Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 577.354+615.322:612.822

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ГЛІЦИНОВІ РЕЦЕПТОРИ В ПІРАМІДНИХ НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПУ ЩУРА ТА МЕХАНІЗМИ ЇХ МОДУЛЯЦІЇ ГІНКГОЛІДАМИ

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник:академік НАН України, доктор біологічних наук Кришталь Олег Олександрович Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран

Офіційні опоненти:академік НАН України, доктор біологічних наук Магура Ігор Сильвестрович професор Кафедри молекулярної фізіології і біофізики Фізико-технічного Навчально-Наукового центру НАН України

кандидат біологічних наук Пархоменко Микола Тимофійович провідний науковий співробітник відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. Паладіна НАН України

Провідна установа: Національний Університет ім. Т. Г. Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ

Захист відбудеться 06.05.2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 03.04.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гліцин та -аміно-масляна кислота відіграють провідну роль в центральній нервовій системі ссавців, опосередковуючи гальмівну синаптичну передачу у переважній більшості її відділів (Legendre, 2001). Специфічні рецептори до цих амінокислот відносяться до родини ліганд-керованих канал-утворюючих білків, як і решта подібних рецепторів: нікотиновий, ацетилхоліновий, серотоніновий 3-го типу тощо (Barnard, 1992). Гліцин-активовані рецептори пригнічують активність нейронів шляхом відкривання хлорних каналів (Curtis et al., 1968; Barker and Ransom, 1978; Barker and McBurney, 1979), тому модуляція функціонального стану таких рецепторів неминуче призводить до впливу безпосередньо на нейрональне збудження.

Наразі відомо, що гліциновий рецептор складається із п'яти субодиниць та , що найчастіше поєднуються у стехіометричному співвідношенні як 3 :2, та формують центральну пору іонного (хлор-проникного) каналу (Chattipakorn and McMahon, 2002) (Pfeiffer et al., 1984). У відкритому стані канал рецептора може бути блоковано неспецифічними блокаторами, що діють як неконкурентні антагоністи рецептора. Для гліцинового рецептора існує кілька блокаторів, зокрема цианотрифенілборат (Rundstrom et al., 1994) та пікротоксин (Pribilla et al., 1992), дія яких визначається субодиничним складом рецептора, який потерпає певних змін у процесі онтогенетичного розвитку живого організму. При патологіях гліцинового рецептора, наприклад, гіперфлексії, змінюється афінність рецептора до агоніста, а також чутливість канальної пори до неконкурентних антагоністів (Lewis et al., 1998), тому пошук специфічних модуляторів гліцинового рецептора як за фізіологічних умов, так і при точкових мутаціях генів, що кодують його білки, вважається доцільним і потребує особливої уваги.

Раніше вважалося, що гліцин як нейромедіатор, домінує в нижчих відділах ЦНС, наприклад, у спинному мозку та стовбурових частинах мозку (Aprison M.H., 1990), тоді як -аміно-масляна кислота притаманна вищим відділам (гіпокамп, кора, мозочок) (Rampon et al., 1996). Проте на сьогодні достовірно відомо, що гліцин присутній у гіпокампі, причому здатний слугувати не лише як ко-агоніст для NMDА-керованих рецепторів (Thomson, 1990), а також активує специфічні рецептори, чутливі до стрихніну, нарівні з ендогенними агоністами гліцинових рецепторів, таурином та -аланіном (Mori et al., 2002). Поява таких фактів змусила переосмислити основні положення функціональної значимості гліцинових рецепторів у ряді процесів, що мають місце у гіпокампі.

Поточний брак уваги до гліцинових рецепторів в гіпокампі з боку науковців, зацікавлених у процесах нейронального гальмування, є непередбаченим, оскільки очевидно, що ціла машинерія, необхідна для гліцин-рецептор-опосередкованого інгібування була виявлена в гіпокампі в результаті багатьох експериментальних досліджень. Як приклад, синаптонейросоми, виділені із гіпокампу дорослих щурів, містили гліцин в концентраціях, однакових із концентраціями ГАМК (36 нМ ГАМК/мг протеїну супроти 42 нм гліцину/мг протеїну) та виявили вивільнення обидвох гальмівних амінокислот із використанням Са²⁺-залежного та Са²⁺-незалежного механізмів, що свідчить про можливість везикулярного та транспортер-опосередованого виділення обидвох амінокислот (Burger et al., 1991; Engblom et al., 1996). На додаток, таурин, відомий як агоніст гліцинового рецептора в окремих системах (Horikoshi et al., 1988a; Horikoshi et al., 1988b; Hussy et al., 1997; Flint et al., 1998), та присутній у гіпокампі у високих концентраціях (del Rio et al., 1987) (Saransaari and Oja, 1999) здатний попереджати екзитотоксичну смерть нейронів та пригнічувати збудливість пірамідних нейронів у гіпокампі (French et al., 1986; Taber et al., 1986). Вірогідно, що ці ефекти таурину в гіпокампі опосередковані активацією гліцинових рецепторів.

