Особливості організації і функціонування сигнальних мереж в нормальних та пухлинних клітинах

Для з'ясування особливостей функціонування сигнальних мереж, з точки зору ефективності внутрішньоклітинного перетворення регуляторного сигналу, можна використати тестування ряду внутрішньоклітинних параметрів після взаємодії ПФР з клітиною-мішенню. За умов in vivo до цих параметрів відноситься в першу чергу індекс мічення клітин [³H]-тимідином. Включення [³H]-тимідину в ДНК зародкових клітин вивчали протягом 9-15 год розвитку.

Рівень включення [³H]-тимідину в ДНК значно в ідрізняється на досліджуваних етапах ембріогенезу, динаміка цього процесу володіє коливальним характером. Найбільш високий рівень включення [³H]-тимідину спостерігається на 12 год розвитку, в той час як значне зниження індексу мічення - на 10 год розвитку. Виявлені зміни свідчать про стадієспецифічну регуляцію синтезу ДНК, а, отже, і мітотичну активність клітин в ранньому ембріогенезі. Зниження синтезу ДНК співпадає з двома основними морфогенетичними подіями, які відбуваються протягом гаструляції і на початку нейруляції - індукцією мезодерми (10 год розвитку) і нейроектодерми (13 год розвитку). Встановлено (рис. 2, б), що інсулін (10^-6М) і EGF (10^-9М) пригнічують включення міченого тимідину в ДНК на стадіях, що характеризуються відносно високою мітотичною активністю клітин зародків в'юна (85 і 70% від контролю, відповідно, на 12 год розвитку). В періоди з відносно низьким мітотичним індексом інсулін і EGF, навпаки, посилюють цей процес: 136%, 185% (при дії інсуліну) та 110%, 118% (при дії EGF) порівняно з контролем на 11 і 13 год розвитку, відповідно). Необхідно зазначити, що вплив інсуліну і EGF як на стимуляцію, так і пригнічення включення [³H]-тимідину в ДНК бластодерм виявився дозозалежним. Отримані експериментальні дані дозволили висунути гіпотезу про здатність ПФР як стимулювати проліферацію різних типів клітин, так і пригнічувати сигнальні процеси, залежні від цих регуляторних сполук, в стимульованих клітинах. Виявлені ріст-регулюючі ефекти досліджуваних ПФР свідчать, що вже на ранніх стадіях ембріогенезу експресуються всі сигнальні ланки, необхідні для спряження і переносу регуляторного сигналу в ядро, а інсуліно- і EGF-подібні речовини володіють функціональною значимістю в регуляторних процесах, які відбуваються на ранніх етапах розвитку костистої риби в'юна.

Одним із основних способів перетворення та внутрішньоклітинного проведення регуляторних сигналів є каскадні процеси фосфорилювання-дефосфорилювання клітинних білків, які визначають ключові параметри функціонування сигнальних мереж. Для з'ясування конкретних механізмів, які забезпечують залучення фосфорильованих по тирозину білків у процеси росту і трансформації клітин, було отримано поліклональні афінно очищені pTyr-специфічні антитіла. Спектри pTyr-вмісних білків у бластодермах, а також їх зміни під впливом інсуліну вивчали в динаміці протягом 9-15 год розвитку. Результати імуноблотингу білків бластодерм (рис. 3, а, б) свідчать про високий рівень фосфорилювання по залишках Tyr клітинних білків з мол. масами 105, 90, 66, 34, 30, 24 і 18 кДа. Ступінь модифікації вказаних білків є стадієспецифічним. Так, найбільш високий рівень pTyr-специфічного фосфорилювання білків з мол. масами 105, 90, 66, 30 і 24 кДа спостерігається на 9, 11 і 12 год розвитку, а білка з мол. масою 18 кДа - на 10, 13, 14 і 15 год, зі значним зниженням в останні досліджувані періоди. Смуги з мол. масами 42 і 53 кДа є більш вираженими на 10 і 14 год ембріогенезу. Цікаво, що зниження рівня фосфорилювання по Tyr білків з мол. масами 105, 90, 66, 30 і 24 кДа корелює з індукцією мезодерми і нейроектодерми на 10 і 13 год розвитку, відповідно, в той час як ступінь модифікації білка р18 в ці періоди є більш високим.

Показано, що обробка бластодерм інсуліном (10^-6М) призводить до значного пригнічення Tyr-специфічного фосфорилювання і/або посилення дефосфорилювання р105, р90, р66, р30, і р24 протягом всього досліджуваного періоду розвитку. Як видно з рис. 3, в, г, регуляторний вплив фактора росту на модифікацію р18 залежить від ступеня його базального фосфорилювання: зниження фосфорилювання спостерігається на стадіях з більш високим рівнем експресії (11, 14 і 15 год розвитку) і, навпаки, посилення фосфорилювання - на стадіях з відносно низьким рівнем експресії. Виключенням є 15 год розвитку, протягом якої ступінь модифікації р18 під впливом інсуліну залишається без видимих змін. При обговоренні змін в спектрах pTyr-вмісних білків в бластодермах в'юна, оброблених інсуліном, особливу увагу привертає також факт посилення фосфорилювання білків з мол. масами 34 і 42 кДа. При цьому, найбільш виражений ефект спостерігається на 9, 11, 12 і 15 год розвитку.

