Лікарські макроміцети у поверхневій та глибинній культурі

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БОТАНІКИ ІМ. М.Г. ХОЛОДНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

ЛІКАРСЬКІ МАКРОМІЦЕТИ У ПОВЕРХНЕВІЙ ТА ГЛИБИННІЙ КУЛЬТУРІ

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі мікології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Соломко Ельвіра Федорівна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, старший науковий співробітник.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Горовий Леонтій Федорович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач лабораторії клітинної біології та біотехнології грибів;

кандидат біологічних наук, Курченко Ірина Миколаївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, старший науковий співробітник

Провідна установа: Донецький державний університет (кафедра фізіології рослин) Міністерства освіти і науки України, м. Донецьк

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (01025, м. Київ, вул. Велика Житомирська, 28).

Автореферат розісланий “26” жовтня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Виноградова О.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Величезний інтерес до пізнання різних аспектів біології та біосинтетичної активності вищих грибів відділу Basidiomycota, що спостерігається в останні роки, обумовлений, в першу чергу, розширенням сфери їх практичного використання. Культивування їстівних та лікарських макроміцетів на різноманітних залишках лігноцелюлозної сировини розглядається як один із найбільш економічно та соціально виправданих шляхів отримання у XXI сторіччі цінних харчових продуктів та природних біологічно активних речовин різної хімічної природи (Chang, 1993, 2001; Lorenzen, Anke, 1998; Mizuno, 1995 a, 2002). Одержання екологічно чистих, фізіологічно функціональних харчових продуктів, а також оздоровчих та лікувально-профілактичних препаратів є надзвичайно актуальною проблемою і для України. З огляду на це, дослідження видів їстівних грибів, що за сучасними даними мають імуностимулюючу, антиоксидантну, протипухлинну, антивірусну та адаптогенну дію, заслуговує на особливу увагу.

Зараз в Україні широко культивують лише печерицю двоспорову (Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach) та гливу звичайну (Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm.), хоча у світовому грибівництві використовують вже біля 40 видів їстівних та лікарських грибів, обсяги виробництва 10 з яких досягли промислових масштабів (Chang, Miles, 2004). Пріоритет у розробці технологій культивування широкого кола видів лікарських грибів належить країнам Південно-Східної Азії, де цілу низку лікувальних та профілактичних препаратів отримують не лише з плодових тіл, але й шляхом культивування вегетативного міцелію різних видів макроміцетів на рідких поживних середовищах (Yang, Jong, 1989; Бухало та ін., 1996, Reshetnikov et al., 2001 b; Wasser et al., 2002 b). Практичне втілення нових грибних біотехнологій у вітчизняне виробництво потребує науково обґрунтованого відбору перспективних продуцентів, розширення фундаментальних знань про їх біологічні властивості, закономірності росту та плодоношення, зокрема на субстратах, характерних рослинництву України. Тому проведення відповідних досліджень є доцільним та актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі мікології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України у відповідності до планів НДР за темою 311 “Біологічні властивості лікарських макроміцетів та шляхи біотехнологічного використання окремих видів в Україні” (№ державної реєстрації 0100U000062) та темою 313 “Підбір умов вирощування лікарського їстівного гриба Lentinula edodes та поживних середовищ" (№ державної реєстрації 0199U003809). Вона включає також дослідження, виконані за темою 283 “Провести дослідження можливості вирощування вищих грибів, які використовують як наркотичні засоби”, яка виконувалася відповідно до наказу ДКНТП № 97 від 30.05.96. Дисертаційна робота була підтримана річним грантом Німецької Служби Академічних Обмінів (DAAD).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - дослідження біологічних властивостей, умов вегетативного росту та плодоношення в культурі різних видів лікарських макроміцетів для обґрунтованого відбору продуцентів, перспективних для створення нових грибних біотехнологій в Україні.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

Дослідити динаміку і визначити швидкість росту вегетативного міцелію культур лікарських грибів на агаризованих середовищах різного складу.

Дослідити вплив температури на ріст і життєздатність вегетативного міцелію грибів та встановити сприятливі значення цього параметру для росту культур різних видів.

Виявити культурально-морфологічні та молекулярно-біологічні ознаки окремих практично важливих видів.

Підібрати склад та визначити оптимальні значення рН рідких синтетичних середовищ для глибинного культивування вегетативного міцелію.

