Кальцієва сигналізація в спінальних нейронах соматосенсорної системи в умовах наявності ноціцептивних синдромів

Таблиця 2. Параметри, визначені для нейронів ДР контрольних щурів та тварин із діабетичною нейропатією. Дані представлені в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р - параметр вірогідності.

Було виявлено, що концентрація Р_і, яку виміряли на 300 секунді після ініціації реакції, суттєво зменшувалася при діабеті в тканинах як ДКГ, так і ДР (табл. 1, 2). У ДКГ загальна Ca²⁺, Mg²⁺-АТФазна активність становила 263 ± 43 мкМ ч^-1 мг^-1 у контролі й 113 ± 5 мкМ ч^-1 мг^-1 при діабеті. Питома активність РМСА становила 216 ± 32 мкМ ч^-1 мг^-1 й 89 ± 4мкМ ч^-1 мг^-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Питома активність SERCA становила 47 ± 14 мкМ ч^-1 мг^-1 й 24 ± 4мкМ ч^-1 мг^-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Таким чином, зменшення питомих активностей РМСА й SERCA при діабеті становило 63 ± 6 % й 50 ± 8 % відповідно (p < 0.01). Дуже схожа картина спостерігалася і у тканинах ДР: загальна Ca²⁺, Mg²⁺ АТФазна активність становила 55 ± 6 мкМ ч^-1 мг^-1 у контролі й 22 ± 6 мкМ ч^-1 мг^-1 при діабеті. Питома активність РМСА становила 39 ± 4 мкМ ч^-1 мг^-1 й 15 ± 2 мкМ ч^-1 мг^-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Питома активність SERCA становила 16 ± 3 мкМ ч^-1 мг^-1 й 11 ± 4мкМ ч^-1 мг^-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Таким чином, зменшення питомих активностей РМСА й SERCA при діабеті становило 60 ± 9 % й 48 ± 12 % відповідно (p < 0.01). Зміни кальцієвої сигналізації в нейронах соматосенсорної системи на різних термінах розвитку діабетичної нейропатії. Для визначення залежності змін кальцієвого гомеостазу сенсорних нейронів від терміну розвитку діабетичної нейропатії ми провели серію експериментів, у яких порівнювали основні параметри кальцієвої сигналізації в нейронах ДКГ і ДР щурів з різними термінами розвитку діабету. У досліди були взяті 7 щурів через 4 тижні і 9 щурів через 7 тижнів після ін'єкції СТЗ. З розвитком діабету помітно погіршувалося самопочуття тварин. Вони втрачали вагу, у багатьох щурів розвивалася ретинопатія, підвищене сечовипускання. Тварини з великим терміном діабету більше часу витрачали на їжу і пиття. Рівень глюкози достовірно (р<0.05) зростав з 17.2 ± 2.9 мМ (4 тижні) до 26.6 ± 1.8 мМ (7 тижнів).

Для визначення змін нейропатичних синдромів з розвитком діабету ми використовували тест "гаряча поверхня". При 48 градусах Цельсія латентність больової реакції була достовірно більшою у щурів з терміном розвитку діабету 7 тижнів у порівнянні з щурами, в яких діабет розвивався 4 тижні. Так, латентність больової реакції при 48° С склала 23 2 с (n = 7) для щурів з 4-тижневим і 35 7 с (n = 9) для щурів з 7-тижневим діабетом. (p < 0.05). Таким чином, ми спостерігали достовірне збільшення латентності больової реакції у тварин з більш пізнім терміном розвитку діабету, що говорить про посилення в них термічної гіпоалгезії (табл. 3).

Основні показники внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу також змінювалися з розвитком захворювання. Так, базальний рівень [Ca²⁺]_i в малих нейронах ДКГ і в нейронах ДР достовірно збільшувався на сьомому тижні розвитку захворювання, у порівнянні з 4-им. У середньому базальний рівень [Ca²⁺]_i в малих нейронах ДКГ був 101 нM 4 нM (n=39) у тварин на 4 тижні розвитку діабету і 134 нM 11 нM (n=19) у щурів через 7 тижнів після ін'єкції СТЗ (p < 0.001). У нейронах ДР базальний рівень [Ca²⁺]_i був у середньому 82 нM 17 нM (n=39) у тварин на 4 тижні розвитку діабету і 102 нM 6 нM (n=47) у щурів через 7 тижнів після ін'єкції СТЗ (p < 0.05). (табл. 3).

Таблиця 3. Основні параметри змін при розвитку діабетичної нейропатії, визначені для нейронів ДКГ та ДР. Дані представлено в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р - параметр вірогідності

Амплітуди кальцієвих відповідей на 20 мМ кофеїну у нейронах ДКГ, викликаних після перезаповнення кальцієвих депо ЕР за допомогою деполяризації, достовірно зменшувалися з 756 нM ± 72 нM (n=16) на 4 тижні розвитку діабету, до 463 нM ± 51 нM (n=26) на 7-му тижні (р < 0.001). Аналогічно, амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнтів, викликаних аплікацією 30 мМ кофеїну, у нейронах ДР достовірно зменшувалась з 126 нМ 11 нM (n = 15) на 4 тижні розвитку діабету до 108 нМ 14 нМ (n = 17) на 7-му тижні (р < 0.05, табл. 3).

Прикладання 1 мкМ іономіцину до нейронів ДКГ і ДР у безкальцієвому розчині, призводило до транзієнтного збільшення [Ca²⁺]_i в обох вікових групах тварин. Амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнтів під дією 1 мкМ іономіцина була меншою в нейронах тварин на більш пізніх термінах розвитку діабету, але тільки в нейронах ДР, і склала 89 нM 7 нM, (n = 19) на 4 тижні і 68 нM 6 нM (n = 17) на 7 тижні (р<0.05, табл. 3). У нейронах ДКГ різниця амплітуд іономіцин-індукованих транзієнтів була статистично недостовірною 98 нМ 23 нM, (n = 11) на 4 тижні і 116 нM 26 нM (n = 16) на 7 тижні (р > 0.6). Основні параметри зміни стану тварин і кальцієвої сигналізації в нейронах соматосенсорної системи на різних термінах розвитку діабетичної нейропатії представлені в таблиці 3. З цих даних можна зробити висновок, що часовий хід розвитку діабетичної нейропатії корелює з розвитком та посиленням абнормальностей внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу як в первинних, так і у вторинних соматосенсорних нейронах.