Фізіологічна роль гліцинових рецепторів у гіпокампі достеменно невідома, однак їх наявність та висока густина поширення диктує потребу їх детального дослідження, включаючи вивчення субодиничної структури, модуляцію біологічно активними агентами та ідентифікації процесів, що мають місце у гіпокампі, і у котрі, прямо чи опосередковано ці рецептори можуть бути залучені.

Екстракт Ginkgo biloba є комплексом біологічно активних речовин, включаючи флавонові глікозиди 22-27% (кверцитин, каемферол, ізорхамнетин) та терпенові лактони, що обіймають близько 2.8-3.4%, та включають гінкголіди (А, В, С та J), білобалід і гінкголідову кислоту, яка посідає найменший відсоток серед складових екстракту (DeFeudis, 1998).

Усі гінкголіди є 20-карбон-вмісними молекулами (гінкголід В має хімічну формулу С20Н24О10), що містять шість кілець, що включають тетрагідрофуранову групу, спірононанову систему, три лактонових кільця та tert-бутилову групу. Гінгколід В характеризується присутністю двох гідроксильних груп, що кріпляться до вуглеців у положенні С1 та С3 спірононанової системи.

Протягом останніх років зусиллями когорти вчених було виявлено, що використання екстракту є ефективним за широкого спектру захворювань, що пов'язані із фізичними та розумовими розладами, такими як хвороба Альцгеймера, чи деменція (Le Bars et al., 2002), шизофренія (Zhang et al., 2001), епілептичні судоми (Granger, 2001), апоптоз нервових тканин у людей похилого віку тощо.

Проте, дані відомості стосувалися екстракту як суміші речовин, і до цього часу бракує наукових фактів, що здатні пролити світло на те, які саме складові екстракту Ginkgo biloba спричиняють кожен із цих впливів на ЦНС. Зокрема, зовсім небагато відомо про ефекти окремих складових на функціонування нейронів на молекулярному рівні.

Окремо слід наголосити про факт того, що гінкголіди проявляють антагоністичну активність супроти рецепторів до фактора активації тромбоцитів, так як пригнічують зв'язування 1-O-алкіл-2-ацетил-sn-гліцеро-3-фосфохоліну (PAF) до його мембранних рецепторів. Дослідження модуляторних аспектів дії гінкголідів стосовно ліганд-активованих рецепторів у нейронах є доцільним і вимагає грунтовного дослідження.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за темою “Дослідження стрихнін-чутливих гліцин-активованих рецепторів в пірамідних нейронах зони СА1 гіпокампу щурів та їх модуляції гінкголідами (складовими екстракту Ginkgo biloba)”.

Мета і задачі дослідження:

із застосуванням методик фіксації потенціалу та внутрішньоклітинної перфузії нейронів з'ясувати фармакологічні характеристики гліцин-керованих рецепторів у пірамідних нейронах гіпокампу, та вивчити механізми дії нового класу блокаторів гліцин-керованого хлорного каналу - гінкголідів (складових екстракту Ginkgo biloba) з метою їх подальшого клінічного використання. З'ясувати потенційний внесок гліцинових рецепторів у каскад подій довготривалої потенціації в гіпокампі, виходячи із здатності гінкголідів модулювати цей процес та пригнічувати гліцин-активовані струми.

Матеріали та методи досліджень. В експериментах використовувались білі щурі лінії Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 7 та 14 днів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті.

