Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах

Belan P.V., Gerasimenko O.V., Tepikin A.V., Petersen O.H. Localization of Ca²⁺ extrusion sites in pancreatic acinar cells // J Biol Chem. - 1996. -V 271, №13. - P. 7615-7619.

Belan P.V., Saftenku E. Mathematical model of Ca²⁺ diffusion and buffering in extracellular solution after Ca²⁺ extrusion from a spherical cell // Neurophysiology. - 1996. -V 28. - P. 187-193.

Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Belan P.V., Petersen O.H. Inositol trisphosphate and cyclic ADP-ribose-mediated release of Ca²⁺ from single isolated pancreatic zymogen granules // Cell. - 1996. -V 84, №3. - P. 473-480.

Belan P., Gerasimenko O., Petersen O.H., Tepikin A.V. Distribution of Ca²⁺ extrusion sites on the mouse pancreatic acinar cell surface // Cell Calcium. - 1997. -V 22, №1. - P. 5-10.

Belan P.V., Saftenku E., Gerasimenko O.V., Pogorelaya N.Ch., Chvanov M.A., Teslenko V.I. Nonuniformity of calcium efflux from pancreatic acinar cells and its analysis by mathematical model of calcium diffusion and buffering in extracellular solution // Ibid. - 1997. -V 29. - P. 40-44.

Belan P., Gardner J., Gerasimenko O., Gerasimenko J., Mills C.L., Petersen O.H., Tepikin A.V. Isoproterenol evokes extracellular Ca²⁺ spikes due to secretory events in salivary gland cells // J Biol Chem. - 1998. -V 273, №7. - P. 4106-4111.

Melnick I.V., Chvanov M.A., Belan P.V. Rat hippocampal neurons maintain their own GABAergic synaptic transmission in culture // Neurosci Lett. - 1999. -V 262, №3. - P. 151-154.

Belan PV. Petersen OH. Measuring Calcium and Calmoduline Inside and Outside Cells //Measuring Ca²⁺ extrusion from single cells. Heidelberg: Springer-Verlag, 2000. - P. 251-267.

Chvanov M.A., Boychuk Ya.A., Melnick I.V., Belan P.V., Kostyuk P.G. Distributions of the inter-event intervals for miniature inhibitory and excitatory postsynaptic currents in cultured hippocampal neurons // Neurophysiology. - 2000. -V 32, №3. - P. 201-203.

Storozhuk M.V., Melnick I.V., Kostyuk P.G., Belan P.V. Postsynaptic mechanism may contribute to inhibitory acetylcholine effect on GABAergic synaptic transmission in hippocampal cell cultures // Synapse. - 2001. -V 41, №1. - P. 65

Belan P.V., Kostyuk P.G. Glutamate-receptor-induced modulation of GABAergic synaptic transmission in the hippocampus // Pflugers Arch JID - 0154720. - 2002. -V 444, №1. - P. 26-37.

Stepanyuk A., Chvanov M., Ivanov A., Boychuk Y., Pivneva T., Belan P. Prolonged Decay of Evoked Inhibitory Postsynaptic Currents in Hippocampal Neurons is not Shaped by Asynchronous Release // Neurophysiology. - 2002. -V 34, №2/3. - P. 249-252.

Storozhuk M.V., Ivanova S.Y., Pivneva T.A., Melnick I.V., Skibo G.G., Belan P.V., Kostyuk P.G. Post-tetanic depression of GABAergic synaptic transmission in rat hippocampal cell cultures // Neurosci Lett. - 2002. -V 323, №1. - P. 5-8.

Ivanova S.Y., Lushnikova I.V., Pivneva T.A., Belan P.V., Storozhuk M.V., Kostyuk P.G. Differential properties of GABAergic synaptic connections in rat hippocampal cell cultures // Synapse. - 2004. -V 53, №2. - P. 122-130.

Stepanyuk A.R., Boychuk Y.A., Tsugorka T.N., Drebot Y.I., Lushnikova I.V., Pivneva T.A., Belan P.V. Estimating transmitter release rates and quantal amplitudes in central synapses from postsynaptic current fluctuations // Fiziol. Zh. - 2004. -V 50, №4. - P. 22-32.

Chvanov M.A., Kostyuk P.G., Belan P.V. Changes in patterns of mIPSC activity due to glutamate receptor activation // Bogomoletz-Nencki Symposium on Molecular and Physiological Approaches to Neuronal Plasticity, Sulejow (Poland), 2001.

Belan P., Stepanyuk A., Chvanov M., et al. Mechanisms underlying decay of evoked GABAergic IPSC in hippocampal cultured neurons // American Society for Neuroscience 31^st Annual Meeting, San Diego (USA), 2001.

Belan P.V., Chvanov M.A., Kostyuk P.G. Peaked distributions of inter-event intervals of miniature inhibitory and excitatory postsynaptic currents in hippocampal culture // 34^th International Congress of Physiological Sciences. St Petersburg (Russia), 2001.

