Кальцієва сигналізація в спінальних нейронах соматосенсорної системи в умовах наявності ноціцептивних синдромів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 612.822:611.813.14

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

КАЛЬЦІЄВА СИГНАЛІЗАЦІЯ В СПІНАЛЬНИХ НЕЙРОНАХ СОМАТОСЕНСОРНОЇ СИСТЕМИ В УМОВАХ НАЯВНОСТІ НОЦІЦЕПТИВНИХ СИНДРОМІВ

03.00.13 - Фізіологія людини і тварин

ВОЙТЕНКО НАНА ВОЛОДИМИРІВНА

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Міжнародному Центрі молекулярної фізіології НАН України та Державному університеті штата Айова (США)

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Ліманський Юрій Петрович,

зав. відділом фізіології стовбуру мозку Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

доктор біологічних наук, професор

Макарчук Микола Юхимович,

зав. кафедрою фізіології людини і тварин Київського Національного університету ім. Тараса Шевченка.

Провідна установа: Київський Національний Медичний університет ім. О.О.Богомольця, кафедра фізіології.

Захист дисертації відбудеться 21.12.2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4. З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ВСТУП

кальцієвий нейрон діабетичний транзієнт

Актуальність проблеми.

Ідентифікація причин і розробка способів запобігання розвитку больових синдромів при різних захворюваннях є принципово важливими задачами сучасної фізіології. Незважаючи на величезну кількість експериментального і клінічного матеріалу, який накопичено з цих проблем за останні десятиліття (Лиманський 1986, Milan 1999), питання про те, як формується біль, залишається значною мірою відкритим. Дослідження механізмів, процесів і явищ у тих системах мозку, що сприймають і обробляють інформацію про вплив больових факторів на організм, мають забезпечити істотний прогрес у рішенні цієї задачі.

Механізми розвитку больових синдромів, таких як гіпералгезія та алодінія, або, навпаки, втрати больової чутливості до теперішнього часу вивчені недостатньо. Так, дані про зміни внутрішньоклітинного метаболізму і, зокрема, кальцієвого гомеостазу, які відбуваються у нейронах входу ноцицептивної системи при больових впливах, поки що практично відсутні, хоча очевидно, що ці механізми мають відігравати найважливішу роль у змінах передачі ноцицептивних сигналів, що спостерігаються при нейропатіях та запаленнях різного генезу.

Також невідомо, порушення яких саме механізмів, котрі задіяні у регулюванні концентрації вільного цитозольного кальцію ([Ca²⁺]_i) у клітині, мають первинне значення. Показано, що розлади клітинного метаболізму Ca²⁺ відіграють істотну роль у розвитку порушень в секреції інсуліну та його дії на організм при діабеті. Порушення кальцієвого гомеостазу, вірогідно відіграють істотну роль у судинних ускладненнях, що супроводжують діабет, таких як артеріальна гіпертензія, атеросклероз та ангіопатії. Є підстави вважати, що пов'язані з діабетом зміни в нервових тканинах можуть базуватися на модифікаціях кальційакумулюючої функції мітохондрій та параметрів деполяризаційних кальцієвих сигналів і призводити до анормального проведення больових імпульсів в первинних сенсорних нейронах.

Таким чином, запалення і сенсорна діабетична нейропатія являють собою такі патологічні стани організму, яки призводять до значних метаболічних перебудов у різних клітинах організму, у тому числі й у нервових. Розуміння принципів регуляції кальцію та їх змін при запаленні і діабеті необхідно як для розширення нашого уявлення про виникнення сенсорних нейропатій і больових синдромів, так і для знаходження шляхів їх лікування. Тому логіка виконаної роботи полягала в поетапному вивченні та порівнянні змін кальцієвої сигналізації у спінальних нейронах соматосенсорної системи гризунів в умовах нейропатії та запалення, а саме: (і) встановленні наявності порушень проведення больових сигналів на рівні цілого організму; (іі) дослідженні функціонування молекулярних механізмів регуляції кальцієвого гомеостазу в ізольованих соматосенсорніх нейронах та нейронах у зрізах спинного мозку тварин з больовими синдромами; (ііі) порівнянні змін кальцієвого гомеостазу при запаленні та нейропатії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: “Дослідження впливу різних нейромедіаторів на гомеостаз кальцію в ізольованих нейронах мозку щурів”, "Зміни дії нейромедіаторів та модуляторів гомеостазу кальцію в сенсорних нейронах щурів на різних стадіях розвитку діабетичної нейропатії”, “Вивчення ролі потенціал- та лігандкерованих кальцієвих каналів ізольованих сенсорних нейронів дорсальнокорінцевих ганглиїв та нейронів дорсального рогу під час розвітку больової нейропатії у щурів”, а також наукових тем Міжнародного Центру молекулярної фізіології НАН України: "Дослідження молекулярних механізмів гомеостазу кальцію в нервових клітинах під час ішемії та діабету”, "Дослідження кальційової провідності глутаматних рецепторів трансгенних мишей з нокаутованими генами цих рецепторів” та “Зміни ефективності синаптичної передачі на різних рівнях нервової системи за експериментально викликаних патологічних станів”.

Мета роботи.

Мета виконаної роботи полягала у виявленні і порівняльному аналізі змін кальцієвої сигналізації та їх механізмів у первинних та вторинних нейронах соматосенсорної системи (клітини дорсальнокорінцевих гангліїв (ДКГ), та нейрони дорсального рогу (ДР) спинного мозку, відповідно) тварин (гризунів) в умовах наявності експериментально викликаних больових синдромів.

Задачі дослідження.

Визначити адекватність використання стрептозотоцинової моделі цукрового діабету як моделі нейропатичного болю шляхом вимірів больової чутливості щурів у нормі і при експериментально викликаному діабеті.

Провести порівняльний аналіз основних параметрів кальцієвих транзієнтів у первинних і вторинному (ноцицептивних та неноцицептивних) сенсорних нейронах здорових щурів і щурів із синдромами діабетичної нейропатії.

Визначити залежність змін кальцієвого гомеостазу у соматосенсорних нейронах від терміну розвитку діабетичної нейропатії.

Провести порівняльний аналіз основних параметрів кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією цитоплазматичної мембрани, у первинних соматосенсорних нейронах здорових тварин і тварин з карагенініндукованим периферичним запаленням.