Для дослідження фармакологічних характеристик гліцин-активованих струмів та модуляції їх гінкголідами, а також з'ясування потенційного внеску гліцин-активованих рецепторів у каскад подій довготривалої потенціації використовувалися такі методичні підходи:

а)приготування зрізів гіпокампу щурів;

б)виділення окремих клітин із зрізів гіпокампу з використанням методу вібродисоціації нервових клітин;

в)метод “петч-клемп” у конфігурації "ціла клітина" для реєстрації гліцин-активованого струму;

г)реєстрація збуджуючих постсинаптичних потенціалів (ЗПСП) із ділянки stratum radiatum СА1 зони гіпокампу із використанням біполярної стимуляції колатералей Шафера.

Отримання ізольованих нейронів. Для отримання окремих пірамідних нейронів гіпокампу, придатних для дослідження методом фіксації потенціалу, використовувався метод м'якої ферментативної обробки зрізів гіпокампу (Kiskin et al., 1991). Після декапітації тварини гіпокамп переносили у штучний спинномозковий розчин (А) наступного складу (у мМ): 150 NaCl, 5 KCl, 0.9 CaCl2, 1.1 MgCl2, 26 NaHCO3, 10 глюкоза, 1.25 NaH2PO4, pH=7.4; далі у цьому розчині гіпокамп нарізали на зрізи 200-400 мкм, які витримували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі (24С) у розчині (В) наступного складу (у мМ): 150 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 26 NaHCO3, 10 глюкоза, 1.25 NaH2PO4, pH=7.4. Розчин постійно насичувався газовою сумішшю (95% O2, 5% CO2), pH 7.4. Для ферментативної обробки використовували протеазу (в розчині А) (Sigma, P-5147, Aspergillus oryzae) у концентраціі 0.4 мг/мл (при t=32 Cо, 10 хвилин). Для виділення окремих, ізольованих нервових клітин із зрізів гіпокампу застосовувалась модифікована методика вібродисоціації клітин із тканини, запропонована Воробйовим (Vorobjev, 1991).

Реєстрація хемоактивованих трансмембранних струмів. Реєстрація іонних струмів через мембрану нейронів проводилася методом внутрішньоклітинної перфузії (Kostyuk et al., 1981) із використанням скляних мікропіпеток, які мали опір 2-5 МОм (Hamill et al., 1981). Використання пристрою “рухомий столик” (виробництво “Pharma Robot”, Київ) у експериментах дозволяло провести швидку зміну позаклітинних розчинів за 15-20 мсек. Піпетки заповнювалися внутрішньоклітинним розчином (у мМ): 70 Tris-PO4, 5 EGTA, 40 TEA-Cl (Tetraethylammomium chloride), 30 Tris-Cl, 5 Mg-ATP, 0.5 GTP; pH 7. Склад позаклітинного розчину (у mM): 130 NaCl; 3 CaCl2; 5 KCl; 2 MgCl2, 10 n-2-гідроксиетилпіперазин-N'-2-етансульфонової кислоти (n-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethanesulphonic acid) (HEPES), 0.1 мкM TTX; pH=7.4.

Всі реактиви, які використовувалися в роботі, були вироблені фірмою Sigma Chemical Co. (St. Louis, США). Вода для розведення розчинів була деіонізована на апараті Super-Q фірми Millipore і мала питомий опір 10-12 МОм* см. Гінкголіди (складові екстракту Ginkgo biloba) були люб'язно надані фірмою Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. (Німеччина).

Дані були апроксимовані згідно із рівнянням Хіла

(1)

де - концентрація речовини, - концентрація речовини, при якій пригнічення струму дорівнює 50% від максимального, -коефіцієнт Хіла та рівняння

,

де К_D1 та К_D2 відображають афінність гомо- та гетеромерних рецепторів до гінгколіда В (BN52021) та [BN]-концентрація гінкголіда В. Первинна обробка даних (вимірювання амплітуди, нормалізація тощо) здійснювалась із використанням програми “AnDatRa”, створеної Я. Бойчуком на мові Delphi1.0. Статистичну обробку даних та побудову графіків виконували з використанням програмного пакету Origin 6.0 (Microcal Software, Inc., Northampton MA, USA). Статистичні порівняння виконувалися за t-тестом Стьюдента, застосовуючи описані алгоритми (Урбах, 1964).