Однією з найбільш гнучких та універсальних систем генерації вторинних посередників, яка може прямо чи опосередковано бути задіяною до контролю організації і функціонування сигнальних мереж клітин, є інозитліпідна сигнальна система (Ullrich & Schlessinger, 1991). Дослідження метаболізму поліфосфоінозитидів (ПФІ) у плазматичних мембранах зародкових клітин продемонструвало, що вже на ранніх етапах розвитку в'юна експресуються основні сигнальні ензими, які каталізують їх синтез та розпад (Дробот і ін., 1991). Встановлено, що метаболічні ланки обміну ПФІ є чутливими до дії інсуліну і гуанілових нуклеотидів (Дробот і ін., 1991). Тому метою наступного етапу роботи було з'ясувати, чи реалізується регуляторний вплив інсуліну на активність РІ-кіназ за умов in vivo та дослідити їх динаміку в ранньому ембріогенезі. Як динаміка активностей РІ-3- та РІ-4-кіназ протягом 9-13 год розвитку, так і скерованість регуляторного впливу інсуліну на рівень активностей досліджуваних ензимів близько корелюють з даними по включенню міченого тимідину в ДНК. Так, максимальна активність РІ-3- та РІ-4-кіназ виявляляється на 11 і 12 год розвитку, в той час як мінімальна активність - на 10 та 13 год розвитку. Максимальний стимулюючий ефект інсуліну вдалось зафіксувати на 10 год розвитку (на 31 та 19% порівняно з контролем для РІ-3- та РІ-4-кіназ, відповідно), а максимальне пригнічення - на 12 год розвитку (на 35 і 40% порівняно з контролем для РІ-3- та РІ-4-кіназ, відповідно). Як стимулюючий (10 год розвитку), так і інгібуючий (12 год розвитку) ефекти інсуліну на рівень активностей РІ-3- та РІ-4-кіназ виявились дозозалежними (рис. 4, в, г). Встановлено також, що в очищених препаратах плазматичних мембран інсулін, як і за умов in vivo, на 10 год розвитку стимулює активність РІ-3-кінази на 40% порівняно з контролем (рис. 4, д). За присутності GTPгS спостерігається зниження рівня активності ензиму до 82% від контрольних значень. Інкубація мембран одночасно з інсуліном та GTPгS супроводжується наступним зниженням рівня активності РІ-3-кінази до 68%. Це дозволяє припустити, що GTPгS може потенціювати вплив інсуліну на пригнічення активності ферменту. В той же час, перемикання сигнальних шляхів регуляції активності ліпідкінази зі стимуляції на пригнічення може пояснюватись утворенням за присутності GTPгS стабільної активної форми G-білка з високою афінністю до ефекторної ланки. Одночасно, на 10 год за присутності GTPгS спостерігається не тільки підвищення рівня активності РІ-4-кінази (125% порівняно з контролем), але і потенціювання стимулюючого ефекту інсуліну (115% та 185%, відповідно).Потенціювання GTPгS регуляторного впливу інсуліну на активність РІ-3-кінази виявлено також на 12 год розвитку. При обробці плазматичних мембран інсуліном спостерігається зниження активності ензиму на 50%, в той час як за присутності інсуліну і GTPгS цей рівень падає до 36% порівняно з контролем Змін в активності РІ-4-кінази під впливом інсуліну і GTPгS на 12 год розвитку виявити не вдалось.

Проведені дослідження дозволяють припустити існування складної сітки регуляторних взаємозв'язків рецептора інсуліну з інозитліпідною сигнальною системою в клітинах ранніх зародків в'юна і зробити наступні важливі висновки: 1) ферменти синтезу інозитвмісних ліпідів, РІ-3- та РІ-4-кінази, є важливими ланками сигнальних мереж, залучених до регуляції процесів проліферації і диференціації в ранньому ембріогенезі в'юна; 2) G-білки є залучені до стимулювання активності РІ-4-кінази і негативного регулювання РІ-3-кінази в бластодермах ранніх ембріонів в'юна; 3) особливості функціонального спряження рецепторних тирозинових протеїнкіназ з ефекторними білками-субстратами забезпечують скерованість дії регуляторних факторів і можуть виступати в ролі пускового механізму, який визначає кінцеву фізіологічну відповідь клітин.

Активація трансляції є необхідною метаболічною подією відповіді клітин на мітогенні стимули, індуктори диференціації і апоптозу. Ще у 80-х роках було показано, що процес ініціації трансляції, як одна з основних регуляторних ланок білкового синтезу, регулюється фосфорилюванням-дефосфорилюванням ключових компонентів апарату трансляції (Duncan & McConkey, 1982; Traugh et al., 1983). Одним з цих компонентів є білок S6 40S субчастинки рибосом, фосфорилювання якого зростає у відповідь на дію позаклітинних сигналів (Trevillyan et al., 1984; Blenis & Erikson, 1984; Maller et al., 1985). Як субстрат для виявлення і наступної характеристики S6-кіназної активності в цитозолі зародків в'юна використано 40S субчастинки рибосом, в яких білок S6 знаходиться в нативному оточенні. Виявлено, що в цитозолі бластодерм в'юна S6-кіназна активність є достатньо високою і складає 0,33 пмоль Р_н · хв^-1 · мг^-. Обробка зародків протягом 30 хв EGF в концентрації 10 нг/мл супроводжується підвищенням S6-кіназної активності цитозолю на 25%.

Відомо, що S6-кінази з різних джерел, які стимулюються мітогенами, фосфорилюють білок S6 по 5 центрах як за умов in vivo (Thomas et al., 1982; Oliver et al., 1988), так і in vitro (Matsuda et al., 1989). Для з'ясування залежності між рівнем стимуляції S6-кіназної активності EGF в бластодермах за умов in vivo і характером модифікації білка S6 ми провели розділення білків 40S субчастинок рибосом після кіназної реакції методом двовимірного електрофорезу, який дозволяє виявляти форми білка S6 різного ступеня модифікації. З видно, що S6-кіназа/кінази з контрольних і оброблених EGF (20 нг/мл, 30 хв) бластодерм каталізує включення 4-5 залишків фосфату в екзогенний білок S6. При цьому, ефект стимулюючого агента знаходить відображення не в зміні специфічності модифікації субстрату по різних центрах, а лише в кількісному вираженні ферментативної активності.

З метою з'ясування ролі S6-кінази, що стимулюється EGF, в регуляції сигнальних мереж клітин ранніх зародків в'юна нами було отримано частково очищений препарат досліджуваного ферменту. На першому етапі очистку S6-кінази проводили іонообмінною хроматографією на DEAE-целюлозі в градієнті концентрації NaCI. Згідно з отриманими даними в цитозолі зародків в'юна після хроматографічного розділення виявляються 3 фракції, що мають здатність фосфорилювати білок S6. Ці фракції елююються послідовно 10 мкМ сАМР в стартовому буфері (фракція 1), 0,12-0,18 M NaCI (фракція 2) і 0,25-0,30 M NaCI (фракція 3). Після обробки бластодерм зародків в'юна EGF в концентрації 20 нг/мл протягом 30 хв S6-кіназна активність фракції 1 зменшується в 2 рази, фракції 2 зростає в 4 рази і практично не змінюється у фракції 3. На наступному етапі очистки з метою визначення молекулярної маси S6-кінази, що стимулюється EGF, нами було здійснено гель-проникаючу хроматографію на сефадексі G-150 фракції 2. Згідно з профілем елюції уявна молекулярна маса досліджуваного ензиму складає біля 70 кДа, що узгоджується з даними літератури.

Встановлено, що як і у випадку вивчення інших сигнальних процесів в клітинах зародків в'юна (Tyr-специфічне фосфорилювання, активність РІ-3- і РІ-4-кіназ), S6-кіназна активність осцилює протягом досліджуваного періоду розвитку, в той час як фазові зміни активності під впливом EGF володіють антибатним характером. Так, максимальна активність виявляється на 10 год розвитку з наступним підйомом на 13 год, а мінімальна - на 9 і 12 год розвитку. Максимальний рівень S6-кіназної активності та здатність EGF інгібувати відповідний сигнальний шлях співпадають з індукцією мезодерми (10 год розвитку) і нейроектодерми (12 год розвитку) і корелюють із зниженням включення тимідину в ДНК.