Встановити оптимальні умови отримання посівного міцелію та здатність до плодоношення на рослинних субстратах відібраних штамів лікарських грибів.

Розробити практичні рекомендації з культивування виду цінного їстівного лікарського гриба Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow.

Об'єкти дослідження: культури лікарських макроміцетів (Basidiomycota).

Предмет дослідження: швидкість росту вегетативного міцелію, еколого-фізіологічні, культурально-морфологічні, молекулярно-біологічні характеристики базидіальних макроміцетів та умови плодоношення у чистій культурі.

Методи дослідження. При вирішенні завдань були використані загальноприйняті мікологічні, мікробіологічні, молекулярно-біологічні, електронно-мікроскопічні та статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Результати експериментальних досліджень, отримані при виконанні дисертаційної роботи, розширюють фундаментальні знання про біологічні властивості видів вищих базидіальних грибів у чистій культурі. Вони суттєво поповнюють банк даних штамів різних видів лікарських макроміцетів, що зберігаються у Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІБК), створюючи наукові засади їх подальшого практичного використання у вітчизняній біотехнології.

Вперше кількісно охарактеризована швидкість радіального росту вегетативного міцелію 49 видів (136 штамів) лікарських грибів, що належать до 27 родів відділу Basidiomycota, встановлена залежність швидкості росту культур від складу агаризованих поживних середовищ та температури інкубації, визначена життєздатність культур при критично низьких (+4єС) та високих (+37єС) температурах. Для більшості досліджених культур визначені найбільш сприятливі поживні середовища та діапазон температур, які забезпечують максимальну швидкість росту вегетативного міцелію.

Отримано нові відомості про культурально-морфологічні і молекулярно-біологічні маркерні ознаки окремих раніше не досліджених видів і штамів (Auricularia spp., Ganoderma lucidum (M.A. Curt.: Fr.) P. Karst., Hypsizygus marmoreus та ін.). Новими для науки є дані про швидкість росту вегетативного міцелію (від 1,2 до 4 мм/добу чи 0,05-0,17 мм/год), оптимальне значення кислотності середовища (рН 7,2), мікроморфологічні (наявність хламідоспор та артроконідій на дикаріотичному міцелії) та молекулярно-біологічні характеристики малодослідженого і критичного у таксономічному аспекті виду їстівного лікарського гриба Hypsizygus marmoreus. За наслідками проведених досліджень, включаючи характеристику нуклеотидних послідовностей ITS регіонів рибосомальної ДНК, встановлена належність трьох штамів H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow (південноазіатського походження) та штаму H. tessulatus (Bull.: Fr.) Singer (північноамериканського походження) до одного й того ж виду - Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow. Внесення цих відомостей до банку даних EMBL (Віденський університет, Австрія) робить можливим їх подальше використання у фундаментальних критико-систематичних дослідженнях роду Hypsizygus Singer. Дослідження біологічних властивостей культур виду G. lucidum різного географічного походження показало, що, незважаючи на досить різні культуральні та фізіологічні характеристики (швидкість росту, забарвленість колоній та їх реверзуму на різних середовищах та ін.), штам ІБК-921 європейського походження та штам ІБК-1607 з Кореї за результатами молекулярно-біологічних досліджень належать до одного виду - Ganoderma lucidum (M.A. Curt.: Fr.) P. Karst.

Вперше охарактеризовано ріст та вихід міцеліальної біомаси за джерелом вуглецевого живлення у 19 видів (33 штамів) лікарських грибів на рідких середовищах з глюкозою та визначені склад і кислотність середовищ, сприятливі для росту в глибинній культурі ряду перспективних для біотехнології видів. Відомості про оптимальні значення рН середовища для росту вегетативного міцелію культур видів Agrocybe aegerita (Brig.) Singer (рН 6,3), Hypsizygus marmoreus (рН 7,2) та Grifola frondosa (Dicks.: Fr.) Gray (рН 5,0_5,5 та 6,7) одержані нами вперше.

Для відібраних за ознакою максимальної швидкості росту міцелію штамів, що належать до 10 практично важливих видів їстівних та лікарських грибів, встановлена здатність до утворення стадії телеоморфи у чистій культурі. Вперше показана можливість використання лушпиння соняшникового насіння як найбільш універсального альтернативного субстрату для плодоношення таких видів, як Agrocybe aegerita, Auricularia auricula-judae (Bull.) Wettst., A. polytricha (Mont.) Sacc., Flammulina velutipes (M.A. Curtis: Fr.) P. Karst., Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers., Lentinula edodes (Berk.) Singer та Pleurotus spp., що промислово культивують у світі на інших лігноцелюлозних субстратах.