Результати досліджень. Властивості гліцин-активованих струмів у пірамідних нейронах СА1 зони гіпокампу щурів

Аплікація гліцину (Gly) (100-200 мкМ) на ізольований пірамідний нейрон СА1 зони гіпокампу спричиняє появу відносно великого за амплітудою (до 5 нА) трансмембранного Cl^- струму у 95% випадків. Визначене значення EGly для нейронів гіпокампу при фіксації потенціалу складало -16 мВ (при внукрішньоклітинній концентрації хлору [Cl^-]_in 70 мM та зовнішньоклітинній концентрації [Cl^-]_out 140 мM), що корелює із значенням рівноважного потенціалу для хлорного струму, вирахуваним за рівнянням Нернста (-18 мВ) та свідчить про активацію хлорних каналів. Концентрація половинної дії гліцину складала ЕС₅₀=69.951.7 мкМ n=1.60.1. Гліцин-активовані струми були чутливими до дії конкурентного антагоніста гліцинового рецептора стрихніну (ІС₅₀=15.721.8нМ, n=1.00.1) та не блокувалися бікукуліном, використаним у концентраціях, в котрих дана сполука повністю пригнічує ГАМК-активовані струми (2-10 мкМ). Таурин, що є більш слабким агоністом гліцинових рецепторів, активував гліцинові рецептори, що блокувалися стрихніном в присутності 2 мкМ бікукуліну. Концентрація половинної дії ЕС₅₀ для таурину складає 4.88 мМ, що корелює із даними літератури, отриманими для гліцинових рецепторів пірамідних нейронів у зрізах гіпокампу (Mori et al., 2002). Вище наведені експериментальні дані свідчать, що в нейронах СА1 зони гіпокампу щурів дійсно досліджувалися гліцин-активовані струми, і вивчення модуляційних аспектів дії фармакологічних агентів адекватно відображає їх ефективність стосовно стрихнін-чутливого гліцинового рецептора в пірамідних нейронах зони СА1 гіпокампу як обраної моделі.

Селективність дії гінкголідів по відношенню до гліцин-керованих стрихнін-чутливих рецепторів

Наступною частиною досліджень було визначення фармакологічних характеристик гінкголідів А, В, С та J (складових екстракту Ginkgo biloba). Для гінкголіда В хімічну структуру відображено на рисунку 1.А. Результати дослідів свідчать, що гінкголіди продемонстрували значну селективність до гліцин-активованих рецепторів, адже вони не впливали на NMDA- та AMPA-активовані струми та пригнічували ГАМК-активовані струми із активністю, у 20 разів меншою, ніж гліцин-активовані (Рис.1.Б).

Б. Діє-залежний ефект гініголіда С (10 мкМ) на гліцин-активовані струми. Для з'ясування механізмів дії гінкголідів, концентрації, в котрих вони аплікувалися, поступово збільшували. Так ефект гінкголіда В, як й інших гінкголідів, поглиблювався із збільшенням концентрації (Рис.3.А). Було побудовано криві концентраційної залежності дії для кожного із гінкголідів. Пікове значення відповіді (І) було нормалізовано відносно контролю (І0) і подано як відношення log концентрації відповідного гінкголіда. SD репрезентує стандартне відхилення. На рисунку 3.А. відображена крива концентраційної залежності для гінкголіда В.

А. Оригінальні записи відображають дію гінкголіда В в залежності від концентрації.

Б. Крива концентрація-ефект для гінкголіду В на гліцин-активовані струми (200 мкМ). Підтримуваний потенціал складав - 70 мВ. Отримані дані апроксимувалися рівняннм Хіла.

Гінкголіди діють безпосередньо на канал гліцин-керованого стрихнін-чутливого рецептора

Було з'ясовано, що гінкголіди приєднуються до каналу гліцинового рецептора, оскільки при аплікуванні агоніста протягом усього експерименту, та виключно під час аплікації агоніста характер дії досліджуваної сполуки був однаковий. Проте жодного ефекту на гліцин-індуковані відповіді не спостерігалося при аплікації гінкголіду В між аплікаціями агоніста. Тому було зроблено висновок, що найбільш вірогідно, гінкголід діє на іонну пору рецептора. Отримані результати не виявляють точного сайту зв'язування представника нового класу антагоністів гліцинового рецептора, а лише вказують на його локалізацію всередині канальної пори, як найбільш вірогідний висновок, що випливає із проведених досліджень.