Виявити зміни кальцієвих сигналів, які викликані вивільненням іонів кальцію з внутрішньоклітинних органел сенсорних нейронів мишей і щурів на тлі карагеніниндукованого запалення.

Вивчити функціонування іонотропних та метаботропних глутаматних рецепторів в умовах викликаного карагеніном запалення.

Провести зіставлення змін кальцієвої сигналізації в соматосенсорних нейронах при наявності больових синдромів запального і нейропатичного походження.

Наукова новизна отриманих результатів.

У роботі вперше проведено порівняння модифікацій механізмів внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації, котрі можуть лежати в основі розвитку больових синдромів при запаленні і діабетичній нейропатії. Виявлено зміни кальцієвого гомеостазу в первинних (нейрони ДКГ) і вторинних (нейрони ДР) соматосенсорних нейронах, характерні для станів як ноцицептивного, так і нейропатичного болю у гризунів. Показано, що ці зміни відбуваються у функціях кальцієвих каналів і внутрішньоклітинних кальцієвих депо досліджених нейронів мишей та щурів. Вперше продемонстровано, що при больових синдромах амплітуди кальцієвих транзієнтів, які індуковані кофеїном, АТФ та іономіцином, зменшуються, а вхід іонів кальцію в цитозоль через іонотропні глутаматні рецептори посилюється. Часовий перебіг цих змін чітко корелює з динамікою розвитку алодінії та гіпералгезії після ініціації захворювання. Отримані дані свідчать про можливість того, що зменшення кальційакумулюючої активності эндоплазматического ретикулуму і мітохондрій може бути основним фактором, відповідальним за процеси центральної сенситизації. Уперше показані специфічні риси кальцієвої сигналізації у первинних і вторинних соматосенсорних нейронах щурів з периферичним запаленням і цукровим діабетом.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Результати, які отримані в роботі, мають як фундаментальне, так і практичне значення. Порівняння роботи внутрішньоклітинних кальційрегулюючих структур в умовах діабетичної нейропатії та запалення істотно допомагають розумінню механізмів виникнення больових синдромів і збагачують знання, що стосуються цих патологій.

Практичне значення отриманих результатів полягає в тому, що вони дозволяють зрозуміти, які саме механізми внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу у первинних і вторинних сенсорних нейронах ушкоджуються при розвитку різних патологій, пов'язаних з виникненням больових синдромів. Отримані в роботі дані та їх інтерпретація можуть стати основою для розробки високоселективних фармакологічних підходів до лікування вищеназваних патологій. Є підстави вважати, що речовини, які впливають на роботу кальцієвих каналів плазмалемми, кальцієвих насосів ендоплазматичного ретикулуму і плазмалемми, а також можливі модулятори кальцієвого уніпортеру мітохондрій можуть бути використані для лікування сенсорних нейропатій у людей, які хворіють діабетом, а також для зменшення страждань хворого на гостре і, можливо, хронічне запалення тих чи інших тканин та органів.

Особистий внесок здобувача.

Автор поставила задачу досліджень і самостійно розробила методики приготування тонких зрізів спинного мозку та ізоляції функціонально повноцінних вторинних сенсорних нейронів, внесла ряд удосконалень у методику проведення поведінкових тестів, а також самостійно виконувала основну частину експериментів, здійснювала аналіз, статистичну обробку й узагальнення результатів.

Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: академіком П.Г.Костюком, доктором медичних наук О.П.Костюк, кандидатами біологічних наук Б.С.Сушко, О.В.Грищенко, І.Кругликовим, В.Шишкіним, а також аспірантами Е.Потапенко и Л.Шутовим. Біохімічні експерименти були виконані сумісно з доцентом кафедри фізіології людини та тварин Львівського державного університету ім. І.Франка к.б.н. Н.В.Федірко. У роботі використовували деяке унікальне устаткування, яке було створено провідним інженером Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця С.І.Кабанченко.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації докладено на семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, а також на міжнародних симпозіумах і з'їздах: щорічних конференціях Американського Товариства Нейронаук, США (Новий Орлеан, 1997; Лос Анжелес, 1998; Маямі, 1999; Сан Діего, 2001; Орландо, 2002; Новий Орлеан, 2003, Сан Дієго 2004); щорічних конференціях Американського Біофізичного Товариства, США (Новий Орлеан, 1997; Новий Орлеан, 2000; Сан Антоніо 2003); спільному Богомолец-Ненскі симпозіумі (Сулеєв, Польша, 2001); 33-м і 34-м міжнародних Конгресах фізіологичних наук (Санкт-Петербург, Росія 1997; Крайстчерч, Нова Зеландія, 2001); міжнародному семінарі по нейронаукам (Прага, Чехия, 2001); 37-м щорічнім засіданні Європейської Наукової Діабетичної Асоціації (Глазго, Велика Британія, 2001); XIV міжнародному біофізичному Конгресі (Буэнос-Айрес, Аргентина, 2002); 62-й Научній Сесії Американської Діабетичної Асоциації (Сан-Францисько, США, 2002); Ювілейній школі IBRO (Ялта, Україна, 2004), а також на засіданнях сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, 2000, 2001, 2002, 2003 и 2004 років.

Публікації.

