Структурно-функціональні особливості кіназ рибосомного білка S6 - S6К1 та S6К2
Форма мітоген-залежної кінази рибосомного білка S6 – S6K2. Докази існування відмінностей у функціонуванні кіназ у клітин та особливості регуляції їхньої активності. Механізм регуляції балансу між вмістом ядерної та цитоплазматичної фракцій S6K2.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 29.07.2014 |
| Размер файла | 81,3 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Визначення білків асоційованих з S6K. Для виявлення нових функціональних зв'язків S6K було застосовано дріжджову двогібридну систему, що широко застосовується у світі для визначення білково-білкових взаємодій. Створено низку "bait"-конструкцій, що відповідали повнорозмірним формам, С- та N-кінцевим фрагментам S6K1 і S6K2. Однак лише “bait”-конструкція повнорозмірної форми S6K1 задовольняла вимогам системи і відповідно її використовували надалі. Скринування кДНК бібліотеки 19-денних ембріонів мишей дозволило ідентифікувати декілька позитивних клонів, однак подальший аналіз підтвердив специфічність лише одного клону (№ 2). Аналіз нуклеотидної послідовності кДНК позитивного клону з використанням баз даних дозволив виявити високу гомологію центральної ділянки білкового продукту (розрахованої молекулярної маси 62 кДа) з фосфопантотенатаденілтрансферазою прокаріотів та нижчих еукаріотів. C-кінцева ділянка мала натомість високу гомологію з каталітичним доменом дефосфоКоА-кіназ. Крім того, серед вищих еукаріотів ідентифіковано декілька функціонально не охарактеризованих білків, які мали гіпотетичні фосфопантотенатаденілтрансферазний та дефосфоКоА-кіназний домени (рис. 19).
Згідно з даними літератури біохімічно було охарактеризовано лише ензим очищений із печінки свині, що мав фосфопантотенатаденілтрансферазну та дефосфоКоА-кіназну активності одночасно (Warral et al., 1982). Однак амінокислотну послідовність відповідного ензиму не було визначено, як не було ідентифіковано і його ген, а тому гіпотезу про існування біфункціонального білка не було остаточно підтверджено. Відповідно було висунуто гіпотезу, що кДНК клону 2 кодує біфункціональний ензим - КоА-синтазу, який каталізує два останніх етапи біосинтезу КоА.
Визначення прогнозованих активностей КоА-синтази. Для підтвердження висунутої гіпотези кДНК клону 2 та її фрагмент, що відповідає дефосфоКоА-кіназному домену, було експресовано в клітинах бактерій і ссавців відповідно. Ензиматичну активність рекомбінантних білків визначали з використанням як субстратів фосфопантотенату та dPКoA (рис. 20).
Згідно з наведеними даними, повнорозмірна форма білка використовує як субстрат для синтезу КоА як фосфопантотенат, так і dPКoA. Натомість субстратом фрагмента білка, що містить лише dPКoAК домен, є лише dPКoA. Перевірка активності мутантної форми КоА-синтази, у якої His203 замінено на Ala, що, за даними літератури, призводить до блокування активності фосфопантотенатаденілтрансферази бактерій (Izard et al., 1999), свідчить, що ця заміна є критичною і для аналогічної активності КоА-синтази.
Таким чином, представлені дані свідчать, що кДНК S6K1-зв'язувального білка кодує біфункціональний фермент КоА-синтазу.
Підтвердження взаємодії S6K та КоА-синтази у клітинах ссавців. Для підтвердження взаємодії між S6K1 та КоА-синтазою та перевірки здатності S6K2 утворювати комплекс з КоА-синтазою відповідні рекомбінантні білки (EE-S6K1, ЕЕ-S6K2, Myc-КоА-синтаза) експресували в клітинах НЕК293. Гіпотетичні комплекси преципітували з використанням анти-ЕЕ антитіл і аналізували за допомогою анти-Мус антитіл. Згідно з еспериментальними даними (рис. 21), як S6K1, так і S6K2 здатні до утворення комплексу з КоА-синтазою в клітинах ссавців.
Існування комплексу між ендогенними білками було підтверджено аналогічним шляхом, однак преципітацію ендогенної КоА-синтази проводили за допомогою поліклональних антитіл отриманих проти С-кінцевого фрагмента КоА-синтази, а присутність S6K у складі комплексу визначали за активністю S6K в реакції фосфорилювання S6 рибосомного білка (рис. 22).
Для визначення клітинних компартментів де може відбуватися утворення S6K/КоА-синтаза комплексу було проаналізовано субклітинну локалізацію КоА-синтази, експресованої в клітинах НЕК293. Оскільки за даними літератури КоА-синтезується в цитозолі чи в примітохонріальних ділянках, або навіть в матриксі мітохондрії (Robishaw et al., 1982; Tahiliani et al., 1987), було одночасно визначено локалізацію мітохондрій, для чого застосовували специфічний для мітохондрій барвник MitoTracker.
Представлені дані (рис. 23) свідчать про майже виняткову колокалізацію КоА-синтази з мітохондріями, де саме і може утворюватися комплекс з S6K. Згідно з дослідженями субклітинної локалізації S6K, таку можливість не можна виключати.
Аналізуючи функціональне значення виявленої взаємодії S6K з КоА-синтазою, встановлено, що надекспресія КоА-синтази в клітинах не впливає на рівень фосфорилювання S6 рибосомного білка. Аналогічно надекспресія S6K2 не впливала на активність КоА-синтази. Таким чином, на сьогодні фізіологічне значення встановленої взаємодії лишається незрозумілим. Однак існують дані літератури щодо ролі S6K в біогенезі ліпідів та енергетичному метаболізмі клітини, процесів, де КоА відіграє одну з провідних ролей (Thomas et al., 2005). З огляду на те, що біосинтез білка є самим енергомістким процесом у клітині існування функціонального зв'язку S6K з біогенезом КоА є цілком логічним.