Зміни кальцієвої сигналізації в нейронах ДКГ, які викликані карагеніновим запаленням

Порівняння кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією нейронів ДКГ великого й малого діаметрів у нормі та при запаленні, показало відсутність достовірних відмінностей їхніх основних характеристик: базального рівня [Ca²⁺]_i, амплітуди й швидкості наростання кальцієвих транзієнтів, часу напівспаду (t_0,5), а також рівня залишкового кальцію в цитозолі на 60 с спаду деполяризаціонного транзіента (R₆₀). Слід зазначити, що достовірних змін амплітуди кальцієвих транзієнтів у відповідь на деполяризацію цитоплазматичної мембрани не було виявлено як у великих, так й у малих сенсорних нейронах. Для більш глибокого дослідження можливих змін кальційрегулюючої ролі внутрішньоклітинних кальцієвих депо нейронів ДКГ при запаленні ми застосували відповідні експериментальні процедури, що дозволяють активувати викид і захоплення Ca²⁺ ЕР і мітохондріями.

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДКГ при запаленні

Функціонування мітохондрій

Для визначення того, як змінюється ефективність функціонування мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди деполяризаційних [Ca²⁺]_i транзієнтів у контрольних умовах і на тлі дії 10 мкМ СССР. При цьому для всіх типів клітин не спостерігалося змін у співвідношенні амплітуд даних Ca²⁺ відповідей у присутності та відсутності СССР при запаленні в порівнянні з нормою. Однак аплікація 10 мкМ СССР на спаді кальцієвого транзієнту викликала викид Ca²⁺ набагато меншої амплітуди при запаленні, ніж у контрольних експериментах (табл. 4). Для великих нейронів ДКГ амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду при запаленні склала 38 ± 9 % (n=21) у порівнянні з 71 ± 10 % (n=25) у контролі (p < 0.05); для малих нейронів ДКГ, відповідно, 49 ± 6 % (n=35) при запаленні та 84±15% (n=22) у контролі (p < 0.05). Отже, при запаленні ми спостерігаємо зменшення виведення кальцію мітохондріями в обох типах нейронів ДКГ, тоді як ефективність мітохондріального кальцієвого захоплення, очевидно, не змінюється.

Функціонування ріанодинового депо ЕР

Досліджуючи роботу ріанодинового депо ЕР нейронів ДКГ, ми використали кофеїн у концентрації 20 мМ. В стані спокою (без попередньої деполяризації) амплітуда кофеїніндукованого кальцієвого транзієнту достовірно зменшилася з 345 ± 86 нМ (n=8) у контролі до 123 ± 27 нМ (n=10, p < 0.05) при запаленні (табл. 4). У нейронах ДКГ контрольних тварин середня амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного кофеїном, була значно більшою після попередньої деполяризації цитоплазматичної мембрани за допомогою аплікації гіперкалієвого розчину. Це явище свідчить про перезаповнення кальцієвого депо за участю Ca²⁺-ATФази ЕР.

Таблиця 4. Параметри, визначені для нейронів ДКГ контрольних тварин та тварин із периферичним запаленням. Дані представлено в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р - параметр вірогідності.

Після перезаповнення кальцієвого депо ЕР за допомогою деполяризації, амплітуди [Ca²⁺]_i транзієнтів, викликаних кофеїном, також достовірно зменшувалися в нейронах тварин з периферичним запаленням у порівнянні з нейронами контрольних мишей. У середньому амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного аплікацією кофеїну після деполяризації цитоплазматичної мембрани, становила 658 ± 139 нМ (n=8) у контролі і 251 ± 32 нМ (n=14, p < 0.001) при запаленні (табл. 4). Можна припустити, що зниження кофеїн-індукованих відповідей пов'язано або зі зниженням ефективності роботи ріанодинових рецепторів, або зі зменшенням кальційакумулюючої ємності самого ЕР. Вищенаведені результати ймовірно не пов'язані з уповільненням роботи Са²⁺-АТФази ЕР, оскільки відносні зміни кофеїніндукованих відповідей до та після перезаповнення депо достовірно не змінювалися. Так, збільшення відповідей на 20 мМ кофеїну за рахунок перезаповнення депо ЕР в нормі склало 48 ± 9 %, а при запаленні 41 ± 6 % (p>0.5).

Функцианування ІnsР₃ депо ЕР

Для того, щоб викликати продукування ІnsР₃ з наступним вивільненням кальцію з ЕР через ІnsР₃-рецептори ми проводили аплікацію 100 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині. У цьому випадку ситуація була цілком аналогічною [Ca²⁺]_i сигналам, викликанім кофеїном. Амплітуда АТФ-індукованого кальцієвого транзієнту зменшилася з 98 ± 15 нМ (n=12) у контролі до 35 ± 3 нМ (n=9, p < 0.005) при запаленні (табл. 4). Після перезаповнення кальцієвого депо ЕР за допомогою деполяризації амплітуди АТФ-індукованих [Ca²⁺]_i транзієнтів також достовірно зменшувалися в нейронах тварин з периферичним запаленням у порівнянні з нейронами контрольних тварин. У середньому амплітуда кальцієвих транзієнтів, викликаних аплікацією АТФ після деполяризації цитоплазматичної мембрани, становила 158 ± 15 нМ (n=12) у контролі та 60 ± 7 нМ (n=9, p < 0.001) при запаленні (табл. 4). Таким чином, можна зробити висновок, що при периферичному запаленні погіршується функція InsP₃-чутливого депо ЕР нейронів ДКГ.