За результатами роботи опубліковано 31 стаття у провідних вітчизняних і закордонних журналах і 45 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 501 найменування. Робота викладена на 326 сторінках, містить 5 таблиць та проілюстрована 60 рисунками.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єкти дослідження. В експериментах використовували модель ноцицептивного болю, який викликано карагеніновим запаленням, та модель невропатичного болю, що викликаний стрептозотоциновим (СТЗ) діабетом. Для одержання моделі експериментального запалення ми використовували самців щурів лінії Вистар віком 21 день (маса 30-35 г) або дорослих мишей віком 2 місяця (маса 25-30 г). Запалення викликалося внутрім'язовою ін'єкцією 100 мкл розчину карагеніна (Carrageenan Lambda, Type ІV, Sіgma-Aldrich, США) у задню кінцівку (2 мг на 100 мкл 0.9 % розчину NaCl для ін'єкцій, Галичфарм, Україна). Експозиція для розвитку запалення становила 3 години. Контрольним тваринам того ж віку ін'єкували аналогічний об'єм чистого 0.9% розчину NaCl. Для одержання моделі експериментального діабету використовували самців щурів лінії Вистар віком 21 день (маса 30-35 г). Діабет викликався одноразовою внутрішньочеревинною ін'єкцією 80 мг/кг СТЗ, що був розчинений в ізотонічному розчині NaCl. Ін'єковані СТЗ і контрольні тварини такого ж віку утримувалися на однаковій дієті протягом усього періоду розвитку захворювання; тварин брали в експеримент через 3-4 або 6-7 тижнів після ін'єкції СТЗ. Концентрацію глюкози в плазмі крові, вимірювали за допомогою оптичного сенсора глюкози (Roche Dіagnostіcs, Німеччина). Концентрація глюкози в плазмі крові знаходилася в межах 5 - 9 мМ у контрольних тварин і 14 - 28 мМ у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом. Експерименти з тваринами були затверджені і проводилися відповідно до вимог Клініки піддослідних тварин Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Після експозиції, достатньої для розвитку запалення або діабету, проводили стандартну процедуру ферментативного виділення сенсорних нейронів ДКГ або ДР люмбального відділу (L4-L6) спинного мозку (Voitenko et al. 2004). У разі індукції запалення нейрони ДКГ і ДР виділялися з тієї сторони, у яку виконували ін'єкцію. Тонкі зрізи спинного мозку готували за методикою Рандич і співавторів (Randіc et al. 1993). Для цього під глибокою ефірною анестезією проводили ламінектомію та препарували люмбосакральну ділянку спинного мозку (сегменти L4 -S1). Відразу ж після цього фрагмент спинного мозку занурювали в охолодженій до 4°С інкубаційний розчин, постійно насичуваний сумішшю 95% + O₂5% CO₂, у якому виконували подальші операції. Після очищення від твердої мозкової оболонки, препарат прикріплювали до столика вібротома (Campden Іnstruments, Велика Британія), за допомогою якого готували тонкі фронтальні зрізи (300 мкм) сегментів L4-L6. Після приготування зрізи витримували протягом принаймні 1 години в оксигенованому базовому розчині при температурі 32°С.

Для дослідження змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію в ізольованих нейронах ДКГ і ДР були використанні кальцієві барвники іndo-1 та fura-2. В експериментах на недіалізованих клітинах використовували мембранопроникні форми барвників (іndo-1/АМ та fura-2/АМ). Для завантаження кальцієвих барвників були застосовані наші оригінальні методики (Voitenko et al. 2000; Kostyuk et al. 2001; Voitenko et al. 2004).

Встановлення наявності діабетичних нейропатій. Для встановлення наявності відхилень в роботі нервової системи тварин з діабетом використовували методи "формалінового тесту" та "гарячої поверхні". Перший метод використовували для дослідження поведінкових реакцій тварин при гострому болі, другий метод дозволяв досліджувати больові реакції щурів на термічний стимул, а також визначати поріг больової температурної чутливості.

Одночасна реєстрація трансмембранних струмів і внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів. Нейрони візуально ідентифікували, використовуючи довгофокусний об'єктив NA 0.9, х60 (Olympus, Японія) і відеокамеру Hamamatsu C2400, (Hamamatsu Corp., Японія) у режимі інфрачервоного диференційно-інтерференційного контрасту. Іонні струми ("пэтч-клэмп" у конфігурації "ціла клітина") реєстрували з використанням неоплавлених тонкостінних піпеток з боросілікатного скла (8-10MО; VWR Scіentіfіc, США), підсилювача Lіst EPC7 (HEKA Electronics, Німеччина). Клітини, котрі мали гладку поверхню мембрани і низький контраст, демонстрували найкращі ознаки життєздатності нейронів, такі як потенціал спокою, потенціал дії (рис. 1), вхідний опір і постійну часу мембрани. Після одержання гігаомного контакту нейрони утримували при потенціалі -60 мВ. Стимуляцію і реєстрацію електричних сигналів проводили з використанням програмного забезпечення pClamp - 8.0 (Axon Іnstruments, США). Зміни внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію визначали згідно зі змінами флуоресценції барвника fura-2, яку вимірювали з використанням охолоджуваної CCD камери (PXL; EEV-37-GІ, Photometrіcs, США) на довжині хвилі 510 нм зі збуджуючим випромінюванням на довжині хвиль 360 та 380 нм. В разі використання барвника іndo-1 зміни внутрішньоклітинної концентрації кальцію визначали як зміни флуоресценції на довжинах хвиль 400 та 500 нм за допомогою двох фотопомножувачів зі збудженням на довжині хвилі 360 нм. Для виміру змін флуоресценції використовували програмне забезпечення ІPLAB (Scanalytіcs, США) або Tida ( HEKA Electronics, Німеччина).

Відносну зміну інтенсивності флуоресценції (R) на зазначених довжинах хвиль застосовували для розрахування [Ca²⁺]_i у цитозолі за формулою Грінкевіча (Grynkiewicz G. et al. 1985):

[Ca²⁺]_i = K_d · B · (R - R_min) / (R_max - R).

Значення констант, що входять у формулу (K_d, B, R_min, R_max), одержували за допомогою калібрування відповідного експериментального устаткування.

Вимірювання активності Ca²⁺, Mg²⁺-АТФаз ДКГ і ДР. Мікросомальну фракцію одержували шляхом диференціального центрифугування. Величину АТФ-гідралазної активності визначали по кількості відщепленого неорганічного фосфату Р_i, вміст якого визначали за допомогою модифікованого методу Фиске-Субарроу.