Гінкголід В не конкурує за центр зв'язування із агоністом гліцином та антагоністом стрихніном

Зв'язування гінкголіду із відкритим каналом робить малоймовірним приєднання молекули досліджуваної речовини до центру зв'язування агоніста гліцину чи, конкурентного антагоніста гліцинового рецептора, стрихніну. Проте ми прагнули перевірити таку можливість, для чого обчислили криву концентраційної залежності дії агоніста (у контролі) та криву дії агоніста на фоні аплікації гінкголіда В у концентрації 1 мкМ. Як видно із рисунка 4.А, крива концентраційної залежності для гліцину не потерпає статистично достовірного зсуву, що свідчить про відсутність конкуренції за центр зв'язування на гліциновому рецепторі між цими агентами.

Рис. 4

А. Ефект 1 мкМ гінкголіда В на концентраційну криву агоніста гліцину. Пік кожного гліцин-індукованого струму був нормалізований до максимального значення гліцин-активованого струму (1 мМ гліцину), н=13.

Б. Крива концентраційної залежності дії антагоніста стрихніну на гліцин-індуковані відповіді, та на фоні попереднього блокування гліцинової відповіді гінкголідом В (1 мкМ). Спочатку гліцинові відповіді блокувалися гінкголідом в насичуючій концентрації (до 5 аплікацій). Далі гінкголід В (1 мкМ) сумісно із стрихніном у вибраній концентрації аплікували на нейрон. Підтримуваний потенціал у всіх експериментах складав - 70 мВ.

Величини ЕС50 дії гліцину у контролі і на фоні дії гінкголіду складали EC50=69.51.7 мкM та EC50=97.316.8 мкM відповідно. За обчисленням t-тесту значення складало р>0.57, що свідчить відсутність конкуренції між гліцином та гінкголідом В за центр зв'язування.

Так обчислені із концентраційних кривих дії стрихніну та стрихніну на фоні насичуючої концентрації гінкголіду В, значення IС50 складали IC50(STR)= 15.72 1.8 та IC50 STR+1M ГінкголідВ= 14.95 0.18. Значення коефіцієнта Хіла у обидвох випадках не змінювалися (Рис. 4).

Варто прокоментувати два основні висновки, що випливають із результатів проведеної серії експериментів. По-перше, було виявлено, що синаптосомальний антагоніст рецептора фактора активації тромбоцитів перешкоджає індукуванню LTP в зоні СА1 гіпокампу щурів, що викликалась високочастотною стимуляцією. По-друге, аплікування слабкого антагоніста PAF рецепторів, гінкголіда J, в концентрації, достатній для блокування гліцинових рецепторів, ніяк не вплинула на індукцію чи подовження в часі LTP в зоні СА1 гіпокампу.

Таким чином, було експериментально доведено, що антагоністи PAF рецептора в СА1 зоні гіпокампу пригнічують LTP. В зв'язку із раніше отриманими даними, стосовно антагоністичної ролі гінкголідів на гліциновий рецептор було проведено ряд дослідів, в котрих потенційна роль гліцинових рецепторів в LTP не була доведена, тобто, в основі ефекту гінкголідів на LTP феномен в СА1 зоні гіпокампу лежить їх конкурентна дія на PAF-активовані рецептори. В той час, доведено вклад гліцин-активованих стрихнін-чутливих рецепторів в гіпокампі в явищі STP, індукованому високочастотною стимуляцією.

Виходячи із факту, що екстракт Ginkgo biloba представляє собою комплекс компонентів, ми прагнули проаналізувати їх окремі ефекти на основні типи рецептор-канал-систем в мембрані нейронів. Було проведено дослідження дії гінкголідів А, В, С та J на Na-TTX-чутливі, Na-TTX-нечутливі канали та AMPA-, NMDA-, ATP- та гліцин-індуковані струми. Всі перелічені гінкголіди в концентрації 10 мкМ не змінювали жоден із потенціал- чи хемо-активованих струмів, окрім гліцин-індукованих. Всі гінкголіди у концентрації 10 мкМ суттєво зменшували амплітуду гліцин-індукованого струму. Їх дія була концентраційно-залежною, та ефект мав діє-залежний (use-dependent) характер. Крім того, кожен із гінкголідів проявляв антагоністичну активність лише у випадку відкритого каналу гліцинового рецептора. Стосовно гінкголіду В, як і інших гінкголідів, було зареєстровано потенціал-залежність ефекту, що разом із фактом діє-залежності ефекту свідчить про дію сполук як канальних блокаторів гліцин-керованого каналу.