Зміни кальцієвої сигналізації у нейронах ДР, які викликані карагеніновим запаленням

Ця серія експериментів проводилася на гостро-ізольованих нейронах желатинозної субстанції ДР щурів. Рівень базального [Ca²⁺]_i склав 75 ± 15 нМ (n = 90) і 82 ± 17 нМ (n = 85) для нейронів контрольних тварин і тварин з карагеніновим запаленням відповідно. Різниця в рівні базального [Ca²⁺]_i статистично не відрізнялась в нейронах контрольних тварин та щурів з карагеніновим запаленням (p > 0.1). Для деполяризації клітин використовували додавання гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К⁺ близько 50 мМ. Ми не виявили істотної різниці в значеннях пікових амплітуд або часу наростання кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією, у контрольних тварин і тварин з карагеніновим запаленням. Так, постійна часу наростання [Ca²⁺]_i транзієнтів становила 4.5 ± 0.7 c (n = 39) і 4.9 ± 0.6 c (n = 60) для контрольної групи і для тварин з карагеніновим запаленням, відповідно, і описувалася моноекспоненційною функцією. Різниця в пікових значеннях кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією, також не була статистично достовірною. Деяка різниця в характеристиці [Ca²⁺]_i транзієнтів нейронів ДР була виявлена нами під час описання кінетики спаду транзієнтів, яка характеризує характер виведення Са²⁺ із цитозоля клітини. Найбільш істотна різниця була встановлена у рівні залишкового [Ca²⁺]_i, виміряного на 15 та 30 секунді після закінчення деполяризації. Ця різниця зникала на 60 секунді після закінчення деполяризації (табл. 5). Так, на 15 секунді після закінчення деполяризації рівень залишкового кальцію склав у контрольних умовах 12.7 ± 1.5 % (n=39) від максимальної амплітуди транзієнту, а в клітинах в умовах запалення 18.8 ± 2.1 % (n=60, р<0.001). На 30 секунді рівень залишкового кальцію склав 6.5 ± 0.6 % й 9.3 ± 0.7 % відповідно (р<0.01), а на 60 секунді - 4.3 ± 1 % й 4.8 ± 1.2 % відповідно (р>0.1).

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДР при запаленні.

Функціонування мітохондрій

Для того, щоб проаналізувати можливий внесок мітохондрій у зміни кальцієвої сигналізації сенсорних нейронів мишей при інфламаторному болі, проводилася аплікація СССР, що припиняв накопичення іонів кальцію мітохондріями. У контрольних клітинах аплікація 10 мкM CCCP перед деполяризацією викликала збільшення амплітуди зростання [Ca²⁺]_i, індукованого деполяризацією, що свідчить про участь мітохондрій у процесі швидкого захоплення іонів кальцію під час досягнення піка транзієнту. Для визначення того, як змінюється ефективність функціонування мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди деполяризаційних [Ca²⁺]_i транзієнтів у контрольних умовах і на тлі дії СССР. При цьому для нейронів ДР не спостерігалося змін у співвідношенні амплітуд таких Са²⁺ відповідей при запаленні в порівнянні з контролем.

Аплікація CCCP після досягнення піка транзієнта викликала додаткове зростання [Ca²⁺]_i, що свідчить про значний викид кальцію, що був попередньо запасений мітохондріями. Однак у нейронах ДР тварин з карагеніновим запаленням таке зростання було надзвичайно зниженим. У середньому у нейронах ДР амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного аплікацією CCCP після деполяризації, склала 36 ± 6 % (n=34) у контролі і 16 ± 4 % (n=9, р<0.05) при запаленні (табл. 5). Отримані дані свідчать про те, що запалення пов'язане з істотним зниженням мітохондріального захоплення нейронами ДР й наступним викидом кальцію в цитозоль.

Функционування ріанодинового депо ЕР

Додавання 30 мМ кофеїну до нейронів ДР призводило до транзієнтного збільшення вільного внутрішньоклітинного кальцію як у нейронах контрольних, так й у нейронах тварин з карагеніновим запаленням. Досліди по додаванню кофеїну проводилися як до, так і після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення депо. Амплітуда [Ca²⁺]_i транзієнту під дією 30 мМ кофеїну в стані спокою практично не відрізнялася в нейронах тварин з карагеніновым запаленням і складала 69 ± 13 нМ (n = 15) у нейронах контрольних тварин й 55 ± 11 нМ (n = 15, p > 0.1) у нейронах щурів з карагеніновым запаленням (табл. 5). Однак, після перезаповнення кальцієвого депо ЕР за допомогою деполяризації, амплітуди кофеїн-індукованих [Ca²⁺]_i транзієнтів достовірно зменшувалися в нейронах тварин з периферичним запаленням у порівнянні з нейронами контрольних тварин. У середньому амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного аплікацією кофеїну після деполяризації цитоплазматичної мембрани, становила 302 ± 23 нМ (n = 15) у контролі та 238 ± 41 нМ (n = 15, p < 0.05) при запаленні

Таблиця 5. Параметри, визначені для нейронів ДР контрольних тварин та тварин із периферичним запаленням. Дані представлено в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р - параметр вірогідності.

Таким чином, ми спостерігаємо драматичне зменшення викиду кальцію з ЕР нейронів ДР тварин з периферичним запаленням у порівнянні з нейронами контрольних щурів (табл. 5).

Зміни функціонування глутаматних рецепторів нейронів желатинозної субстанції при карагеніновому запаленні.

У даній серії експериментів ми використали метод одночасної реєстрації трансмембранних струмів і внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів у нейронах желатинозної субстанції в зрізах спинного мозку. У конфігурації “ціла клітина”, використовуючи піпетку, що містить флуоресцентний індикатор кальцію Fura-2, ми одночасно реєстрували агоністіндуковані струми в сомі нейронів ДР та зміни концентрації вільного кальцію як в області соми, так й в області проксимальних дендритів нейронів желатинозної субстанції. Експерименти проводили на тонких зрізах відділів L4 - L6 спинного мозку контрольних щурів (без запалення) і щурів, взятих в експеримент через 3 години після того, як ін'єкували карагенін у задню кінцівку тварини. У перфузійний розчин додавали 0.5 мкМ тетродотоксину (ТТХ) для блокування потенціал-залежних натрієвих каналів і спонтанного збудження.

