Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах

Займаючись даним дослідженням, ми намагалися зрозуміти, як паттерн змін концентрацій вільного внутрішньоклітинного кальцію може впливати на просторову організацію потоків викидів кальцію, а також вивчити те, чи може агоніст сам по собі або/та джерело кальцію, який вивільняється, впливати на просторове розташування місць викидів кальцію.

Для вирішення цих питань ми проводили експерименти, у яких змінювали концентрацію внутрішньоклітинного кальцію подібно до того, як це відбувається при дії гормонів та нейропередатчиків, виходячи із термінів амплітуди та кінетики, але відмінних з точки зору просторового розподілу всередині клітини.

Раніше вже було показано, що стимуляція агоністом панкреатичних ацинарних клітин викликає початкове підвищення кальцію в апікальній частині клітини, яке потім поширюється у базальну частину (Belan et al. 1996). Це явище було повторене у специфічних умовах наших експериментів. Просторовий паттерн змін інтенсивності флуоресценції, отриманий за допомогою конфокального мікроскопу у площині одиночної панкреатичної ацинарної клітини (набір зображень у верхній частині рис.). У наведеному прикладі підвищення [Ca²⁺]_i протягом іонофоретичної аплікації АХ було локалізовано виключно у апікальній частині клітини. Аплікації, які тривали довше у часі (у цій та іншіх клітинах), викликали хвилю змін [Ca²⁺]_i, яка ініціалізувалася у тій же самій апікальній частині клітини, а потім це підвищення концентрації кальцію поширювалося по всій клітині (дані не показані).

Підвищення кальцію, яке відбувалося внаслідок вивільнення Ca²⁺ із зв'язаної форми (NP-EGTA) за допомогою флеш фотолізу проходило інакше. [Ca²⁺]_i підвищувалася однорідно по всій конфокальній площині, що проходила через клітину. Ця однорідність спостерігалася практично протягом усього періоду підвищення концентрації кальцію.

Ми провели серії експериментів по локалізації місць вивільнення кальцію протягом іонофоретичної аплікації АХ. У цих експериментах ми вимірювали як зовнішньоклітинну концентрацію кальцію поблизу плазматичної мембрани (що відображає просторовий паттерн вивільнення кальцію), так і концентрацію вільного кальцію всередині клітини. Кластер омивався розчином, який містив у собі Calcium Green 1 декстран та був попередньо навантажений Fura Red/АМ. Конфокальний мікроскоп застосовували для того, щоб зареєструвати як місця вивільнення Ca²⁺ із клітин кластеру, так і зміни [Ca²⁺]_i у одній із клітин. Оптичну площину проводили через клітини кластеру і, таким чином, флуоресценція у боксі 1 була, головним чином, флуоресценцією Fura Red всередині клітини. Іонофоретична аплікація АХ спричиняла як мобілізацію внутрішньоклітинного Ca²⁺ так і вивільнення Ca²⁺. Зростання концентрації зовнішньоклітинного кальцію (що відображало процес вивільнення Ca²⁺ ) відбувалося значно швидше біля апікального полюсу клітини, ніж біля базального. Крім того, спостерігалася значна різниця у часі між піками відповідей у апікального та базального полюсів клітини, яка вказує на те, що значна частина підвищення кальцію пояснюється дифузією Ca²⁺ із апікальної частини клітини. Амплітуда відповідей біля апікального полюсу клітини була приблизно у 2.5 разів вища за амплітуду відповідей біля базального.

В другої серії експериментів по локалізації місць вивільнення кальцію одиночні панкреатичні ацинарні клітини навантажували NP-EGTA. Спалах УФ світла посилався на клітину із УФ лазера конфокальної системи. Протягом спалаху та відкритті та закритті шторки УФ лазера, вимірювання флуоресценції припиняли для того, щоб не пошкодити фотопомножувач реєстраційної системи. Після швидкого зростання [Ca²⁺]_i внаслідок спалаху УФ світла відбувається збільшення зовнішньоклітинної концентрації кальцію, що свідчить про вивільнення Ca²⁺ із клітини у оточуюче середовище. Головне джерело вивільненого кальцію було локалізовано у апікальній частині клітини. Стимуляція такого типу (при тривалості спалаху від 1 до 5 секунд) завжди викликала подібні просторові паттерни вивільнення Ca²⁺ із клітин (n=8).

Ми провели кілька експериментів на ненавантажених клітинах, як для випадку стимуляції за допомогою АХ, так і при стимуляції флеш фотолізом, для того, щоб упевнитися, що барвник Fura Red сам по собі не впливав на просторовий паттерн вивільнення кальцію. В цих експериментах для реєстрації вивільнення Ca²⁺ використовувався тільки зовнішньоклітинний індикатор. Ми не помітили ніякої різниці у просторовому паттерні змін зовнішньоклітинної концентрації Ca²⁺ у порівнянні із клітинами, навантаженими Fura Red (n=3 для стимуляції АХ; n=2 для стимуляції флеш фотолізом).

Було цікаво порівняти просторові паттерни вивільнення кальцію, отримані за допомогою стимуляції АХ та флеш стимуляції на одній і тій же клітині або маленькому кластері клітин, оскільки паттерн вивільнення повинен залежати від топологічної структури різних типів клітин. У цьому випадку подібні просторові паттерни повинні також демонструвати подібність у вивільненні кальцію при різних типах стимуляції. У попередніх експериментах ми побачили, що спричинене спалахом підвищення [Ca²⁺]_i у деяких випадках може викликати мобілізацію кальцію із внутрішніх депо (можливо, через механізм кальцій-залежного вивільнення кальцію). Для того, щоб бути впевненим, що вивільнений при УФ спалаху кальцій є “зв'язаним ”, а не кальцієм мобілізованим із внутрішніх депо, ми робили спалах після попередньої аплікації АХ (що повинна була розрядити запаси кальцію у внутрішньоклітинних депо).

Під час стимульованого агоністом підвищення кальцію або під час вивільнення кальцію із зв'язаного стану всередині клітини, Ca²⁺ спочатку викидається із апікального секреторного полюсу клітини, і цей процес відбувається незалежно від того, що існує велике розмаїття джерел Ca²⁺ та різні паттерни [Ca²⁺]_i у просторі, і крім того, незалежно від присутності чи відсутності агоніста. Це відбувається, найвірогідніше, через відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у областях секреторних гранул, хоча цей феномен можна також пояснити і тим, що кальцієві насоси у області секреторних гранул за своїми характеристиками відрізняються від насосів базальної мембрани. Інтенсивність вивільнення Ca²⁺ із апікального секреторного полюсу є такою, що протягом часу стимуляції агоністом відбуваються значні (по кілька мМ на літр) зміни у концентрації вільного кальцію в люмені ацинусу.