Розчини і реактиви. Інкубаційний фізіологічний розчин, що застосовували у перебігу препарування спинного мозку, містив (мМ): NaCl - 125; KCl - 5; CaCl₂ - 2.5; MgSO₄ - 1.5; NaHCO₃ - 25; KH₂PO₄ - 1.6; глюкоза - 10; рН 7.4. Температуру розчину підтримували на рівні 4°С протягом усього процесу виділення і приготування зрізів. Базовий фізіологічний розчин, що застосовували під час експериментальних процедур і завантаження зрізів флуоресцентними кальцій чуттєвими зондами містив (мМ): NaCl - 128; KCl - 2; CaCl₂ - 2.5; MgSO₄ - 1.5; NaHCO₃ - 25; KH₂PO₄ - 1.6; глюкоза - 10; рН 7.4, в умовах постійного насичення сумішшю 95 % O₂ + 5% CO₂; температуру розчину підтримували на рівні 32°С. Внутрішньопіпетковий розчин, що використовували в електрофізіологічних експериментах, містив (мМ): глюконат калію - 133; NaCl - 5; MgCl₂ - 0.5; HEPES-Na - 10; MgATP - 2; GTP - 0.1; fura-2 калієву сіль - 0.2-0.3; pН 7.3 доводили за допомогою KOH. Базовим позаклітинним розчином, який використовували для ізольованих нервових клітин, перфузії експериментальної камери і приготування інших позаклітинних розчинів, був модифікований розчин Тироде наступного складу (мМ): NaCl - 140; KCl - 2; MgCl₂ - 2; CaCl₂ - 2; HEPES - 10; глюкоза - 10; рН 7.4 доводили за допомогою NaOH. Для одержання гіперкалієвого розчину 50 мМ Na⁺ у розчині Тироде ізоосмотично заміщували 50 мМ K⁺. Безкальцієвий фізіологічний розчин одержували з базового розчину шляхом еквімолярної заміни CaCl₂ у базовому розчині на MgCl₂, а також додаванням 1 мМ хелатора кальцію EGTA. З метою запобігання можливого впливу потенціалів дії на генерацію кальцієвих транзієнтів у всіх експериментах з тонкими зрізами спинного мозку до базового розчину додавали 1 мкМ блокатора потенціалзалежних Na⁺ каналів тетродотоксину (ТТХ).

Аналіз даних. У процесі експерименту дані оцифровували аналого-цифровими перетворювачами (Axon Іnstruments, США та HEKA Electronics, Німеччина) і зберігали на твердому диску комп'ютера з використанням програмних пакетів pClamp - 8.0, Axolab 3.0 (Axon Іnstruments, США), ІPLAB (Scanalytіcs, США) та Tida ( HEKA Electronics, Німеччина). Аналіз даних виконували з використанням аналітичних програмних продуктів (Clampex - 8.0, Axon Іnstruments; Tida HEKA Electronics; Origin 3.54, Microcal Software; Excel 2000, Microsoft). У подальшому результати представлені як середні значення ± середньоквадратична похибка при обсязі вибірки n. Вірогідність розходжень між значеннями визначали за критерієм t-Стьюдента. Різницю вважали достовірною при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Больова чутливість щурів в нормі та зі СТЗ-індукованим діабетом

У даних експериментах ми оцінювали зміни поведінкових реакцій щурів зі СТЗ-індукованим діабетом у відповідь на біль, викликаний підшкірною ін'єкцією формаліна (формаліновий тест). Досліди проводили на самцях щурів лінії Wistar двох груп: контрольної (10 тварин) й зі СТЗ - індукованим діабетом (7 тварин). При введенні формаліну (20 мкл 5% розчину), як у хворих, так і у здорових щурів розвивалися реакції неконтрольованого посмикування та активного лизання кінцівки, у яку був уведений формалін. При цьому характер розвитку даніх реакцій був достовірно різним у контрольних щурів й у щурів зі СТЗ-індукованим діабетом. У діабетичних щурів відповідь носила яскраво виражений двофазний характер; вона складалася з першої “гострої” фази, що тривала близько 10 хв, і другої “тонічної” фази, що була тривалою (85-90 хв), без яскраво виражених максимумів. У контрольних тварин значно менш виражена перша фаза; друга фаза, навпаки, проявлялася більш інтенсивно і мала яскраво виражений максимум на 40-45 хв. Реакції припинялися через 70-75 хв, тобто набагато раніше, ніж у діабетичних тварин.

При застосуванні тесту “гаряча поверхня” ноцицептивну стимуляцію виконували, розміщуючи експериментальну тварину на поверхні, розігрітій до температури, здатної викликати больову реакцію. Як больові реакції ми розглядали посмикування кінцівок, що контактують з нагрітою поверхнею, і їх лизання. У перебігу експериментів було встановлено, що поріг больової чутливості у контрольних щурів і щурів зі СТЗ-індукованим діабетом статистично не відрізнявся; він складав 42⁰ С. При підвищенні температури поверхні з 43 до 47⁰ С, не спостерігалося достовірних розходжень у латентності больової реакції, проте при 48⁰ С ці розходження ставали достовірними, (експерименти з подальшим збільшенням температури не проводилися з гуманних міркувань). Так, у щурів, розміщених на гарячій поверхні з температурою 48⁰ С, час настання больової реакції склав 10 ± 0.8 с (n = 5) для контрольних тварин й 22 ± 1.5 с (n = 5), для діабетичних щурів (р < 0.001). Таким чином, ми спостерігали достовірне збільшення латентного періоду больової реакції у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом, що говорить про наявність у них термічної гіпоалгезії.

Зміни кальцієвої сигналізації в нейронах ДКГ при діабетичної нейропатії

Для експериментів по вивченню змін, що відбуваються на клітинному рівні, було взято 65 контрольних тварин й 73 тварин зі СТЗ-індукованим діабетом. Тварини з діабетом бралися в експеримент через 6-7 тижнів після введення СТЗ. Концентрація глюкози в плазмі крові склала у середньому 7.4 ± 1.2 мМ (n = 65) у контрольних тварин й 26.6 ± 1.8 мМ (n = 73) у щурів зі СТЗ-індукованим діабетом.

Однією з найважливіших характеристик внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу є кінетика кальцієвих транзієнтів, які пов'язані з деполяризацією клітинної мембрани. Пікові значення кальцієвих транзієнтів характеризують вхід кальцію в клітину через потенціалзалежні кальцієві канали, а крива спаду таких транзієнтів описує динаміку виведення Ca²⁺ із цитозоля. Відкривання потенціалзалежних кальцієвих каналів є функцією зменшення мембранного потенціалу. Порівняння кальцієвих сигналів, які викликалися у тварин з діабетом і контрольних щурів короткочасною (3 с) деполяризацією нейронів ДКГ малого діаметра, показало що їхні основні характеристики, а саме базальний рівень [Ca²⁺]_i, тривалість напівспаду (t_0,5), а також рівень залишкового кальцію в цитозолі через 60 с після закінчення деполяризації (R₆₀) достовірно відмінні. У середньому базальний рівень [Ca²⁺]_i у малих нейронах ДКГ складав 76 ± 6 нМ (n=26) у контрольних тварин й 134 ± 11 нМ (n=29) у нейронах діабетичних щурів (p < 0.001).