Ми не виявили достовірної різниці в основних електрофізіологічних характеристиках нейронів ДР у зрізах спинного мозку між контрольними щурами і тваринами з карагеніновим запаленням. Потенціал спокою нейронів складав -60.8 ± 0.8 мВ (n=55) у нейронах контрольних щурів й -61.3 ± 0.7 мВ (n=59) у нейронах щурів з карагеніновим запаленням (р > 0.5). Амплітуда потенціалів дії становила 77.0±2.8мВ (n=35) у нейронах контрольних щурів й 75.8±2.1 мВ (n=46) у нейронах щурів з карагеніновим запаленням (р > 0.5). Вхідний опір нейрона був 451.7 ± 39.5 МОм (n=35) у нейронах контрольних щурів й 491.3 ± 46.9 МОм (n=46) у нейронах щурів з карагеніновим запаленням (р > 0.5).

Активація метаботропних глутаматних рецепторів (mGluR) у нейронах ДР.

Інформація про механізми кальцієвої сигналізації і їхній потенційній участі в клітинній відповіді на активацію mGluR у нейронах ДР дотепер відсутній. У даній частині роботи були досліджені кальцієві сигнали, які викликані аплікацією 1-100 мкМ (S)-3,5-дигідрипіридину (DHPG), у нейронах ДР спинного мозку. Дана речовина є специфічним агоністом mGluR групи I. Експерименти проводили в присутності 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV, 10 мкМ 6-ціано-7-нітроквіноксалина-2,3-дііону (CNQX), 10 мкМ 6-нітро-7-сульфанойлбензо(f)квіноксалина-2,3-дііону (NBQX) для блокування потенціал-залежних Na⁺-каналів, NMDA й AMPA/каінатного підтипів іонотропних глутаматних рецепторів. У режимі фіксації потенціалу аплікація 100 мкМ DHPG (90 с) викликала збільшення [Ca²⁺]_i одночасно в сомі та дендритах більшості досліджених нейронів ДР. DHPG-активовані кальцієві сигнали були схожі за формою, яка складається з початкового піка і фази повільного відновлення, але відрізнялися за своїми кінетичними характеристиками (рис. 7А). У номінально безкальцієвому зовнішньому розчині відповіді на DHPG зберігалися; при цьому швидка транзієнтна компонента зникала, а повільна компонента тільки зменшувалась. Число клітин, що відповідають на DHPG, достовірно зростало в зрізах, отриманих з щурів з карагеніновим запаленням (рис. 7Б). Процентне співвідношення клітин (від загального числа тестованих нейронів), що відповідають на додавання різних концентрацій DHPG збільшенням базального рівня кальцію, у контрольних тварин склало: 1 мкМ DHPG - 13 % (n=16); 5 мкМ DHPG - 3 % (n=16); 10 мкМ DHPG - 4 % (n=14). У щурів з карагеніновим запаленням число клітин, що відповіли, суттєво зростало: 1 мкМ DHPG - 44% (n=17); 5 мкМ DHPG - 50%, (n=17); 10 мкМ DHPG - 64%, (n=18). Середнє підвищення базального рівня кальцію (вимірюваного в одиницях -?F/F) у нейронів, що відповіли на аплікацію DHPG у нейронах контрольних тварин, склало (рис. 7В): 1 мкМ DHPG - 102 ± 5 % (n=11); 5 мкМ DHPG - 124.1 ± 7.3 % (n=13); 10 мкМ DHPG - 156.5 ± 17.4 % (n=16). При запаленні: 1 мкМ DHPG - 120.3 ± 6.7 % (n=14); 5 мкМ DHPG - 153.6 ± 10.6 % (n=15); 10 мкМ DHPG - 165.3 ± 14.9 % (n=7, табл. 5).

Активація NMDA рецепторів у нейронах ДР.

У даних експериментах ми досліджували дію агоністів іонотропних глутаматних рецепторів NMDA типу на електричну активність і кальцієві відповіді в нейронах ДР контрольних щурів і щурів з карагеніниновим запаленням. Аплікація 25 мкМ NMDA (60 с) у відсутності іонів магнію збільшувала рівень цитозольного кальцію в нейронах як контрольних, так і щурів з карагеніновим запаленням, що свідчить про наявність кальційпровідних NMDA рецепторів (рис. 8). У нейронах щурів з карагеніновим запаленням амплітуда NMDA-індукованого [Ca²⁺]_i транзієнту зростала в дендритах, але не в сомі тестованих клітин (табл. 5). Карагенінове запалення призводило до суттєвого зростання кальцієвого транзієнту, викликаного аплікацією NMDA у дендритах нейронів на 26.2 ± 6.5% у порівнянні з нейронами контрольних щурів. У середньому амплітуда кальцієвих транзієнтів викликаних аплікацією NMDA у дендритах нейронів ДР, становила 50.1 ± 5.3 % (n = 20) у нейронах контрольних тварин та 63.7 ± 4.2 % (n = 14) при запаленні (p < 0.05). Не було виявлено достовірних змін ні в амплітудах NMDA-індукованих [Ca²⁺]_i транзієнтів у сомі нейронів, ні в NMDA-індукованих струмах (табл. 5).

AMPA-індуковані мембранні струми і [Ca²⁺]_i транзієнти в нейронах ДР

Добре відомо, що циклотіазид (ЦТЗ) помітно потенціює фармакологічні й функціональні відповіді, які викликано AMPA, запобіганням десенситизації AMPA-рецепторів (Partin et al, 1994). Для того, щоб запобігти десенситизації AMPA-рецепторів, яка потенційно може маскувати зміни AMPA-опосередкованих струмів і кальцієвих відповідей, викликаних запаленням, нами була перевірена дія АМРА на мембранні струми і [Ca²⁺]_i транзієнти в нейронах ДР у присутності 20 мкМ ЦТЗ. Після інкубації зрізів в позаклітинному розчині, котрий містить 0.5 мкМ АМРА протягом 60 с у присутності 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV і 20 мкМ ЦТЗ, амплітуди AMPA-індукованих мембранних струмів у нейронах ДР були значно вище в клітинах щурів з карагеніновым запаленням, у порівнянні з контрольними щурами.