Ізопротеренол викликає зовнішньоклітинні Сa²⁺ спайки відповідно до актів секреції у клітинах слинної залози

У екзокринних клітинах після дії агоніста відбувається зростання [Ca²⁺]_i (Douglas 1968), яке викликає екзоцитоз (Maruyama et al. 1993). Кальцієві насоси були знайдені у різних областях плазматичної мембрани екзокринних ацинарних клітин (Lee et al. 1997), і зростання [Ca²⁺]_i також активує залежне від АТФаз вивільнення Ca²⁺ через плазматичну мембрану (Belan et al. 1996). Секреторні гранули містять Ca²⁺ у дуже високій концентрації (Gerasimenko et al. 1996), і акт екзоцитозу сам по собі також повинен вивільнювати Ca²⁺. Однак під час наших попередніх досліджень на панкреатичних ацинарних клітинах (Belan et al. 1996), в яких викликана агоністом секреція є суттєво зниженою при низькій концентрації зовнішньоклітинного Ca²⁺, було показано, що головна частина Ca²⁺ вивільняється у відповідь на супрамаксимальну стимуляцію агоністом завдяки опосередкованому Ca²⁺ насосами потоку через плазматичну мембрану, а не завдяки екзоцитозу, (Tepikin et al. 1992; Belan et al. 1996).

На відміну від загальноприйнятої ролі Ca²⁺ у регуляції екзоцитозу існують екзокринні секреторні клітини, наприклад, клітини слинних залоз, для яких головним внутрішньоклітинним сигналом, який викликає екзоцитоз є не підвищення [Ca²⁺]_i, а зростання концентрації циклічного АМФ (Quissell and Tabak 1989; Spearman and Butcher 1989). Збудження в_ адренергічних рецепторів стимулює секрецію білків із слинних залоз шляхом утворення циклічного АМФ без помітного зростання [Ca²⁺]_i . У цих клітинах на секреторні відповіді важко вплинути шляхом відсутності чи присутності зовнішньоклітинного Ca²⁺ (Petersen et al. 1977). Оскільки слинні залози мають як холінергічні мускаринові і б_адренергічні рецептори, які контролюють [Ca²⁺]_i, так і в_адренергічні рецептори, які регулюють утворення циклічного АМФ (Quissell and Tabak 1989; Spearman and Butcher 1989), ми вирішили порівняти механізми вивільнення Ca²⁺ у зовнішньоклітинне середовище у відповідь на дію мускаринового агоніста АХ та в-адренергічного агоніста ізопротеренола (ISP) в одиночних клітинах та маленьких кластерах клітин слинної залози.

Вимірювання вивільнення Са²⁺, спричиненого ISP та АХ , які були проведені за допомогою методики краплини

Для того, щоб кількісно охарактеризувати вивільнення кальцію із сабмандибулярних клітин, ми використовували методику краплини. Кластери сабмандибулярних клітин поміщали у маленькі краплини зовнішньоклітинного розчину із кальцій- чутливим барвником fluo-3.

У цій серії експериментів клітини попередньо навантажували fura _2. Загальна кількість кальцію, вивільненого із кластерів, розраховувалася на основі вимірювання за допомогою fluo-3. Кластери, які поміщали у краплини, демонстрували значне базальне вивільнення кальцію відповідно до зниження загальної концентрації клітинного кальцію у 81 + 15 мкM за хвилину (n = 7) (сабмандибулярні клітини миші).

Аплікація ISP у зовнішньоклітинний розчин призводила до значного зростання концентрації зовнішньоклітинного кальцію (рис. 9А). Одночасно, ми майже не спостерігали змін у [Ca²⁺]_i у відповідь на аплікацію ISP (рис. 9А). Ця відсутність змін у [Ca²⁺]_i дозволяє припустити, що основна частина Ca²⁺ протягом стимуляції ISP вивільняється внаслідок секреції. Похідна від змін [Ca²⁺]_o, яка вказує на кількість Ca²⁺, вивільненого внаслідок екзоцитозу, показала, що існує початковий швидкий компонент секреції (максимальна величина екструзії становила при цьому 460 + 28 мкM/хв, n = 7, рис 9В) який зникав після, приблизно, 100 секунд.

Вивільнення кальцію протягом цих перших 100 секунд стимуляції ISP відповідає зниженню загальної концентрації клітинного кальцію на 429 + 35 мкM (n = 7). За цим початковим швидким компонентом слідувало більш повільне вивільнення кальцію, яке продовжувалося довше, ніж тривали наші експерименти (більше, ніж 500 сек.). Величина екструзії протягом цієї більш повільної фази приблизно вдвічі перевищувала її рівень у спокої до стимуляції. Загальне вивільнення кальцію протягом перших 300 сек. стимуляції відповідає зниженню загальної концентрації кальцію у клітині на 930 + 40 мкM (n = 7).

Інформація щодо здатності ISP вивільняти кальцій із внутрішньоклітинних депо у сабмандибулярних ацинарних клітинах є предметом наукових дискусій. У перших повідомленнях вказувалося, що ISP може вивільняти кальцій із кальцієвих депо в сабмандибулярних ацинарних клітинах (Helman et al. 1987; Cook et al. 1988). Однак, коли тестували очищені клітинні препарати, то було знайдено, що хоча ISP і міг значно підвищити концентрацію цитозольного Ca²⁺ у клітинах інтралобулярної (гранулярної) протоки, але він практично не впливав на ацинарні клітини (Dehaye et al. 1993). Оскільки точні знання про дію ISP на ацинарні клітини були надзвичайно важливими для інтерпретації результатів нашого дослідження, ми провели окремі експерименти, у яких вивчався ефект стимулюючої дії ISP на [Ca²⁺]_i. Ці експерименти проводили на клітинах, навантажених fura-2 із використанням системи цифрових досліджень зображень (QuantiCell, Applied Imaging, UK). Клітини поміщали у відкриті камери для перфузії. Було протестовано 67 клітин. ISP аплікували за допомогою перфузії. Високі дози ISP (10 мкM) не викликали такі зміни у [Ca²⁺]_i у всіх тестованих клітинах, які можна було б виміряти. Наступна за цим аплікація АХ викликала у тих самих клітинах значні зміни у [Ca²⁺]_i (на 70 - 470 нМ).