Результати проведених досліджень свідчать, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі є їх системний коливний (осциляторний) характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних ПФР залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних бластодермах (від пригнічення їхньої активності при високому рівні в контролі і, навпаки, до стимуляції - при низькому рівні в контролі).

Закономірності регулювання сигнальних механізмів у клітинах еритролейкемії людини лінії К562 при індукції процесів диференціації і апоптозу. На наступному етапі для з'ясування молекулярних механізмів, які лежать в основі осциляцій сигнальних процесів в клітинах та впливу на них позаклітинних регуляторних сполук, було обрано таку модель, як клітини еритролейкемії людини лінії К562 з високим рівнем експресії химерного онкобілка р210Bcr-Abl (Anderson, 1979). Вважається, що конститутивна тирозинкіназна активність р210Bcr-Abl є фактором, що визначає високий проліферативний потенціал клітин К562 і підтримує їх на стадії бласту. В той же час, клітини К562 зберегли здатність до диференціації під впливом індукторів різної хімічної природи та скерованості дії в обхід генетичних змін, що викликали їхню трансформацію (Tabillo et al., 1983).

Встановлено, що нагромадження бензидин-позитивних клітин та клітин з морфологією промегакаріоцитів і мегакаріоцитів залежить від дози індукторів диференціації, гербіміцину А та РМА, та часу інкубації з ними. Враховуючи отримані дані, в усіх наступних експериментах були використані концентрації індукторів, які забезпечували на 4-у добу півмаксимальне нагромадження диференційованих клітин: 4·10^-8 М - для гербіміцину А і 1,6·10^-8М - для РМА. Згідно з отриманими даними, вже через 3 доби після обробки антибіотиком кількість бензидин-позитивних клітин досягає максимуму (52+8,3%), що складає приблизно половину клітинної популяції, в той час як рівень РМА-індукованої мегакаріоцитної диференціації досягає на цей же момент близько 66% (за даними цитоморфологічних досліджень). Культивування клітин К562 протягом 4-х діб за присутності індукторів диференціації супроводжується вже на 24-у год 33% і 42% пригніченням клітинного росту порівняно з контролем, яке досягає на 96 год 57% і 74% для гербіміцину А і РМА, відповідно. Виявилось також, що культивування клітин з гербіміцином А призводить до загибелі на 72-у год 22-25% клітинної популяції, в той час як в контролі спостерігається загибель лише 5-6% клітин. Слід відмітити, що відносна кількість живих клітин в культурі, індукованій РМА, практично не відрізняється від цього показника в контрольних клітинах і залишається на такому ж рівні протягом всього часу культивування. Загибель частини клітин за механізмом апоптозу в культурі гербіміцин А-індукованих клітин було підтверджено аналізом фрагментації ДНК при електрофорезі в агарозному гелі. Нагромадження моно- і олігонуклеосомних фрагментів ДНК в індукованих клітинах вдалось зафіксувати лише на 48 год культивування з наступним збільшенням їх кількості на 72 год Ці факти, дозволяють зробити висновок, що гербіміцин А володіє здатністю спрямовувати клітини К562 щонайменше по двох напрямках - диференціації по еритроїдному ряду або по шляху апоптозу. Останній процес є своєрідною функціональною атрофією частини клітинної популяції, нездатної переходити в диференційований стан. Як видно в, обробка клітин К562 РМА не супроводжується індукцією апоптозу, що корелює з даними цитоморфологічних досліджень.

Наявні експериментальні дані переконливо свідчать, що за участю p210Bcr-Abl в гемопоетичних клітинах активується як Ras-залежний (Mandanas et al., 1993; Pendergast et al., 1993; Puil et al., 1994), так і РІ-3-кіназний сигнальні шляхи (Varticovski et al., 1991; Skorski et al., 1995), однак особливості їх регуляції при індукції диференціації лейкемічних клітин в культурі є нез'ясованими.

Імуноблотингом з використанням анти-с-Abl антитіл встановлено, що при обробці клітин гербіміцином А рівень експресії р210Bcr-Abl незначно знижується вже на 3-ю год інкубації і в подальшому не зазнає значних змін. Аналіз автокіназної активності p210Bcr-Abl в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин К562 показав, що зміни в рівні фосфорилювання p210Bcr-Abl носять коливний характер як в контрольних, так і стимульованих клітинах. Рівень фосфорилювання p210Bcr-Abl в клітинах, які культивувались за присутності антибіотика, зростає на 3-ю год і протягом наступних досліджених періодів часу є нижчим порівняно з контролем. В той же час, характер динаміки фосфорилювання p210Bcr-Abl є подібним в інтактних і індукованих клітинах, починаючи з 12 год культивування.

Фосфорилювання p210Bcr-Abl і ефекторних білків по тирозину є необхідною молекулярною передумовою для активації Bcr-Abl-залежних сигнальних мереж, залучених до регуляції росту, диференціації та апоптозу Ph¹-позитивних клітин (Lugo et al., 1990). Встановлено, що, попри експресію в клітинах дерегульованої тирозинової протеїнкінази р210Bcr-Abl, фосфорилювання низки специфічних білків по залишках тирозину не підтримується на постійному конститутивному рівні, а залежить від фази росту клітинної культури. Згідно даних літератури і значень M_r, а також результатів попередніх імуноблот-аналізів з використанням специфічних антитіл, pY-вмісні білки, ідентифіковані в лізатах клітин К562, відповідають Bcr-Abl (pp210), c-Bcr (pp160), с-Abl (pp140), c-Cbl (pp120), ізоформам адаптерного білка Shc (pp52 і рр46) та CrkL (pp39). Модифікація білків з M_r 210, 160, 140, 116 і 42 кДа протягом перших 24 год культивування характеризується хвилеподібною динамікою і практично пригнічується на 2-3 добу. Обробка клітин інгібітором тирозинових протеїнкіназ призводить на 3 год культивування до значного посилення фосфорилювання вказаних білків (рис. 9, а), що корелює з підвищенням автокіназної активності. Існує також залежність рівня їхнього фосфорилювання в клітинах, що диференціюються, від відповідних показників в інтактних клітинах (посилення фосфорилювання у випадку більш низького рівня модифікації в контролі і, навпаки). Таким чином, результати дослідження динаміки автокіназної активності і анти-pTyr імуноблотингу не дозволяють однозначно інтерпретувати ефекти гербіміцину А в клітинах К562 як результат прямого впливу антибіотика на тирозинкіназну активність химерного онкобілка. Цей вплив, найбільш імовірно, може бути пов'язаний з порушенням білок-білкових взаємодій в Bcr-Abl-залежних сигнальних комплексах за рахунок здатності гербіміцину А реагувати з сульфгідрильними групами білків (Makishima et al., 1995).