У середньому амплітуди AMPA-індукованих струмів були 198.0 ± 38.2 пА (n=10) для нейронів контрольних щурів та 497.7 ± 50.8 пА (n=12) для нейронів щурів із запаленням (р<0.001). Порівняння нормованих амплітуд [Ca²⁺]_i транзієнтів, зазначених величиною ДF/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих відповідей на АМРА значно збільшені в нейронах ДР щурів з карагеніновым запаленням у порівнянні з контрольними тваринами (табл. 5). У середньому амплітуди AMPA-індукованих змін флуоресценції в сомі були 25.6 ± 7.7 % (n=10) у нейронах контрольних тварин й 54.9 ± 7.1 % (n=12) при запаленні (р<0.01). У дендритах AMPA-індуковані [Ca²⁺]_i транзієнти мали середні амплітуди 27.6 ± 6.5 % (n=9) у нейронах контрольних тварин та 59.2 ± 7.1 % (n=12) при запаленні (р<0.001).

[Ca²⁺]_i транзієнти, які викликано активацією каінатних (КА) рецепторів у нейронах ДР.

Було показано, що КА рецептори не мають кальцієву провідність в нейронах ДКГ (Lee et al, 2001). Для того, щоб показати наявність такої провідності КА рецепторів, експресованих у нейронах желатинозної субстанції ДР, ми провели серію експериментів на генетично трансформованих (трансгенних) мишах. Ми використали мишей трьох трансгенних груп: 1) миші з нокаутованим 5-м типом КА рецептору (Glu5 k/o); 2) миші з нокаутованим 6-м типом КА рецептору (Glu6 k/o); 1) миші з нокаутованими 5-м й 6-м типами КА рецептору (Glu5/6 k/o). Аплікація 100-300 мкМ каінату в омиваючому розчині, що містить TTX, D-APV й 100 мкМ селективного блокатору АМРА рецепторів GYKI 53655, викликала вхідні струми й збільшення [Ca²⁺]_i тільки в групах Glu5 k/o і контрольних мишей. У групах Glu6 k/o й Glu5/6 k/o мишей аплікація каінату не викликала ні трансмембранних струмів, ні збільшення [Ca²⁺]_i. З отриманих даних можна зробити висновок, що Glu6 k/o тип каінатных рецепторів, експресований у нейронах желатинозної субстанції ДР спинного мозку, має кальцієву провідність.

Показавши наявність кальцієвої провідності каінатних рецепторів у нейронах желатинозної субстанції дорсального рогу, ми провели серію експериментів у порівнянні КА-індукованих струмів та [Ca²⁺]_i транзієнтів у нейронах нормальних тварин і щурів з карагеніновим запаленням. Аплікація 25-100 мкМ КА (60 с) до нейронів ДР щурів у присутності TTX і D-APV викликала вхідні струми та [Ca²⁺]_i транзієнти як у сомі, так і у дендритах всіх тестованих клітин у зрізах контрольних щурів і щурів з карагеніновим запаленням. Після інкубації зрізів в позаклітинному розчині, що містить 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV та GYKI 53655, нами не було виявлено достовірних змін у КА-індукованих мембранних струмах нейронів щурів з карагеніновим запаленням у порівнянні з контрольними щурами (табл. 5). У середньому амплітуди КА-індукованих струмів становили 108.0 ± 20.2 пА (n=10) для нейронів контрольних щурів й 117.7 ± 20.8 пА (n=12) для нейронів щурів із запаленням (р > 0.5).

Порівняння нормованих амплітуд [Ca²⁺]_i транзієнтів, зазначених величиною ДF/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих відповідей на аплікацію 100 мкМ КА (60 с) значно збільшені в нейронах ДР щурів з карагеіновим запаленням у порівнянні з контрольними тваринами. У середньому амплітуди КА-індукованих змін флуоресценції в сомі складали 4.9 ± 1.7 % (n = 9) у нейронах контрольних тварин й 16.6 ± 4.1 % (n = 10) при запаленні (р < 0.05). У дендритах КА-індуковані [Ca²⁺]_i транзієнти мали середні амплітуди 7.6 ± 4.3 % (n = 9) у нейронах контрольних тварин й 22.2 ± 3.9 % (n = 10) при запаленні (р < 0.05).

Для підтвердження збільшення кальцій-провідної активності КА рецепторів при карагенініндукованому запаленні досліджували дію іншого, більш селективного, агоністу КА рецепторів домоївої кислоти (DА). Також, як і при дії КА, аплікація 3 мкМ DА (60 с) до нейронів ДР у присутності 1 мкМ TTX і 50 мкМ APV викликала вхідні струми і [Ca²⁺]_i транзієнти як у сомі, так і дендритах всіх тестованих клітин у зрізах контрольних щурів і щурів з карагеніновим запаленням. Після інкубації зрізів в позаклітинному розчині, що містить 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV та 100 мкМ GYKI 53655, нами не було виявлено достовірних змін в DA-індукованих мембранних струмах нейронів щурів з карагеніновим запаленням у порівнянні з контрольними щурами (табл. 5). У середньому амплітуди DA-індукованих струмів були 82.0 ± 20.2 пА (n=10) для нейронів контрольних щурів й 91.7 ± 20.8 пА (n=12) для нейронів щурів із запаленням (р > 0.5).

Порівняння нормованих амплітуд [Ca²⁺]_i транзієнтів, виражених величиною ДF/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих відповідей на аплікацію 3 мкМ DA (60 с), як й у випадку дії КА, значно збільшені в нейронах ДР щурів з карагеніновим запаленням у порівнянні з контрольними тваринами (рис. 10C). У середньому амплітуди DA-індукованих змін флуоресценції в сомі становили 3.1 ± 1.4 % (n = 7) у нейронах контрольних тварин й 19.8 ± 5.1 % (n = 9) при запаленні (р < 0.05). У дендритах DA-індуковані [Ca²⁺]_i транзієнти мали середні амплітуди 8.6 ± 2.5 % (n = 7) у нейронах контрольних тварин й 24.2 ± 3.7 % (n = 8) при запаленні (р < 0.05).

Контрольні експерименти з розчином, що не містить карагеніну.