При порівнянні кінетики відновлення транзієнтного підвищення [Ca²⁺]_i у відповідь на деполяризацію виявилося достовірне підвищення рівня залишкового кальцію на спаді такого транзієнту, але тільки в нейронах ДКГ малого діаметра. Величина R₆₀ у нейронах щурів з діабетом склала 15 ± 3 % (n=17), тоді як у нейронах контрольних тварин аналогічне значення було 10 ± 1 % (n=19, p < 0.05). У великих нейронах ДКГ відповідні значення не розрізнялися одне від одного, навіть за збільшеної тривалості деполяризації.

Для подальшої інтерпретації механізмів функціонування структур, що беруть участь у регуляції кальцієвого гомеостазу, ми досліджували вплив блокаторів різних кальцієвих каналів на кальцієві транзієнти, які викликано деполяризацією. Аплікація 50 мкМ блокатора кальцієвих каналів L-типу ніфедипипіну на нейрони ДКГ призводила до істотного зменшення амплітуди кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією. Як видно з табл. 1, ця депресія була значно сильнішою у діабетичних щурів у порівнянні з контрольними тваринами. У малих за розміром нейронах ДКГ нормовані амплітуди кальцієвих транзієнтів, які викликалися деполяризацією на тлі аплікації ніфедипіна, складали 64 ± 5 % (n = 11) у нейронах контрольних тварин і 46 ± 5 % (n=9) у нейронах діабетичних щурів, у порівнянні з величинами транзієнтів за відсутності згаданого агента. Розходження між значеннями у контрольних та діабетичних тварин були статистично достовірними (p < 0.05). У великих нейронах такі амплітуди знижувалися до 57 ± 6 % (n=16) і 34 ± 6 % (n=8), у контрольних і діабетичних тварин відповідно (p < 0.05).

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДКГ при діабетичної нейропатії

Функціонування мітохондрій

Для вивчення можливих змін у кальцієвої регуляції в нейронах ДКГ, яка реалізується мітохондріями, ми провели серію експериментів з використанням роз'єднувача протонного градієнта на мембрані мітохондрій карбоніл-цианід-m-хлорофеніл гідразона (СССР). Як було показано раніше, гіперкалієва деполяризація, яка реалізується на тлі дії СССР, істотно збільшує амплітуду [Ca²⁺]_i транзієнтів: від 702 ± 62 нМ (n=19) у нормальних умовах до 1065 ± 105 нМ (n=14) у присутності СССР (p < 0.05). При порівнянні кальцієвих відповідей на деполяризацію в нормальних умовах і на тлі дії 10 мкМ СССР нами було виявлено, що в малих (ноцицептивних) нейронах ДКГ достовірна відмінність амплітуд [Ca²⁺]_i транзієнтів при діабеті зникає (табл. 1). Відповідні амплітуди дорівнювали 799 ± 100 нМ (n=17) у нормальних умовах та 938 ± 142 нМ (n=22) під час дії СССР (p < 0.05). У великих нейронах ДКГ дані амплітуди істотно відрізнялися як у контролі, так і при діабеті (p < 0.05). У випадку, коли СССР аплікувався під час спаду кальцієвого транзієнту, то як при діабеті, так і у нормі, відбувався додатковий викид кальцію, який

запасається мітохондріями під час підвищення [Ca²⁺]_i, викликаного деполяризацією. І у великих, і у малих нейронах ДКГ діабетичних щурів ми виявили значне пригнічення даного викиду. Так, у великих нейронах ДКГ нормована амплітуда СССР - індукованого викиду зменшилася від 235 ± 42 % (n=12) до 62 ± 20% (n=10, p < 0.005). У малих нейронах ДКГ значення таких амплітуд становили в нормі 134 ± 22% (n=8), а при діабеті лише 68 ± 12% (n=6, p < 0.05). Дані результати свідчать, що при діабеті робота Na⁺/Ca²⁺-обмінника мітохондрій значно послаблюється. До того ж у малих нейронах це пригнічення ймовірно супроводжується ще й послабленням захоплення Ca²⁺ кальцієвим уніпортером.

Функціонування ріанодинового депо ендоплазматичного ретикулуму (ЕР)

Досліджуючи роботу ріанодинового депо ЕР у нейронах ДКГ ми використали такий активатор ріанодинових рецепторів, як кофеїн у концентрації 20 мМ. Для виключення розбіжностей, які пов'язані з рівнем завантаженості кальцієвого депо ЕР, ми попередньо деполяризовали досліджувані клітини. Аплікація 20 мМ кофеїну до інтактних нейронів ДКГ (без попередньої деполяризації) призводила до транзієнтного збільшення [Ca²⁺]_i у нейронах контрольних і діабетичних тварин.

Ми не виявили достовірної різниці між амплітудами кофеїніндукованих [Ca²⁺]_i транзієнтів у нейронах здорових і діабетичних щурів до дії деполяризації (табл.1). У середньому амплітуди кофеїніндукованих [Ca²⁺]_i транзієнтів складали 334 ± 48 нМ (n=21) у нейронах контрольних тварин і 354 ± 39 нМ (n=27) у нейронах діабетичних щурів (p > 0.1). Це свідчить про те, що початковий обсяг кальцію в ЕР майже однаковий у нормі та при діабеті. До цього, ефективність виведення кальцію через ріанодинові рецептори, очевидно, не змінюється.

Можна припустити, що зниження амплітуд кофеїніндукованих відповідей після перезаповнення депо пов'язане з уповільненням роботи Са²⁺-АТФаз ЕР в умовах діабетичій нейропатії.