Для більш повного з'ясування сили дії сполук на гліциновий рецептор було отримані дані, що використалися для побудови кривих доза-ефект для інгібування гліцинової відповіді, викликаної аплікацією 200 мкМ гліцину кожним із гінкголідів. Величини ІС50, отримані із кривих, складають 1.97; 0.273, 0.267 та 2.0 мкM для гінголідів А, В, С та J відповідно. Значення коефіцієнта Хіла у всіх випадках було наближено до одиниці, що свідчить про поєднання молекули блокатора та каналу гліцин-активованого рецептора у стабільному відношенні 1:1.

Гінгколід В, як найбільш активний представник нового класу блокаторів гліцин-керованого рецептора не конкурував за центр зв'язування гліцину та конкурентного антагоніста стрихніну. Відсутність перекривання сайту зв'язування стрихніну і гінкголіду В, вкупі із раніше виявленими ефектами діє-залежності, потенціалзалежності та дії виключно на відкритий в присутності агоніста канал підтверджують факт дії гінкголіду, як і інших гінкголідів на певний, можливо специфічний сайт всередині пори іонного каналу.

Наступна серія експериметнів була спрямована на визначення можливого зв'язку між ефективністю блокатора та субодиничною будовою гліцинового рецептора. Нами було використано пікротоксин як фармакологічний агент за допомогою якого можна вирізнити гліцинові рецептори, що є гомомерними та гетеромерними. Оскільки за даними літератури ембріональна 2 субодиниця у постнатальному періоді заміщується на 1, а імуногістохімічні експерименти виявили лише 1- та 1/- вмісні рецептори в пірамідних нейронах гіпокампу, то використання пікротоксину як індикатора структури рецепторів можна вважати єдино доцільним.

За даними блокування пікротоксином гліцин-індукованих відповідей у нейронах 7- та 14 денних щурів можна зробити висновок про присутність гетеромерних рецепторів як в першій, так і в другій вікових групах. Аналізуючи дві сигмоїдальні криві, що були апроксимовані функцією 2, ми встановили приблизний внесок гомомерних рецепторів у двох вікових групах. Так у 7-денних щурів відсоток гомомерних рецепторів складав 71%, в той час як у 14-денних- 9%. Оскільки при прикладанні гінкголіду В пригнічувались в більшій мірі гетеромерні гліцинові рецептори, то, таким чином відбувалося збільшення відсоткового внеску гомомерних, котрі далі блокувалися пікротоксином. Так значення половинної дії пікротоксину на фоні гінкголіду В складало ІС₅₀=92 мкМ, що значно відрізняється від значення половинної дії ІС₅₀=354 мкМ, отриманого із кривої концентраційної залежності дії пікротоксину, прикладеного поодиноко. Тобто, із проведених експериментів випливає, що, дійсно, гінкголід В є більш ефективним відносно гетеромерних гліцинових рецепторів.

Як відомо, існує ряд модуляторів функцій гліцинового рецептора, проте за умов відсутності фармакологічних агентів, із застосуванням яких можна безпосередньо визначити субодиничний склад рецептора, тонкі механізми їх дії часто залишаються невідомими. Для визначення потенційного складу гліцинових рецепторів відомо небагато агентів. Так цианотрифенілборат пригнічує 1-вмісні гліцинові рецептори із значенням половинної дії IC₅₀=1.3 M, в той час як 2 гомомерні рецептори пригнічуються цим блокатором значно слабкіше (IC₅₀20 M). Другим агентом є пікротоксин, що був використаний у наших експериментах. Таким чином, згідно із отриманими результатами, гінкголід В є першим відомим канальним блокатором, дія якого залежить від конфігурації рецептора, має вищу чутливість до переважно гетеромерних гліцинових рецепторів.