Можна припустити, що ISP може викликати таке повільне зростання кальцію у цитоплазмі, яке важко зареєструвати. Відомо, що лантан у високих концентраціях блокує кальцієві АТФ-ази у плазматичній мембрані (Kwan et al. 1990; Toescu and Petersen 1995). Таким чином, лантан може потенціювати вказані гіпотетичні кальцієві сигнали завдяки блокуванню кальцієвих насосів у плазматичній мембрані. Однак у експериментах, в яких зовнішньоклітинний розчин містив лантан (2 мM), ми не змогли зареєструвати ніякого зростання [Ca²⁺]_i у цитоплазмі клітин після аплікації ISP (n = 29). В усіх цих клітинах наступна аплікація АХ викликала значне зростання [Ca²⁺]_i. Відсутність викликаних ISP змін у [Ca²⁺]_i у цих двох наборах експериментів чітко вказує на те, що вивільнення кальцію, зареєстроване у експериментах за методом краплі не може відбуватися завдяки активації Ca²⁺ насосів у плазматичній мембрані.

Ми також провели серію експериментів за методом краплі, в яких у зовнішньоклітинний розчин краплини додавався б- адренергічний інгібітор фентоламін у високій концентрації (30 мкM). Це повинно було запобігти виникненню будь-яких кальцієвих сигналів від гіпотетично можливої викликаної ISP активації б-адренергічних рецепторів. У цих експериментах (n = 8) ISP викликав значне вивільнення кальцію назовні клітин без будь-якого помітного зростання [Ca²⁺]_i. Величина вивільнення кальцію була подібна до тієї, яка була зареєстрована без фентоламіну у зовнішньоклітинному розчині. Вивільнення кальцію протягом перших 100 секунд стимуляції ISP в присутності фентоламіну відповідає зниженню загальної концентрації кальцію у клітині на 477 + 35 мкM. Ці експерименти далі підтвердили те припущення, що вивільнення кальцію із клітин, викликане аплікацією ISP, не має відношення до вивільнення Ca²⁺, опосередкованого роботою Ca²⁺ насосів у плазматичній мембрані.

Аплікації АХ на кластери, поміщені у краплини, також викликали значне вивільнення Ca²⁺ із клітин. Однак, на відміну від того, що відбувалося при аплікації ISP, аплікації АХ спричинювали значне зростання [Ca²⁺]_i. Величина вивільненого кальцію градуально спадала та досягала рівня спокою приблизно через 100 _ 300 сек. після початку стимуляції АХ. Максимальні величини АХ-викликаного вивільнення кальцію становили 430 + 70 мкM/хв (n=3). Загальне вивільнення кальцію протягом перших 300 сек. стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію у клітинах на 680 + 65 мкM (n = 3).

Спайки вивільнення Ca²⁺

Вивільнення Ca²⁺ за допомогою Ca²⁺ насосів та вивільнення Ca²⁺ завдяки екзоцитозу повинно призводити до різних типів змін [Ca²⁺]_o. Можна очікувати, що екзоцитоз викличе короткі спайки [Ca²⁺] у зовнішньоклітинному розчині тоді, коли окремі гранули переносять свій вантаж - іони кальцію - назовні клітин. В той же час насоси та обмінники повинні спричинять вивільнення кальцію, яке має “гладкий” вигляд. Ґрунтуючись на таких уявленнях, ми зробили спробу за допомогою конфокальної мікроскопії розрізнити механізми, які включені у вивільнення кальцію у випадках стимуляції клітин ISP та АХ.

Для того, щоб виміряти зміни [Ca²⁺]_o, ми додавали Calcium Green 1 декстран до практично безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину. У більшості експериментів ми записували усереднені зміни флуоресценції у малих боксах, розміщених поблизу межі клітини

Ми також проводили експерименти, під час яких ми робили “фільм” (швидку послідовність зображень) про зміни [Ca²⁺]_o поблизу кластера клітин. На рис. 10С представлено експеримент цієї серії (n = 7). Фільм знімали протягом терміну, відміченого короткою рискою шкали на рис. 10В; він показаний на рис. 10С. Зростання флуоресценції розпочиналося у певній точці на краю кластера, а потім поширювалося у вигляді хвилі дифузіїї. Характер спайків, який носила зміна [Ca²⁺]_o, дозволяє припустити, що ці зміни відбувалися завдяки екзоцитозу.

Інформація про розподіл концентрації Ca²⁺ у зовнішньоклітинному розчині для послідовності точок у часі дозволила нам підрахувати кількість вивільненого Ca²⁺ у даній області та оцінити кількість Ca²⁺, який покинув цю область у результаті секреторного акту (Belan et al. 1996). Наприклад, під час другого спайку, показаного на рис. 10С, кількість секретованого кальцію становила приблизно 3.5 x 10^_18 моль. Поділивши цю величину на приблизний об'єм сабмандибулярної клітини (5 x 10^_13 літр) можна отримати величину приблизного зменшення загальної концентрації кальцію у клітині внаслідок одиночного акту екзоцитозу. Розраховане значення для цього окремого експерименту становило 7 мкM. В окремих експериментах протягом аплікації ISP концентрація [Ca²⁺]_i замірялася для клітинних кластерів, навантажених Fura Red. В цих експериментах із використанням конфокального мікроскопа ми не зареєстрували змін у [Ca²⁺]_i (n = 5).

В цій же серії дослідів було показано, що елементарні акти секреції можуть мати місце у декількох просторово роздільних місцях на поверхні малих клітинних кластерів. Причому секреція спостерігалась у одних і тих же місцях кластерів, в той час як у інших вона була відсутня. Ми також спостерігали синхронне збільшення концентрації позаклітинного кальцію у декількох боксах, що знаходились поблизу секреторних полюсів поодиноких клітин або клітинних кластерів.

Відмінність у відповідях із вивільненням Ca²⁺ на ізопротеренол та ацетилхолін

У наступній серії експериментів ми, в основному, записували усереднені [Ca²⁺]_o сигнали у тих областях, які нас цікавили. Сигнали, записані у таких експериментах, залежали від розмірів боксів, розташування боксів по відношенню до місць вивільнення кальцію, а також від кількості вивільненого кальцію.

