Гліцинові рецептори в пірамідних нейронах гіпокампу щура та механізми їх модуляції гінкголідами

На підставі даних електрофізіологічного скринінгу складових екстракту Ginkgo biloba висловлено припущення про існування всередині канальної пори гліцинового рецептора специфічного центру, чутливого до гінкголідів як речовин певної хімічної будови. За результатами експериментів, здійснених із використанням обраного методичного підходу та математичних розрахунків, зроблено висновки про можливу специфічність дії нового блокатора гінкголіда В на канал гетеромерного гліцинового рецептора сталого субодиничного складу 2/3. Знайдені нові каналоблокатори можуть у подальшому використовуватися як маркери нативних гліцинових рецепторів, що характерні для нейронів дорослого організму, тобто для гетеромерних гліцинових рецепторів.

Ключові слова: гліциновий рецептор; гліцин-керований канал; гінкголіди (А, В, С та J); пірамідний нейрон; гіпокамп.

Кондрацкая Е.Л. Глициновые рецепторы в пирамидных нейронах гиппокампа крыс и механизмы их модуляции гинкголидами. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена исследованию фармакологических свойств нативних глицин-активируемых рецепторов в пирамидных неройнах гиппокампа крыс и выяснению механизмов действия нового класса блокаторов глицин-управляемого хлорного канала из числа гинкголидов. С использованием электрофизиологического метода “петч-клемп” в конфигурации “целая клетка” выявлены основные характеристики взаимодействия гинкголидов с глициновым рецептором и исследована специфика их действия как селективных каналоблокаторов. На основании данных электрофизиологического скрининга терпеновых составных экстракта Ginkgo biloba высказаны предположения о существовании внутри канальной поры глицинового рецептора специфического центра, чувствительного к гинкголидам, как веществам определенного химического строения.

По результатам экспериментов, осуществленных с использованием избранного методического подхода и математических расчетов, сделаны выводы о возможной специфичности действия нового блокатора гинкголида В на канал гетеромерного глицинового рецептора постоянного субъединичного состава 2/3. Найденные новые каналоблокатори могут в дальнейшем использоваться как маркеры нативних глициновых рецепторов, которые характерны для нейронов взрослого организма, то есть для определения гетеромерных глицинових рецепторов.

Ключевые слова: глициновый рецептор; глицин-управляемый канал; гинкголиды (А, В, С и J); пирамидный нейрон; гиппокамп.

Elena. L. Kondratskaya. Glycine receptors in pyramidal hippocampal neurons of the rat and their modulation by ginkgolides. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The dissertation is devoted to the investigation of pharmacological properties of native glycine receptors in hippocampal pyramidal neurons of rat as well as detection of main mechanisms of action of novel class of glycine-gated channel blockers that belong to ginkgolides.

Using whole-cell patch-clamp technique, the main features of interactions of ginkgolides A, B, C and J with glycine receptors were elucidated. As examined on several other voltage- and ligand-operated channels, the action of ginkgolides is otherwise selective: the substance does not affect GABA-, AMPA- or NMDA-activated responses. The blocking action of all tested ginkgolides is use-dependent: they block open glycine-activated channels. The IC50 values for saturating blocking action of ginkgolides B and C are 0.273 мM and 0.267 мM respectively, while ginkgolides A and J are less effective: the IC50 values are 1.97 мM and 2.0 мM. Corresponding dose-response relationships are close to single-site binding isotherms. On the basis of electrophysiological screening of terpenoid constituents of Ginkgo biloba extract we proposed the existance of a site specifically sensitive to ginkgolides inside a channel pore of the glycine receptor.

We used various chloride channel blockers to get more insight into the mechanism of ginkgolide B blocking action. GABA receptor antagonist picrotoxin is known to block б homomeric glycine receptors, while beeing ineffective for heteromeric б1/ ones. Studying pyramidal hippocampal neurons of rat, it was confirmed that the effect of picrotoxin depends on the age of the animals. Its blocking ability was characterized by IC50=140 M and IC50=354 M for 7- and 14- days old rats respectively indicating at a possibly increased contribution of heteromeric receptors. It was found that the blocking action of ginkgolide B is subjected to a more drastic change in the same range of ages: the IC50 value is decreased from 1.6 M for 7-days old rats to 0.273 M for 14-old rats. When measured on the background of ginkgolide B (1 M), IC50 for picrotoxin was 92 M.

According to experimental results as well as mathematical calculations it is concluded that ginkgolide B primarily affects heteromeric glycine receptors composed of 3/2 subunits. These novel channel blocker can be utilized as marker of native heteromeric glycine receptors that are mainly expressed in adult neurons. Moreover, ginkgolides in contrast to another known glycine-gated channel blockers (strychnine or picrotoxin) do not induce seizures in explotable concentrations (10nM-100M), perhaps, owing to their exclusively use-dependent mode of action. Concequently, the neuromodulatory action of whole Ginkgo biloba extract may be conditioned by its major constituents, such as ginkgolides A, B, C and J via producing a novel action on glycine-gated chloride channels.

Platelet-activating factor (PAF), a biologically active lipid (1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphoholine), is identified in different regions of brain, including hippocampus. Specific PAF-activated receptors (PAFRs) are expressed in corresponding brain areas. PAF has been proposed to be a retrograde messenger of long-term potentiation (LTP): the antagonist of PAFRs, ginkgolide B (or BN52021) prevents induction of LTP. It was found that ginkgolide B is also an efficient blocker of the glycine receptor (GlyR) operated chloride channels (IC50=273 10 nM in hippocampal pyramidal neurons). The question is as follows: is the alteration of LTP by BN52021 due to the PAF antagonism or to the inhibition of the glycine-gated chloride channels? We have studied the effects of ginkgolides B and J on LTP induced in the CA1 area of rat hippocampus. Ginkgolide J which is the weakest blocker of PAFR (IC50=54 M, as compared to IC50=2.5 M for ginkgolide B) inhibits GlyR-operated channels with IC50=2.0 M. This assures a convenient concentration window allowing the inhibition of GlyR-operated channels without affecting PAFRs. 5 M of ginkgolide J did not prevent the induction of LTP, while ginkgolide B (5 M) completely inhibited this phenomenon. The effect of ginkgolide B on LTP did not alter considerably if GlyRs were blocked by strychnine (2 M). Strychnine itself had no significant effect on induction of LTP. Both ginkgolides and strychnine significantly facilitated short-term potentiation (STP). Our data supports the hypothesis of the action of ginkgolides on LTP through inhibition of PAFRs.

Key words: glycine receptor; glycine-gated channel; ginkgolides (A, B, C, J); pyramidal neuron; hippocampus.

Размещено на Allbest.ru