У другій серії експериментів було перевірено можливість залучення гліцинових рецепторів до каскаду подій довготривалої потенціації, викликаної високочастотною стимуляцією в гіпокампі щурів, виходячи із факту двоякого антагонізму гінкголіда В стосовно PAF та гліцинових рецепторів. Отримані нами результати підтвердили, що антагоніст фактора активації тромбоцитів, гінкголід В, BN52021, в концентрації 5 мкм, дійсно пригнічує індукцію LTP, викликану високочастотною стимуляцію в зоні СА1 гіпокампу щурів. В наших експериментах аплікація гінкголіда В (5 мкМ) повністю інгібувала появу ЗПСП (LTP), що вимірювався на 60 хв після 1 сек високочастотної стимуляції. В той самий час, гінкголід В, що аплікувався в концентрації 5 мкМ значно підвищував значення STP, ЗПСП, що реєстрували на 15 хв після 0.2 сек високочастотної стимуляції. Таким чином, виходячи із ефектів гінкголіда В на ініціацію LTP, можна припустити потенціальну роль PAF рецептора в каскаді цих реакцій. Окрім тавтологічної ролі гліцинових рецепторів поряд із ГАМК в гіпокампі, ми припустили, що здатність гінкголідів блокувати гліцин-керовані канали може екранувати ефект гінкголіда В безпосередньо на PAF рецептор. Тому у наступній серії експериментів ми використали конкурентний антагоніст гліцинових рецепторів стрихнін в концентрації 2 мкМ, в котрій стрихнін не викликає судом чи епілептичної активності (Lopantsev, 1992; Straub et al., 1997), також не здатний блокувати ГАМКА рецептори, як це відомо (ІС₅₀=6.7 мкМ) (Shirasaki et al., 1991). Аплікування стрихніну в такій концентрації не змінювала індукції LTP. Поєднане аплікування стрихніну (2 мкМ) із гінкголідом В (5 мкМ) повторювало ефект, отриманий при аплікації лише гінкголіду В.

Наступним кроком було проведення експерименту із використанням іншого гінкголіду J в концентрації 5 мкМ, в якій він здатний антагонізувати гліцинові рецептори, проте неефективний відносно PAF рецепторів. При аплікації гінкголіду J, в концентрації 5 мкМ, не було виявлено жодних ефектів на індукцію чи подовження процесів LTP. Керуючись висновками, що випливають із даних експериментальних досліджень, можна підсумувати, що припущена нами роль гліцинових рецепторів в індукції LTP не підтвердилася. Не можна безкомпромісно стверджувати відсутність будь-якого опосередкованого впливу гліцинергічної передачі на реакції довготривалої потенціації, проте в умовах, прийнятих в нашій роботі, та із використанням обраного методичного підходу вище прийнята гіпотеза в експериментах не підтвердилася.

Висновки

1. Використовуючи метод “петч-кламп” у конфігурації “ціла клітина” було доведено присутність гліцин-активаних стрихнін-чутливих рецепторів в ізольованих пірамідних нейронах гіпокампу щурів та доповнено відомості щодо раніше відомих фармакологічних властивостей.

2. Відкрито новий клас селективних блокаторів гліцин-керованого хлорного каналу серед гінкголідів (складових екстракту Ginkgo biloba). Активні концентрації гінкголідів як модуляторів визначаються наномолярною та субмікромолярною шкалою. Значення половинної дії (ІС50) складають 1.97; 0.273, 0.267 та 2. мкM для гінголідів А, В, С та J відповідно. Значення коефіцієнта Хіла у всіх випадках було наближено до одиниці, що свідчить про поєднання молекули антагоніста та гліцин-активованого рецептора у стабільному відношенні 1:1.

3. З'ясовано механізм антагоністичної дії гінкголіду В, як представника нового класу блокаторів на гліциновий рецептор. Доведено, що гінкголід В є блокатором гліцин-керованого хлорного каналу із характерною унікальною особливістю діє-залежного ефекту, що пояснює поступовість дії цієї сполуки в залежності від прикладання. Діє-залежність гінкголіда, що в поєднанні із фактом залежності від потенціалу свідчить про приєднання молекули сполуки до певного центру зв'язування всередині канальної пори рецептора та зумовлює її ефективність як канального блокатора. Новий клас канальних блокаторів гліцин-керованого каналу не викликали судом при застосуванні в інтервалі концентрацій 10 нМ- 100 мкМ. Такий ефект можна пояснити їх винятковою здатністю блокувати хлорний канал гліцинового рецептора із властивою тільки цим сполукам діє-залежністю ефекту.

4. Продемонстровано переконливі докази, що гінкголід В не конкурує за центр зв'язування із агоністом гліцином, конкурентним анатагоністом гліцинового рецептора стрихніном та канальним блокатором ліганд-керованих хлорних каналів, зокрема ГАМК-керованих, пікротоксином.