Типовий результат стимуляції ISP сабмандибулярних клітин наведено на рис. 11. Відповідь складається із паттерну спайкування [Ca²⁺]_o. У деяких експериментах ми спостерігали суміш повільних підйомів на які накладалися швидкі спайки. Ми можемо уявити паттерн спайкування як послідовність секреторних актів, які відбувалися один за одним. Тому такі “змішані” паттерни можуть бути результатом суперпозиції численних актів секреції. Спонтанні спайки [Ca²⁺]_o могли також виникати без будь-якої стимуляції агоністом. Можна припустити, що це явище відбувається внаслідок базального екзоцитозу. Іноді ми також спостерігали “згладжені” зміни [Ca²⁺]_o. Можливо, “згладжені” зміни були записані від боксів, які знаходилися далеко від того місця, де відбулася секреція. Інше пояснення полягає у тому, що бокси були занадто великими для того, щоб реєструвати локалізовані секреторні акти.

На відміну від стимуляції ISP, перша аплікація АХ ніколи не викликала чистого паттерну спайкування (відповідей без значного підвищення базової лінії між спайками), але друга аплікація АХ у двох випадках із шести викликала відповіді типу чистих спайків. Це відбувалося у експериментах, у яких протягом першої аплікації АХ спайки накладалися на загладжену форму змін концентрації кальцію. Нарешті в експериментах, у яких спайковий паттерн змін [Ca²⁺]_o реєструвався в результаті другої стимуляції АХ, наступна стимуляція ISP також викликала відповідь зі спайками. Ці дані дають підставу припустити, що протягом початкової стимуляції АХ були записані два компоненти вивільнення кальцію: (i) перекачування кальцію із цитозолю у зовнішнє середовище за допомогою Са²⁺-АТФаз, що спричиняло загладжене зростання, зареєстроване у тих випадках, коли АХ аплікувався перший раз та (ii) вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу, що призводило до генерації спайків [Ca²⁺]_o.

Для того, щоб зареєструвати загальну величину вивільненого кальцію із клітинних кластерів, ми усереднювали величини концентрації кальцію у великій області зовнішньоклітинного розчину навколо відносно великих клітинних кластерів (більше, ніж 10 клітин). Таким чином, вимірювані зміни концентрації кальцію відображають середню величину вивільнення кальцію із клітин. Хоча на клітинний кластер набагато простіше аплікувати агоністи, ніж робити це за допомогою методики краплі (Tepikin, Llopis et al. 1994), отримані результати носять скоріше якісний, аніж кількісний характер. При такій конфігурації експерименту, звичайно, неможливо розрізнити спайки [Ca²⁺]_o, які виникли у результаті екзоцитозу. Такий протокол експерименту ми використовували тільки для того, щоб дослідити, чи є незалежними джерела кальцію для кальцієвих викидів, спричинених обома типами агоністів. У таких експериментах стимуляція АХ призводила до повільного поступового зростання [Ca²⁺]_o. Стимуляція клітин за допомогою ISP після стимуляції АХ, досить довгої для того, щоб виснажити внутрішні запаси кальцію, викликала значне збільшення [Ca²⁺]_o. Все це вказує на те, що стимуляція АХ не вичерпує ресурсів для викликаного ISP вивільнення кальцію (n = 8).

У додаткових експериментах довготривала аплікація ISP (15 мкM, протягом 40 хвилин) не спустошувала внутрішньоклітинні запаси Ca²⁺, які могли бути вивільнені за допомогою АХ, і не запобігала АХ індукованому вивільненню кальцію у зовнішньоклітинний простір (n = 5).

Таким чином за допомогою нової методики для вимірювання концентрації зовнішньоклітинного кальцію поблизу клітинної мембрани та методики краплини ми вивчали ступінь вивільнення кальцію із ацинарних клітин слинної залози. Ізопротеренол, що є в_адренергічним агоністом та потужним секреторним агентом, не викликав змін у концентрації вільного Ca²⁺ у цитозолі, але спричинював помітні зміни у вигляді спайків [Ca²⁺]_o. Відсутність зростання [Ca²⁺]_i та пульсоподібна природа змін у [Ca²⁺]_o вказують на те, що ці спайки з'являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул. Холінергічний агоніст АХ який викликає помірну секрецію у цих клітинах, також викликав значне зростання [Ca²⁺]_i та ”гладке” за формою зростання [Ca²⁺]_o, яке, найбільш можливо, було спричинені роботою кальцієвих насосів плазматичних мембран із накладанням коротких спайків [Ca²⁺]_o, викликаних екзоцитозом. Величина викликаного ISP вивільнення кальцію була досить значною. Обчислена величина втрат кальцію протягом перших 100 секунд при супрамаксимальній стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію в клітині на 0.4 мМ.

АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ

У дисертаційній роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах. Порушення цих механізмів можуть лежати в основі розвитку певних патологічних станів, що призводять до тяжких захворювань у людини.

Виконане дослідження спирається на розроблені авторами новітні підходи для кількісного та якісного вимірювання роботи кальцій-регулюючих клітинних механізмів, що дозволяють значно розширити наші знання про фізіологічні зміни, що відбуваються в екзокринних клітинах в нормі та патології, а також можуть бути застосовані для вивчення різних молекулярних механізмів у багатьох типах клітин.

Крім того, дане дослідження може допомогти вирішити питання про походження таких складних захворювань як гострий і хронічний панкреатити, що дозволяє стверджувати про можливість клінічного застосування результатів, отриманих у цій роботі.

Просторова локалізація систем викиду іонів кальцію на поверхні панкреатичних ацинарних клітинах

Відносно високий процент Ca²⁺, вивільненого із секреторного полюсу, як це показано у наших експериментах (рис.6), може бути результатом відносно високої щільності Ca²⁺ насосів у цій ділянці та/чи може бути пояснений тим, що Ca²⁺ насоси у цій частині клітини мають характеристики, відмінні від характеристик насосів у базальній мембрані. Ці припущення мають сенс оскільки на даний момент описана велика кількість ізоформ Ca²⁺ АТФаз плазматичної мембрани (Carafoli 1992). Крім того відомо, що афінність цих АТФаз може контролюватися альтернативним сплайсінгом, що призводить до змін у афінності АТФаз для кальмодуліна (Enyedi et al. 1994). Можливо також, що стимуляція агоністом може диференційовано регулювати Ca²⁺ насоси в люмінальній та базолатеральній мембранах. Більш детально ці припущення буде розглянуто у наступній главі цього розділу.

