Структурно-функціональні особливості кіназ рибосомного білка S6 - S6К1 та S6К2

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології та генетики

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Структурно-функціональні особливості кіназ рибосомного білка S6 - S6К1 та S6К2

03.00.03 - молекулярна біологія

ФІЛОНЕНКО ВАЛЕРІЙ ВІКТОРОВИЧ

КИЇВ 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Окремі дослідження проведено в лабораторії клітинної регуляції Інституту ракових досліджень Людвіга (м.Лондон, Велика Британія).

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

Риндич Алла Володимирівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

зав. відділу молекулярної онкогенетики;

доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії;

доктор біологічних наук

Сидоренко Світлана Павлівна

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Є.Кавецького НАН України,

завідувач лабораторії сигнальних каскадів клітини.

Провідна установа: Інститут біології клітини НАН України, м.Львів.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Сигнальні системи клітини відіграють ключову роль у координованій регуляції функціонування окремо взятої клітини і організму в цілому. Їхня основна функція полягає в передачі позаклітинних стимулів, що індукуються гормонами, факторами росту, цитокінами, від рецепторів клітинної мембрани до відповідних компартментів клітини (ядро, цитоплазма), що, в свою чергу, призводить до змін експресії відповідних генів як на рівні транскрипції, так і на рівні трансляції мРНК (Conlon et al., 1999; Fingar et al., 2004). Передача позаклітинного сигналу опосередковується складним каскадом послідовних фосфорилювань/дефосфорилювань компонентів сигнальних шляхів, що відповідно опосередковуються кіназами/фосфатазами білків і ліпідів. Дослідження молекулярних механізмів передачі позаклітинних стимулів лежить в основі розуміння шляхів міжклітинної комунікації і регуляції функціонування окремо взятої клітини.

Ціла низка патологій, включаючи злоякісну трансформацію клітини, діабет, ожиріння, серцево-судинні захворювання та інші, супроводжується порушеннями функціонування сигнальних систем пов'язаних зі змінами експресії чи активності їхніх окремих компонентів (Holland et al., 2004). У багатьох випадках компоненти сигнальних систем, що зазнають суттєвих змін у процесі онкогенезу, а саме - рецептори клітинної мембрани та їхні ліганди, адапторні білки, кінази та фосфатази білків та ліпідів, використовують у сучасній онкології як біомаркери злоякісної трансформації, а також як безпосередні мішені в специфічній хіміо- та імунотерапії онкологічних захворювань (Sebolt-Leopold and Herrera, 2004; Xu et al., 2004; Stephens et al., 2005).

Все більш зрозумілішим стає те, що причиною зазначених патологій є багатофакторні порушення у функціонуванні клітин. Навіть у межах патологій, що мають однакові клінічні прояви, існують суттєві відмінності на молекулярному рівні, в тому числі і серед сигнальних молекул. Таким чином, дослідження сигнальних систем як у нормі, так і при патологічних станах дозволяє виявити нові молекулярні маркери для розробки сучасних підходів в діагностиці та терапії цілої низки патологій.

Згідно з даними літератури, РІ3К/mTOR-залежний сигнальний шлях, що знаходиться під контролем відповідно РІ3К (фосфатидилінозитол 3'-кінази) та mTOR кінази, є одним з провідних у регуляції основних клітинних функцій, а саме - росту клітин, проліферації, диференціації та апоптозу. Активація РІ3К/mTOR сигнального шляху починається з активації власне РІ3 кінази, що індукується активованими внаслідок взаємодії з позаклітинними мітогенами рецепторами плазматичної мембрани (Richardson et al., 2004). Активність mTOR кінази залежить не лише від дії мітогенних стимулів, опосередкованих РІ3К, а і від сигналів, індукованих поживними речовинами (амінокислотами, глюкозою, жирними кислотами) (Tee et al., 2005).

Відповідальними за одну з кінцевих ланок у передачі мітогенних стимулів у клітині є родина кіназ рибосомного білка S6 (S6К), донедавна представлена лише однією - S6К1 (Kozma et al., 1990). Саме завдяки S6К відбувається конвертація позаклітинних стимулів у безпосередню фізіологічну відповідь клітини, а саме - активацію білкового синтезу. Каталітична активність S6К полягає у фосфорилюванні рибосомного білка S6 і, як наслідок, активації трансляції цілого субкласу мРНК, що містять у 5'-ділянці, яка не транслюється (5'UTR), специфічну олігопіримідинову послідовність. Ці мРНК кодують компоненти апарату трансляції - рибосомні білки та деякі фактори трансляції (Thomas et al., 2002).

Треба зазначити, що регуляція на рівні трансляції завдяки присутності структурованих послідовностей в 5'UTR властива цілій низці макромолекул, залучених до регуляції клітинного циклу. Однак механізми такої активації ще детально не досліджені, хоча і підкреслюється провідна роль фосфорилювання та дефосфорилювання відповідних білків (Pickering et al., 2005).