Практичне значення одержаних результатів. Створено наукові засади технології отримання посівного міцелію та плодових тіл ряду нових для грибівництва України видів їстівних та лікарських грибів. Відібрані найбільш перспективні штами таких цінних видів, як Agrocybe aegerita, Auricularia auricula-judae та A. polytricha, Flammulina velutipes, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Hypsizygus marmoreus, Lentinula edodes та інші. Встановлено час та оптимальні умови отримання фізіологічно-активного рідкого та субстратного посівного матеріалу. Для селектованих штамів визначені найбільш сприятливі для росту міцелію температура інкубації, рН та склад агаризованих і рідких середовищ з числа таких, що можуть бути використані у практиці робіт вітчизняних лабораторій. Рекомендовано склад простих та доступних субстратів, що забезпечують плодоношення селектованих культиварів на відходах рослинництва України. Окремі новації будуть використані для патентування.

Отримані дані щодо швидкості росту вегетативного міцелію 49 видів (136 штамів) базидіальних макроміцетів на агаризованих середовищах різного складу, про сприятливі та критичні для росту значення температури і рН середовищ, а також культурально-морфологічні особливості досліджених штамів використовують при паспортизації культур, що зберігаються у Колекції шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. Зразки екстрактів, отриманих із плодових тіл та культурального міцелію за запропонованих умов поверхневого та глибинного культивування селектованого штаму Psilocybe cubensis (Earle) Singer 994, використано у дослідженнях механізму дії психотропних речовин на центральну нервову систему тварин, проведених в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. лікарський макроміцет грибний

Враховуючи результати досліджень, проведених у лабораторних та промислових умовах, складено "Методичні рекомендації з культивування лікарського їстівного гриба Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow інтенсивним методом", які можуть бути використані при проведенні дослідно-виробничих випробувань в умовах різних регіонів України та при розробці нормативно-технічної документації на плодові тіла цього гриба.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проаналізовано наукову літературу, виконано основний обсяг експериментальних досліджень, проведено необхідні розрахунки та здійснена статистична обробка отриманих дослідних даних. Планування основних напрямків роботи, обговорення результатів та висновків проведено здобувачем у творчому співробітництві з науковим керівником д.б.н. Е.Ф. Соломко. Вивчення мікроструктур вегетативного міцелію окремих видів базидіоміцетів методом СЕМ проведено спільно з д.б.н. А.С. Бухало, а молекулярно-біологічні дослідження виконано під керівництвом проф. F. Buscot та за участю доктора C. Renker (Йенський університет ім. Ф. Шиллера, Німеччина), які є співавторами відповідних публікацій. Отримані дисертантом екстракти грибів роду Psilocybe були використані в модельних експериментах на тваринах, а результати фізіологічних досліджень висвітлені у відповідних публікаціях, присвячених дії грибних екстрактів на центральну нервову систему, співавтором яких є здобувач.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені та обговорені на X та XI з'їздах Українського ботанічного товариства (1997, 2001); на міжнародних конференціях та конгресах: "Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов" (Донецьк, 1997); “Проблемы микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, 1998); "Микология и криптогамная ботаника в Росии: традиции и современность" (Санкт-Петербург, 2000); "XV Science and Cultivation of Edible Fungi" (Maastricht, Netherlands, 2000); "Perspective of medicinal mushrooms in health care and nutrition in the 21^st century” (Київ, 2001); "IV Mushroom Biology and Mushroom Products" (Cuernavaca, Mexico, 2002); "IX Studies on the Latin American Fungi" (Xalapa, Mexico, 2002); І з'їзді мікологів Росії (Москва, 2002); "XIV Congress of European Mycologists" (Ялта, 2003); ІІІ Всеросійському конгресі "Успехи медицинской микологии" (Москва, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 робіт, з них 7 статей у періодичних фахових наукових виданнях, матеріали й тези 13 наукових конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, 4-х розділів експериментальної частини, висновків, списку використаної літератури (272 джерела, з них 189 іноземних), 2-х додатків і містить 28 таблиць та 34 рисунка. Загальний обсяг роботи становить 231 сторінку, в їх числі 42 сторінки додатків ("Методичні рекомендації з культивування лікарського їстівного гриба Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow інтенсивним методом" та результати статистичної обробки даних).