Зареєстроване явище вивільнення Ca²⁺ через секреторний полюс, має багато переваг, якщо розглядати його із точки зору функцій ацинарних клітин. Ca²⁺ сигнали, викликані фізіологічними агоністами, дійсно пов'язані із ділянкою секреторних гранул (Thorn et al. 1993) і селективна робота кальцієвих насосів на люмінальній мембрані дозволяє запобігти поширенню сигналу у базолатеральні області. Це може бути важливим для того, щоб запобігти Ca²⁺-викликаному вивільненню Ca²⁺ у ядрі через інозітол трифосфатні та руанодінові рецептори, які локалізовані на внутрішній нуклеарній мембрані (Gerasimenko et al. 1995). В той час як Ca²⁺, вивільнений через базолатеральну мембрану, здається, не має спеціальних функцій, Ca²⁺ , який накачується в ацинарний (зовнішньоклітинний) люмен може підтримувати високу концентрацію Ca²⁺ у цьому зовнішньоклітинному компартменті. Це дуже важливо, оскільки відомо, що ендоцитоз у підшлунковій залозі не може відбуватися при відсутності зовнішнього Ca²⁺ (Maruyama et al. 1993). На основі вищесказаного ми можемо запропонувати для розгляду цікавий цикл Ca²⁺ у підшлунковій залозі, при якому стимуляція агоністом у першу чергу запускає вивільнення Ca²⁺ із депо у області секреторних гранул (Petersen et al. 1994), вірогідніше, із самих гранул (Gerasimenko et al. 1996). Ca²⁺, виділений у цитозоль, згодом транспортується через люмінальну мембрану у ацинарний люмен, де він стимулює ендоцитоз (Maruyama et al. 1993), що слідує за екзоцитозом, викликаним стимулом, і може частково потрапляти назад у клітину завдяки процесу ендоцитозу або іншими шляхами входу Ca²⁺ і, таким чином, також може поступати назад у нові секреторні гранули.

Розподіл Ca²⁺-ATФАЗ по поверхні ацинарної клітини.

Із результатів наших досліджень стає ясно, що переважна локалізація місць вивільнення кальцію при стимуляції агоністом знаходиться у апікальній частині панкреатичної ацинарної клітини, і це відбувається не внаслідок специфічності просторового паттерну зростання [Ca²⁺]_i та не внаслідок різної регуляції агоністами кальцієвих насосів у апікальній та базальній частинах клітин. Неоднорідність розподілу вивільнення кальцію також не залежить від джерела мобілізованих іонів кальцію: іони кальцію, які вивільнялися як із внутрішніх депо, так і із NP-EGTA також викидалися із клітин переважно у апікальній частині. Всі вищенаведені результати підвели нас до висновку про те, що кальцієві насоси розташовані на поверхні плазматичної мембрани та/чи регулюються (деякими дуже тісно розподіленими, немобільними системами регуляції кальцієвих насосів) таким чином, що головна частина викидів кальцію відбувається у апікальній області.

Ми проводили наші експерименти на ізольованих клітинах. В інтактних ацинусах переважне вивільнення Ca²⁺ із апікального полюсу означатиме, що більша частина Ca²⁺ виділиться із клітин через люмінальну частину клітинної мембрани. Прийнявши до уваги об'єм люмена (кілька кубічних мікрон), кількість клітин у одному ацинусі (кілька десятків) (Kern 1986) та кількість вивільненого кальцію у одній клітині (0.5-1.0 мM у об'ємі клітини за 100-300 сек (Tepikin et al. 1992)) стає ясно, що стимуляція агоністом може викликати драматичне (від декількох мілимолей/літр до навіть декількох десятків мілимолей/літр) зростання кількості вільного кальцію у люмені. У попередній главі було зроблено припущення про те, що таке зростання може бути необхідним для ініціювання ендоцитозу (Maruyama et al. 1993) (услід за агоніст-залежним екзоцитозом), але справжнє розуміння цього важливого явища є предметом майбутніх досліджень.

Вивільнення Ca²⁺ із одиночних ізольованих панкреатичних зимогенних гранул

Одна із найважливіших частин даної роботи, присвячена механізмам регуляції іонів кальцію у поодиноких секреторних гранулах, стала можлива головним чином завдяки впровадженню новітніх методів вимірів, що були розроблені під час виконання роботи. Наші експерименти по дослідженню молекулярних механізмів регуляції кальцію, що розташовані в окремих гранулах вказують на те, що Ca²⁺ може вивільнятися із одиночних ізольованих ЗГ, коли вони стимулюються Ca²⁺ -вивільняючими вторинними посередниками IP₃ або cADPr. Концентрація вільного кальцію всередині нестимульованої ізольованої ЗГ становить приблизно 50 мкМ, значення, яке близьке до величин, які попередньо публікувалися відносно IP₃ -чутливих внутрішньоклітинних Ca²⁺ депо у інтактних клітинах (Tse et al. 1994). Таким чином ми довели можливість існування нового джерела Ca²⁺, який може швидко мобілізуватися, і це допомагає пояснити явище викликаних агоністом цитозольних транзієнтних змін [Ca²⁺]_i локалізованих у секреторній гранулярній області - змін, які були зареєстровані раніше у експериментах на інтактних або перфузованих із середини панкреатичних ацинарних клітинах (Kasai et al. 1993).

Гіпотези про те, що секреторні гранули можуть бути важливим джерелом мобілізованого Ca²⁺, і пояснення таким чином викликаних агоністом цитозольних Ca²⁺ сигналів не є новими (Blondel et al. 1995), але ця точка зору ніколи не була загальноприйнятою (Pozzan et al. 1994). Yoo та Albanesi показали, що існує IP₃ -викликане вивільнення Ca²⁺ із практично чистої фракції адренальних медулярних секреторних везикул бика (Yoo and Albanesi 1990). Це спостереження протирічить іншим даним, згідно яких відповіді на IP₃ немає у гранулах із клітинної лінії феохромоцитоми (PC-12), яка походить від хромафінних клітин щура (Fasolato et al. 1991). Крім того у іншій роботі повідомлялося про те, що дані Yoo та Albanesi (Yoo and Albanesi 1990) неможливо підтвердити (див. обговорення у роботі Kasai (Kasai 1995).