Chvanov M., Melnick I., Kostyuk P., et al. Different disposition of postsynaptic glutamate and GABA _A receptors causes different patterns of glutamate-induced modulation of inhibitory postsynaptic currents in hippocampal culture // X International Neurobiological Symposium „Mechanisms of Learning and Memory”, Magdeburg (Germany), 2000.

Chvanov M.A., Belan P.V. GABA_Aergic synaptic transmission modulation in the hippocampus by low glutamate concentration // X International Neurobiological Symposium: Mechanisms of Learning and Memory Magdeburg (Germany), 2000.

Chvanov M.A., Melnick I.V., Belan P.V., et al. Low Concentrations of Glutamate Cause a Decrease in Frequency and Coefficient of Variation of Miniature GABA_A Synaptic Currents in Cultured Hippocampal Neurones // 44^th Annual Meeting of Biophysical Society, New Orleans (USA) 2001.

Belan P., Stepanyuk A., Boychuk Y., et al. Mechanisms underlying decay of prolonged GABAergic IPSC in hippocampal cultured neurons // American Society for Neuroscience 32^d Annual Meeting, Orlando (USA), 2002.

Belan P., Chvanov M., Stepanyuk A., et al. Sources of quantal variability in GABAergic synapses of hippocampal neurons // American Society for Neuroscience 33^d Annual Meeting, New Orleans (USA), 2003.

.Tsugorka T., Stepanyuk A., Drebot Y., Markova O., Cherkas V., Belan P. Relationship between neuronal morphology and inhibitory synaptic transmission // IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptors, Channels, Messengers”, Yalta (Ukraine), 2004.

Belan P., Stepanyuk A, Tsugorka T. Estimation of transmitter release rates and quantal sizes from current fluctuations // American Society for Neuroscience 34^th Annual Meeting, San Diego (USA), 2004.

Belan P., Markova O., Fitzgerald D. et al. Hippocalcin as a possible messenger in site specific short-term signal transduction in the hippocampus // American Society for Neuroscience 35^th Annual Meeting, Washington (USA), 2005.

T.Tsugorka, A.Stepanyuk, Y.Drebot, O.Markova, V.Cherkas, A.Dovgan, P.Belan. Dependence of delayed inhibitory synaptic currents on neuronal morphology and dendritic synaptic localization // IBRO CEERC Summer School: "Research strategies for the study of complex neural networks: From synaptic transmission to seeing the brain in action", Debrecen (Hungary), 2005.

 Білан П.В. Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах. У роботі було досліджено зміни у концентрації Ca²⁺ поблизу ізольованих секреторних гранул та показано, що відомі вторінні посередники IP₃ та cADPr викликають швидке вивільнення Ca²⁺ із гранул, чим можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca²⁺] в секреторному полюсі ацинарних клітин. Було також показано, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca²⁺ із ацинарних клітин внаслідок стимуляції агоністом; це має місце завдяки відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин. За допомогою новітніх методів досліджень, розроблених під час виконання роботи, було встановлено, що ізопротеренол спричиняв помітні зміни у вигляді спайків концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Відсутність зростання [Ca²⁺]_i та пульсоподібна природа змін у зовнішньоклітинної [Ca²⁺] вказують на те, що ці спайки з'являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул. Величина викликаного ізопротеренолом вивільнення кальцію була досить значною. Зроблено висновок про те, що у секреторних клітинах кальцій вивільняється у люмен шляхом екзоцитозу, і що екзоцитоз може бути основним механізмом вивільнення кальцію у позаклітинний простір із екзокринних та інших типів секреторних клітин.

Ключові слова: екзокринні клітини, кальцієва сигналізація, секреторна гранула, екзоцитоз, IP₃.

Белан П.В. Механизмы внутриклеточной кальциевой регуляции в экзокринных клетках. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена исследованию различных клеточных механизмов, принимающих участие в скоординированной регуляции концентрации ионов кальция в экзокринных клетках. Для достижения поставленной цели был разработан “метод капельки”, который является новым инновационным подходом, позволяющим количественно оценивать кинетику выведения ионов кальция из одиночных клеток млекопитающих. Так же была разработана новая методика для пространственной визуализации малых трансмембранных потоков ионов кальция в секреторных гранулах, отдельных клетках и малых клеточных агрегатах, в основе которой лежала идея использования флуоресцентного кальциевого индикатора, связанного с высокомолекулярными декстранами для замедления диффузии ионов кальция. Показано, что известные вторичные посредники IP₃ и cADPr, вызывают заметное снижение концентрации свободного интрагранулярного Ca²⁺. Используя новый метод пространственной визуализации малых трансмембранных потоков ионов кальция, измерены изменения концентрации Ca²⁺ вблизи изолированных секреторных гранул и показано, что IP₃ и cADPr вызывают быстрое высвобождение Ca²⁺ из гранул, чем можно объяснить явление вызванного агонистом повышения цитозольной [Ca²⁺] в секреторном полюсе ацинарных клеток. Используя новую методику, в которой высокая степень разрешения при визуализации мест высвобождения клеточного Ca²⁺ достигалась с помощью конфокальной микроскопии и Ca²⁺-чувствительного флуоресцентного красителя, связанного с тяжёлым декстраном, было продемонстрировано, что секреторный полюс является основным местом высвобождения Ca²⁺ из ацинарных клеток вследствие стимуляции агонистом. Показано, что во время стимулированного агонистом повышения кальция или при высвобождении кальция из связанного состояния внутри клетки, Ca²⁺ выводится из апикального секреторного полюса клетки. Это, скорее всего, происходит из-за относительно высокой плотности расположения кальциевых насосов в апикальной мембране ацинарных клеток. Интенсивность высвобождения Ca²⁺ из апикального секреторного полюса такова, что на протяжении стимуляции агонистом происходят значительные (до нескольких миллимолей на литр) изменения в концентрации свободного кальция в люмене ацинуса.