На сьогодні існують підтвердження того, що з активацією S6К пов'язана активація транскрипції і генів рибосомних РНК і відповідно функціонування S6К1 безпосередньо пов'язане з регуляцією біогенезу рибосом (Hannan et al., 2003). Таким чином, S6K є одним із ключових ензимів, причетних не лише до регуляції трансляції мРНК компонентів апарату трансляції, а й до регуляції в цілому білкового синтезу в клітині, індукованого мітогенними стимулами.

Доведено, що S6К здатна фосфорилювати in vitro цілу низку додаткових субстратів, а саме: проапоптичний білок BAD (Harada et al., 2001); білок SKAR, що бере участь у сплайсингу мРНК (Richardson et al., 2004); фактор транскрипції CREM (de Groot et al., 1994); субстрат інсулінового рецептора (IRS) (Harrington et al., 2005); фактор ініціації трансляції білкового синтезу 4В (eIF4B) (Raught et al., 2004). Відповідно функції S6К не обмежені лише регуляцією білкового синтезу, однак вони мають бути підтвердженими in vivo.

На момент початку досліджень напевно було відомо про наявність лише однієї форми S6К, хоча експерименти з нокаутними по гену S6К мишами свідчили про можливість існування додаткової форми S6К, здатної, хоча і частково, компенсувати її відсутність (Shima et al., 1998). Нещодавно паралельно з нашими дослідженнями декількома групами було ідентифіковано нову форму S6К, названу S6К2 (Saitoh et al., 1998; Lee-Fruman et al., 1999; Koh et al., 1999).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою №2.2.4.10 - “Дослідження сигнальних шляхів при злоякісній трансформації та пошук пухлиноспецифічних антигенів” (номер державної реєстрації - 0101U000360, 2001-2005 рр.), а також у рамках співробітництва з Інститутом ракових досліджень Людвіга (Лондон, Велика Британія), згідно з договором про наукове співробітництво.

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було визначення структурно-функціональних особливостей представників родини кіназ рибосомного білка S6 - S6K1 та S6K2 і з'ясування відмінностей у рівні їхньої експресії та субклітинній локалізації в нормальних тканинах та пухлинах людини. Відповідно до мети поставлено такі завдання:

1. Провести детальний порівняльний аналіз первинних структур S6К1 та S6К2.

2. Визначити субстратну специфічність S6К1 та S6К2 по відношенню до S6 рибосомного білка.

3. Дослідити вплив мітогенних факторів на активацію S6К1 та S6К2 у відповідь на стимуляцію клітин.

4. Встановити роль фосфорилювання гомологічних сайтів у S6K1 та S6K2 для їхньої активації.

5. Визначити місце РІ3К/mTOR-залежного сигнального каскаду у регуляції активності S6К2. Порівняти вплив інгібіторів РІ3К та mTOR кіназ на індуковану мітогенами активність S6К1 та S6К2.

6. З огляду на існування теоретично розрахованого сайта фосфорилювання протеїнкінази С (РКС) у структурі S6К2 дослідити роль РКС у регулюванні активності та субклітинної локалізації S6К2.

7. Отримати високоспецифічні поліклональні та моноклональні антитіла проти рекомбінантних повнорозмірних форм S6K1 та S6K2 та їхніх фрагментів, експресованих у системі бактерій та бакуловірусу.

8. Дослідити рівень експресії S6К1 та S6К2 у різних тканинах ссавців на рівні мРНК та на рівні білка.

9. Методом двогібридної системи дріжджів визначити нові S6К-асоційовані білки та з'ясувати значення виявлених взаємодій.

10. Дослідити рівень експресії та особливості субклітинної локалізації S6К у нормальних тканинах, доброякісних та злоякісних пухлинах людини.

Об'єкт дослідження - молекулярні механізми передачі позаклітинних мітогенних стимулів за участі РІ3К/mTOR-залежного сигнального каскаду.

Предмет дослідження - кінази рибосомного білка S6 (S6K1 та S6K2), РІ3К, mTOR, КоА-синтаза, культивовані лінії клітин людини; нормальні тканини, злоякісні та доброякісні пухлини людини.

Методи дослідження - клонування кДНК фрагментів у плазмідні конструкції, конструювання експресувальних векторів, експресія рекомбінантних білків у бактеріальних та бакуловірусних експресувальних системах, очищення рекомбінантних білків із лізатів клітин, Нозерн-блот аналіз, отримання моноклональних та поліклональних антитіл, імуногістохімічні дослідження парафінованих зрізів тканин, дріжджова двогібридна система, метод сайт-спрямованого мутагенезу, тимчасова трансфекція клітин ссавців кДНК конструкціями, імунопреципітація та Вестерн-блот аналіз, конфокальна сканувальна мікроскопія, визначення кіназної активності S6K in vitro, визначення ензиматичної активності КоА-синтази.