Наші дані отримані більш прямим шляхом, ніж дані Yoo та Albanesi (Yoo and Albanesi 1990), оскільки ми змогли виміряти зміни концентрації внутрішньогранулярного Ca²⁺ для одиночної ізольованої ЗГ. Крім того, за допомогою вимірювань (з високою роздільною здатністю) процесів вивільнення Ca²⁺ із одиночних ізольованих ЗГ в результаті іонофоретичної аплікації IP₃ ми показали, що IP₃ може викликати швидкі та потужні викиди кальцію із гранул із розгорткою у часі, яка відповідає генерації Ca²⁺ спайка у інтактних екзокринних клітинах. Ми також вперше показали, що можливий посередник вивільнення Ca²⁺ - cADPr - може викликати вивільнення Ca²⁺ із цих гранул і пояснили, таким чином, раніше зареєстроване явище викликаних cADPr Ca²⁺ спайків у секреторному полюсі інтактних клітин (Thorn P et al. 1994).

Екзоцитоз як новітній механізм виведення кальцію із екзокринних клітин.

Широке коло досліджень, що були проведені багатьма лабораторіями (дивись огляд літератури) включаючи нашу (Gerasimenko et al. 1996) показали, що секреторні везикули та гранули містять кальцій у дуже високій концентрації, і акт екзоцитозу сам по собі повинен вивільнювати Ca²⁺ у зонішьоклітинне середовище. Таким чином екзоцитоз разом з ендоцитозом, що призводить до захвату у ендосоми зонішьоклітинного кальцію та переміщення його через плазматичну мембрану усередину клітин, можуть слугувати, як механізми, що опосередковують кальцієвий метаболізм у секреторних клітин. Однак це досить просте припущення не було не висловлено не досліджено, головним чином (як ми вважаємо) із-за браку необхідних експериментальних методів досліджень. З розробкою нових методів, запропонованих у даній роботі, ми попробували дослідити ймовірність даної гіпотези.

Під час попередніх досліджень цієї гіпотези на панкреатичних ацинарних клітинах (Belan et al. 1996) було показано, що викликана агоністом секреція завжди дуже суттєво знижувалася у цих клітинах при низькій концентрації зовнішньоклітинного Ca²⁺, яка була використана у наших дослідах. В цих експериментальних умовах ми визначили, що головна частина Ca²⁺, вивільненого із клітин під час стимуляції, з'являється у відповідь на аплікацію агоністом завдяки опосередкованому Ca²⁺ насосами потоку через плазматичну мембрану а не завдяки екзоцитозу (Tepikin et al. 1992; Belan et al. 1996).

Подальші досліди проведені на ацинарних клітинах сабмандибулярних слинних залоз показали (дивись Результати), що спостерігається значне зростання вивільнення кальцію із цих секреторних клітин, викликане стимуляцією ISP, агоністом б_адренергічних рецепторів, без помітного зростання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. Таким чином це зростання неможливо було пояснити роботою Ca²⁺-ATФаз плазматичної мембрани. Ми знову запропонували гіпотезу, згідно якій ISP_викликане вивільнення Ca²⁺ відбувається, як послідовність екзоцитозів. Основні аргументи, які підтримують наш висновок про те, що ISP спричинює вивільнення Ca²⁺ завдяки екзоцитозу, а не завдяки активації Ca²⁺ насосу наступні:

1) Спайковий характер вивільнення кальцію, викликаного ISP.

2) ISP не спричинює ніякого помітного зростання [Ca²⁺]_i і, таким чином, немає причини пояснювати вивільнення Ca²⁺ активацією Ca²⁺ ATФ- ази.

3) Хоча ISP не підвищує [Ca²⁺]_i, але вивільнення Ca²⁺ при його дії є більше за величиною, ніж те, яке спостерігається у відповідь на стимуляцію АХ, який суттєво підвищує значення [Ca²⁺]_i.

4) ISP у слинних залозах є більш сильним стимулятором секреції, ніж АХ, оскільки він викликає більш значну і тривалу секрецію білку, ніж може бути досягнено при дії АХ (Mills et al. 1991).

5) Секреторні гранули у багатьох абсолютно різних типах секреторних клітин, включаючи сабмандибулярні клітини слинних залоз, містять високу концентрацію кальцію (близько 10 _ 100 мM) (Gerasimenko et al. 1996). Таким чином, екзоцитоз повинен викликати підвищення [Ca²⁺]_o.

6) Відповіді із вивільненням Ca²⁺, викликані ISP та АХ, найвірогідніше, мають різні джерела виникнення, оскільки ISP може викликати значне вивільнення Ca²⁺ услід за стимуляцією АХ, яка відбувалася досить довго для того, щоб спустошити внутрішні запаси Ca²⁺. У додаткових експериментах, не показаних у результатах, довгий термін інкубації з ISP не перешкоджав вивільненню кальцію, викликаному АХ.

Використавши методики високого просторового роз рішення, що базуються на впровадженні конфокальної мікроскопії, ми змогли отримати короткотривалі спайки вивільнення Сa²⁺, особливо під час дії ISP, але також і при дії АХ. Хоча ISP відомий, як більш сильний стимулятор секреції, АХ також може викликати секрецію білку у цих клітинах. Таким чином, простіше пояснити спайки зовнішньоклітинного Ca²⁺ як послідовності одиночних актів екзоцитозу, які, проте, можуть включати у себе і по декілька гранул (складний екзоцитоз). Загальна величина відповіді із вивільненням кальцію внаслідок дії АХ, таким чином, є комбінацією вивільнення Ca²⁺ за допомогою кальцієвих насосів плазматичної мембрани, та вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу. Важко оцінити відносний вклад цих двох компонентів у вивільнення кальцію внаслідок дії АХ, але мала кількість швидких (викликаних секрецією) кальцієвих транзієнтів, що реєструвались у при дії АХ у експериментах із Calcium Green-1 декстраном (рис. 12), дуже гарна кореляція між величиною вивільняємого кальцію та концентрацією внутрішньоклітинного Ca²⁺, що була зареєстрована у експериментах із методикою краплини і той факт, що вивільнення кальцію може бути спричинене АХ після довгої інкубації із ISP- все це дозволяє припустити, що кальцієві насоси роблять основний внесок у вивільнення кальцію під час дії АХ. В той же час можна вважати, що екзоцитоз є основним механізмом, який відповідає за вивільнення кальцію внаслідок дії ISP у ацинарних клітинах слинних залоз.