С помощью новой методики для измерения концентрации внеклеточного кальция вблизи клеточной мембраны и методики капли было показано, что изопротеренол, в-адренергический агонист и мощный секреторный агент, не вызывал изменений в концентрации свободного Ca²⁺ в цитозоле, но вызывал заметные изменения в виде спайков концентрации внеклеточного кальция. Отсутствие возрастания [Ca²⁺]_i и пульсоподобная природа изменений внеклеточной [Ca²⁺] указывают на то, что эти спайки появляются, по видимому, вследствие высвобождения кальция из секреторных гранул. Холинергический агонист ацетилхолин вызывал значительное повышение [Ca²⁺]_i и “гладкое” по форме повышение [Ca²⁺]_o, которые были вызваны работой кальциевых насосов плазматических мембран, с наложением коротких спайков [Ca²⁺]_o, вызванных экзоцитозом кальция во внеклеточную среду. Величина вызванного изопротенолом высвобождения кальция была довольно значительной. Вычисленная величина потерь кальция за первые 100 секунд при супрамаксимальной стимуляции соответствует уменьшению общей концентрации кальция в клетке до примерно 0.4 ммоль/л. Сделан вывод о том, что в ацинарных клетках слюнных желез кальций высвобождается в люмен путём экзоцитоза, и что именно экзоцитоз (а не кальциевые АТФазы плазматической мембраны) может быть основным механизмом высвобождения кальция в околоклеточное пространство из экзокринных и других типов секреторных клеток.

Данное исследование опирается на разработанные авторами новые подходы для качественного и количественного описания работы кальций-регулирующих клеточных механизмов. Данные методики позволили значительно расширить наши знания о функционировании экзокринных клеток в норме и патологии. Разработанные авторами новые методы могут быть использованы для изучения различных молекулярных механизмов во многих типах клеток. Кроме того, данное исследование может помочь решить вопрос происхождении таких сложных заболеваний как острый и хронический панкреатиты, что позволяет говорить о возможности клинического использования результатов, полученных в данной работе.

Ключевые слова: экзокринные клетки, кальциевая сигнализация, секреторная гранула, экзоцитоз, IP₃.

Belan P.V. Mechanisms of intracellular calcium regulation in exocrine cells. Manuscript. Dissertation for doctor of science degree by specialty 03.00.02 - biophysics. A.A.Bogomoletz Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kiev, 2004.

This work is devoted to studies of different cellular mechanisms taking part in coordinated regulation of calcium ion concentration in exocrine cells. It has been shown that known second messengers, IP3 and cADPr, evoke a marked decrease in the free intragranular calcium concentration. Using a novel high resolution method developed in the work, we have also measured changes in the free calcium concentration ([Ca²⁺]) in the vicinity of an isolated zymogen granules and show that IP3 and cADPr cause rapid calcium release from the granule, explaining the agonist-evoked cytosolic [Ca²⁺] rise in the secretory pole. We have also found that Ca²⁺ is primarily extruded by calcium pumps from the secretory pole and propose that this process is useful for maintaining a high Ca²⁺ concentration in the acinar lumen, which is necessary for promotion of endocytosis. It has been shown that this spatial pattern of extrusion is most likely due to a relatively high density of calcium pumps in the secretory granule region, Isoproterenol (ISP), a в-adrenergic agonist and powerful secretogogue, evoked no change in the cytosolic free calcium concentration but induced vigorous extracellular Ca²⁺ concentration spiking, most likely due to calcium release from secretory granules. The rate of ISP-induced calcium efflux was very substantial. We conclude that in salivary glands, calcium release via exocytosis is one of the main mechanisms extruding calcium from cells to the extracellular milieu.

Key words: exocrine cells, calcium signaling, secretory vesicle, exocytose, IP₃.

Размещено на Allbest.ru