною здатнюстю з селекційно-цінних інбредних ліній як вихідного матеріалу забезпечило успіх в дослідах з різних напрямків: клітинної селекції, мутагенеза in vitro, культивуванні зрулих зародків. Генетичний аналіз довів можливість отримання сомаклональних мутацій в культурі in vitro.

Крім того, встановлено, що калюсоутворення та наступна регенерация рослин, можуть бути значно поліпшені за рахунок використання спадкової мінливості, яка виникає за рахунок традиційних генетичних джерел: внутришньо- і міжвидової гібридизації та експериметального мутагенеза. Сомаклональні інбредні лінії протестовані за комплексом господарськоцінних ознак можуть бути використані в генетико-селекційних програмах прикладного і фундаментального напрямків.

Висновки

В дисертації наведено теоретичне і експериментальне узагальнення наявності і особливостей реалізації в умовах in vitro та in vivo сомаклональної мінливості кукурудзи. Встановлено, що сомаклональна мінливість має певні особливості і відмінності від мінливості, індукованої впливом хімічних і фізичних мутагенних чинників в умовах in vitro. Доведена можливість створення нового вихідного матеріалу для генетико-селекційного поліпшення кукурудзи внаслідок мінливості власного геному в умовах in vitro без внесення чужорідної генетичної інформації та використання мутагенів.

1. Генотип вихідних інбредних ліній є ведучим фактором, який визначає індукцію трьох різних типів калюсів і двох шляхів регенерації рослин: соматичного ембріогенезу і пагоневого морфогенезу.

2. Ознаки “індукція калюсоутворення” і “регенераційна здатність” генетично обумовлені і властиві для всіх досліджених інбредних ліній і гібридів.

3. Оптимізовано умови культивування (субкультивування з 6-бензиламинопурином в ході одного пасажу) і модифіковано склади живильних середовищ (додавання манніта, азотнокислого срібла) для регенерації рослин з інбредних ліній кукурудзи з низьким морфогенетичним потенціалом.

4. Показано наявність ефекту гетерозису за ознаками: “індукція калюсоутворення” і “регенераційна здатність” при міжлінійних схрещуваннях. Встановлено можливість штучного добору сомаклональних ліній з підвищеним регенераційним потенціалом з ліній з низьким регенераційним потенціалом.

5. Контроль ознаки “індукція тотипотентного калюсоутворення” здійснюється за адитивно-домінантним типом.

6. Вперше встановлено, що регенераційна здатність в культурі in vitro кукурудзи залежить від сформованості і функціональної активності фотосинтетичного апарату калюсних клітин.

7. Доведено позитивний вплив опромінення синім світлом на зміну морфогенетичних реакцій калюсних культур.

8. Внаслідок генетичного аналізу сомаклональних варіантів кукурудзи експериментально обґрунтована можливість отримання сомаклональних мутантів як результату впливу всього комплексу факторів культури in vitro.

9. Визначено і протестовано способи обробки мутагенами, оптимальні і критичні дози і експлантати для культури тканин кукурудзи.

10. Вперше виявлено позитивний вплив низьких доз хімічних мутагенів на зміну спектра ростових реакцій в умовах in vitro незрілих зародків інбредних ліній з низьким регенераційним потенціалом.

11. Вперше показано доцільність використання індукованих in vivo мутантних ліній в разі низького рівня калюсоутворення в вихідного матеріалу.

12. Шляхом порівняльного аналізу встановлено різні спектри спадкової мінливості серед рослин -регенерантів після мутагенної обробки (М2R2) в порівнянні з сомаклональними варіантами (R2).

13. Встановлено підвищення ефективності трансформації кукурудзи за допомогою А. tumefaciens в результаті оптимізації віку вихідних експлантатів (незрілих зародків) і добору вихідних генотипів (сомаклональних ліній з підвищеним регенераційним потенціалом).

14. Розроблено біотехнологічні прийоми отримання вихідного матеріалу з поліпшеним амінокислотним складом білка кукурудзи: шляхом ступінчастої клітинної селекції до аналогу лізину АЕЦ, а також внаслідок спонтанної мінливості серед сомаклональних варіантів вихідних інбредних ліній.

15. Вперше зареєстровані в Національному центрі генетичних ресурсів України сомаклональні інбредні лінії кукурудзи, які мають підвищений регенераційний потенціал та господарськоцінні ознаки.