Особливості експресії S6К1 та S6К2 при злоякісній трансформації. Як уже зазначалося, ціла низка патологій, включаючи злоякісну трансформацію клітини, діабет, ожиріння, серцево-судинні захворювання та інші, супроводжується порушеннями функціонування сигнальних систем. У багатьох випадках компоненти сигнальних систем використовують у сучасній онкології як біомаркери злоякісної трансформації, а також як безпосередні мішені в специфічній хіміо- та імунотерапії онкологічних захворювань. Беручи до уваги те, що біогенез рибосом і відповідно рівень білкового синтезу в злоякісних клітинах зазнають суттєвих змін, цілком логічним було б припустити існування змін в експресії представників родини S6K.
За даними літератури (Wu et al., 2000), високий рівень експресії S6K1 виявлено як у клітинах аденокарциноми молочної залози людини лінії MCF7, так і в злоякісних пухлинах молочної залози.
Досліджено цілу низку клітинних ліній аденокарциноми молочної залози та виявлено в них підвищений вміст обох форм кіназ. Порівняльний аналіз рівня експресії S6K1 та S6K2 у пухлинах молочної залози та в умовно нормальних тканинах, що їх оточують, також свідчить про суттєві зміни. Вестерн-блот аналіз гомогенатів доброякісних пухлин виявив підвищений рівень експресії S6K1 у половині проаналізованих зразків (рис. 24 А, Б). При цьому помітних змін в експресії S6K2 не виявлено. Натомість, у пухлинах аденокарцином молочної залози виявлено значне підвищення експресії як S6K1, так і S6K2 (рис. 24, В).
Визначення рівня експресії S6K у пухлинах з огляду на рівень їхньої диференціації свідчить про статистично достовірне його підвищення як для S6K1, так і S6K2 в пухлинах низького ступеня проліферації і відповідно високого рівня злоякісності (рис. 25).
Імуногістохімічні дослідження зразків пухлин та умовно нормальних тканин виявили дуже цікаву закономірність. Поряд із незначним рівнем експресії обидві форми кінази було детектовано винятково в цитоплазмі клітин нормальних тканин (рис. 26). Натомість у клітинах доброякісних та злоякісних пухлин спостерігали суттєве накопичення кіназ як у цитоплазмі, так і в ядрі.
Особливо ця тенденція виявилася характерною для S6K2. Ядерну локалізацію S6K2 було детектовано в близько 80 % досліджуваних пухлин. Показники для S6K1 були значно меншими. Таким чином, існує чітка тенденція до накопичення S6K2 у ядрі злоякісних клітин, пов'язана як із підвищенням рівня її експресії, так і змінами в регуляції балансу між вмістом S6K2 у цитоплазмі та ядрі. Можливим наслідком цього процесу є зміни в експресії відповідних генів, причетних до підтримки високого рівня проліферації пухлин. Дійсно, високий вміст S6K2 виявлено в зонах контакту пухлини з оточуючих їх тканинами, які за морфологічними ознаками нагадують зони інвазивного росту пухлини. Крім того, для S6K2, але не S6K1 виявлено кореляцію між збільшенням вмісту S6K2 в ядрі та експресією відомих маркерів проліферації PCNA та Ki-67.
Дослідження інших типів пухлин, а саме - щитовидної залози та ендометрію людини свідчить, що для них теж характерним є збільшення вмісту кіназ в доброякісних та злоякісних пухлинах а також тенденція до транслокації S6K у ядро, що більшою мірою стосується S6K2 (Таблиця).
Таким чином, ідентифіковано нову кіназу S6K2, яка згідно з результатами аналізу первинної структури, має високий рівень гомології і подібну доменну організацію з уже відомою кіназою рибосомного білка S6; два альтернативних старти трансляції і, можливо, аналогічно з S6К1 існує у вигляді двох ізоформ S6К2/I та S6К2/IІ. S6K2 ефективно фосфорилює як субстрат рибосомний білок S6, має гомологічні з S6K1 сайти фосфорилювання, ключові для її активації і знаходиться під контролем РІ3K/mTOR-залежного сигнального каскаду.
З огляду на представлені експериментальні дані, щодо субстратної специфічності S6K та особливостей регуляції їхньої активності запропоновано модель ролі S6K в передачі позаклітинних стимулів опосередкованій PI3К/mTOR-залежним сигнальним каскадом (рис. 27).
Високий рівень структурної гомології і, як наслідок, подібна субстратна специфічність свідчить, що кінази можуть виконувати у клітині схожі функції, а саме приймають участь у регуляції білкового синтезу шляхом регуляції трансляції мРНК компонентів апарату трансляції: рибосомних білків та факторів ініціації трансляції.
Однак визначені особливості в механізмах регуляції активності S6K вказують і на відмінності в їхньому функціонуванні у клітині. Оскільки S6K1 є більш залежною порівняно з S6K2 від mTOR кінази, активність якої контролюється не лише мітогенними факторами, а і вмістом поживних речовин, можна зробити припущення, що активність S6K1 необхідна як для контролю загального білкового синтезу, так і стимульованого мітогенними факторами. Натомість активність S6K2 в більшій мірі виявляється залежною від мітогенних стимулів і, відповідно, кіназа залучена до мітогено-активованої регуляції біосинтезу. Крім того, кінетика активації S6K2 мітогенами свідчить, що S6K2 забезпечує ранню, порівняно з S6K1, відповідь клітин на мітогенні стимули.
Ідентифікування нових субстратів S6K1, згідно даних літератури, а саме проапоптичного білка BAD, білка залученого до сплайсингу CP80, UBF фактора транскрипції генів рибосомних РНК, субстрату інсулінового рецептора свідчить, що функції S6K1 не обмежується лише регуляцією трансляції мРНК.
Цілком імовірно, що все це стосується і S6K2, оскільки на сьогодні вже встановлено, що S6K2 здатна фосфорилювати деякі із вказаних субстратів. При цьому, з огляду на подібну субстратну специфічність кіназ, розподіл функцій між S6K може забезпечуватися їхньою субклітинною локалізацією та відмінностями в механізмах активації. Приймаючи до уваги існування додаткового сигналу ядерної локалізації та встановленого механізму регуляції вмісту S6K2 в цитоплазмі та в ядрі за участі РКС, цілком імовірно, що функції S6K2, в більшій мірі аніж S6K1 пов'язані з використанням ядерних субстратів. Саме S6K2 може бути в першу чергу залучена до регуляції експресії генів рибосомних РНК шляхом регуляції активності фактора транскрипції UBF. Однак не можна виключати використання і інших ядерних субстратів. На користь цього свідчить високий вміст S6K2 в ядрах злоякісних клітин, що корелює з підвищеним рівнем проліферації неопластичних клітин.