Наукова новизна одержаних результатів. Ідентифіковано нову форму кінази рибосомного білка S6 - S6K2. Доведено здатність S6K2 фосфорилювати S6 рибосомний білок та залежність її активності від мітогенних стимулів. Встановлено подібність механізмів регуляції S6K1 та S6K2 у клітині, що потребує участі РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху та фосфорилювання S6K2 за гомологічними з S6K1 сайтами. Виявлено відмінності в кінетиці активації S6K1 та S6K2 мітогенними стимулами, що свідчить про існування відмінностей в механізмах регуляції активності та функціонуванні S6K. Вперше встановлено, що РКС здатна фосфорилювати S6K2, але не S6K1. Визначено, що сайтом фосфорилювання є Ser486. Доведено, що він ключовим для регулювання субклітинної локалізації S6K2.

Знайдено новий S6K1-зв'язувальний білок та ідентифіковано його як КоА-синтазу. Вперше клоновано кДНК, що кодує КоА-синтазу. Біохімічними методами підтверджено, що КоА-синтаза є біфункціональним ферментом і має одночасно дефосфоКоА-кіназну та фосфопантотенатаденілтрансферазну активності і відповідно каталізує два останніх етапи біосинтезу КоА.

Вперше показано, що КоА-синтаза взаємодіє з S6K1 у клітинах ссавців. Встановлено, що С-кінцеві регуляторні ділянки як S6K1, так і КоА-синтази залучені до утворення білково-білкового комплексу. Методами конфокальної мікроскопії клітин та субклітинного фракціонування виявлено мітохондріальну локалізацію КоА-синтази. Доведено, що N-кінцевий гідрофобний домен КоА-синтази відповідає за її асоціацію з зовнішньою мембраною мітохондрій. Вперше встановлено зв'язок функціонування сигнальних молекул із ензимами відповідальними за біосинтез КоА.

Вперше досліджено особливості експресії S6К1 та S6К2 на рівні білка в різних тканинах ссавців. Виявлено тканиноспецифічний характер експресії S6K та відсутність кореляції між вмістом S6K та її мРНК у тканинах.

Вперше досліджено вміст S6К1 та S6К2 в доброякісних пухлинах та злоякісних пухлинах молочної залози, щитовидної залози та ендометрію людини у порівнянні з нормальними тканинами. Встановлено підвищений вміст S6К1 та S6К2 в злоякісних пухлинах. Вперше проведено порівняння субклітинної локалізації S6К1 та S6К2 у нормальних тканинах та пухлинах молочної залози, щитовидної залози та ендометрію людини і виявлено тенденцію до накопичення S6К1 і, в значно більшій мірі, S6К2 у ядрі злоякісних клітин усіх типів досліджуваних пухлин.

Практичне значення одержаних результатів. Клоновано кДНК послідовність нової форми S6K - S6K2 та S6K1-звязувального білка - КоА синтази, що дозволяє застосування широкого спектра молекулярно-біологічних методів для дослідження механізмів функціонування РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху та його зв'язку з ензимами біогенезу КоА.

Клонування гена КоА-синтази дозволяє отримувати високоочищений препарат КоА-синтази в необмежених кількостях, що може полегшити створення препаратів для лікування хвороб, пов'язаних із порушенням біосинтезу КоА та обміну вітаміну В5 в організмі.

Отримано полі- та моноклональні антитіла проти S6К1 та S6К2, КоА-синтази, які можуть бути використані для подальшого дослідження функціональних особливостей вказаних макромолекул у різних типах клітин і тканин імунохімічними та імуногістохімічними методами. Визначення рівня експресії та особливостей субклітинної локалізації S6К у злоякісних пухлинах у комбінації з використанням уже відомих маркерів злоякісних пухлин може бути корисним для розробки засобів детальної діагностики та прогнозування перебігу онкологічних захворювань. Отримані результати дають підставу розглядати S6К1 та S6К2 як потенційні мішені для майбутньої хіміотерапії онкологічних захворювань молочної залози людини.

Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані у спецкурсах з молекулярної біології та біохімії для студентів біологічних факультетів.

Особистий внесок здобувача. Усі дослідження виконувались за безпосередньої участі здобувача. Дисертант особисто брав участь в ідентифікації та подальшій детальній характеристиці нової форми кінази рибосомного білка S6. Автором самостійно створено більшість кДНК конструкцій рекомбінантних форм кіназ рибосомного білка S6, проаналізовано активність їхніх продуктів та отримано моноклональні антитіла до S6K1 та S6K2. Дисертантом досліджено рівень in vitro фосфорилювання рекомбінантних форм S6K1 та S6K2 за участі РКС.

Дисертантові належить ідея існування змін рівня експресії та субклітинної локалізації S6K у злоякісних клітинах. Автор брав безпосередню участь у плануванні усіх представлених експериментів та обговоренні результатів. Ним самостійно проаналізовано весь отриманий матеріал та сформульовано усі положення і висновки роботи. Більшість наукових робіт, що відображають результати дисертації, підготовлено до друку дисертантом.