Список опублікованих праць

1. Кунах В.А., Чеченева Т.Н., Моргун В.В. Получение каллусных тканей от разных по генотипу растений кукурузы.//Физиология растений.-1980.-27.-№2.-С.221-223.

2. Чеченева Т.Н., Труханов В.А., Кордюм В.А. Селективные маркеры для генетической инженерии высших растений.//Молекулярная биология.-1983.-35.-С.40-45.

3. Кордюм В.А., Труханов В.А, Топорова Е.К., Шульженко В.Н., Чеченева Т.Н. Репликация в протопластах табака рекомбинатных плазмид.//Биополимеры и клетка.-1987.-3, №3.-С.145-148.

4. Топорова Е.К., Чеченева Т.Н, Труханов В.А., Костромина В.В, Кордюм В.А., Судьба плазмидной ДНК при ее введении в протопласты табака.//ДАН СССР.-1983. -269.-№5.-С.1212-1214.

5. Чеченева Т.Н., Труханов В.А. Культура ткани и изолированных протопластов кукурузы.//Генетические методы ускорения селекционного процесса.-Кишинев:Штиинца.-1986.-С.52-58.

6. Чеченева Т.Н., Моргун В.В., Рубан Т.А. Регенерация растений из разных типов каллусных тканей инбредных линий и гибридов кукурузы.//Докл. АН УССР.-1988.-Сер. Б.-С.80-83.

7. Чеченева Т.Н., Ларченко Е.А., Моргун В.В., Труханов В.А. Изменчивость по качественным и количественным признакам в потомстве растений- регенерантов кукурузы.//Физиология и биохимия культ. растений. -1990.-22, №6.-С. 542-546.

8. Чеченева Т.Н., Шевченко В.В., Кочубей С.М. Исследование состояния фотосинтетического аппарата в каллусных тканях кукурузы.//Физиология растений.-1994.- 41, №1.-С. 17-20.

9. Чеченева Т.Н., Труханов В.А. Генетическая обусловленность каллусообразования и регенерационной способности у кукурузы.//Цитология и генетика. -1994.-28, №5.-С. 46-50.

10. Чеченева Т.Н., Труханов В.А. Повышение регенерационной способности инбредных линий кукурузы in vitro.//Цитология и генетика. -1997.-31, №2.-С. 36-39.

11. Чеченева Т.Н., Ларченко Е.А. Влияние химических мутагенов и гамма-облучения на культуру in vitro инбредных линий кукурузы. //Цитология и генетика. -1997.-31, №3.-С. 65-71.

12. Чеченева Т.Н. Культура in vitro в селекции кукурузы с целью улучшения белкового состава зерновых.//Биотехнология.-1997.-6.-С. 25-29.

13. Чеченева Т.Н., Лучко Л.В., Дыкун М.О. Индукция каллуса у зрелых зародышей кукурузы.//Биополимеры и клетка. -1999.-15,№3.-С. 237-240.

14. Самохвал Є.Г., Чеченєва Т.М. Вплив синього світла на калюсоутворення і морфогенез в культурі соматичних тканин кукурудзи. //Фізіологія в Україні на межі тисячоліть. Глава в монографії. Київ.-2000.-1.-С. 390-392.

15. Чеченєва Т.М. Спонтанна мінливість in vitro у кукурудзи.//Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. Глава в монографії. Київ: Логос, т.1.-2001.-С. 579-585.

16. Чеченєва Т.М., Гур'єва І.А. Порівняльне дослідження сомаклональних інбредних ліній кукурудзи за кількісними ознаками. //Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. Глава в монографії. Київ: Логос, т.-2001.-С.586-589.

17. Чеченева Т.Н. Изменчивость in vitro у кукурузы, индуцированная 1,4 бисдиазоацетилбутаном.//Физиология и биохимия культ. растений. -2001.-33, №6.-С. 480-484.

18. Чеченева Т.Н. Генетическое изучение сомаклональных вариантов кукурузы.//Физиология и биохимия культ. раст. -2002.-34,№4.-С. 349-352.

19. Чеченева Т.Н., Гурьева И.А. Морфогенетичекие особенности биотехнологических инбредных линий кукурузы.//Физиология и биохимия культ. раст.-2003.-35, №1.-С. 48-54.

20. Чеченева Т.Н., Гурьева И.А., Вакуленко С.Н. Сомаклональная инбредная линия кукурузы УКЧ 10 и гибридные комбинации с ее участием.//Физиология и биохимия культ. раст. -2003.-35, №5.-С. 447-454.