Визначення КоА-синтази як S6K-зв'язувального білка вказує на зв'язок PI3K/mTOR сигнального каскаду з цілою низкою метаболічних процесів у клітині залежних від КоА, в тому числі і з енергетичним метаболізмом клітини. Той факт, що біосинтез білка є самим енергомістким процесом у клітині, існування зв'язку між механізмами регуляції білкового синтезу та регуляції енерговідновлення у клітині є цілком логічним однак потребує більш детального дослідження.
З огляду на підвищення рівня експресії S6K та субклітинний перерозподіл кіназ, особливо S6K2, можна зробити висновок про існування суттєвих змін в функціонуванні кіназ при злоякісній трансформації, що пов'язані як зі змінами в механізмах регуляції їхньої експресії, так і субклітинної локалізації. Беручи до уваги провідну роль РКС в регуляції балансу цитоплазматичної та ядерної фракцій S6K2, можна припустити, що це пов'язано зі змінами в функціонуванні цієї кінази. Наведені дані, щодо особливостей експресії S6K в злоякісних клітинах роблять їх привабливими об'єктами для подальшого дослідження з огляду на можливість їхнього використання як діагностичних та прогностичних маркерів, а також перспективних мішеней для хіміотерапії онкологічних захворювань.
ВИСНОВКИ
Доведено існування родини високогомологічних кіназ рибосомного білка S6 у ссавців, представниками якої є S6K1 та S6K2. Структурно-функціональна організація S6К1 та S6К2 свідчить як про подібність, так і відмінності в їхньому функціонуванні у клітині, що забезпечується на рівні регуляції активності кіназ та їхньої субклітинної локалізації.
1. Ідентифіковано нову форму кінази рибосомного білка S6 людини - S6К2, що має значну гомологію на рівні первинної структури, аналогічну доменну організацію та гомологічні сайти фосфорилювання з уже відомою формою кінази S6K1.
2. Доведено, що білок малої 40S субчастинки рибосом S6 є специфічним субстратом S6К2 аналогічно з S6К1.
3. Встановлено, що активація S6К2 відбувається у відповідь на мітогенну стимуляцію клітин, однак кінетика активації S6К2 та S6К1 суттєво відрізняється.
4. Показано, що гомологічні сайти фосфорилювання у S6К1 і S6К2 - Thr412/401 і Thr252/241, відповідно, є ключовими для активації кіназ.
5. Доведено, що регуляція активності як S6К1, так і S6К2 знаходиться під контролем РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху, однак роль mTOR кінази в регуляції активності S6К2 є значно меншою порівняно з S6К1, що пов'язано з особливостями будови С-кінцевих регуляторних ділянок S6K.
6. Виявлено існування РКС-залежної регуляції субклітинної локалізації S6К2 у цитоплазмі та в ядрі, що відбувається шляхом фосфорилювання Ser486 розташованого в межах додаткового сигналу ядерної локалізації S6К2.
7. Ідентифіковано S6К-зв'язувальний білок - КоА-синтазу, що вказує на зв'язок S6K та РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху з низкою метаболічних процесів у клітині.
8. Встановлено, що КоА-синтаза локалізована переважно на мітохондріях, де саме і може відбуватися взаємодія S6K1 та KoA-синтази.
9. Визначено структурні елементи S6K1 та KoA-синтази відповідальні за утворення білково-білкового комплексу та мітохондріальну локалізацію KoA-синтази, а саме - їхні С-кінцеві регуляторні ділянки та N-кінцевий гідрофобний фрагмент КоА-синтази відповідно.
10. Вперше визначено первинну структуру КоА-синтази і доведено, що це є біфункціональний ензим, який каталізує два останніх етапи біогенезу КоА.
11. Порівняльний аналіз вмісту S6К1 і S6К2 у нормальних тканинах та у пухлинах молочної залози людини свідчить про підвищений рівень експресії S6K1 в аденомах та аденокарциномах, а S6K2 - лише в аденокарциномах молочної залози.
12. Аналіз субклітинної локалізації S6К у різних типах пухлин людини вказує на тенденцію до накопичення S6K і більшою мірою S6K2 у ядрі злоякісних клітин, що, можливо, пов'язано із змінами в регуляції ядерно-цитоплазматичного транспорту S6K за участі РКС.
13. Встановлено кореляцію між підвищенням рівня проліферації злоякісних клітин та ядерною локалізацією S6K2, але не S6K1.
14. Запропоновано модель ролі S6K1 та S6K2 у передачі позаклітинних стимулів опосередкованій PI3К/mTOR-залежним сигнальним каскадом.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Вартанян О. А., Машанов-Голиков А. В., Вольфсон А. Д., Захарова О. Д., Лаврик О. И., Филоненко В. В., Берестень С. Ф. Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы млекопитающих и получение моноклональных антител // Молекуляр. биология - 1990. - Т. 24, № 3. - С. 788-794. (Автором модифіковано методику отримання моноклональних антитіл, підготовлено статтю до друку).
2. Gout I., Minami T., Hara K., Tsujishita Y., Filonenko V., Waterfield M. D., Yonezawa K.. Molecular cloning and characterization of a novel p70 S6 kinase, p70 kinase , containing a prolin-rich region // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, № 46. - Р. 30061-30064. (Автором проведено клонування рекомбінантних форм S6K2, визначено вплив інгібіторів вортманіну та рапаміцину на активність кінази, досліджено експресію мРНК у тканинах ссавців).