Ролі мітогенних факторів для активації S6K досліджували спільно з к. б. н. Т. Й. Вальовкою (Лондон, Велика Британія). Визначення ролі PI3K/mTOR-залежного шляху в регуляції активності S6K2 проводили спільно з к. мед. н І. Гутом та М. Вотерфілдом (Лондон, Велика Британія). Експерименти з використанням двогібридної системи дріжджів та характеристику КоА-синтази було виконано спільно з к. б. н. О. М. Живолупом, к. б. н. І. О. Немазаним та Г. Г. Панасюк. Визначення нуклеотидної послідовності кДНК КоА-синтази здійснено спільно з Т. Фентоном та Х. Ребхолз (Лондон, Велика Британія). Отримання гомогенатів пухлин та виявлення в них вмісту S6K1 та S6K2 проводили спільно з к. б. н. Л. О. Савінською та к. б. н. Г. В. Овчаренко. Дослідження субклітинної локалізації S6K1 та S6K2 в нормальних тканинах та пухлинах людини проводили спільно з д. б. н. П. В. Погрібним, к. мед. н. В. С. Усенком, к. б. н. В. В. Лизогубовим та Д. І. Литвином. Дослідження субклітинної локалізації рекомбінантних форм S6K2 в клітинах НЕК 293 проводили спільно з к. мед. н. І. Т. Гутом та к. б. н. Т. Й. Вальовкою (Лондон, Велика Британія). Субклітинну локалізацію КоА-синтази досліджували спільно з М. Ванг (Лондон, Велика Британія). Поліклональні антитіла проти Кі67 антигену отримували спільно з к. б. н. М. В. Родніним та І. О. Тихонковою. Мас-спектральний аналіз фосфорильованих форм S6K2 здійснювали спільно з Р. Крамером (Лондон, Велика Британія). Автор висловлює щиру подяку к. мед. н. І. Т. Гуту за корисні поради та допомогу в плануванні та проведенні експериментів та при обговоренні результатів. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних наукових працях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації апробовано на семінарах відділу структури та функцій нуклеїнових кислот та наукових конференціях ІМБіГ НАНУ і представлено у вигляді доповідей на конгресі „Онкологія-2000” (Київ, 2000), на ІІІ Парнасівській конференції (Львів, 2000), на ІV Парнасівській конференції (Вроцлав, Польща, 2002), на VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), на 17-му конгресі Європейської асоціації ракових досліджень (EACR) (Мадрид, Іспанія, 2002), на спеціальному конгресі FEBS з сигнальних шляхів (Брюссель, Бельгія, 2003), на Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), на 29-му конгресі FEBS (Варшава, Польща, 2004), на V Парнасівській конференції (Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 24 статті у провідних закордонних та вітчизняних фахових виданнях та тези 12 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 312 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 95 рисунків, 5 таблиць. Список використаної літератури охоплює 314 найменуваннь.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Для експресії рекомбінантних білків у бактеріальній системі та системі клітин ссавців використовували плазміди pET 23d(+), pET 24d(+) (Novagen), pcDNA3.1(+), pcDNA A4/TO (Invitrogene). Рекомбінантні форми S6K клонували злитими з ЕЕ-міткою, де ЕЕ - поліглутамінова послідовність. Рекомбінантні форми КоА-синтази клонували злитими з Мус-міткою. Імунопреципітацію рекомбінантних форм S6K та КоА-синтази з лізатів клітин НЕК293, трансфікованих відповідними ДНК конструкціями, здійснювали за допомогою анти-ЕЕ та анти-Мус моноклональних антитіл.

Як антиген для отримання моноклональних та поліклональних антитіл проти S6K1, S6K2 використовували їхні С-кінцеві рекомбінантні пептиди з найменшим (23 %) рівнем гомології, попередньо клоновані з 6хHis-послідовністю, експресовані в клітинах бактерій та очищені афінною хроматографією на NiNTA-сефарозі. Для отримання антитіл проти КоА-синтази використовували її С-кінцевий фрагмент, одержаний аналогічним способом. При одержанні поліклональних антитіл проти C-кінцевого фосфопептиду S6K2, що містить сайт фосфорилювання РКС, як антиген використовували синтезований фірмою Alta Bioscience синтетичний пептид (SGTKKpS⁴⁸⁶KRGRG), що відповідає амінокислотній послідовності S6K2 з 481 по 491 а.з.

Для імунізації використовували самців кролів масою 2-3 кг, яким вводили препарати афінно очищених антигенів в ад'юванті Фрейнда. Робили шість підшкірних ін'єкцій вздовж хребта по 15-20 мкг пептиду на ін'єкцію. Через 8 тижнів робили повторну імунізацію такою ж кількістю антигену у неповному ад'юванті Фрейнда. Втретє кролів імунізували через 4, тижні використовуючи 200 мкг препарату в ЗФP для кожного. Титр сироватки визначали методом ELISA.