21. Чеченева Т.Н., Труханов В.А. Побеговый морфогенез и соматический эмбриогенез в культуре ткани кукурузы.//Экспериментальная генетика в ускорении селекционного процесса. Киев: Наукова думка. -1989.-С. 120-128.

22. Чеченева Т.Н., Легейда.В.С., Савченко Е.К., Войтюк Л.И. Эффективность каллусообразования различных сортов и линий кукурузы.// Структура и генетические функции биополимеров. Киев: Наукова думка. -1981.- С. 74 - 76.

23. Чеченєва Т.М. Вплив генотипів рослин і експлантів на ефективність трансформації кукурудзи. // Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми. - Київ: Парламентське видавництво ВРУ.- 2003.-С.89-95.

24. Чеченєва Т.М. Поліпшення амінокислотного складу білка кукурудзи біотехнологічним шляхом. //Наукові праці Українського державного університету харчових технологій.-2001.-№10.-С.150-151.

25. Чеченева Т.Н. Отбор сомаклональных линий с повышенной регенерационной способностью из гетерогенных каллюсных популяций кукурузы.//Фактори експериментальної еволюції організмів.- Київ: Аграрна наука -2003. - С.380-384.

26. Спосіб культивування тканини кукурудзи. Патент SА №4353389, МКИ 4С12N5/00, A/1507792/ Чеченєва Т.М., Труханов В.А., Моргун В.В. Заявл. 04.01.1988.Опубл.30.09.1996, Бюл. №3.-3с.

27. Авторське свідоцтво про реєстрацію зразка генофонду рослин в Україні № 83. Кукурудза лінія УКЧ 6. Національний Центр генетичних ресурсів України № ИВ0103499 Чеченева Т.Н. Запит № 000299. Заявл. 21.04.2000. Вид. 5.12.2003

28. Авторське свідоцтво про реєстрацію зразка генофонду рослин в Україні № 84. Кукурудза лінія УКЧ 11. Національний Центр генетичних ресурсів України № ИВ0103361 Чеченева Т.Н. Запит № 000300. Заявл. 15.04.2000. Вид. 5.12.2002.

29. Кунах В.А, Чеченева Т.Н., Легейда В.С., Савченко Е.К., Войтюк Л.В., Зосимович В.П. Получение культуры ткани кукурузы и ее цитогенетическая характеристика.//Тезисы IV съезда УОГиС.- Одесса. -1981.-1.-С. 221-223.

30. Kostromina V.W., Toporova E.K., Checheneva T.N., Trukhanov V.А., Kordyum V.A. Expression bacterial plasmides in tobacco protoplasts.//Abstr. XV Int.Gen.Congr.-New Delhi.- 1983.-P.766.

31. Чеченева Т.Н., Труханов В.А., Рубан Т.А.,Дудник К.Ю., Ларченко Е.А.. // Регенерационный потенциал культуры незрелых зародышей различных генотипов кукурузы.// Тез. V съезда УОГиС.-Киев. -1986.-1.-С. 174.

32. Чеченева Т.Н., Ларченко Е.А. Регенерационный потенциал отдаленных гибридов кукурузы и теосинте.// Тез V Межд. конф. “Биология культивируемых клеток. и биотехнология”.- Новосибирск. -1988.-С. 297-298.

33. Чеченева Т.Н. Фенотипическая изменчивость растений-регенерантов кукурузы. // Тез. Всес. конф. „Новые направления биотехнологии”.- Пущино.-1988.-С. 86.

34. Чеченева Т.Н., Моргун В.В., Ларченко Е.А., Труханов В.А.Качественная и количественная изменчивость в потомстве растений-регенерантов кукурузы. // Тез. конф.”Частная генетика растений”.- Киев. -1989.-С. 115.

35. Чеченева Т.Н. Регенерационная способность инбредных линий кукурузы и их гибридов.//Тез. Всес. cов. “Генетика соматических клеток в культуре” (Звенигород, 1989).- Москва. -1989.- С. 77.

36. Checheneva T.N, Larchenko E.A.,Morgun V.V., Trukhanov V.A. Variability in quantitative traits in progeny of regenerated plants.// Abstr. VII Int. Cong. of Plant Tissue and Cell.-Amsterdam.-1990.-P.175.

37. Чеченева Т.Н., Ларченко Е.А., Труханов В.А., Рубан Т.А.Сомаклональные мутанты у кукурузы.//VI съезд УОГС (Полтава,1992).-Киев. -1992.-С. 138.