3. Погребной П. В., Кухаренко А. П., Тихонкова И. А., Пальчевский С. С., Cавинская Л. А., Погребная А. П., Валевка Т. И., Маркеева Н. В., Солдаткина М. А., Мацука Г. Х., Гут И. Т, Филоненко В. В. Получение и характеристика моноклональных антител против р70S6-киназы б// Экспериментальная онкология. - 1999. - Т. 21, № 3 - С. 232-238. (Автором клоновано кДНК С-кінцевого фрагменту S6K1 у відповідний вектор, рекомбінантний пептид експресовано у клітинах бактерій, проведено його очищення та подальшу імунізацію тварин, охарактеризовано моноклональні антитіла, підготовлено статтю до друку).
4. Вальовка Т. Й, Філоненко В. В., Пальчевський С. С, Великий М. М., Дробот Л. Б., Вотерфилд М., Мацука Г. Х., Гут І. Т. Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного S6 білка типу в // Біополімери і клітина. - 1999.- Т. 15, № 5. - C. 415-421. (Автором досліджено кінетику активації S6К1 та S6К2 сироваткою крові, підготовлено статтю до друку).
5. Роднін М. В., Тихонкова І. О., Філоненко В. В., Дробот Л. Б., Мацука Г. Х., Гут І. Т. Пошук та характеристика антигенів меланоми за допомогою методу SEREX// Біополімери і клітина.-2000.- Т. 16, № 5. - C. 339-345. (За участі автора сформульовано завдання дослідження, проведено очистку Кі67 антигену, підготовлено статтю до друку).
6. Вальовка Т. Й., Філоненко В. В., Великий М. М., Дробот Л. Б., Вотерфілд М., Мацука Г. Х., Гут І. Т. Особливості фібронектин-залежної активації кіназ рибосомного білка S6 (S6K1 i S6K2) // Укр. бiохім. журн.- 2000.- Т. 3, № 3. - C. 31-37. (Автором проведено клонування S6K1 i S6K2 у вектори для експресії в клітинах ссавців, визначено активність S6K, підготовлено статтю до друку).
7. Савінська Л. О., Киямова Р. Г., Погрібний П. В., Овчаренко Г. В., Гут І. Т., Філоненко В. В. Порівняльна характеристика експресії б та в ізоформ S6 кінази в тканинах ссавців// Біополімери і клітина.- 2001. -Т. 17, № 5.-С. 374-378. (Автором сформульовано завдання дослідження, підготовлено статтю до друку).
8. Живолуп О. М., Немазаний І. О., Побігайло Н. В., Панасюк Г. Г., Пальчевський С. С., Кухаренко О. П., Савінська Л. О., Овчаренко Г. В., Вудмаска М. І., Гут І. Т., Мацука Г. Х., Філоненко В. В. Використання дріжджової двогібридної системи для пошуку S6К1 та S6К2 зв'язувальних партнерів// Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 2.-С. 102-109. (Автором сплановано виконання експериментів, підготовлено статтю до друку).
9. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Babich A., Panasyuk G., Pobigailo N., Vudmaska M., Naidenov V., Kukharenko O., Palchevskii S., Savinska L., Ovcharenko G., Verdier F., Valovka T., Fenton T., Rebholz H., Wang M. L., Shepherd P., Matsuka G., Filonenko V., Gout I. T. Molecular cloning of CoA Synthase. The missing link in CoA biosynthesis // J.Biol.Chem. -2002. -Vol. 277, № 25. - Р. 22107-22110. (За участі автора сплановано завдання дослідження, проаналізовано кДНК бібліотеку мишей з використанням “bait” конструкцій S6K1, проведено ідентифікацію позитивних клонів, отримано антитіла до КоА-синтази, визначено рівень експресії КоА-синтази в різних тканинах щура, проведено мутаційний аналіз).
10. Valovka T., Verdier F., Cramer R., Zhyvoloup A., Fenton T., Rebholz H., Wang M. L., Gzhegotsky M., Lutsyk A., Matsuka G., Filonenko V., Wang L., Proud C.G, Parker P. J., Gout I. T. Protein kinase C phosphorylates ribosomal protein S6 kinase в II and regulates its subcellular localization // Mol. Cell. Biol. - 2003.-Vol. 23, № 3. - С. 852-863. (Автором проведено дослідження рівня фосфорилювання рекомбінантних форм S6K1 i S6K2 за участі РКС та вплив на нього мітогенних факторів. Клоновано мутантні форми S6K2. За участі автора проаналізовано анти-Ser486 антитіла, досліджено субклітинну локалізацію мутантних форм S6K2 у трансфікованих клітинах НЕК 293).
11. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Valovka T., Fenton T., Rebholz H., Wang M. L., Foxon R., Lyzogubov V., Usenko V., Kyyamova R., Gorbenko O., Matsuka G., Filonenko V., Gout I. Subcellular localization and regulation of Coenzyme A Synthase// J.Biol.Chem.-2003. -Vol. 278, № 50. - Р. 50316-50321. (За учаті автора сплановано мету дослідження, визначено роль гідрофобних ділянок КоА-синтази для субклітинної локалізації, клоновано N-кінцеву послідовність КоА-синтази злитою з GFP).
12. Савінська Л. О., Усенко В. С., Лизогубов В. В., Погрібний П. В., Пальчевський С. С., Овчаренко Г. В., Чешук В. Г., Гут І. Т., Мацука Г. Х., Філоненко В.В. Експресія - та - ізоформ р70S6 К у клітинних лініях та пухлинах молочної залози людини// Біополімери і клітина.-2003.-Т. 19, № 1. - Р. 64-71. (Автором сплановано завдання дослідження, підготовлено статтю до друку).
13. Lytvyn D. I., Dudchenko T. M., Lyzogubov V. V., Usenko V. S., Nespryadko S. V., Vinnitskaya A. B., Vorobyova L. I., Pal'chevskiy S. S., Filonenko V. V., Pogrebnoy P. V. Expression of б- and в-isoform of p70S6 kinase in human endometrial tumors// Experimental Oncology.- 2003.- Vol. 25, № 2. - P. 274-278. (За участі автора сплановано завдання дослідження, підготовлено статтю до друку).
14. Lysogubov V. V., Usenko V. S., Khojaenko Yu. S., Lytvyn M. A., Soldatkina M. A.., Rodnin N. V., Filonenko V. V., Pogrebniy P. V. Immunohistochemical analysis of p70S6 kinase in human thyroid tissue upon pathology// Experimental Oncology. - 2003. - Vol. 25, № 4, - P. 304-306. (Автором сплановані завдання дослідження, приготовані препарати пухлин для аналізу, підготовлено статтю до друку).
15. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Panayotou G., Gout I., Filonenko V. Specific interaction between S6K1 and CoA synthase: a potential link between the mTOR/S6K pathway, CoA biosynthesis and energy metabolism// FEBS Lett. - 2004.- Vol. 578, № 3. - Р. 357-362. (Автором сплановано завдання дослідження, клоновано мутантні форми КоА-синтази).
16. Panasyuk G., Nemazanyy I., Filonenko V., Zhyvoloup A. Large scale yeast transformation in low-percentage agarose medium// Biotechniques. - 2004. - Vol. 36, № 1. - P. 40-44. (За участі автора cформульовано ідею дослідження, підготовлено статтю до друку).
17. Savinska L. O., Lyzogubov V. V., Usenko V. S., Ovcharenko G. V., Gorbenko O. N., Rodnin M. V., Vudmaska M. I., Pogribniy P. V., Kyyamova R. G., Panasyuk G. G., Nemazanyy I. O., Malets M. S., Palchevskyy S. S., Gout I. T., Filonenko V. V. Immunohistochemical analysis of S6K1 and S6K2 expression in human breast tumors// Experimental Oncology.- 2004.-Vol. 26, № 1. - Р. 24-30. (Автором визначені завдання дослідження, очищено рекомбінантні форми S6K, підготовлено статтю до друку).
18. Filonenko V. V., Tytarenko R.., Azatjan S. K., Savinska L. O., Gaydar Y. A., Gout I. T., Usenko V. S., Lyzogubov V. V. Immunohistochemical analysis of S6K1 and S6K2 subcellular localization in human breast tumors// Experimental Oncology. - 2004. - Vol. 26, № 4. - Р. 294-299. (Автором сформульовані завдання роботи щодо аналізу субклітинної локалізації S6K, проведено статистичну обробку даних, підготовлено статтю до друку).
19. Lyzogubov V. V., Lytvyn D. I., Dudchenko T. M., Lubchenko N. V., Pogrybniy P. V., Usenko V. S., Gout I. T., Filonenko V. V. Imunnohistochemical study of S6K1 and S6K2 expression in human endometrial adenocarcinomas// Experimental Oncology.-2004.- Vol. 26, № 4. -С. 287-293. (За участі автора сформульовані завдання дослідження та зроблені висновки з результатів, підготовлено статтю до друку).
20. Вальовка Т. Й., Гут І. Т., Філоненко В. В. Вплив точкових мутацій регуляторних амінокислотних залишків та делецій N- та С-кінцевих ділянок S6K1 та S6K2 на активність кіназ // Біополімери і клітина.-2005. - Т. 21, №1. - С. 42-48. (Автором проведено клонування та in vitro визначення активності мутантних форм S6K1 i S6K2, підготовлено статтю до друку).
21. Тихонкова І. О., Лізогубов В. B., Довгопола О. О., Коровін С. І., Овчаренко Г. В., Роднін М. В., Філоненко В. В. Дослідження структурно-функціональних властивостей імуногенного фрагмента білка Кі-67 та отримання до нього поліклональних та моноклональних антитіл// Біополімери і клітина. - 2005. - Т. 21, № 2. - С. 180-183. (Автором сплановано завдання дослідження та зроблено висновки, проведено статистичну обробку даних, підготовлено статтю до друку).
22. Lyzogubov V., Khozhaenko Yu., Usenko V., Antonjuk S., Ovcharenko G., Tikhonkova I., Filonenko V. Immunohistochemical analysis of Ki67; PCNA and S6K1/2 expression in human breast tumors// Experimental Oncology.-2005.- Vol. 27, № 2. - P. 141-144. (Автором сформульовано завдання дослідження, охарактеризовано анти-Кі67 антитіла, зроблено висновки з результатів. Підготовлено статтю до друку
23. Панасюк Г. Г., Немазаний І. О., Філоненко В. В. Ідентифікація ендогенних ізоформ кінази рибосомного білка S6 - S6K2// Біополімери і клітина.-2005.-Т. 21, № 3. С. 293-295. (Автором проведено очистку анти-S6K2 моноклональних антитіл, сплановано завдання дослідження та зроблено висновки з отриманих результатів, підготовлено статтю до друку).
24. Kiyamova R. G., Filonenko V. V. Tumor-associated antigens and development of immunotherapeutics strategies //Біополімери і клітина.-2005.-Т. 21, № 3. - С. 220-229. (Автором зроблено узагальнення даних літератури, підготовлено статтю до друку).
25. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Gout I. The identification and functional characterization of novel ribosomal S6 kinase binding partner//Rev. Oncol. - 17th meeting of the European Association for Cancer Research. - 2002. - Vol. 4, Sappl 1. - P. 1-10. (За участі автора сплановано завдання дослідження, проаналізовано кДНК бібліотеку мишей, проведено ідентифікацію позитивних клонів).
26. Filonenko V., Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Matsuka G., Gout I. Identification and characterization of p70S6 kinase binding partners by yeast two hybrid system 4th PARNAS conference Molecular Mechanisms of Cell Activation, Biological Signals and their target enzymes. - Wroclaw (Poland). - 2002. - P. 49. (За участі автора проаналізовано кДНК бібліотеку мишей, проведено ідентифікацію позитивних клонів).
27. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Matsuka G., Gout I. The use of yeast two-hybrid system for the identification of novel S6 kinase binding partners// Український біохімічний журнал. Матеріали VIII-го Українського біохімічного з'їзду. - Чернівці (Україна). - 2002, - Vol. 74, N 4b. Suppl. 2. - Р. 30. (За участі автора проаналізовано кДНК бібліотеку мишей, проведено ідентифікацію позитивних клонів, отримано антитіла до КоА-синтази).
28. Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Panasyuk G., Filonenko V. Subcellular localization and regulation of CoA synthase // EJB. - FEBS Special Meeting on Signal Transduction. - 2003. - Vol. 270, Suppl. 1. - P. 142. (За участі автора отримано антитіла до КоА-синтази, визначено рівень експресії КоА-синтази в різних тканинах щура, проведено мутаційний аналіз).
29. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. CoA synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo. Workshop on: The Proteins Controlling Cell Growth And Their Role In Tumour Formation: mTOR, TSC And PTEN Centre fore International meetings on Biology. - Madrid (Spain). - 2003. - P. 57. (За учаті автора визначено роль гідрофобних ділянок КоА-синтази для субклітинної локалізації, клоновано N-кінцеву послідовність КоА-синтази злитою з GFP).
30. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. CoA synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo // EJB. -29th FEBS Meeting. - Warsaw (Poland). - 2004- Vol. 271. - Suppl. 1. - P. 168. (За учаті автора сплановано мету дослідження, визначено роль гідрофобних ділянок КоА-синтази для субклітинної локалізації, клоновано N-кінцеву послідовність КоА-синтази злитою з GFP, досліджено рівень експресії КоА-синтази в тканинах ссавців).
31. Pogrebnoy P. V., Markeeva N. V., Pogrebnaya A. P., Savinskaya, L. A., Tykhonkova I. A., Gout I. T., Filonenko V. V., Matsuka G. Kh. Generation and characterization of monoclonal antibodies to p70S6kinase // The 2nd Congress of Oncologist from the CIS member States "Oncology-2000". - Kуiv (Ukraine). - 2000. - P. 158. (Автором клоновано кДНК С-кінцевого фрагменту S6K1 у відповідний вектор, пептид експресовано у клітинах бактерій, проведено його очищення та подальшу імунізацію тварин, охарактеризовано моноклональні антитіла).
32. Filonenko V., Savinska L., Ovcharenko G., Vudmaska M., Panasyuk G., Nemazanyy I., Palchevskyy S., Gout I. Oncogenic potential of ribosomal protein S6 kinase // Тези Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології. - Львів (Україна). - 2004. - C. 114.
33. Gout I., Filonenko V. Regulation of cell growth in normal and cancer cells // Укр. бiохім. журн. - 5-th Parnas conference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. - Київ (Україна). - 2005.-Vol. 77, № 2. - P. 21. (Автором узагальнені експериментальні дані субклітинної локалізації S6K в різних типах пухлин людини, проведено статистичну обробку даних).
34. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. Specific interaction between S6K1 and CoA syntase// Укр. бiохім. журн. - 5-th Parnas conference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. - Київ (Україна). - 2005.-Vol. 77, № 2. - P. 132. (За учаті автора визначено роль гідрофобних ділянок КоА-синтази для субклітинної локалізації, клоновано N-кінцеву послідовність КоА-синтази злитою з GFP, перевірено взаємодію КоА-синтази з S6K2).
35. Lyzogubov V., Tytarenko R., Usenko V., Ovcharenko G., Rodnin N., Tikhonkova I., Filonenko V. Immunohistochemical analysis of the S6K1/2 subcellular localization and ribosomal protein S6 phosphorylation in human breast cancer// Укр. бiохім. журн. - 5-th Parnas conference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. - Київ (Україна). - 2005.-Vol. 77, № 2. - P. 206. (Автором сформульовані завдання роботи щодо аналізу субклітинної локалізації S6K в пухлинах різних типів, проведено статистичну обробку даних).
36. Tykhonkova I. O., Rodnin M. V., Ovcharenko G. V., Dovgopola O. O., Lizogubov V. V., Filonenko V. V. The studies of immunological and structural functional properties of Ki-67 nuclear antigen fragment// Укр. бiохім. журн. - 5-th Parnas conference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. - Київ (Україна). - 2005.-Vol. 77, № 2. - P. 248. (Автором сформульовані завдання роботи, зроблено висновки).
АНОТАЦІЯ
Філоненко В. В. Структурно-функціональні особливості кіназ рибосомного білка S6 - S6К1 та S6К2. -Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.
Ідентифіковано нову форму мітоген-залежної кінази рибосомного білка S6 - S6K2, що має значну структурну гомологію з уже відомою формою S6K1. Доведено, що S6K2 аналогічно до S6K1 є складовою РІ3К/mTOR-залежного сигнального каскаду залученого до передачі позаклітинних мітогенних стимулів.
Незважаючи на високий рівень субстратної специфічності отримано докази існування відмінностой у функціонуванні кіназ у клітині, які пов'язані з особливостями регуляції їхньої активності та субклітинної локалізації.
Встановлено, що механізм, за яким відбувається регуляція балансу між вмістом ядерної та цитоплазматичної фракцій S6K2, потребує РКС опосередкованого фосфорилювання Ser486.
Виявлено суттєве зміни в експресії S6K в аденокарциномах молочної залози людини порівняно з нормальними тканинами та тенденцію до накопичення S6K в ядрах злоякісних клітин у пухлинах різного походження.
Ідентифіковано новий S6K-зв'язувальний партнер - КоА-синтазу, що свідчить про зв'язок РІ3К сигнального шляху з низкою метаболічних процесів у клітині.
Ключові слова: сигнальнi системи клiтини, S6K1, S6K2, онкогенез, мутагенез, КоА-синтаза, РКС, РІ3К, mTOR.
Филоненко В. В. Структурно-функциональные особенности киназ рибосомного белка S6 - S6К1 и S6К2. -Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.
Идентифицирована новая протеинкина, характеризующуяся в соответствии с анализом первичной структури ее кДНК высоким уровнем структурной гомологии с киназой рибосомного белка S6 - S6K1; аналогичной с S6К1 доменной организацией; наличием гомологичных с S6К1 сайтов фосфорилирования; наличием двух альтернативных стартов трансляции и соответственно предположительно двух изоформ. Это дает основание считать ее новой формой киназы рибосомного белка S6 - S6K2. Изучение ферментативной активности рекомбинантной S6K2/II свидетельствует, что S6K2/II еффективно фосфорилирует как субстрат рибосомный белок S6.