Моноклональні антитіла отримували за модифікованим протоколом злиття спленоцитів імунізованих мишей лінії ВАLB/c з мієломними клітинами лінії Sp/20 у присутності ПЕГ 1500.

Для створення "bait"-конструкцій використовували плазміди рEG202, рEG202-NLS, pNLexA. Для пошуку S6K-зв'язувальних білків як "bait" застосовували повнорозмірну форму S6K1 яким скринували кДНК бібліотеку 19-денних ембріонів миші. кіназ клітина рибосомний білок

У роботі використано ендонуклеази рестрикції виробництва фірми MBI Fermentas (Литва). Рестрикцію ДНК проводили у відповідному для кожної ендонуклеази буфері, згідно з рекомендаціями виробника. Для розрізання ДНК (1 мкг) використовували 2U ендонуклеази рестрикції в об'ємі 20 мкл. Реакційну суміш інкубували при 37 ⁰ C 1-2 год, а ДНК фрагменти аналізували методом ДНК електрофорезу в агарозному гелі. Мутантні форми S6K та КоА-синтази, які містили точкові заміни амінокислотних залишків, створювали за допомогою набору QuickChange™ для сайт-спрямованого мутагенезу (Stratagene), згідно з рекомендаціями виробника. У реакції використовували суперскручену дволанцюгову ДНК вектора із вставкою, два синтетичних олігонуклеотидних праймери, що містили мутацію, та високоточну PfuTurbo ДНК-полімеразу. Праймери для мутагенезу були від 25 до 45 п. н. довжиною та мали температуру плавлення (T_m), більшу чи рівну 78 ⁰ C; некомплементарний триплет знаходився у центрі праймера та мав додаткові комплементарні 10-15 п. н. по краях.

Нуклеотидну послідовність усіх створених рекомбінантних ДНК конструкцій визначали за допомогою автоматичного ДНК секвенатора ABI 73A™ (Applied Biosystems) з використанням набору для секвенування.

Нозерн-блот аналіз. Для Нозерн-блот аналізу використовували нітроцелюлозні мембрани, на яких було імобілізовано зразки полі(А)⁺ РНК виділені з різних тканин людини (CLONTECH). Використовували такі кДНК проби: для аналізу мРНК S6К1 - кДНК фрагмент (476 п. н.), що містив 56 п. н. з 3'-кінця кодуючої ділянки та 420 п. н. з 3'-кінця некодуючої ділянки кДНК EST клону S6К1 людини (АА425599); для аналізу мРНК S6К2 - 650 п. н. кДНК фрагмент, що містив 518 п. н. кодуючої ділянки та 130 п. н. кодуючої ділянки кДНК EST клону S6К2 людини (АА 410355); для аналізу мРНК КоА-синтази - 850-п. н. фрагмент (1-850) кДНК КоА-синтази кодуючої ділянки. Проби кДНК мітили [³²Р] за допомогою набору для мічення (Readiprime TMII, Amersham Biosciences). Як контроль використовували кДНК пробу для -актину (CLONTECH). Усі етапи гібридизації та детекції проводили згідно з рекомендаціями Amersham Biosciences.

Тимчасова трансфекція клітин НЕК293. Клітини за 12 год до трансфекції пересаджували на чашки діаметром 60мм у кількості 1,2^.10⁶. Тимчасову трансфекцію клітин НЕК293 проводили з використанням 2,5-10 мкг відповідної плазмідної ДНК та реагенту LipofectAMINE (Life Technologies, Inc.) згідно з рекомендаціями виробника. Для кожної трансфекції плазмідну ДНК та 10 мкл LipofectAMINE розчиняли окремо у 100 мкл середовища без сироватки Opti-MEM (Gibco BRL). Суміші інкубували протягом 10 хв при кімнатній температурі, об'єднували та інкубували додатково 30 хв для формування ДНК-ліпосомних комплексів. Протягом цього періоду клітини промивали 2 рази середовищем DMEM без сироватки та додавали до клітин 2 мл середовища Opti-MEM. ДНК-ліпосомні комплекси додавали до клітин, що надалі культивували протягом 5 год при 37 ⁰ C в CO₂ інкубаторі. Після цього Opti-MEM середовище замінювали на середовище DMEM з 10 % сироватки, а трансфіковані клітини культивували ще додатково 24 год. Експресію рекомбінантних білків у клітинах аналізували методом Вестерн-блот аналізу.