Використання прямого методу вимірювання співвідношення GTP/GDP в анти-Ras імунопреципітатах клітин, попередньо інкубованих за присутності Н₃³²РО₄, дозволило показати, що посилення фосфорилювання p210Bcr-Abl і ряду специфічних білків в клітинах К562 на 3 год культивування з гербіміцином А узгоджується зі змінами функціональної активності низькомолекулярної високоафінної GTPази, р21Ras. З діаграми видно, що кількість GTP, асоційованого з р21Ras, в контрольних клітинах протягом 3-х діб культивування коливається в межах від 27% до 37%. Отримані цифри відображають відносно високий вміст активної форми р21Ras в Bcr-Abl-трансформованих клітинах, ріст яких підтримується присутністю сироватки (Mandanas et al., 1993; Cortez et al., 1996). Встановлено, що гербіміцин А вже на 3-ю год викликає зростання співвідношення GTP/GDP на 15% порівняно з контролем (28,4% в контролі і 43,6% за присутності антибіотика, В наступні часові періоди цей показник падає, однак навіть на 3-ю добу не досягає контрольних значень (27% в контролі і 31,5% за присутності антибіотика). Анти-Erk імуноблотингом показано, що тимчасова активація p21Ras на 3-ю год культивування клітин К562 за присутності гербіміцину А корелює з активацією ключової ланки Ras-залежного сигнального каскаду, Erk-кінази. Про активацію Erk судили по зростанню кількості фосфорильованої форми фермента, яка мігрує більш повільно при електрофорезі в SDS-ПААГ.

Зміни у взаємодіях одного з активаторів Ras-залежного сигнального каскаду, адаптерного білка Grb2, з pY-вмісними білками лізатів контрольних і гербіміцин А-індукованих клітин аналізували in vitro, використовуючи рекомбінантну GST-кон'юговану форму Grb2. Показано, що основними pY-вмісними білками, які зв'язуються з GST-Grb2 в лізатах контрольних і індукованих клітин К562 в процесі їхнього культивування є білки з мол. масами 52, 66, 74, 116, 140, 160 і 210 кДа. Рівень зв'язування вказаних фосфобілків протягом перших 24 год культивування досить близько корелює з динамікою фосфотирозин-специфічного фосфорилювання клітинних білків: зниження зв'язування спостерігається на 12-у год в лізатах контрольних клітин та на 6-у і 24-у год в лізатах гербіміцин А-індукованих клітин. При цьому максимум зв'язування в контрольних клітинах відповідає мінімальному рівню білок-білкової взаємодії в клітинах, що диференціюються, і, навпаки. Одночасно, результати по зв'язуванню з GST-Grb2 in vitro на 48-у і 72 год культивування різко контрастують із даними анти-pY-імуноблотингу загальних клітинних лізатів: зниження рівня фосфорилювання ряду специфічних білків клітин К562 співпадає з драматичним зростанням їхньої афінності до рекомбінантного білка. Не виключено, що виявлене посилення взаємодії може бути результатом прямого і опосередкованого кооперативного зв'язування за участю як SH2, так і SH3 доменів Grb2 і визначатися фізіологічними потребами клітин. Беручи до уваги дані літератури, що множинні Grb2-комплекси опосередковують активацію Ras-залежного сигналювання в гемопоетичних клітинах (Puil et al., 1994), проаналізувано динаміку зв'язування стиковочного білка Shc з GST-Grb2 в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин К562. За результатами анти-Shc імуноблотингу зв'язування білка Shc з GST-Grb2 в лізатах контрольних клітин володіє фазним характером. Максимальне зв'язування спостерігається на 12-у і 48-у год культивування клітин. Обробка клітин гербіміцином А супроводжується значним пригніченням білок-білкової взаємодії у всі досліджувані періоди часу з максимумом на 24 год. Період максимального зв'язування Shc в індукованих клітинах відповідає мінімуму зв'язування в контролі. Звертає на себе увагу також факт посилення зв'язування Shc в лізатах контрольних клітин на 48 і 72 год культивування, в той час як в індукованих клітинах взаємодія Shc-Grb2 в цей період взагалі не виявляється. Обробка клітин К562 РМА призводить на 3-ю год до посилення асоціації досліджуваних адаптерних білків з наступним поступовим зниженням рівня зв'язування до 72-ої год культивування, що значно відрізняється за динамікою від клітин, індукованих гербіміцином А. Результати проведених досліджень дозволяють зробити важливий висновок, що зниження здатності Shc утворювати комплекс з GST-Grb2 корелює з нагромадженням диференційованих клітин при індукції як еритроїдної, так і мегакаріоцитної диференціації клітин К562. Таким чином, розробка препаратів, здатних інгібувати взаємодію Grb2-Shc в клітинах хронічної мієлоїдної лейкемії може стати одним із перспективних методів лікування даного захворювання.

Встановлено, що рівень експресії регуляторної р85 субодиниці РІ-3-кінази залишається незмінним протягом досліджуваного періоду часу як в інтактних, так і в гербіміцин А- та РМА-індукованих клітинах. За результатами проведених досліджень РІ-3-кіназна активність, як і інші досліджені сигнальні процеси в клітинах К562, осцилює залежно від фази росту клітинної культури. Піки активності в контрольних клітинах спостерігались на 3-ю і 48-у год, в той час як мінімальна активність виявлялась на 12-у і 72-у год культивування. Обробка клітин гербіміцином А призводить на 3-ю год індукції еритроїдної диференціації практично до повного інгібування активності РІ-3кінази (на 96% порівняно з контролем) з одночасною, як було показано раніше, активацією Ras-залежного сигналювання. Протягом 6-ої - 24-ої год культивування РІ-3-кіназна активність в індукованих клітинах перевищувала контрольні значення з наступним значним зниженням, як і в контролі, на 72 год. Загальний характер динаміки активності РІ-3-кінази при індукції мегакаріоцитної диференціації є подібним до динаміки активності цього фермента в клітинах, оброблених гербіміцином А до 48 год культивування. При цьому слід відмітити, що кінцева відповідь при сигналюванні через РІ-3-кіназу на пізних етапах (72-а год) індукції еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації суттєво відрізняється: інгібування ліпідкіназної активності спостерігається під впливом гербіміцину А і, навпаки, стимуляція - при дії РМА. Отримані дані дозволяють зробити висновок про різну регуляторну значимість фосфоінозитидів, фосфорильованих в 3'-положенні кільця інозиту, в реалізації біологічних ефектів гербіміцину А та РМА в клітинах К562.