Всі перераховані вище експерименти на нейронах мишей та щурів з карагеніновою моделлю запалення були повторені на нейронах тварин, яким робилась контрольна ін'єкція 0.9 % розчину NaCl того ж об'єму, але без карагеніну. Усі без винятку результати в обох типах клітин співпали з тими, які були одержані на нейронах здорових тварин. Отже, виявлені зміни були пов'язані винятково із впливом карагенінового запалення й не були наслідком підвищення тиску і появою набряку в кінцівці після ін'єкції, дії розчину NaCl, короткочасного ефірного наркозу або можливим стресом і болем, викликаними у тварини процедурою ін'єкції.

АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що можуть лежати в основі розвитку центральної сенситизації при больових синдромах. Виконане дослідження дозволяє значно розширити наші знання про фізіологічні зміни, що відбуваються в нервових клітинах при різних патологічних станах. Крім того, воно може допомогти вирішити питання про походження больових синдромів при карагеніновому запаленні і діабетичній нейропатії, що дозволяє стверджувати про можливість клінічного застосування отриманих у цій роботі даних.

В експериментах із тваринами, що страждають діабетичною нейропатієй, ми спостерігали як посилення больової реакції на гострий біль, так і ослаблення больової реакції на тонічну "інфламаторну" біль (формаліновий тест), а також наявність у діабетичних тварин термічної гіпоалгезії. Ці дані свідчать, що індукція діабету диференційовано змінює механізми, які відповідальні за різні типи болю. У багатьох роботах була показана наявність у діабетичних тварин різних форм прояву нейропатій, таких як тактильна гиперальгезія й алодінія, порушення чутливості до хімічних стимулів і ін. (Cesena & Calcutt 1999, Malmberg et al. 2003). Як видно, СТЗ модель цукрового діабету у щурів супроводжується значними змінами в больових реакціях, патофізиологічні причини яких не з'ясовані дотепер.

Останнім часом, однак, усе більша увага приділяється порушенням кальцієвого гомеостазу, які, щонайменше супроводжують, а, можливо, є однією з головних причин, що призводять до розвитку діабетичних нейропатій. Показані в роботі зміни кальцієвого гомеостазу і збільшений рівень [Ca²⁺]_і у соматосенсорних нейронах можуть призводити до безлічі процесів, які змінюють нейрональну активність. Було показано, що збільшений рівень [Ca²⁺]_і ініціює підвищення викиду нейромедіаторів (Stanley 1997). Однак, збільшення рівня [Ca²⁺]_і в нейронах ДР, може грати більш специфічну роль у їхній сенсибілізації.

Недавні дослідження показали, що визначені кальційрегулюючі механізми, наприклад, потенціалзалежні Ca²⁺ канали і NMDA рецептори впливають на модуляцію нейронної діяльності, наприклад, у генерації внутрішньоклітинних медіаторів, NO і простагландинів (Robello et al. 1997), а також у модуляції експресії генів (Bіto et al. 1997). Таким чином, показана нами активація Ca²⁺ каналів L-типу та N-типу в ноцицептивних нейронах при діабеті (Voіtenko et al. 2000), а також іонотропних глутаматних рецепторів при запаленні (Voіtenko et al. 2004) може мати специфічне значення в модуляції сумарних повільних Ca²⁺ потоків, що сприяють поступовому і тривалому збільшенню збудливості нейронів. Крім того, L-тип Ca²⁺ каналів - важливе джерело наповнення тих внутрішньоклітинних кальцієвих депо, що модулюють транскрипцію генів за допомогою різних ядерних регулюючих елементів (Delmas & Brown 2002). З іншого боку, N- і P - типи Ca²⁺ каналів, що сконцентровані в поверхневих ламінах дорсального рога, беруть участь у синаптичній передачі, а, значить, відображають зміни, що відбуваються в терміналях периферійних аферентних волокон (Dіaz & Dіckenson 1997).

При вивченні впливу патологій на ефективність роботи внутрішньоклітинних кальцієвих депо нами були виявлені значні зміни у функціонуванні мітохондрій і ЕР. У випадку карагениніндукованого запалення, як і при СТЗ-індукованої нейропатії, спостерігалося зниження амплітуди СCCP-індукованих відповідей на спаді деполяризаційних кальцієвих транзієнтів в обох типах досліджених нейронів (Voitenko et al. 2004, Svіchar et al. 1998). Порушення акумуляції Са²⁺ мітохондріями при запаленні і діабеті може порушувати синтез АТФ і змінювати співвідношення АТФ/АДФ. Цей процес може бути тісно пов'язаний із процесами надлишкового накопичування фосфору мітохондріями. У його присутності навіть незначне підвищення [Ca²⁺]_m призведе до зниження мембранного потенціалу мітохондрій і буде сприяти припиненню синтезу АТФ (Nіcholls & Budd 2000). Оскільки участь мітохондрій у посттетанічній потенціації і виділенні нейромедіаторів було показано в деяких дослідженнях (Melamed-Book & Rahamіmoff 1998)(Stanton & Schanne 1986), то порушення роботи мітохондрій може відігравати істотну роль у виникненні діабетичних нейропатій.

Вивчення кальційрегулюючої ролі ЕР при карагениновому запаленні і СТЗ-індукованної нейропатії виявило істотне зменшення амплітуди кальцієвого викиду у відповідь на додавання різних агонистів, таких як кофеїн, іономицин і АТФ у соматосенсорних нейронах щурів. Таким чином, ми, імовірно, маємо справу або зі зменшенням кальцієвої ємності ЕР, або з модуляцією ріанодинових і/чи InsP₃ рецепторів, або з уповільненням роботи Са²⁺-АТФази ЕР. Зниження активності кальцієвого депо ЕР може являти собою протекторний механізм, що виникає у відповідь на могутню нейрональну і хімічну стимуляцію даних клітин при запаленні (Usachev et al. 1993).