Значна кількість кальцію може постійно вивільнятися із секреторних клітин внаслідок базальної (не викликаної дією агоністів) секреторної активності. Наші попередні результати показали, що в аналогічних умовах (кімнатна температура, низька зовнішньоклітинна концентрація кальцію) панкреатичні ацинарні клітини практично не секретують. У експериментах із панкреатичними ацинарними клітинами, поміщеними у розчин, який містив кальцієвий індикатор, зв'язаний з декстраном, ми не побачили швидких кальцієвих транзієнтів у областях поблизу клітин. У панкреатичних ацинарних клітинах вивільнення кальцію, виміряне у експериментах на краплині із використанням декстран - зв'язуючого кальцієвого індикатора відбувалося завдяки активності кальцієвих насосів плазматичної мембрани (Belan et al. 1996). Для цих клітин величина базального вивільнення кальцію, виміряна за допомогою методики краплини становила приблизно 8 мікроM за хвилину, тоді як для сабмандибулярних клітин ця величина була приблизно у 10 разів вища (81 + 15 мкM на хвилину). Ми пояснюємо цю різницю більш високим рівнем базального екзоцитозу у сабмандибулярних клітинах у порівнянні із панкреатичними ацинарними клітинами. Це також може означати, що екзоцитоз може бути одним із основних механізмів, який регулює вміст внутрішньоклітинного кальцію у секреторних клітин.

У багатьох типах клітин екзоцитоз є практично перманентним процесом протягом всього періоду життя клітини. Можна припустити, що клітини можуть накопичувати деякі речовини (наприклад, Ca²⁺) які повинні вивільнятися із них, і накопичувати такі речовини у секреторних гранулах, а потім секретувати їх разом із головними продуктами секреції, такими, як протеолітичні ферменти чи нейропередатчики. Такий механізм може мати певні переваги: (i) енергія, яка витрачається для секреції везикул (і яка у будь - якому випадку повинна витрачатися для секреції головних секреторних продуктів) буде витрачена для вивільнення інших речовин; (ii) більша частина іонів кальцію, яка надходить у цитозоль, у першу чергу запасається у внутрішньоклітинних депо (Mogami et al. 1997). Для того, щоб вивільнити Ca²⁺ мембранними системами плазматичної мембрани, треба було б спершу вивільнити його у цитозоль, а потім із цитозолю - у зовнішньоклітинне середовище. Такий механізм потребував би повторного викачування Ca²⁺ проти високих електрохімічних градієнтів, що призвело б до перевитрат енергії; (iii) повна площа поверхні внутрішньоклітинних компартментів значно більша за площу плазматичної мембрани. Така площа дає можливість розмістити більше Ca²⁺ регулюючих систем (наприклад, Ca²⁺ насосів), що в свою чергу дозволяє закачувати Ca²⁺ всередину цих внутрішньоклітинних компартментів. А перехід цього кальцію у секреторні везикули рано чи пізно призводить до його секруції у зовнішньоклітинне середовище.

Ca²⁺ може накопичуватися у секреторних гранулах як безпосередньо за допомогою АТФ-аз та/чи Ca²⁺/H⁺ обмінника (Nicaise et al. 1992), так і непрямим шляхом, за допомогою захвату кальцію, який зберігається у внутрішньоклітинних депо (Hofer and Schulz 1996). Безвідносно до механізму, за допомогою якого Ca²⁺ накопичується у секреторних гранулах, вміст кальцію у них дуже високий і досягає у клітинах деяких типів 100 мM (Nicaise et al. 1992). Така висока загальна концентрація кальцію призводить до його суттєвого вивільнення навіть протягом одиночного акту секреції. Наприклад, екзоцитоз однієї секреторної гранули (припустимо, що об'єм гранули становить 10^_4 від об'єму клітини) зменшить загальну концентрацію внутрішньоклітинного кальцію на 1_10 мкM, що є значною зміною у порівнянні із концентрацією вільного внутрішньоклітинного кальцію (0.1 мкM). Крім того було показано чи припущено, що висока інтрагранулярна концентрація кальцію є важливою для процесингу секреторних продуктів, упаковки білків та злиття гранул із плазматичною мембраною Burgoyne and Morgan 1995).

Наші результати дають можливість припустити, що описаний вище механізм виведення кальцію може мати місце у багатьох типах клітин, для яких можливий екзоцитоз. Відомо, що екзоцитоз грає роль у експорту кальцію у адренальних медулярних клітинах бика (von Grafenstein and Powis 1989) , нервових закінченнях (Thirion et al. 1995) та яйцях морського їжака Kuhtreiber et al. 1993). Дана робота вперше характеризує як кількість, так і кінетику вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу на рівні одиночної клітини та у порівнянні із вивільненням кальцію за допомогою мембранних кальцієвих насосів. Ми встановили, що вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу може бути важливим механізмом вивільнення кальцію із секреторних клітин і, у деяких випадках і типах клітин, основна частина кальцієвого вихідного потоку має місце завдяки роботі цьому механізму.

Механізми кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах.

В даній главі ми коротко підсумуємо основні біофізичні знахідки, що стосуються механізмів кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах, які було зроблено при виконанні дисертаційної роботи.

Ацинарні секреторні клітини, що були об'єктом наших досліджень, є сильно поляризованими з чітко розрізняємими апікальним секреторним полюсом, де розташовані секреторні гранули та базальним полюсом, що домінується ендоплазматичним ретикулумом. В цій роботі ми вперше показали, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca²⁺ із ацинарних клітин внаслідок їх стимуляції як фізіологічними так патофізіологічними концентраціями агоністів. Це високополяризоване вивільнення Ca²⁺ при підвищенні його внутрішньоклітинної концентрації відбувається через відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин.

Було також вперше показано, що секреторні гранули можуть слугувати як внутрішньоклітинні кальцієві депо і що головні вторинні посередники, що виробляються екзокринними клітинами у відповідь на дію агоністів - IP₃ та cADPr - викликають швидке вивільнення Ca²⁺ із гранул. Таким чином, при дії агоністів секреторні гранули можуть вивільняти кальцій або безпосередньо, або через механізм CICR, чим частково або повністю можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca²⁺] в секреторному полюсі ацинарних клітин.