З метою з'ясування особливостей регуляції активності РІ-3-кінази в інтактних клітинах К562 і під впливом індукторів диференціації та апоптозу порівнювали динаміку білок-білкових взаємодій, опосередкованих повнорозмірною формою регуляторної р85 субодиниці фермента та її SH3 доменом, з динамікою активності РІ-3-кінази. Встановлено, що основними pY-вмісними білками лізатів клітин К562, які взаємодіють in vitro з GST-р85б/full та GST-р85б/SH3, є білки з M_r 210, 160, 140, 120, 85, 66, 52, 46 і 39 кДа. Зв'язування ідентифікованих білків в лізатах інтактних клітин характеризується вираженою хвилеподібною динамікою, в той час як зміни в рівні білок-білкової взаємодії в лізатах індукованих клітин носять координований характер порівняно з контрольними показниками. Суттєве зниження активності РІ-3-кінази на 3-ю год інкубації за присутності гербіміцину А пов'язане з низьким рівнем зв'язування практично всіх ідентифікованих фосфотирозинвмісних білків. Важливо також зауважити, що в гербіміцин А-індукованих клітинах зв'язування р120 як з SH3 доменом регуляторної субодиниці РІ-3-кінази, так і з її повнорозмірною формою негативно корелює з динамікою активності фермента. В інтактних клітинах негативної кореляції між цими показниками не спостерігається. Одночасно, максимуми активності РІ-3-кінази в контрольних (на 3-ю і 48-у год культивування) та індукованих клітинах (на 6-у та 24-у год культивування) співпадають із підвищенням рівня зв'язування білків р66 і р52. Результати проведених досліджень дозволяють припустити, що білок p120 (c-Cbl за даними імуноблотингу) при асоціації з р85 може функціонувати як негативний регулятор каталітичної активності ензиму в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин К562. Вартим уваги є факт, що в гербіміцин А-стимульованих клітинах відсутня кореляція між змінами активності РІ-3-кінази і рівнем зв'язуванням білка р46Shc з р85, в той час як в інтактних клітинах встановлена відповідність добре прослідковується. Рівень зв'язування вказаних білків in vivo обернено корелює з рівнем тирозин-специфічного фосфорилювання Shc, який виявляється в GST-р85б/SH3 преципітатах та рівнем зв'язування Shc, який детектується в GST-Grb2 преципітатах.

Результати наших експериментів корелюють з даними інших дослідників, згідно яких SH3 домен р85 взаємодіє з N-кінцевою Pro-багатою ділянкою Shc, який фосфорилюється по залишках тирозину та опосередковує конститутивну взаємодію з продуктом протонкогену c-Cbl (Harrison-Findik et al., 1995). Вказана взаємодія є однією з ланок сигнальних мереж, на рівні яких контролюється активність РІ-3-кінази в Bcr-Abl-трансформованих клітинах. Не виключено, що рівень модифікації Shc є одним із регуляторних чинників, які впливають на стехіометрію білок-білкової взаємодії з іншими адаптерними білками (Grb2, p85б) та на специфічність і скерованість сигналювання через вказані надмолекулярні комплекси.

Результати експериментів по зв'язуванню in vitro білків клітинних лізатів з GST-кон'югованими формами р85б в процесі мегакаріоцитної диференціації клітин К562 стали ще одним яскравим свідченням на користь існування осциляцій в рівні зв'язування специфічних мішеней із адаптерними білками та скерованості впливу позаклітинних регуляторних сполук на формування таких надмолекулярних комплексів залежно від показників в контролі. Встановлено, що максимальному зв'язуванню в контролі на 12-у год відповідає мінімальне зв'язування більшості білків в РМА-стимульованих клітинах, і, навпаки, на 48-у год при мінімальному зв'язуванні в контролі спостерігається максимальне зв'язування під впливом РМА. На 3-ю добу відмічається практично повне інгібування взаємодії pY-вмісних білків з повнорозмірною формою р85б як в контролі, так і в досліді. В клітинах К562, що диференціюються по мегакаріоцитному шляху, виявляється обернена залежність між ліпідкіназною активністю РІ-3-кінази та зв'язуванням білків р210Bcr-Abl, р140c-Abl і р120c-Cbl з повнорозмірною формою р85, чого не спостерігається в інтактних клітинах. Очевидно, відновлення негативного контролю вищевказаних білків на активність РІ-3-кінази є важливим регуляторним моментом в контролі сигнальних шляхів клітин, що стали на шлях диференціації.

Отримані дані дозволяють запропонувати гіпотезу, згідно якої диференційна координована регуляція Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигнальних шляхів можезабезпечувати як стимуляцію мітогенезу і інгібування апоптозу, так і індукцію диференціації в одному і тому ж типі Bcr-Abl-трансформованих клітин. Можна припустити, що клітини вибирають між проліферацією і диференціацією завдяки різниці в тривалості та періодичності активації Ras/Erk і РІ-3-кінази, в основі чого лежать різноскеровані системні зміни на рівні взаємодії специфічних адаптерів із своїми ефекторними мішенями. Таким чином, існує ймовірність, що індуктори диференціації можуть не просто десенситизувати функції Ras і РІ-3кінази на ранніх стадіях відповіді лейкемічних клітин, а швидше всього здатні переключати Ras-залежне РІ-3-кіназне сигналювання на альтернативний шлях.

Закономірності регулювання сигнальних механізмів клітин за участю адаптерного білка Ruk. Як зазначалось в попередніх розділах, провідну роль в організації та регулюванні сигнальних мереж клітин відіграють адаптерні/”риштувальні” білки, характерною особливістю будови яких є наявність множинних доменів та мотивів, залучених до міжмолекулярної взаємодії, зокрема SH2, SH3, РТВ, РН доменів та інших (Pawson & Nash, 2003). З клонуванням у 2000 році SH3-вмісного адаптерного білка Ruk було започатковано новий напрямок досліджень в галузі клітинного сигналювання (Gout et al., 2000). Нагромаджені на сьогодні експериментальні дані дозволяють вважати Ruk представником окремої родини SH3-вмісних адаптерних білків (Dikic, 2002), які виконують інтегруючу роль в регуляції архітектури актинового цитоскелету і адгезії клітин (Hutchings et al., 2003; Schmidt et al., 2003; Tibaldi & Reinherz, 2003), апоптозу (Gout et al., 2000; Chen et al., 2000; Schiffer et al., 2004), мітогенному сигналюванні (Petrelli et al., 2002; Soubeyran et al., 2002), ліганд-опосередкованому ендоцитозі рецепторних тирозинових протеїнкіназ (Petrelli et al., 2002; Soubeyran et al., 2002; Szymkiewicz et al., 2002 Особливості структурно-функціональної організації Ruk_l (наявність трьох SH3 доменів, пролін- та серин-багатих повторів, суперспіралізованої С-кінцевої ділянки) (Gout et al., 2000) свідчать, що вказаний білок може взаємодіяти з молекулами різної хімічної природи, залученими до сигнальної трансдукції Вшлшсб 2002).