Функціонування інозитолтрифосфат чутливого депо ЕР

Для вивчення викликаних діабетом змін у вивільненні Ca²⁺ із іншого депо, яке існує у ЕР - інозитол-1,4,5-трифосфат(InsP₃)-чутливого депо, ми використовували агоністи метаботропних пуринових і глутаматних рецепторів. Відомо, що активація деяких типів метаботропних (P2Y) пуринорецепторів призводить до збільшення рівня InsP₃ у цитозолі, що призводить до збільшення [Ca²⁺]_i за рахунок вивільнення Ca²⁺ з InsP3-чутливого кальцієвого депо. Як і у експериментах з вивільненням Ca²⁺ з ріанодин чутливих депо, ми дослідили ступінь завантаженості кальцієвих депо ЕР в стані спокою. Аплікація 200 мкМ АТФ на нейрони ДКГ, що перебували в спокої, у безкальцієвому позаклітинному розчині, призводила до підвищення [Ca²⁺]_i у нейронах як діабетичних, так і контрольних тварин. Амплітуди транзієнтів, індукованих додаванням АТФ, у нейронах діабетичних тварин у порівнянні з контрольними не демонстрували істотних відмінностей. У середньому амплітуди цих транзієнтів становили 114 ± 18 нМ (n=11) для нейронів контрольних й 98 ± 19 нМ (n=12, p > 0.1) для нейронів діабетичних щурів. Отже, у нейронах ДКГ, які знаходилися в спокої, InsP3-чутливі депо заповнені кальцієм приблизно до однакового рівня і у діабетичних, і у контрольних щурів.

Наступним етапом наших досліджень був аналіз амплітуд кальцієвих транзієнтів в умовах вивільнення Ca²⁺ з InsP₃-чутливих кальцієвих депо після їхнього перезаповнення, індукованого гіперкалієвою деполяризацією. Аплікація 200 мкМ АТФ у безкальцієвому позаклітинному розчині на малі (ноцицептивні) нейрони ДКГ викликала кальцієвий транзієнт із середньою амплітудою 232 ± 47 нМ (n=10) у контролі й 88 ± 12 нМ (n=13) у діабетичних тварин. Таким чином, зниження амплітуди АТФ-індукованого вивільнення Ca²⁺ з InsP₃-чутливого кальцієвих депо склало 62 ± 5 % (p < 0.01).

Іономіциніндукований викид кальцію з ЕР

Для дослідження ємності кальцієвих депо ЕР ми використали антибіотик іономіцин. Відомо, що іономіцин є широко вживаним клітинним іонофором, котрий індукує високоспецифічну проникність іонів двовалентних металів й особливо кальцію (Liu and Hermann, 1978). У концентраціях менших або рівних 1 мкМ іономіцин зумовлює викид кальцію з обох типів депо ЕР згідно з ріанодин- та InsP₃-незалежними механізмами (Morgan and Jacob, 1994). Додавання 1 мкМ іономіцину до безкальцієвого розчина призводило до транзієнтного збільшення рівня вільного внутрішньоклітинного Ca²⁺ у нейронах ДКГ як контрольних тварин, так і щурів з СТЗ-індукованим діабетом (рис. 4А). Щоб уникнути артефактів, які можуть бути пов'язані зі ступенем завантаженості кальцієвих депо ЕР, всі досліди з додаванням іономіцину проводилися після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення таких депо.

Щоб уникнути артефактів, які можуть бути пов'язані зі ступенем завантаженості кальцієвих депо ЕР, всі досліди з додаванням іономіцину проводилися після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення таких депо. Так само, як і при дії інших активаторів викиду кальцію з депо, амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнтів під дією 1 мкМ іономіцину була значно меншою в нейронах діабетичних тварин; вона склала 236 ± 20 нМ (n=20) у контрольних нейронах й 116 ± 25 нМ (n=16) у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом. Різниця амплітуд була статистично достовірною (р < 0.001). Таким чином, середня амплітуда иономицин-індукованого [Ca²⁺]_i транзієнту зменшувалася у нейронах тварин з експериментальним цукровим діабетом на 51 ± 5% у порівнянні з контрольними значеннями (табл.1).

Таблиця 1. Параметри, визначені для нейронів ДКГ контрольних щурів та тварин із діабетичною нейропатією. Дані представлені в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р - параметр вірогідності.

Зміни кальцієвої сигналізації у нейронах ДР при діабетичній нейропатії

У нейронах желатинозної субстанції ДР рівень базального [Ca²⁺]_i склав в середньому 90 ± 4 нМ (n = 31) у контрольних тварин й 102 ± 6 нМ (n = 47) у тварин з діабетичною нейропатією.

Деполяризація клітини викликалася додаванням гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К⁺ близько 50 мМ. Ми не виявили істотної міжгрупової різниці в значеннях пікових амплітуд або часу наростання кальцієвих транзієнтів, що викликані деполяризацією у контрольних і діабетичних тварин. Так, постійна часу наростання таких транзієнтів становила 3.5 ± 0.8 с (n = 28) і 3.9 ± 0.6 с (n = 38) у контрольній групи та у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом відповідно (p > 0.1) й описувалася моноекспоненційною функцією.

Різниця між піковими значеннями кальцієвих транзієнтів, що викликані деполяризацією, також не була достовірною. Відповідні значення склали 636 ± 36 нМ (n = 28) і 564 ± 51 нМ (n = 38, p > 0.1), у контрольних тварин і тварин із діабетичною нейропатією відповідно (табл. 2). Основна різниця характеристик [Ca²⁺]_i транзієнтів у нейронах ДР була виявлена нами щодо кінетики спаду таких транзієнтів, що відображає характер вилучення Са²⁺ із цитозолю. Найбільш істотну різницю було виявлено в значеннях рівню залишкового [Ca²⁺]_i, який вимірювали на 90-й секунді після початку деполяризації. Рівень залишкового кальцію був достовірно вищім у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом і становив (у відсотках пікового значення) 2.8 ± 0.5 % (n = 25) і 14.1 ± 1.2 % (n = 25) у контрольних тварин і щурів з діабетичною нейропатією відповідно (р<0.001; табл. 2). Отже, отримані результати дозволяють дійти висновку про наявність порушень кальційрегуляторної функції у вторинних нейронах соматосенсорної системи.

Один з найбільш істотних шляхів підвищення цитозольного [Ca²⁺]_i - це вхід Ca²⁺ через потенціал залежні Ca²⁺ канали клітинної мембрани. Для відкривання таких каналів ми використали дію позаклітинного розчину із підвищеною концентрацією (50 мМ) іонів K⁺, що призводить до деполяризації мембрани у нейронах даного типу до рівня -10 - 0 мВ. Для визначення внеску різних типів потенціалкерованих кальцієвих каналів у загальний деполяризаціцний [Ca²⁺]_i транзієнт ми використали блокування різних підтипів каналів їхніми специфічними інгібіторами такими як ніфедипін й w-конотоксин.