Прямий вимір активності Са²⁺-АТФаз у мікросомах ДКГ і ДР підтвердили нашу гіпотезу про переважаючу роль зміненої активності SERCA у зменшенні кальцієвого викиду з ЕР при діабетичної нейропатії. Зменшення активності як SERСA, так і PMCA у первинних і вторинних сенсорних нейронах може також пояснювати збільшення базального рівня кальцію в даних нейронах і уповільнення його відновлення після деполяризації. Те, що уповільнення виводу кальція з цитозоля відбувається в ноцицептивних нейронах, може бути однієї з причин виникнення змін больової чутливості при діабеті, оскільки підвищений рівень базального кальцію може впливати на процеси потенціації сигналізації нейрона і модулювати частоту передачі сенсорної імпульсації (Konnerth et al. 1992).

Часовий характер змін функції внутрішньоклітинних Са²⁺-акумулюючих структур при карагеніновому запаленні та діабетичній нейропатії добре корелює з розвитком алодінії і гипералгезії, що були досліджені в тому же інтервалі після індукції запалення або діабету (Stanfa & Dіckenson 1999, Stanfa & Dіckenson 1998, Sandkuhler 2004). Ці дані допускають можливість того, що зменшення Са²⁺-акумулючих активностей мітохондрій і ЕР може бути чинником, що робить вагомий внесок у процес центральної сенситизації. У природних умовах виявлені зміни можуть, у визначеній мірі, коректуватися частотою, кількістю і ритмічністю виділення нейромедіатора із синаптических закінчень первинних нейронів і посиленням його дії в умовах запалення або нейропатії. Про те, наскільки важливу роль у розвитку нейропатій грає кальцієве депо ЕР свідчить той факт, що спинномозкове введення ріанодина значно зменшувало амплітуду фази "гострого" болю при формаліновому тесті у діабетичних мишей (Kameі et al. 2000). У той же час на фазі "тонічного" болю при формаліновому тесті ріанодин робив потенціюючу дію, причому у контрольних тварин не відзначалося достовірних змін при дії ріанодина ні в першій, ні в другій фазі формалінового тесту (Kameі et al. 2000). Оскільки при запаленні ми маємо справу з "тонічним" болем, то одержані в наший роботі відомості можуть дати ключ до пояснення змін, що спостерігаються в роботі кальцієвого депо ЕР при запаленні. Також у декількох роботах (Ohsawa & Kameі 1999) було показано, що спинномозкове введення ріанодина діабетичним мишам збільшувало тривалість реакції в taіl-flіck тесті, що наближало величину даного показника до здорових тварин. Це означає, що ріанодинове депо ЕР відіграє першорядну роль у розвитку термічної алодінії і гипералгезії, що може бути також використано для аналізу процесів, які відбуваються не тільки при діабеті, а й при різноманітних запаленнях.

Таким чином, отримані нами результати свідчать про значні зміни кальційрегулуюючих функцій мітохондрій, кальцієвих каналів плазмалемми, а також ефективності роботи кальцієвого депо ЕР при периферичному запаленні і діабетичній нейропатії в первинних і вторинних ноцицептивних нейронах ссавців.

Роль збуджуючих амінокислот у розвитку больових синдромів.

Постсинаптичне збільшення Са²⁺ при синаптичній передачі - важливий пусковий механізм для короткочасних і довгочасних змін в ефективності синапсу (Bliss and Collingridge 1993). Основний об'єм передачі між первинними аферентами і нейронами ДР відбувається через постсинаптично розташовані глутаматні рецептори (Gerber et al. 1991). Активація глутаматних рецепторів являє собою інтегральну складову процесу, за допомогою якого при запаленні в переферійних тканинах встановлюються стани, що пов'язані із біллю, такі як алодінія та гіпералгезія (Millan 1999). Нещодавні наукові дослідження показали, що запалення за допомогою речовини Фрейнда (CFA) викликає підсилення експерсії субодиниць глутаматних рецепторів у ланцюгу ствола мозку, що регулює біль (Guan 2003). Це може вносити вклад до змін пластичності після тривалого вхідного больового сигналу (Stanfa and Dickenson 1999). Повторна стимуляція первинних аферентів, чи больова стимуляція, як було показано, викликає синаптичну пластичність в дорсальному розі спинного мозку (Randic 1996), а іонотропні глутаматні рецептори і кальцій беруть участь у явищах сенситизації та змінах ефективності синапсу між первинними і вторинними ноцицептивними нейронами (Bliss and Collingridge 1993).

Глютаматні NMDA, АМРА і КА іонотропні рецептори відіграють ключову роль у синаптичній передачі аферентних сигналів. Зміни активності NMDA-рецепторів, викликають виникнення синдромів підвищеного болю, наприклад нейропатичного болю (Isaev 2000). Було показано, що антагоніст NMDA- рецепторів МК-801 може запобігати чи звертати розвиток алодінії, яка може виникати внаслідок прямих змін внутрішньоклітинного рівню кальцію чи змін в екзоцитозі. При хронічній гіпергликемії активація NMDA рецепторів в нейронах DRG і ДР (ламіни І і ІІ) пов'язана із зниженим больовим порогом. NMDA рецептори можуть також бути знайдені на тормозних інтернейронах, функціональне ушкодження яких також може відігравати роль при нейропатії. NMDA канали тісно взаємодіють із рецепторами нейрокініну-1 і простагландинами і можуть модулюватися оксидом азоту. Взаємодія всіх цих факторів може збільшити тяжкість гіпералгезії (Low 1999). Крім того, гіперосмотичний стан (можливо, внаслідок збільшення внутрішньоклітинного рівня натрію) може відігравати рол в надмірній активації NMDA (Nachemson and Bennett 1993). Відповідно, антагоністи NMDA можуть викликати зменшення термічної гіпералгезії. Існують дані, що за умов діабету збільшується активність NMDA рецепторів тільки тих нейронів, які містять субстанцію P (Garrison 1993).

Резюмуючи, можна сказати, що представлені дані можуть вказувати на можливі клітинні механізми, що лежать в основі змін проведення і обробки ноцицептивної інформації в дорсальному розі спинного мозку, що безпосередньо може віддзеркалюватись на поведінкових больових реакціях щурів. Представлені в роботі дані вперше показують, що клітинні механізми, що лежать в основі інфламоторного болю, можуть бути опосередковані синаптичною і нейрональною пластичністю, що є результатом тривалого посилення NMDA, АМРА і/чи КА-індукованих кальцієвих транзієнтів із наступною активацією внутрішньоклітинних каскадів в ДР спинного мозку щурів. Аналогічні дані були отримані на нейронах ДР щурів із нейропатієй (Isaev 2000). Таким чином, наші дані підтверджують нейромодуляторну роль ендогенної глутаматергічної системи в функціонуванні нейронів ДР спинного мозку і в супутньою запаленню і нейропатії центральній сенситизації.