Основний зміст

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури складається з двох підрозділів. В першому підрозділі проаналізована історія використання в медицині та сучасний стан дослідження лікувальних властивостей вищих базидіальних грибів. В другому підрозділі подана екологічна характеристика окремих видів грибів - об'єктів дослідження, які вже культивують у світі, розглянуто загальні принципи відбору перспективих штамів-продуцентів, основні етапи та методи культивування, а також критично підсумовані відомості про умови, сприятливі для росту і плодоношення практично важливих видів. Виходячи з аналізу літературних даних, визначена актуальність власного дослідження.

Розділ 2. Матеріали Та методи досліджень

Об'єктами дослідження були 52 види (147 штамів) лікарських грибів, що відносяться до 28 родів, 16 родин, 4 порядків відділу Basidiomycota, які зберігаються у Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІБК) (табл. 1).

Дослідження росту, морфології і культуральних ознак проводили за загальноприйнятими методами (Перт, 1978; Билай, 1980; Методы ..., 1982; Бухало, 1988) на 9 агаризованих середовищах: агаризованому пивному суслі (СА), пшеничному агарі (ПА), вівсяному агарі (ВА), синтетичному середовищі Чапека (ЧА), картопляно-глюкозному агарі (КГА), картопляно-декстрозному агарі (PDA), мaльт-екстракт агарі (MEA), мальт-екстракт-пептонному агарі (MPA) та мальт-екстракт-дріжджово-пептонному агарі (MYPA). Визначення оптимальних та критичних для росту вегетативного міцелію значень температури проводили в діапазоні від 4±1^оС до 37±0,5^оС. Виділення геномної ДНК з міцелію H. marmoreus і G. lucidum та полімеразну ланцюгову реакцію (PCR) проводили за стандартними методами (Raeder, Broda, 1985) з використанням універсальних праймерів (White et al., 1990). Дослідження росту грибів у глибинній культурі та отримання рідкого посівного міцелію проведено відповідно до описаної методології (Соломко та ін., 1984, 1992, 1994) на ряді модифікацій органічного середовища з глюкозою та пептоном (Weis et al., 1999) і синтетичного середовища з мінеральним джерелом азоту (Соломко, Федоров, 1988; Соломко, 1992). Розрахунок виходу біомаси за субстратом (глюкозою) проводили за С.Дж. Пертом (1978), а середню швидкість накопичення біомаси в глибинній культурі - за М.Е. Бекером (1978). В дослідах по плодоношенню як субстрати були використані зерно пшениці та проса, лушпиння соняшника, пшенична солома, кукурудзяні стрижні, тирса дерев листяних порід та деякі субстратні суміші. При проведенні випробувань у промислових умовах фірми “Weser-Champignon” (Німеччина) використовували субстратну суміш з 79% букової тирси, 20% кукурудзяного борошна та 1% крейди. Одержані експериментальні дані опрацьовані статистично за комп'ютерними програмами Origin (версія 5) і MS Excel (версія 9).

Таблиця 1. Систематичний склад досліджених культур базидіальних макроміцетів

Розділ 3. РІСТ ГРИБІВ на агаризованих поживних середовищах

Швидкість росту є однією з найважливіших характеристик будь-якого біологічного об'єкту. Експериментальне дослідження динаміки росту вегетативного міцелію культур вищих базидіальних грибів на агаризованих середовищах різного складу показало, що кінетика поверхневого росту колоній відповідає загальновідомим для інших міцеліальних організмів закономірностям (Перт, 1978; Reshetnikov et al., 1989). На підставі отриманих експериментальних даних нами визначена радіальна швидкість росту міцелію (V_R, мм/добу) на агаризованих середовищах різного складу у 131 культури, що належать до 49 видів, 27 родів. Отримана інформація значно поповнює досить обмежені відомості про швидкість росту базидіальних грибів різних видів у фазі лінійної залежності збільшення радіусу міцеліальних колоній від часу культивування, що об'єктивно характеризує штамове різноманіття культур окремих видів, а також дає підстави для певних узагальнень. Так, виходячи із загальноприйнятих критеріїв, що використовуються при розгляді життєвих стратегій міцеліальних грибів (Великанов, Сидорова, 1983), до швидкоростучих r-стратегів, тобто таких, радіальна швидкість росту яких дорівнює чи перевищує 0,5 мм/год (тобто V_R 12 мм/добу) з досліджених нами видів макроміцетів можна віднести лише G. lucidum 1621, Pleurotus djamor (Fr.) Boedjin 1526 та Volvariella volvaceae (Bull.: Fr.) Singer 1605. До С-стратегів, радіальна швидкість росту яких є меншою за 0,05 мм/год (тобто V_R 1,2 мм/добу), належать культури Psilocybe cyanescens Wakef. Близькими до цієї групи є окремі представники роду Marasmius (M. alliaceus (Jacq.: Fr.) Fr., M. androsaceus (L.: Fr.) Fr.). Проте більшість досліджених видів (біля 92% культур) за цим критерієм були віднесені нами до проміжної групи Р-стратегів.