Ми також довели, що екзокринні клітини можуть вивільняти суттєву кількість іонів кальцію шляхом екзоцитозу. Подальші роботи, проведені в цьому напрямку показали, що ендоцитоз (що слідує за агоніст-викликаним екзоцитозом) призводить до зворотного, вхідного потоку кальцію. Причому кальцій, що був захоплений у ендосоми, був швидко імпортованій із ендосом до інших клітинних органел і після цього міг бути використаний у багатьох кальцій-залежних клітинних процесах (Gerasimenko, Tepikin et al. 1998). Таким чином, вперше було показано, що екзоцитоз та ендоцитоз, а не тільки кальцієві насоси плазматичної мембрани і депо-залежний вхід Ca²⁺, можуть бути одними з головних механізмів, що балансують клітинний кальцієвий гомеостаз.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах.

Розроблено новий метод - метод краплини - що є першим методом, який дозволив кількісно вимірювати кінетику виведення іонів кальцію із поодиноких клітин ссавців.

Розроблено нову методику для просторового спостереження малих трансмембранних потоків іонів кальцію у секреторних гранулах, поодиноких клітинах та малих клітинних агрегатах, в основі якої лежить ідея використання флуоресцентного кальцієвого індикатору, зв'язаного із високомолекулярними декстранами для сповільнення дифузії іонів кальцію.

Показано, що IP₃ та cADPr викликають помітне спадання концентрації вільного інтрагранулярного Ca²⁺. Використовуючи новий метод просторового спостереження малих трансмембранних потоків іонів кальцію, вимірено зміни у концентрації Ca²⁺ поблизу ізольованих секреторних гранул та показано, що IP₃ та cADPr викликають швидке вивільнення Ca²⁺ із гранул, чим можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca²⁺] в секреторному полюсі ацинарних клітин, яке необхідне для процесу секреції ферментів.

Застосувавши нову методику, у якій висока ступінь роздільної здатності при локалізації місць вивільнення клітинного Ca²⁺ досягалася за допомогою конфокальної мікроскопії та Ca²⁺-чутливого флуоресцентного барвника, зв'язаного із важким декстраном, було показано, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca²⁺ із ацинарних клітин внаслідок стимуляції агоністом.

Показано, що під час стимульованого агоністом підвищення кальцію або під час вивільнення кальцію із зв'язаного стану всередині клітини, Ca²⁺ виводиться із апікального секреторного полюсу клітини. Це найвірогідніше відбувається через відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин. Інтенсивність вивільнення Ca²⁺ із апікального секреторного полюсу є такою, що протягом часу стимуляції агоністом відбуваються значні (по кілька мілімолей на літр) зміни у концентрації вільного кальцію в люмені ацинуса, необхідні для стимуляції ендоцитозу, що слідує за секрецією.

За допомогою нової методики для вимірювання концентрації зовнішньоклітинного кальцію поблизу клітинної мембрани та методики краплини було показано, що ізопротеренол, в_адренергічний агоніст та потужний секреторний агент, не викликав змін у концентрації вільного Ca²⁺ у цитозолі, але спричиняв помітні зміни у вигляді спайків концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Відсутність зростання [Ca²⁺]_i та пульсоподібна природа змін у [Ca²⁺]_o вказують на те, що ці спайки з'являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул.

Холінергічний агоніст ацетилхолін викликав значне зростання [Ca²⁺]_i та ”гладке” за формою зростання [Ca²⁺]_o, які, були спричинені роботою кальцієвих насосів плазматичних мембран, із накладанням коротких спайків [Ca²⁺]_o, що були викликані екзоцитом кальцію у зовнішньоклітинне середовище.

Величина викликаного секрецією вивільнення кальцію була досить значною. Обчислена величина втрат кальцію протягом перших 100 секунд при супрамаксимальній стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію в клітині на 0.4 мМ.

Зроблено висновок про те, що в екзокринних клітинах кальцій може вивільнюватися в люмен шляхом екзоцитозу, і що екзоцитоз (а не кальцієві АТФфази плазматичної мембрани) може бути основним механізмом вивільнення кальцію у навколоклітинний простір в екзокринних та інших типах секретуючих клітин.

Список опублікованих прац за темою дисертації

Belan P.V., Osipenko O. Blocking effect of La³⁺ ions on transmembrane ionic current evoked by intracellular cyclic AMP injection in identified Helix pomatia neurons // Neurosci Lett. - 1991. -V 124, № 1. - P. 137-139.

Diatlov V.A., Belan P.V., Bakai E.A., Makovetskii V.P., Makovetskaia V.V. Tocopherol modulation of acetylcholine-induced current in mollusk neurons // Neirofiziologiia. - 1991. -V 23, №5.- P. 628-631.

Gyori J., Kiss T., Shcherbatko A.D., Belan P.V., Tepikin A.V., Osipenko O.N., Salanki J. Effect of Ag⁺ on membrane permeability of perfused Helix pomatia neurons // J Physiol (Lond). - 1991. -V 442. - P. 1-13.

Kostyuk P.G., Belan P.V., Tepikin A.V. Free calcium transients and oscillations in nerve cells. // Exp Brain Res. - 1991. -V 83, №2. - P. 459-464.

Tepikin A.V., Kostyuk P.G., Snitsarev V.A., Belan P.V. Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix pomatia // J Membr Biol. - 1991. -V 123, №1. - P. 43-47.

Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V., Tepikin A. Calcium clamp in isolated neurones of the snail Helix pomatia // J Physiol (Lond). - 1993. -V 462. - P. 47-58.

Belan P.V., Kostyuk P.G., Snitsarev V.A., Tepikin A.V. Calcium clamp in single nerve cells // Cell Calcium. - 1993. -V 14, №6. - P. 419-425.

Belan P.V., Kiss T., Snitsarev V., Storozhuk M.V., Osipenko O.N. The effect of acetylcholine and serotonin on calcium transients and calcium currents in identified Helix pomatia L. neurons // Cell Signal. - 1994. -V 6, №5. - P. 551-559.

Belan P.V., Gerasimenko O.V., Berry D., Saftenku E., Petersen O.H., Tepikin A.V. A new technique for assessing the microscopic distribution of cellular calcium exit sites // Pflugers Arch. - 1996. -V 433, №1-2. - P. 200-208.