Для подальшого розгортання досліджень у вказаному напрямку були отримані поліклональні та моноклональні антитіла проти С-кінцевого суперспіралізованого району та N-кінцевого SH3A домену, відповідно, Ruk_l. Використання вказаних антитіл дозволило показати, що профілі експресії ізоформ Ruk та його ортолога у людини, білка CIN85, їхня субклітинна локалізація та здатність до олігомеризації є специфічними для кожної з досліджених ліній клітин (NIH3T3, Cos1, L1210, HEK293, Ramos, HeLa S3, MDCK, C6, A549, U937) (Дробот І ін., 2005). Очевидно, виявлені зокономірності відображають різну біологічну роль ізоформ Ruk/CIN85 в клітинах різного видового та тканевого походження.

З метою пошуку білків, які взаємодіють із Pro-багатими мотивами Ruk, була використана панель GST-SH3 доменів для преципітації рекомбінантного білка Ruk_l, який експресували в бакуловірусній системі. Як видно Ruk_l взаємодіє in vitro з низкою SH3 доменів, але найбільш ефективно з SH3 доменом р85б регуляторної субодиниці РІ-3-кінази та N-кінцевим SH3 доменом адаптерного білка Grb2. Значно слабше, але досить чітке зв'язування спостерігалось з SH3 доменами адаптерного білка Crk і цитоплазматичних тирозинових протеїнкіназ Src і Fyn. Встановлено також, що Ruk_l утворює стабільний комплекс з р85б при співекспресії в клітинах комах, в той час як експресія делеційного ?SH3 мутанту повністю усуває виявлену взаємодію. Натомість, делеція ВН домену р85б (включно з Pro-багатими ділянками) не впливає на формування надбілкового комплексу. Отримані результати свідчать про те, що саме SH3 домен р85б і Pro-багата ділянка Ruk_l відповідають за взаємодію досліджуваних сигнальних білків in vivo. З іншого боку, експерименти по зв'язуванню in vitro GST-кон'югованих фрагментів Ruk з р85б, яку експресували в клітинах НЕК293, виявили здатність SH3А і SH3В доменів адаптерного білка взаємодіяти з Pro-багатими ділянками регуляторної субодиниці РІ-3-кінази. Як видно в, ця взаємодія потенціюється при використанні, як байту, GST-3SH3. Таким чином, міжмолекулярна взаємодія Ruk і р85б носить складний комплексний характер і відбувається за участю різних доменів і мотивів Ruk, які опосередковують гетеромеризацію двох білків.

На наступному етапі було проаналізовано вплив вказаної міжбілкової взаємодії на ліпідкіназну активність холоферменту з використанням афінно очищених препаратів Ruk_l Glu-tagged та р85б-р110б з лізатів клітин SF9, інфікованих відповідними рекомбінантними бакуловірусами. Присутність Ruk_l призводить до істотного інгібування активності РІ-3-кінази, причому максимальне інгібування спостерігається при еквімолярному співвідношенні досліджуваних білків в реакційній суміші. Цікаво, що наступне підвищення кількості Ruk_l (від 50 до 100 нг) супроводжується зростанням ферментативної активності до значень, які детектуються за відсутності Ruk_l. Таким чином, Ruk_l виявився першим серед низки адаптерних білків, зв'язувальних партнерів РІ-3-кінази, який виявляє інгібуючий ефект на ліпідкіназну активність холоферменту.

Результати попередніх досліджень (див. Розділ 2) дозволяють вважати дозозалежність у скерованості ефектів Ruk_l типовою для риштувальних білків, які можуть функціонувати як центри організації ансамблів білків лише за умови їхньої оптимальної стехіометрії у надмолекулярних комплексах. У випадках, коли концентрація риштувального білка є вищою від оптимальних значень повинно спостерігатись значне пригнічення сигналювання на виході, пов'язане з порушенням і/або реорганізацією системи міжмолекулярних взаємодій. Такі властивості адаптерних/риштувальних білків можуть ефективно використовуватись для регулювання специфічності, ефективності та амплітуди проходження сигналу в мережі, контролювати просторово-часову організацію сигнальних систем клітин.

Встановлена нами можливість ядерної локалізації Ruk_l (Дрель і ін., 2002; Havrylov et al., 2005), а також наявність в його амінокислотній послідовності позитивно заряджених ділянок дозволяє припустити, що досліджуваний білок може прямо або опосередковано взаємодіяти не лише з білками, а й з нуклеїновими кислотами. Для дослідження білково-нуклеїнової взаємодії за умов in vitro було очищено рекомбінантний білок Ruk_l Glu-tagged з лізатів трансфікованих клітин HEK293 афінною хроматографією на білок G-сефарозі з ковалентно кон'югованими моноклональними анти-Glu-tag антитілами. Результати проведених експериментів свідчать, що в досліджуваному препараті присутні щонайменше два білки, які володіють спорідненістю до ДНК і які не виявляються в контрольному елюаті. Виявлена взаємодія є дозозалежною і пригнічується як за присутності надлишку неміченого ОДН (так і ДНК із сперми лосося що може свідчити про специфічність утворення білок-нуклеїнових комплексів.

Електрофорез в денатуруючих умовах показав, що інкубація Ruk_l Glu-tagged з 150-mer [³²Р]-міченим ОДН гену 5S рРНК L. variagatus при 37⁰С супроводжується утворенням низькомолекулярних мічених фрагментів використаної проби.

На наступному етапі ДНКазну активність препарату Ruk_l Glu-tagged аналізували за його здатністю гідролізувати плазмідну ДНК in vitro. Показано, що ДНКазна активність виявляється лише в елюаті з афінного сорбенту, інкубованого з лізатами клітин НЕК293, трансфікованих вектором pRc/CMV2/Ruk_l-Glu-tag, але не контрольних клітин, трансфікованих вектором pRc/CMV2 без вставки . При цьому за присутності Zn²⁺, неспецифічного інгібітора нуклеаз (Duke et al., 1983), реакція гідролізу плазмідної ДНК препаратом Ruk_l Glu-tagged повністю інгібується. При додаванні в інкубаційне середовище анти-Ruk та анти-Glu-tag антитіл спостерігається часткове пригнічення ДНКазної активності, причому вказаний ефект є дозозалежним від доданих

Залежність гідролізу плазмідної ДНК від наявності білка Ruk_l Glu-tagged в інкубаційному середовищі була підтверджена при його виснажуванні в результаті преінкубації отриманого препарату за присутності анти-Glu-tag антитіл з наступною преципітацією імунних комплексів за допомогою білок G-сефарози (Кіт і ін., 2004).