38. Checheneva T.N., Larchenko E.A., Trukhanov V.A., Morgun V.V. Genetic analyses of corn somaclonal mutants.//Abstr.II Internat. Conf. “Plant Biology and Biotechnology in Vitro.”-Almaty.-1993.- P.6.

39. Чеченева Т.Н., Рубан Т.А., Дыкун М.О. Влияние химических мутагенов и гамма-облучения на каллусообразование и регенерационную способность инбредных линий кукурузы.//Междун. симп.“Управление генетической изменчивостью сельскохозяственных растений.”-Ялта, 1992.- С. 120.

40. Checheneva T.N.,Коchubei S.M. Development of photosynthetic apparatus in callus of maize inbreds differing in regeneration capacity.//Abstr. Int. Symp. “Plant Biotechnology and Genetic Engenering”.-Kyiv.-1994.- P.123.

41. Checheneva T.N. Corn biotechnological research.//Abstr. II Int. Symp. on Plant Biotechnology.- Kyiv.-1998.-P.28.

42. Чеченєва Т.М.Біотехнологія in vitro незамінних амінокислот.//VI Міжнар. наук.-техн.конф.“Проблеми створення і впровадження нових ресурсо- та енергоощадних технологій.” //Київ:УДУХТ.-2000.-1.-С. 85.

43. Checheneva T.N., Dykun M.O., Luchka L.V. Corn: Spontaneous and Induced Variability in vitro.//Int. Symp. “Mol. mechanisms of genetic processes and biotechnology”. Moscow, Minsk.-12-18 November, 2001.-Р.201.

44. Чеченева Т.Н. Геномная изменчивость и отбор in vitro у кукурузы.// Тез.IV Междун. конф. “Геном растений.”-Одесса: ЮБЦ. - 2003. - С. 77.

Анотація

Чеченєва Т.М. Спонтанна та індукована мінливість кукурудзи in vitro.

Дисертація (рукопис) на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.15. - генетика. - Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено проблемі генетичного поліпшення кукурудзи шляхом реалізації можливостей сомаклональної і індукованої in vitro спадкової мінливості в гетерогенних клітинних популяціях з наступною регенерацією рослин із таких популяцій.

Встановлено, що в культурі in vitro кукурудзи має місце специфічна генетично обумовлена міжлінійна варіабельність, яка виявляється в індукції калюсоутворення трьох типів і двох шляхів регенерації рослин. Оскільки тестовані на протязі декількох років модифікації складу живильних середовищ і умов культивування не забезпечили довготривалого високого регенераційного потенціалу для ряду цінних ліній, було проведено спрямований штучний добір калюсів з підвищеним регенераційним потенціалом та обов'язковою наступною регенерацією рослин. Внаслідок добору частота тотипотентного калюсоутворення підвищилась в 2,5 -3 рази. Далі регенерували рослини - регенеранти (R2), які зберегли ознаку в ряду насіннєвих поколінь. Використання сомаклональних інбредних ліній з підвищеною регенераційною здатністю як вихідного матеріалу дозволило отримати суттєві результати в напрямках: клітинної селекції, мутагенезу in vitro, культури зрілих зародків, трансформації. Кращі з таких ліній тестовано за комплексом господарсько-цінних ознак і зареєстровано в Національному центрі генетичних ресурсів України.

Ключові слова: кукурудза, калюсоутворення, регенераційна здатність, мінливість in vitro, мутагенез in vitro, клітинна селекція, сомаклональні лінії.

Аннотация

Чеченева Т.Н. Спонтанная и индуцированная изменчивость кукурузы в культуре in vitro.

Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.15 -генетика. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена проблеме генетического улучшения кукурузы путем реализации возможностей сомаклональной и индуцированной изменчивости в гетерогенных клеточных популяциях in vitro с последующей регенерацией растений из таких популяций. Обязательным условием для решения указанной проблемы является разработка методов получения каллюсных культур с высоким и длительно сохраняемым регенерационным потенциалом и регенерацией растений из селекционно-ценных инбредных линий.

Установлено, что в культуре in vitro кукурузы имеет место специфическая межлинейная вариабельность, которая имеет генетическую природу и определяется генотипом исходных линий. Межлинейная вариабельность обуславливает каллюсообразование трех разных типов и двух путей регенерации растений de novo. В потомстве растений - регенерантов установлена изменчивость по качественным и количественным признакам. Частоты и спектр варьирующих признаков (R2) были специфичными для каждого генотипа. Ра...