Киназа рибосомного белка S6 - S6К1 является одним из ключевых ферментов, участвующим в регуляции индуцированного митогенными факторами белкового синтеза, которая осуществляется путем активации трансляции мРНК компонентов аппарата трансляции - рибосомных белков и факторов эллонгации белкового синтеза. Известно, что на уровне S6K1 происходит интеграция внеклеточных стимулов, индуцированных как митогенными факторами, так и питательными веществами. При этом регуляция активности осуществляется опосредованно - через РІ3К/mTOR-зависимый сигнальный путь. Благодаря такой интеграции осуществляется дополнительный контроль клеточного роста и пролиферации, поскольку активация белкового синтеза осуществляется только при наличии обоих факторов.
Представленные данные свидетельствуют о том, что все вышеизложенное может касаться и S6K2. Результаты мутационного анализа гомологичных S6K1 сайтов фосфорилирования у S6K2 подтверждают их важность для регуляции активности киназы. Установлено, что митогенные стимулы также приводят к значительной активации S6K2 в реакции фосфорилирования рибосомного белка S6, а специфичные ингибиторы РІ3К и mTOR способны блокировать стимулированную сывороткой крови активацию S6K2. Однако при этом выявлены и существенные отличия в функционировании S6K1 и S6K2. Кинетика активации киназ сывороткой, несмотря на двухфазный характер, существенно отличается. Для S6K2 характерной оказалась более ранняя активация, по сравнению с S6K1. Установлено, что S6K2 менее чувствительна к ингибиторному воздействию рапамицина, что связано с особенностями структуры регуляторной С-концевой области S6K1 и S6K2, поскольку ее удаление приводит к снижению чувствительности S6K1, но при этом не имеет эффекта для S6K2.
Исследование белков-партнеров S6K методом двугибридной системы дрожжей, позволило идентифицировать кДНК КоА-синтазы и доказать, что это бифункциональный фермент, что катализирует два последних этапа биосинтеза КоА. Существование комплекса S6K и КоА-синтазы подтверждено в клетках млекопитающих. Тем самым впервые показана связь между сигнальными системами и системой биосинтеза КоА и соответственно целым рядом метаболических процессов в клетке.
Экспериментально подтверждено, что РКС способна фосфорилировать S6K2 по Ser486 как in vitro, так и in vivo, при этом фосфорилирование не влияет на ферментативную активность S6K2. Установлено, что фосфорилирование по этому сайту является ключевым для регулирования субклеточной локализации S6K2, поскольку при этом происходит блокирование NLS, приводящее к накоплению S6K2 в цитоплазме. Блокирование же ядерного экспорта ингибитором ядерных пор лептомицином В приводит к накоплению S6K2 в ядре клетки.
Таким образом, установлено существование постоянного обмена между ядерной и цитоплазматической фракциями S6K2. Функция ядерного пула S6K2 на сегодня не исследована, однако она, возможно, связана с использованием ядерных субстратов, которые могу быть общими с S6K1, а именно - фактором транскрипции CREM и UBF. Нельзя исключить и использования как субстрата ядерной фракции рибосомного белка S6. Таким образом, ядерная функция S6K2 может быть связана с регуляцией транскрипции целого спектра генов, в том числе и генов рибосомных РНК.
Целый ряд патологий, в первую очередь онкологических, сопровождается существенными изменениями в функционировании сигнальных систем. Изучение уровня экспрессии и субклеточной локализации S6K1 и S6K2 в разных типах опухолей человека свидетельствует, что они претерпевают существенные изменения по сравнению с таковыми в нормальных тканях. Содержание S6K в злокачественных тканях оказалось более высоким. Кроме того, обнаружено существенное накопление S6K в ядрах раковых клеток, причем в гораздо большей мере это наблюдалось для S6K2. Более чем в 80 % случаев аденокарциномы молочной железы детектировано высокое содержание S6K2. Аналогичная тенденция, хотя и в меньшей степени, наблюдалась и для злокачественных опухолей щитовидной железы и эндометрия.
Представленные данные свидетельствуют о существовании двух высокогомологичных форм киназ рибосомного белка S6, которые проявляют аналогичную субстратную специфичность. Функциональная же активность S6K1 и S6K2 благодаря отличиям в механизмах регуляции их активности и субклеточной локализации может существенно отличаться. Можна предположить, что функции S6K1/II связаны с цитоплазматическим компартментом и, в первую очередь, с регуляцией трансляции мРНК. Функции же S6K2 в большей степени ориентированы на ядро и, возможно, регуляцию транскрипции генов, в том числе и рибосомных РНК. Однако есть предпосылки считать, что многообразие функций S6K значительно шире. Возникновение двух форм S6K в процессе эволюции, по-видимому, связано с усложнением механизмов координированной регуляции биосинтеза белка.
Ключевые слова: сигнальные системы клетки, S6K1, S6K2, онкогенез, мутагенез, КоА-синтаза, РКС, РІ3К, mTOR.
Filonenko V. V. Structural and functional characteristics of ribosomal protein S6 kinases - S6K1 and S6K2. -Manuscript.
Thesis for Doctor degree in Biology, speciality 03.00.03 - molecular biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.
A new mitogen-dependent kinase of ribosomal protein S6 - S6K2 have been identified. S6K2 has a high level of structural homology with already known ribosomal protein S6 kinase S6K1.
Similar to S6K1, PI3K/mTOR dependent signaling pathway have been demonstrated to be involved in the regulation of S6K2 activity in response to mitogenic stimuli.
In spite of high substrate specificity the presented data suggest the sufficient differences in the kinase functioning in the cell due to mechanisms of the regulation of activity and subcellular localization. It was demonstrated that regulation of nuclear and cytoplasmic content of S6K2 requires phosphorylation of Ser486 mediated by PKC.
The new S6K2 binding partner - CoA synthase has been identified by yeast two-hybrid approach that suggest the possible link between PI3K signaling and regulation of number of metabolic events in the cell.
An elevated level of S6K expression and accumulation of S6K1 and to the greater extend S6K2 in the nuclei of malignant cells have been found in different types of human tumors.
Key words: signal transduction pathways, S6K1, S6K2, oncogenes, mutagens, CoA synthase, РКС, РІ3К, mTOR.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Основна структурно-функціональна одиниця всіх живих організмів. Основні типи клітин. Будова, розмноження клітин та утворення білка. Колоніальні та багатоклітинні організми. Заміщення відмерлих та пошкоджених тканин організму. Способи поділу клітин.