З рис. 16, доріжка 1, видно, що плазміда pcGT знаходиться в основному в суперскрученій і значно менше в лінійній та нікованій кільцевих формах (для порівняння див. утворення лінійної форми при розщепленні плазміди ендонуклеазою рестрикції EcoRI. Після 30 хв інкубації pcGT з препаратом Ruk_l Glu-tagged спостерігається перехід суперскрученої форми плазміди в ніковану кільцеву та лінійну з подальшим гідролізом останьої (див. рис. 16, доріжка 2). При збільшенні часу інкубації до 60 хв спостерігається зменшення кількості нікованої кільцевої форми плазміди та збільшення лінійної разом із продуктами гідролізу. На 90 хв можна спостерігати майже повний гідроліз плазміди.

Для подальшої характеристики нуклеазної активності, асоційованої з білком Ruk_l Glu-tagged, ми проаналізували залежність гідролізу плазмідної ДНК від іонів Mg²⁺, Ca²⁺ та Mn²⁺ (Khodarev et al., 1998, Widlak et al., 2001). З видно, що нуклеаза/(нуклеази), асоційовані з Ruk_l Glu-tagged, можуть використовувати як кофактор лише іони Mg²⁺. Встановлено також, що нуклеазна активність не залежить від іонів Ca²⁺ та Mn²⁺. В той же час виявлено, що при комплексній дії іонів Mg²⁺ і Ca²⁺ спостерігається значне посилення гідролізу ДНКв той час як за присутності іонів Mn²⁺ і Ca²⁺ гідроліз не відбувається. Цікаво, що комплексна дія іонів Mg²⁺ та Mn²⁺ не призводить до посилення гідролізу плазмідної ДНК порівняно з дією самого Mg²⁺ .

Отримані дані дозволяють зробити висновок, що афінно очищений препарат рекомбінантного білка Ruk_l Glu-tagged володіє здатністю не тільки зв'язуватись із ДНК, але і гідролізувати її. Асоційована нуклеаза(и) є Mg²⁺ - залежною і проявляє як екзо-, так і ендонуклеазну активності. Крім того встановлено, що іони Ca²⁺ значно потенціюють гідроліз плазмідної ДНК при використанні іонів Mg²⁺ як кофактора ферментативної реакції.

Для з'ясування, які саме послідовності білка Ruk_l задіяні у взаємодію із нуклеазою/(нуклеазами), були використані препарати рекомбінантних Glu-tagged m та h ізоформ білка Ruk, які представляють собою його сплайсові вкорочені варіанти з одним SH3-доменом, або С-кінцевий суперспіралізований район, відповідно (Gout et al., 2000)., що в усіх досліджуваних препаратах (Ruk_l Glu-tagged, Ruk_m Glu-tagged та Ruk_h Glu-tagged) є присутніми щонайменше два білки, які володіють спорідненістю до ДНК. Слід зауважити, що виявлені білково-нуклеїнові комплекси володіють однаковою електрофоретичною рухливістю та інтенсивністю.

ДНКазну активність препаратів Ruk_l Glu-tagged, Ruk_m Glu-tagged та Ruk_h Glu-tagged аналізували за їх здатністю гідролізувати плазмідну ДНК in vitro. ДНКазна активність виявляється в усіх досліджуваних препаратах l, m та h ізоформ рекомбінантного білка Ruk і повністю інгібується за наявності іонів Zn²⁺.

Таким чином, афінно очищені препарати Glu-tagged ізоформ (l, m та h) білка Ruk, спільною структурною особливістю яких є наявність “coiled-coil” послідовності, містять принаймні два білки, які володіють спорідненістю до ДНК, а також проявляють ДНКазну активність. При цьому слід відмітити, що в процесі гідролізу відбувається перехід суперскрученої форми плазміди в ніковану, яка зазнає наступного гідролізу. Картування C-кінцевої суперспіралізованої ділянки амінокислотної послідовності адаптерного білка Ruk_l, залученої до взаємодії із нуклеазою/(нуклеазами), та виявлення ряду їх каталітичних властивостей дозволяє продовжити роботу по ідентифікації даної ендонуклеази/(ендонуклеаз) та з'ясуванню їхньої біологічної ролі.

Дослідження механізмів між- та внутрішньомолекулярних взаємодій, опосередкованих доменами і мотивами ізоформ Ruk, методом зв'язування in vitro GST-кон'югованих форм рекомбінантних білків показало, що з формами Ruk, які містять Pro-багаті мотиви (Ruk_l, Ruk_m) найефективніше взаємодіє GST-SH3A-домен і в значно меншому ступені GST-SH3В-домен, в той час як зв'язування Ruk_l і Ruk_m до GST-SH3С-домену не виявляється зовсім (Ilnytska et al., 2005). Посилення зв'язування спостерігається при використанні як „байту” GST-3SH3, що може свідчити про кооперативність внутрішньомолекулярних взаємодій. Цікаво, що при усуненні стеричних обмежень у випадку експресії Ruk_ДSH3, останній однаково ефективно преципітується всіма трьома (А, В і С) SH3-доменами Ruk. Крім цього всі експресовані ізоформи Ruk (Ruk_l, Ruk_m і Ruk_h), а також мутантна форма білка без Pro-багатих мотивів, ?Pro-Ruk, ефективно преципітуються GST-Ruk_s, що свідчить про роль С-кінцевого суперспіралізованого району в ди-/олігомеризації ізоформ Ruk (Ilnytska et al., 2005). Встановлено також, що система внутрішньомолекулярних взаємодій, опосередкованих адаптерним білком Ruk, зазнає змін під час TNFб-індукованого апоптозу клітин лінії U937 (Ilnytska et al., 2005). Значне посилення взаємодії Ruk_l з GST-SH3A-доменом спостерігається на 4-6 год культивування порівняно з інтактними клітинами, що співпадає в часі з нагромадженням нуклеосомних фрагментів ДНК. Зміна здатності Pro-багатих мотивів Ruk взаємодіяти з екзогенними партнерами може свідчити про існування в клітинах динамічної рівноваги між активними (відкритими) і неактивними (закритими внаслідок внутрішньомолекулярних взаємодій) формами адаптерного білка, що, без сумніву, має регуляторне значення для узгодженого функціонування Ruk-залежних сигнальних мереж в просторі і часі.