Визначення ензиматичної активності S6К. Для визначення активності S6K рекомбінантні форми ЕЕ-S6K імунопреципітували з лізатів трансфікованих клітин, використовуючи відповідні антитіла та білок А сефарозу. Сефарозу відмивали тричі буфером для лізування клітин та один раз буфером для кіназної реакції (50 мM Hepes, pH 7,5, 10 мM MgCl₂, 1 мM DTT, 10 мM 3-гліцерофосфат). Кіназну реакцію ініціювали додаванням до імунопреципітованих на сефарозі комплексів 25 мкл кіназного буфера, що додатково містив 50 мкM ATP, 5 мкКi [-³²P]ATP та 20 мкг 80S рибосом, виділених з печінки щура (Thomas et al., 1978). Реакцію проводили при 30 ⁰ C протягом 10 хв та зупиняли додаванням 2xбуфера для приготування зразків і прогріванням (90 ⁰ С, 5 хв). Зразки розділяли методом гель-електрофорезу в 10 % ПААГ, а кількість включеного у S6 білок радіоактивного [³²P] визначали за допомогою приладу “Phosphoimager system” (Bio-Rad).

Визначення активності КоА-синтази. Для визначення фосфопантотенатаденілтрансферазної активності КоА-синтази рекомбінантні форми Myc-КоА-синтази імунопреципітували з лізатів трансфікованих клітин із використанням відповідних антитіл та білок А сефарози. Сефарозу відмивали тричі буфером (50 мM трис-HCl, pH 8,0, 10 мM MgCl₂, 1,5 мM DTT). Реакцію ініціювали додаванням до імунних комплексів 50 мкл буфера, що додатково містив 0,2 мM 4'- фосфопантетонат (4'-PP), 0,25 мM ATР та 0,5 мкКi [-³²P]ATР. Реакційну суміш інкубували при 25 ⁰ C протягом 30 хв. Продукти реакції розділяли за допомогою низхідної паперової хроматографії з використанням Whatman 3MM паперу, суміші ізобутилової кислоти та гідроксиду амонію у співвідношенні 100:60, що містила 1 мM EDTA. Для ідентифікації радіоактивно мічених продуктів використовували “Phosphoimager system” (Bio-Rad). Визначення дефосфо-КoA-кіназної активності імунних комплексів або рекомбінантної форми His-dPКoAK проводили при 25 ⁰ C протягом 30 хв у буфері, що містив 150 мM трис-HCl, pH 8,0, 10 мM MgCl₂, 1,5 мM DTT, 0,2 мM dPКoA, 0,25 мM ATР, 0,5 мкКi [-³²P]ATР. Продукти реакції розділяли, також, за допомогою низхідної паперової хроматографії.

Як вже зазначалось, аналіз гомологічних сайтів фосфорилювання у S6K1 та S6K2 свідчить про відсутність у S6K2 одного з них, який розташований у псевдосубстратному автоінгібіторному домені S6K1. Було зроблено припущення, що можливо з цим пов'язані відмінності в регуляції S6K за участі mTOR. Дані, наведені на рис. 6 В, свідчать, що створення додаткового сайта фосфорилювання у S6K2, гомологічного Thr444 у S6K1, шляхом введення заміни Val433Thr призводить як до підвищення загальної активності S6K2, так і чутливості кінази до інгібіторної дії рапаміцину. Таким чином, можна припустити, що фосфорилювання Thr444 у S6K1 також відбувається в mTOR-залежний спосіб і є важливим для активації кінази. Крім того регуляція активності на цьому рівні у S6K2 відсутня.

Для визначення ролі РІ3К в регуляції активності S6K2 клітини культивували у присутності різних концентрацій вортманіну після стимуляції клітин сироваткою. Суттєвих відмінностей у рівні інгібування активності S6K1 та S6K2 кіназ виявлено не було (рис. 7). Результати представлених експериментів дають підставу вважати, що РІ3К-залежний сигнальний шлях залучений до регуляції мітогенної активації S6K2 таким же чином, як і S6K1.

Для підтвердження регуляторної ролі фосфорилювання Thr444 y S6K1 в регуляції активності кінази за участі mTOR досліджено мутантні форми S6K1 та S6K2, що не мали С-кінцевих ділянок де саме розташований Thr444. Представлені дані (рис. 8) свідчать про суттєве зменшення чутливості S6K1/С₁₀₀ до інгібіторного ефекту рапаміцину. Натомість помітних змін у чутливості S6K2/C₈₁ до рапаміцину, як і передбачалось, не виявлено.

Можна зробити висновок про те, що саме з відмінностями у структурі С-кінцевих ділянок S6K1 і S6K2, і наявністю у S6K1 додаткового сайту фосфорилювання, відсутнього у S6K2, пов'язана різна чутливість кіназ до регуляторного впливу mTOR.

Порівняння інгібіторного впливу вортманіну на стимульовану сироваткою активність вкорочених та повнорозмірних форм S6K1 та S6K2 не виявило суттєвих відмінностей в їхній чутливості.

S6K2 як субстрат для різних ізоформ РКС. Аналіз амінокислотної послідовності S6K2 дозволив виявити потенційний сайт фосфорилювання для РКС, розташований у С-кінцевій ділянці кінази (рис. 9) у межах додаткового сигналу ядерної локалізації (NLS2) (Lee-Fruman et al., 1999).

У структурі S6K1, що має дуже низьку гомологію з S6K2 у відповідній ділянці, додаткового NLS і відповідно подібного сайта фосфорилювання для РКС не виявлено.