Опираючись на літературні дані і власні результати, можна запропонувати наступну схему підвищення сенсорної чутливості спінальних нейронних механізмів:

ноцицептивна імпульсація викликає підвищений вхід іонів кальцію у первинні сенсорні нейрони;

із терміналей первинних сенсорних нейронів відбувається звільнення глутамату і нейропептидів в дорсальному розі;

потенціюються постсинаптичні NMDA та не-NMDA рецептори і пресинаптичні КА рецептори; деполяризуються нейрони ДР;

збільшується вхід кальцію у ноцицептивні нейрони дорсального рога;

відбувається експресія ранніх генів (наприклад, C-FOC генів), які забезпечують підвищену чутливість рецепторів до нейромедіаторів;

підсилюється взаємодія Са²⁺ і PKС в процесі фосфорилювання мембранних протеїнів, включаючи білки іонних каналів і мембранних рецепторів; змінюється активність Са²⁺-АТФаз;

змінюється активність кальцій-кальмодулін залежної NO-синтази і прдукції NO, що, в свою чергу, може призвести до змін активності гуанілатциклази і продукції цГМФ;

збільшується утворення глутамату і, як наслідок, розвиток ефектів токсичності, що обумовлюють клітинну дисфункцію і навіть загибель клітин. Якщо деякі нейрони ДР функціонують як тормозні одиниці, їх виключення може викликати підвищення збудженості нейронів, і, як наслідок, центральну сенситизацію.

Дана схема може стати певним орієнтиром для подальших досліджень функціональних змін в нервових структурах при розвитку різноманітних больових синдромів. Використання моделей больових синдромів у тварин необхідно для розуміння нейронних механізмів, котрі задіяні в розвиток хронічних больових станів у клінічних хворих. Розуміння принципів функціонування цих механізмів дасть надію розробити засоби для ефективного полегшення патологічних станів, пов'язаних із хронічними болями.

ВИСНОВКИ

У представленій роботі вперше проведено порівняльний аналіз змін кальцієвої сигналізації в первинних (дорсальнокорінцеві ганглії) і вторинних (дорсальний ріг спинного мозку) соматосенсорних нейронів гризунів при станах експериментально викликаних нейропатичного і ноцицептивного болю. Зроблені наступні висновки:

В експериментах проведених із використанням формалінового тесту і тесту "гаряча поверхня" виявилося, що больова і термічна чутливості щурів із СТЗ-індукованим діабетом істотно відрізняється від таких у контрольних тварин, що свідчить про правомірність використання СТЗ-індукованого діабету для моделювання нейропатичного болю.

Концентрація вільного цитозольного кальцію ([Са²⁺]_і) в первинних і вторинних соматосенсорних нейронах здорових тварин і тварин із карагеніновим запаленням істотно не відрізняється. При порівнянні [Са²⁺]_і в первинних і вторинних соматосенсорних нейронах було знайдено, що цей параметр в нейронах ДКГ щурів з діабетичною нейропатією вірогідно віщій у порівнянні із нейронами контрольних тварин. В нейронах ДР цей параметр також демонструє тенденцію до збільшення, проте різниця не досягала статистичної достовірності.

При карагеніновому запаленні достовірної різниці рівня залишкової [Са²⁺]_і після деполяризації плазматичної мембрани нейронів ДКГ у порівнянні з нормою не спостерігається. Кінетика спаду кальцієвих транзієнтів, індукованих деполяризацією в нейронах ДР щурів із периферичним запаленням, істотно уповільнюється порівняно з такою у нейронах контрольних тварин. Рівень залишкової [Са²⁺]_і на спаді кальцієвого транзієнта після припинення деполяризації в нейронах ДКГ і ДР щурів з діабетичною нейропатією вірогідно вищий, ніж у нормі.

Амплітуда [Са²⁺]_і транзієнтів, які викликано звільненням іонів кальцію із ріанодин- і ІnsР₃-чутливих депо ЕР нейронів ДКГ і ДР, достовірно знижується як при діабетичній нейропатії, так і при периферійному запаленні (порівняно із такою у контрольних тварин). Активності Са²⁺-АТФаз плазматичної й ретикулярної мембран у мікросомальних фракціях ДКГ і ДР істотно зніжуються при діабетичній нейропатії. В нейронах ДКГ і ДР функціонування уніпортера мітохондрій значно пригнічується як при діабетичній нейропатії, так і при карагеніновому запаленні.

Фармакологічне дослідження внеску потенціалкерованих кальцієвих каналів в генерацію [Са²⁺]_і транзієнтів показало, що внесок кальцієвих каналів L- і N-типів зростає при діабетичній нейропатії, тоді як внесок каналів Т-типу залишається незмінним.

Карагенінове запалення призводить до збільшення мембранних струмів і амплітуди кальцієвих транзієнтів, що викликані активацією АМРА- і КА-рецепторів в сомі і в проксимальних дендритах нейронів ДР. При цьому NMDA-індуковані струми і амплітуди кальцієвих транзієнтів достовірно збільшуються тільки в дендритах нейронів ДР. При карагеніновому запаленні збільшується кількість нейронів ДР, чутливих до активації групи І метаботропних глутаматних рецепторів. В той же час при діабетичній нейропатії амплітуди [Са²⁺]_і транзієнтів, що викликані активацією метаботропних глутаматних рецепторів в нейронах ДР достовірно зменшуються. Динаміка змін кальцієвої сигналізації досить чітко корелює із розвитком алодінії і гіпералгезії, яки характерні для післязапального періоду. Часовий хід розвитку діабетичної нейропатії також корелює із розвитком та збільшенням порушень внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу як у первинних, так і у вторинних соматосенсорних нейронах.