5. На основі експериментальних даних, отриманих в дослідах із нативними гліциновими рецепторами в пірамідних нейронах щурів на стадіях раннього онтогенетичного розвитку та математичних обчислень зроблено припущення про потенційно можливу підвищену чутливість гінкголіда В до рецепторів із субодиничною композицією 3/2, внесок яких зростає у процесі онтогенетичного розвитку та заміщає гомомерні гліцинові рецептори 2 та гліцинові рецептори із складом 1, характерні для раннього онтогенезу.

6. Доведено, що гліцинові рецептори в пірамідних нейронах гіпокампу не мають безпосереднього внеску у події довготривалої потенціації, припущення про можливість якого виникла у зв'язку із двоякою дією гінкголідів на рецептор фактора активації тромбоцитів та гліцинові рецептори в пірамідних нейронах гіпокампу щурів.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. BN52021, a platelet activating factor antagonist is a selective blocker of glycine-gated chloride channel

Kondratskaya E.L., Lishko P.V., Chatterjee S.S., Krishtal O.A. Neurochemistry International, v.40, (7), 647 - 653, 2002. (Здобувачем виконано основну частку електрофізіологічних експериментів. Здобувачем проведено статистичну обробку результатів та самостійно підготовано працю до публікації).

2. Effects of Ginkgo biloba extract constituents on glycine-activated strychnine-sensitive receptors in hippocampal pyramidal neurons of rat. Kondratskaya E.L., Krishtal O.A. Neurophysiology, 34, ст. 172-174, 2002 (Київ). (Здобувачем здійснено всі електрофізіологічні досліди, статистичну обробку результатів, написання та оформлення праці до друку).

3. Залежність блокуючої дії гінкголіда В на гліцинкеровані канали від субодиничного складу рецепторів О.Л. Кондрацька, О.І. Фісюнов, О.О. Кришталь. Доповіді Національної академії наук України, 2003, 3, ст. 179-183. (Здобувачем особисто проведено всі електрофізіологічні ескперименти, проведено статистичну обробку даних, написано та підготовано рукопис до друку).

Тези доповідей:

1. Ginkgolide B is a high potent and selective blocker of glycine-gated chloride channel. Kondratskaya E., Lishko P., Chatterjee S., Krishtal O. IV Конференція Чеського Товариства Нейронаук (Прага, 2001), ст. 69

2. Блокування гліцин-керованих хлорних струмів антагоністом тромбоцит-активуючого фактора BN52021. Кондрацька О., Лішко П., Чаттерджи С, Кришталь О.ІІ Конференція Українського Товариства Нейронаук (Донецьк, 2001), ст.166-167.

3. Effects of Ginkgo biloba extract constituents on glycine-activated strychnine-sensitive receptors in hippocampal pyramidal neurons of rat. Kondratskaya E.L, Krishtal O.A. Міжнародний Літній Симпозіум “Фармакологія синаптичної передачі у нервовій системі” (Київ, 2002), ст. 172-174

4. The possible contribution of ginkgolide B -sensitive glycine receptors in LTP Elena L. Kondratskaya, Yuri V. Pankratov, Ulyana V. Lalo, S. S. Chatterjee, O. A. Krishtal ІІ Богомолець-Ненскі Конференція “Внутрішньоклітинна сигналізація в збудливих клітинах” (Київ, 2002), ст.9.

АНОТАЦІЇ

???????? ?????? ????????? ????????

Кондрацька О.Л. Гліцинові рецептори в пірамідних нейронах гіпокампу щура та механізми їх модуляції гінкголідами.- Рукопис.

Дисертація присвячена дослідженню фармакологічних властивостей нативних гліцин-активованих рецепторів у пірамідних нейронах гіпокампу та з'ясуванню механізмів дії нового класу блокаторів гліцин-керованого хлорного каналу із числа гінкголідів.

З використанням електрофізіологічного методу “петч-кламп” у конфігурації “ціла клітина” виявлено основні механізми взаємодії гінкголідів із гліциновим рецептором та досліджено специфіку їх дії як селективних каналоблокаторів. Було з'ясовано, що гінкголід В, як представник нового класу модуляторів, не конкурує за центр зв'язування із гліцином чи конкурентним антагоністом стрихніном на рецепторному комплексі. Крім того, ефект кожного із гінкголідів мав унікальну особливість діє-залежності, що разом із доведеим фактом потенціалзалежності та ефективності відносно каналу у відкритому стані свідчить про вибіркову дію гінкголіда на канал рецептора.