Для того щоб перевірити, чи здатна РКС фосфорилювати С-кінцеву ділянку S6K2 in vitro, як субстрат для різних ізоформ РКС використовували рекомбінантні очищені С-кінцеві пептиди S6K1 та S6K2. Результати, які наведено на рис. 10, свідчать, що усі з перевірених ізоформ РКС ефективно фосфорилюють S6K2 на відміну від S6K1.

На наступному етапі було перевірено, чи може РКС використовувати як субстрат відповідні повнорозмірні форми S6K1 та S6K2, імунопреципітовані з НЕК293 клітин, трансфікованих відповідними конструкціями. Результати (рис. 11, А) свідчать, що всі з перевірених ізоформ РКС здатні фосфорилювати повнорозмірну форму S6K2, однак фосфорилювання S6K1 майже не відрізнялось від контрольних показників і було приблизно на рівні автофосфорилювання. Дослідження мутантних форм S6K2, які мали N- (S6K2/N₆₇) та C-кінцеві делеції (S6K2/C₈₁), свідчить, що сайт фосфорилювання, як і передбачалось, розташований у С-кінцевій ділянці S6K2 (рис. 11, Б).

Треба зазначити, що в цих умовах експерименту найвищий рівень фосфорилювання S6K2 виявлено для РКСд порівняно з іншими ізоформами РКС.

Ідентифікація сайта фосфорилювання РКС у структурі S6K2 методом мaс-спектрального аналізу. Сайт фосфорилювання в послідовності S6K2 ідентифікували за допомогою мас-спектрального аналізу. Афінно очищений пептид His-S6K2/С використовували як субстрат для фосфорилювання РКСд. Протеолітичне розщеплення фосфорильованого пептиду проводили ендонуклеазою Lys-С з подальшим мас-спектральним аналізом протеолітичних фрагментів. MALDI MS аналіз пептидів дозволив ідентифікувати сайт фосфорилювання як Ser486.

Аналіз фосфорилювання S6K2 по залишку Ser486 у відповідь на мітогенну стимуляцію клітин. Для аналізу фізіологічної значущості фосфорилювання Ser486 було отримано анти-рSer486 поліклональні антитіла. Для цього як антиген використовували штучно синтезований пептид, що відповідав 11 С-кінцевим амінокислотним залишкам S6K2 і при цьому містив фосфорильований залишок Ser486 (SGTKKS⁴⁸⁶KRGRG). Специфічність антитіл перевіряли методом Вестерн-блот аналізу рекомбінантних S6K до та після фосфорилювання РКС. Із використанням вказаних антитіл досліджували вплив різноманітних позаклітинних стимулів на рівень фосфорилювання S6К2 по залишку Ser486.

Як видно з результатів, наведених на рис. 12, найсуттєвіше підвищення фосфорилювання Ser486 у S6K2 відбувається після стимуляції клітин РМА, що є відомим індуктором РКС.

Вплив РКС-залежного фосфорилювання S6K2 на кіназну активність. Оскільки S6К кінази активуються в результаті множинного фосфорилювання по залишках Ser та Тhr, було важливим детальніше дослідити ефект фосфорилювання Ser486 на кіназну активність S6K2 та визначити сигнальні шляхи, залучені до регуляції цього фосфорилювання. Як свідчать дані, представлені на рис. 13, стимуляція клітин РМА призводить до значного підвищення активності S6K2.

Дослідження впливу інгібіторів РІ3К і mTOR вортманіну і рапаміцину свідчать, що індукована РМА активація S6K2 не залежить від фосфорилювання Ser486 (рис. 14), оскільки суттєве зменшення активності S6K2 внаслідок дії інгібіторів не супроводжувалось зниженням рівня фосфорилювання S6K2. Крім того, заміна Ser486 на незаряджену амінокислоту Ala повністю унеможливлювала РМА-індуковане фосфорилювання, однак ніяким чином не впливала на індуковану РМА активність (рис. 14).

Роль фосфорилювання Ser486 для субклітинної локалізації S6K2. Як зазначалося вище, у структурі S6K2 в межах регуляторної С-кінцевої ділянки ідентифіковано додатковий сигнал ядерної локалізації NLS 2, відсутній у S6K1. Оскільки Ser486 розташований саме в межах цього сигналу, логічним було б припустити, що його фосфорилювання може впливати на субклітинну локалізацію S6K2.

Щоб перевірити цю гіпотезу було досліджено субклітинну локалізацію рекомбінантних S6K1 та S6K2 у трансфікованих клітинах НЕК293 у відповідь на їхню стимуляцію РМА. Результати конфокальної мікроскопії свідчать, що локалізація S6K2 суттєво відрізняється від такої для S6K1. На відміну від S6K1, що переважно була локалізована у цитоплазмі, у клітинах, не стимульованих РМА, S6K2 виявлено в ядрі (рис. 15). Стимуляція ж клітин РМА призводила до різкого зменшення вмісту S6K2 у ядрі і до збільшення в цитоплазмі. Таким чином, стимуляція клітин РМА призводить до транслокації S6K2 з ядра до цитоплазми. За цих умов суттєвих змін у локалізації S6K1 не спостерігали.