Наявні функціональні дані свідчать про те, що адаптерний білок Ruk виконує важливу роль не тільки у підтриманні гомеостазу нормальних клітин, але може бути також залученим до регулювання шляхів злоякісної трансформації клітин людини і тварин і, як наслідок, слугувати молекулярним маркером канцерогенезу та, в перспективі, представляти привабливу мішень для антипухлинної терапії. Для з'ясування можливої біологічної ролі ортолога Ruk у людини, білка CIN85, в канцерогенезі нами було проаналізовано рівень його експресії в світлоклітинних карциномах нирки людини різного ступеня злоякісності згідно класифікації TNM. Експресію ізоформ адаптерного білка CIN85/Ruk досліджували в 20 зразках пухлин нирки людини та відповідних контрольних зразках (морфологічно незмінена тканина, ізольована із того самого органу при радикальній нефректомії) методами імуноблотингу, нозерн-блотингу та імуногістохімії.

За даними імуноблот-аналізу основні імунореактивні смуги в Тритон Х-100-розчинних екстрактах досліджуваних зразків відповідають білкам з молекулярними масами 130, 85, 56 і 34 кДа. Як видно з рис. 19, а, співвідношення в експресії ізоформ CIN85/Ruk є специфічним як для контрольних, так і пухлинних зразків. В той же час, встановлено достовірне зниження рівня експресії повнорозмірної форми білка CIN85/Ruk з M_r 85 кДа у переважній частині досліджених зразків пухлин (в 12-ти зразках з 20-ти) порівняно з контрольними зразками. Зміни в експресії CIN85/Ruk на рівні білка корелюють із змінами експресії на рівні мРНК та даними імуногістохімії. Імуногістохімічні дослідження зразків пухлин та умовно нормальних тканин виявили ще одну цікаву закономірність. Поряд із загальним зниженням інтенсивності зафарбовування в клітинах пухлин детектуються зміни субклітинної локалізації CIN85/Ruk - транслокація до ядра та переважне накопичення в примембранній зоні.

Результати проведених досліджень узгоджуються з даними літератури про посилення сигналювання, залежного від рецепторів епідермального фактора росту (EGF) та фактора росту гепатоцитів (c-Met) в карциномах нирки (Nakamura et al., 2001; Weber et al., 2003). Таке посилення може бути наслідком не тільки генетично обумовленого підвищення рівня експресії зазначених рецепторів, а й порушення механізмів їх ліганд-індукованого ендоцитозу, критичною регуляторною ланкою яких є CIN85. З іншого боку, беручи до уваги здатність Ruk_l інгібувати ліпідкіназну активність РІ-3-кінази, яка в ряді клітинних систем володіє вираженим антиапоптичним потенціалом (Gout et al., 2000), виявлене зниження рівня експресії CIN85/Ruk може одночасно вносити вклад в посилення виживання карциномних клітин. Такі властивості, зокрема, здатність інгібувати PI-3-кіназне сигналювання та зниження експресії в пухлинах, роблять CIN85 функціонально подібним до відомого білка-супресора пухлин PTEN (Sansal & Sellers, 2004). Таким чином, виявлене зниження експресії адаптерного білка CIN85/Ruk в пухлинах нирки людини може призводити до втрати узгодженого контролю процесів апоптозу і проліферації в трансформованих епітеліальних клітинах та вносити вклад в канцерогенез і прогресію нирково-клітинних карцином.

ВИСНОВКИ

Проведено комплекс експериментальних робіт, за результатами яких запропоновано гіпотезу про системний характер осциляцій сигнальних процесів в нормальних і пухлинних клітинах евкаріот та їхню роль в координації спряжених сигнальних шляхів. Запропоновано і експериментально доведено концепцію стосовно критичної ролі стехіометрії адаптерних/риштувальних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах в забезпеченні специфічності і інтенсивності сигналювання. Отримані дані обгрунтовують можливості впливу на специфічні ланки сигнальних мереж за тих чи інших патологічних станів.

1. На моделі зародків костистої риби в'юна (Misgurnus fossilis L.) ідентифіковано і охарактеризовано ряд сигнальних ланок, що активуються на початкових етапах ембріонального розвитку тварин:

- вперше виявлені і охарактеризовані функціональні рецептори інсуліну і EGF в клітинах зародків в'юна на стадії ранньої гаструли;

- охарактеризовано кінетичні параметри високоафінної GTPазної активності G-білків плазматичних мембран зародкових клітин, ізольованих на стадії ранньої гаструли, ідентифіковано субстрати кашлючного (G₀ з M_r 29 кДа) та ботулінічного (з M_r 26 і 28 кДа) токсинів, SMG-білки підродин Rho/Rac та Ras;

- ідентифіковано фосфотирозинвмісні білки, рівень модифікації яких залежить від стадії розвитку зародків і регулюється інсуліном;

- проаналізовано особливості функціонування інозитліпідної сигнальної системи в клітинах ранніх зародків в'юна та вплив на ці процеси інсуліну та гуанілових нуклеотидів. Вперше встановлено, що G-білки залучені до інсулін-опосередкованого стимулювання активності РІ-4-кінази і негативного регулювання РІ-3-кінази залежно від стадії ембріонального розвитку;

- вперше отримано частково очищені препарати S6-кінази ембріональних клітин, ізольованих на стадії ранньої гаструли, досліджено її деякі фізико-хімічні властивості, субстратну специфічність, динаміку активності та особливості регулювання під впливом EGF.

2. Вперше показано, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі (Tyr-специфічного фосфорилювання білків, активностей РІ-3- і РІ-4-кіназ та S6-кінази) є їх системний коливний характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних ПФР (інсуліну і EGF) залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних зародках. Висунуто гіпотезу про здатність ПФР не тільки стимулювати проліферацію різних типів клітин, а й пригнічувати сигнальні процеси в стимульованих клітинах у просторово-часовий спосіб.

3. Встановлено, що індукція основних морфогенетичних подій в ранньому ембріогенезі (мезодерми, 10 год розвитку, і нейроектодерми, 13 год розвитку) співпадає з пригніченням біосинтезу ДНК, тирозин-специфічного фосфорилювання білків з M_r 105, 90, 66, 30 і 24 кДа, активностей РІ-3- і РІ-4-кіназ та зростанням активності S6-кінази і посиленням Tyr-специфічного фосфорилювання білка з M_r 18 кДа. Виявлені особливості динаміки сигнальних процесів вказують на системний характер регулювання сигнальних мереж у ранньому ембріогенезі в'юна.

4. На моделі Ph¹-позитивних клітин еритролейкемії людини лінії К562 з високим рівнем експресії дерегульованої тирозинової кінази р210Bcr-Abl отримано оригінальні дані про те, що рівень її активності, фосфорилювання білків по тирозину, активність ефекторних білків p21Ras і РІ-3-кінази не підтримуються на постійному конститутивному рівні, а володіють коливним характером залежно від фази росту клітинної культури.