презентация [5,6 M], добавлен 18.12.2011Вивчення механізмів зміни, розмноження та реплікації генетичної інформації. Особливості організації, будови та функції клітин. Забезпечення редуплікації ДНК, синтезу РНК і білка. Характеристика еукаріотів та прокаріотів. Кінцеві продукти обміну речовин.
реферат [1,0 M], добавлен 19.10.2017Роль білків (білкових речовин) в живій природі, їх структура та біологічні функції. Трансляція і загальні вимоги до синтезу білка в безклітинній системі: рібосоми, аміноацил-тРНК-синтетази, транспортні РНК. Природа генетичної коди. Етапи синтезу білка.
реферат [31,7 K], добавлен 05.10.2009Первинна структура ланцюгів нуклеїнових кислот. Посттрансляційна модифікація білка: відщеплення метіоніну, утворення дисульфідних зв'язків та модифікація амінокислотних залишків. Інгібітори транскрипції та антибіотики, що пригнічують синтез білка.
презентация [11,0 M], добавлен 23.12.2012Розвиток ендокринології та вивчення ролі гормонів в пристосувальних реакціях організму. Структурно-функціональні особливості та патологічні стани наднирників у ембріонів та дітей, їх дослідження в процесі старіння у зрілих людей та осіб похилого віку.
дипломная работа [1,6 M], добавлен 12.02.2011Поняття і рівні регуляції експресії генів. Їх склад і будова, механізм формування і трансформування. Транскрипційний рівень регуляції. Приклад індукції і репресії. Регуляція експресії генів прокаріот, будова оперону. Огляд цього процесу у еукаріот.
презентация [1,7 M], добавлен 28.12.2013Біосинтез білка. Будова рибосом прокаріотів та еукаріотів. Роль мембран у формуванні клітинних компартментнів. Ароморфози як біологічний процес. Асиметричність плазматичної і внутрішніх мембран клітини. Транспортування речовин через мембрани.
контрольная работа [69,2 K], добавлен 04.11.2010Структурно-функціональні особливості екзотоксинів, їх класифікація та різновиди, механізм та особливості дії. Екзотоксини хвороботворних прокаріотичних мікроорганізмів: ботулотоксин, екзотоксин А, дифтерійний і антраксевий, правцевий і стафілококовий.
курсовая работа [1,7 M], добавлен 15.06.2014Вплив попереднього періодичного помірного загального охолодження щурів-самців у віці 3 та 6 місяців на формування та наслідки емоційно-больового стресу при визначенні функціонального стану церебральних механізмів регуляції загальної активності.
автореферат [58,6 K], добавлен 12.02.2014Управління обміном вуглеводів. Математичний аналіз системи регуляції рівня кальцію в плазмі. Основна модель регуляції обміну заліза у клітинах. Управління обміном білків, жирів і неорганічних речовин. Баланс тепла в організмі. Регуляція температури тіла.
реферат [25,9 K], добавлен 09.10.2010Синтез мітохондріальних білків і особливості формування мітохондрій. Система синтезу білка в мітохондріях. Продукти мітохондріального білкового синтезу. Синтез мітохондріальних білків у цитоплазмі. Формування окремих компонентів мембран.
реферат [32,1 K], добавлен 07.08.2007Вивчення ембріогенезу легень та періодизації їх формування на основі даних макро-, мікро морфологічного і гістохімічного аналізів. Основні етапи розвитку легень у людини в постнатальному періоді, їх функціональні зміни. Легені на пізніх етапах онтогенезу.
курсовая работа [56,0 K], добавлен 06.11.2010Типи клітинної організації. Структурно-функціональна організація еукаріотичної клітини. Вплив антропогенних чинників на довкілля. Будова типових клітин багатоклітинного організму. Ракція клітин на зовнішні впливи. Подразливість та збудливість клітин.
курсовая работа [4,0 M], добавлен 02.12.2012Основі регуляції різноманітної діяльності організму. Функції нервової та ендокринної систем. Реакція організму на будь-яке подразнення. Механізм утворення умовних рефлексів. Роль підкіркових структур та кори великого мозку. Гальмування умовних рефлексів.
реферат [30,7 K], добавлен 30.03.2012Загальна характеристика отряду Рукокрилі. Особливості зовнішньої і внутрішньої будови їх представників, екологічні особливості, поведінка тварин та спосіб існування в дикій природі та у неволі. Літальний апарат кажанів, специфіка полювання та розмноження.
курсовая работа [328,1 K], добавлен 22.01.2015Цитопатичні зміни інфікованих вірусом клітин. Неспецифічні ушкождення, причини цитопатичного ефекту і подальшої загибелі клітин. Характеристика та особливості цитолітичного ефекту. Виявлення біохімічних і цитохімічних змін при вірусних інфекціях.
презентация [694,3 K], добавлен 27.05.2019Особливості та основні способи іммобілізації. Характеристика носіїв іммобілізованих ферментів та клітин мікроорганізмів, сфери їх застосування. Принципи роботи ферментних і клітинних біосенсорів, їх використання для визначення концентрації різних сполук.
реферат [398,4 K], добавлен 02.10.2013Ультраструктура та механізм регенерації клітин. Просвічуюча та скануюча електронна мікроскопія. Об'ємне зображення клітин. Електронограма інтерфазного ядра. Проведення складних морфометричних вимірювань у клітини завдяки використанню цитоаналізаторів.
презентация [13,3 M], добавлен 24.02.2013Вивчення середовища для виробництва білкових концентратів із водоростей, бактерій, рослин, дріжджів та грибів. Огляд ферментаторів для стерильного культивування мікроорганізмів. Аналіз флотації, сепарування, випарювання й сушіння для одержання протеїнів.
дипломная работа [126,7 K], добавлен 07.05.2011Основні процеси, за допомогою якого окремі клітини прокаріотів і еукаріотів штучно вирощуються в контрольованих умовах. Здатність перещеплених клітин до нескінченного розмноженню. Культивування клітин поза організмом. Основні види культур клітин.
презентация [1,3 M], добавлен 16.10.2015