Оскільки одним із основних наслідків стимуляції клітин РМА є фосфорилювання S6K2 по Ser486 було зроблено припущення, що саме фосфорилюванням Ser486 супроводжується перерозподіл кінази з ядра до цитоплазми. Для перевірки цього було визначено локалізацію фосфорильованої по Ser486 S6K2 для чого використовували анти-рSer486 антитіла.

Результати наведені на рис. 16 свідчать, що S6K2_рSer486 локалізована винятково в цитоплазмі звідки витікає, що фосфорилювання S6K2 за Ser486 призводить саме до блокування NLS. Однак лишалось не зрозумілим де саме відбувається фосфорилювання чи в ядрі, чи в цитоплазмі. Для з'ясування цього питання було застосовано інгібітор ядерного експорту лептоміцин В (LMB). Клітинам додавали LMB попередньо до стимуляції РМА, однак і за цих умов S6K2_рSer486 було детектовано винятково в цитоплазмі, що свідчить на користь цитоплазматичного походження Ser486 фосфорилювання. Відповідно, індуковане РМА, накопичення S6K2 у цитоплазмі не є результатом активації ядерного експорту, а наслідком блокування ядерного імпорту, що в свою чергу свідчить про існування постійного обміну між ядерною і цитоплазматичною фракціями S6K2.

Для підтвердження значущості Ser486 фосфорилювання у регуляції ядерно/цитоплазматичної локалізації S6K2 було досліджено локалізацію мутантної форми S6K2/S486E, де Ser було замінено на кислу амінокислоту Glu і, тим самим, модельовано фосфорильований стан S6K2 Як свідчать отримані дані, фосфорилювання за Ser486 є не єдиним чинником, необхідним для затримки S6K2 в цитоплазмі, оскільки мутантна форма S6K2/S486E, подібно до S6K2 дикого типу, була всупереч очікувань локалізована переважно у ядрі клітин і лише стимуляція РМА призводила до накопичення кінази в цитоплазмі. Натомість додаткова мутація (Т401D/S486E) S6K2, що за вищенаведеними даними спричинювала активацію кінази, дійсно призводила до затримки S6K2 в цитоплазмі незалежно від стимуляції РМА. Таким чином фосфорилювання Thr401 і відповідно активація S6К2 так само, як і фосфорилювання Ser486, є головними чинниками в регуляції балансу S6K2 в ядрі і цитоплазмі.

Особливості експресії S6K1/S6K2 в різних тканинах ссавців на рівні мРНК та білка. Рівень експресії мРНК для S6K1 та S6K2 в різних тканинах людини визначали методом Нозерн-блот аналізу препаратів тотальних мРНК, отриманих із різних органів людини. Результати, які наведено на рис. 17, свідчать, що в тканинах людини виявлено один специфічний транскрипт для мРНК S6K2 розміром 2,2 тис. п. н. Натомість S6K1-специфічні проби гібридизувалися з двома транскриптами розміром 3,4 та 7,4 тис. п. н. Профіль експресії мРНК S6K1 та S6K2 в різних органах людини був подібним, і загалом експресія S6K була тканиноспецифічною. Найвищий вміст S6K1/S6K2 мРНК виявлено в серці, скелетних м'язах, селезінці, передміхуровій залозі, товстій кишці та лімфоцитах. Низький рівень виявлено в мозку, легенях і нирках.

Рівень експресії S6K в різних органах щура досліджували з використанням поліклональних антитіл отриманих проти рекомбінантних С-кінцевих фрагментів S6K1 та S6K2, що мають самий низький рівень гомології (рис. 18).

Як S6К1, так і S6К2 виявлено в усіх досліджуваних тканинах. Для S6К1 найвищий рівень експресії знайдено в мозку та м'язах, дещо нижчий, однак досить високий у тимусі, сім'яниках, серці, яєчниках та легенях; незначний - в передміхуровій залозі та нирках і майже зовсім не виявлено експресії в щитовидній залозі, селезінці, печінці і кишечнику. Для S6К1 та S6К2 спостерігали в цілому подібний розподіл рівня експресії залежно від тканини, однак для S6К1 найвищий рівень експресії було виявлено у мозку та м'язах, а для S6К2 - в сім'яниках та яєчниках.

Порівнюючи отримані результати із закономірностями експресії відповідних мРНК, виявлених Нозерн-блот аналізом, можна зробити висновок про відсутність повної кореляції між рівнем експресії S6К1 та S6К2 на рівні мРНК і білка. Це можна пов'язати, в першу чергу, з різною ефективністю трансляції мРНК в різних тканинах і припустити існування регуляції експресії S6K на рівні трансляції мРНК.