Ефект ніфедипіну

Аплікація 50 мкМ блокатора високопорогових кальцієвих каналів L-типу ніфедипіну, значно зменшувала амплітуду деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту у нейронах ДР. Амплітуда деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту під дією ніфедипіна склала 490 ± 36 нМ (n = 18) у нейронах контрольних тварин і 248 ± 21 нМ (n = 13) у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом (p < 0.001). Характерні деполяризаційні [Ca²⁺]_i транзієнти під дією ніфедипіна наведені на рис. 5. Таким чином, амплітуда деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту під дією ніфедипіну зменшувалася у нейронах контрольних тварин на 31 ± 5 %, у той час як у нейронах тварин з експериментальним цукровим діабетом ефект ніфедипіну був виражений значно сильніше, і складав 65 ± 3 %. Дані результати свідчать про істотне збільшення блокуючого ефекту ніфедипіну на деполяризаційний [Ca²⁺]_i транзієнт в умовах СТЗ-індукованого діабету (табл. 2).

Для того щоб визначити подальші можливі зміни внеску потенціалкерованих кальцієвих каналів у генерацію деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту, ми використали специфічний блокатор високопорогових Ca²⁺ каналів N-типу w-конотоксин GVIA. Амплітуда деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту у нейронах ДР на тлі дії 1 мкМ--w-конотоксина склала 546 ± 29 нМ (n = 8) у контрольних умовах й 426 ± 25 нМ (n = 11) при діабеті (p < 0.01). Таким чином, дія w-конотоксина призводила до зменшення амплітуди [Ca²⁺]_i транзієнту, викликаного деполяризацією клітини, на 23 ± 4% у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів з експериментальним діабетом дане зменшення склало, як й у випадку з ніфедипіном, значно більше значення - 40 ± 3%. Дані результати свідчать про достовірне збільшення блокування кальцієвих каналів N-типу при генерації деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту в умовах СТЗ-індукованого діабету (табл. 2).

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДР при діабетичної нейропатії

Функціонування мітохондрій

Для дослідження впливу мітохондрій на кальцієву сигналізацію нейронів ДР ми застосовували блокування захоплення мітохондріями цитозольного Са²⁺ за допомогою СССР. Аплікація 10 мкМ СССР сама по собі не викликала достовірного підвищення [Ca²⁺]_i у нейронах ДР у тонких зрізах спинного мозку. Якщо ж ми деполяризували клітину на тлі додавання СССР, то амплітуда викликаного збільшення [Ca²⁺]_i була набагато вище ніж амплітуда кальцієвого транзієнту у відповідь на деполяризацію у нормальному розчині. Даний ефект пов'язаний з тим, що уніпортер мітохондрій заблокований і, отже, мітохондрії не беруть участь у захопленні іонів кальцію із цитоплазми, у той час як вхід через потенціалкеровані кальцієві канали зберігається незмінним. Так, амплітуда деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту у нейронах ДР на тлі дії 10 мкМ СССР склала 1249 ± 69 нМ (n = 22) у контрольних умовах і 827 ± 45 нМ (n = 22) при експериментально викликаному діабеті (p < 0.001). Таким чином, дія СССР призводила до збільшення амплітуди деполяризаційного [Ca²⁺]_i транзієнту на 78 ± 15 % у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом це збільшення склало значно менше значення - 27 ± 8 % (табл. 2).

Функціонування ріанодинового депо ЕР

Додавання 30 мМ кофеїну до нейронів ДР призводило до транзієнтного збільшення вільного внутрішньоклітинного кальцію у нейронах як контрольних тварин, так й у нейронах тварин з діабетичною нейропатією. Як й у випадку нейронів ДКГ, всі дані по додаванню кофеїну до нейронів ДР отримували після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, що спричиняло перезаповнення депо. Інкубація зрізів спинного мозку протягом 5 хвилин у розчині, що не містить кальцію, не впливала на амплітуду кофеїн - індукованого кальцієвого транзієнту, що свідчить про винятково внутрішньоклітинну природу даного явища (n = 5 й 8 для нейронів контрольних і діабетичних тварин, відповідно).

Однак, у середньому амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнтів, які викликалися аплікацією 30 мМ кофеїну, була значно меншою в нейронах діабетичних тварин і склала 268 ± 18 нМ (n = 17) у контрольних нейронах й 41 ± 8 нМ (n = 13) у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом (p< 0.001). У декількох нейронах діабетичних тварин взагалі не було виявлено відповідей на додавання кофеїну (n = 6), у той час як у контрольний групі ми спостерігали відповіді в 100% досліджуваних нейронів. Таким чином, амплітуда кофеїніндукованого [Ca²⁺]_i транзієнту зменшувалася на 85 ± 7 % у нейронах тварин з експериментальним цукровим діабетом відносно контрольних. Характерні [Ca²⁺]_i транзієнти під дією кофеїну наведені на рис. 2Б. Таким чином, можна зробити висновок про драматичне зменшення викиду кальцію з ріанодинчутливого депо ЕР нейронів ДР при діабетичній нейропатії.

Функціонування InsP₃ - чутливого депо ЕР

Дослідження функції кальційрегулюючих внутрішньоклітинних механізмів здійснювали за допомогою аплікацій АТФ і глутамата як у нормальному позаклітинному середовищі, так і під час відсутності в ньому іонів кальцію. Це дозволило виділити функцію метаботропних рецепторів у генерації відповідних кальцієвих транзієнтів. Як відомо, активація метаботропного рецептора призводить до виникнення клітинної відповіді по двох можливих шляхах: у першому вторинним посередником виступає цАМФ, у другому - InsP₃. Нас цікавив саме другий шлях активації клітинної відповіді, тому що саме він призводить до викиду кальцію з депо за допомогою активації InsP₃ рецептора ЕР.

Амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнту під дією 200 мкМ АТФ у нормальному фізіологічному розчині склала 237 ± 24 нМ (n = 30) у нейронах ДР контрольних тварин і 226 ± 23 нМ (n = 17) у нейронах щурів з діабетичною нейропатією, причім різниця між амплітудами не була статистично достовірною (p > 0.1). Таким чином, амплітуда АТФ-індукованого [Ca²⁺]_i транзієнту не змінювалася у нейронах тварин з нейропатією у порівнянні з нейронами контрольних щурів (табл.2). При додаванні 200 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині, навпаки, спостерігалося істотне зменшення амплітуди кальцієвого транзієнту. Так, амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнту при додаванні 200 мкМ АТФ до нейронів ДР в безкальцієвому розчині склала 156 ± 14 нМ (n = 45) у контрольних умовах та 104 ± 6 нМ (n = 21) при діабетичній нейропатії (p < 0.01). Зменшення амплітуди [Ca²⁺]_i транзієнту при переході у безкальцієвий розчин склало 43 ± 6 % у нейронах контрольних тварин і 54 ± 5 % у нейронах щурів з діабетичною нейропатією. Амплітуда відповіді на додавання АТФ до нейронів ДР в безкальцієвому розчині у нейронах щурів з діабетичною нейропатією у порівнянні з нейронами контрольних тварин зменшилася на 34 ± 6 %. Підсумовуючи отримані результати, можна стверджувати, що в нейронах ДР експресовані як іоноторопні (Р2Х), так і метаботропні (Р2Y) пуринорецептори. При розвитку діабетичній нейропатії відбувається перерозподіл їхнього внеску в генерацію [Ca²⁺]_i транзієнта у бік збільшення внеску іонотропних рецепторів з 43 до 54%. Також відзначено суттєве зменшення викиду кальцію з InsP₃ - чутливого депо ЕР у нейронах діабетичних тварин в порівнянні з контрольними щурами (табл.2).

Аналогічні експерименти були проведені і для вивчення дії глутамата як на іонотропні, так і на метаботропні рецептори у нейронах контрольних і діабетичних тварин. Амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнтів під дією 100 мкМ глутамата в нормальному фізіологічному розчині склала 216 ± 19 нМ (n = 14) у нейронах ДР контрольних щурів й 145 ± 20 нМ (n = 7) у нейронах щурів з діабетичною нейропатією. Таким чином, амплітуди глутаматіндукованого [Ca²⁺]_i транзієнту зменшувалися при розвитку нейропатії у тварин на 33 ± 5 %, і різниця в амплітудах була статистично достовірною (p < 0.01). При додаванні глутамата у безкальцієвому розчині ми також спостерігали достовірне зменшення амплітуди кальцієвого транзієнту. Так амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнтів при додаванні 100 мкМ глутамата до нейронів ДР в безкальцієвому розчині склала 176 ± 21 нМ (n = 13) у контрольних умовах й 80 ± 15 нМ (n=9) при діабетичній нейропатії (p < 0.01). Амплітуда кальцієвих відповідей на додавання глутамата до нейронів ДР в безкальцієвому розчині зменшилася на 54 ± 6 % у нейронах діабетичних тварин в порівнянні з контрольними. Характерні [Ca²⁺]_i транзієнти наведені на рис. 6Б. Таким чином, при діабетичній нейропатії спостерігається зменшення кальціймобілізюучої функції як іонотропних, так і метаботропних глутаматних рецепторів у відповідь на збудження нейромедіатором. Також, як і у випадку з АТФ, спостерігається зменшення викиду кальцію з InsP₃ - чутливого депо ЕР (табл.2).

Іономіцин - індукований викид кальцію з ЕР

Для вивчення ємності кальцієвого депо ЕР, ми використали антибіотик іономіцин. Додавання 1 мкМ іономіцина до нейронів ДР в безкальцієвому розчині, викликало транзієнтне збільшення вільного внутрішньоклітинного кальцію у нейронах як контрольних щурів, так і тварин з діабетичною нейропатією. Щоб уникнути артефактів, які можуть бути пов'язані з рівнем завантаження депо ЕР, всі досліди з додаванням іономіцину проводили після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення таких депо. Так само як і при дії інших активаторів викиду кальцію з депо ЕР, амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнтів під впливом 1 мкМ іономіцину була значно меншою в нейронах діабетичних тварин. Вона склала 188 ± 25 нМ, (n = 8) у нейронах контрольних щурів й 85 ± 13 нМ (n = 6) у нейронах тварин з діабетичною нейропатією. Різниця в амплітудах була статистично достовірною (р < 0.01). Амплітуда іономіциніндукованого [Ca²⁺]_i транзієнту у нейронах тварин з діабетичною нейропатією зменшувалася на 55 ± 8 % порівняно з контрольними значеннями. Всі вищенаведені результати досліджень свідчать про те, що викид кальцію з депо ЕР значно зменшується при активації кожного з перерахованих вище шляхів як за допомогою кофеїну, АТФ і глутамата, так і під дією іономіцина,. Можна припустити, що це явище пов'язане з уповільненням роботи Са²⁺, Mg²⁺-АТФаз ЕР.

Діабет-індукована зміна активностей Ca²⁺, Mg²⁺-АТФаз ДКГ і ДР.

У наступних експериментах нами були прямо виміряні питомі активності Ca²⁺, Mg²⁺-АТФаз плазматичної (PMCA) й ретикулярної (SERCA) мембран у мікросомальних фракціях ДКГ і ДР. Для цього відповідні тканини, узяті у 28 контрольних і 24 діабетичних щурів, розділили, відповідно, на 7 й 6 порцій. Реакція гідролізу АТФ ініціювалася додаванням 5 мМ АТФ у середовище, що містить мікросомальні фракції ДКГ і ДР. Для інгібування залишкової активності мітохондріального Са²⁺ уніпортера й Na⁺,K⁺-АТФази до всіх інкубаційних середовищ додавали 1 мМ азиду натрію і 1 мМ оуабаіну. Питому Са²⁺-АТФазную активність розраховували по різниці між кількістю неорганічного фосфору (Р_i), звільненого в кальційутримуючому й безкальциевому (з додаванням 1 мМ ЭГTA) середовищах. Загальну Са²⁺-АТФазную активність розділяли на складові активності PMCA і SERCA шляхом додавання до інкубаційних середовищ 100 нМ селективного інгібітору SERCA тапсигаргіну.