Виходячи із завдань роботи, доцільним було систематизувати отримані дані і зробити більш детальний поділ культур різних видів базидіоміцетів на групи. Спираючись на порівняльний аналіз узагальнених даних середньої швидкості росту міцелію на п'яти середовищах, до швидкоростучих було віднесено культури у яких цей показник перевищував 8 мм/добу (0,3 мм/год). До цієї групи увійшли 23 штами, що належать до 7 видів: G. lucidum, P. djamor, P. ostreatus, Panus tigrinus (Bull.: Fr.) Singer, V. volvaceae, Trametes multicolor (Schwein.) Jьlich та T. suaveolens (L.) Fr. Всі вони - виключно ксилотрофи. До повільноростучих нами віднесено 36 культур 15 видів, узагальнена швидкість росту яких була нижчою за 4 мм/добу (0,17 мм/год). Це не лише види гумусових сапротрофів та копротрофів родів Psilocybe, Marasmius та Coprinus, але й всі досліджені штами таких видів ксилотрофів, як G. frondosa, H. erinaceus та H. marmoreus. Найбільшу групу штамів (49% від загальної кількості) складали такі, що росли із середньою швидкістю від 4 до 8 мм/добу (0,17-0,3 мм/год).

Швидкість росту культур переважної більшості видів залежала від складу середовища. Для 30% досліджених штамів максимальну швидкість росту забезпечувало лише відповідно одне з середовищ. Стосовно окремих видів простежується певна кореляція між систематичною приналежністю культур та визначеним найсприятливішим середовищем для їх росту. Так, вівсяний агар забезпечував максимальну швидкість росту Ganoderma spp., Coprinus spp., V. volvaceae, T. suaveolens, але був зовсім непридатним для росту культур L. edodes. У 22%, 15% та 11% культур швидкість росту була однаковою на 2-х, 3-х або 4-х середовищах відповідно.

Температура - важливий екологічний фактор, який суттєво впливає на ріст та життєздатність грибів (Жданова, Василевская, 1982; Бухало, 1988). Культури P. djamor походженням із Південної Америки та V. volvacea - ендеміка Південної Азії, повністю втрачають життєздатність після 10-20 днів інкубації у холодильнику при температурі +4С. Всі інші досліджені культури зберігають життєздатність, а окремі штами F. velutipes, P. ostreatus, M. androsaceus здатні навіть до повільного росту міцелію при цій критично низькій для грибів температурі. При критично високій температурі +37С активний ріст відзначено нами лише у Schizophyllum commune Fr.: Fr. Переважна більшість культур досліджених видів макроміцетів не росли при 37С. З них 34% повністю втрачали життєздатність, а інші поновлювали ріст при наступній інкубації при 26С.

Для 92% досліджених культур нами встановлена залежність швидкості росту вегетативного міцелію від температури інкубації. Температура 20С не забезпечувала максимальної швидкості росту міцелію досліджених видів. Температури 26-28С були найбільш сприятливими для росту більшості (64%) досліджених культур. Загальний відсоток культур, що однаково добре росли у більш широкому температурному діапазоні, а саме від 26 до 30С, або від 20 до 28С становить 14% та 10% відповідно. Температура 30С була оптимальною для росту лише окремих штамів видів роду Pleurotus та Peniophora gigantea (Fr.) Massee, які складають лише 4% від загальної кількості досліджених культур. Швидкість росту 8% штамів при всіх досліджених температурах достовірно не відрізнялася.

Склад поживних середовищ та температура інкубації суттєво впливають не лише на швидкість росту міцелію, але й на культурально-морфологічні характеристики досліджених видів. До загальних закономірностей слід віднести те, що, незалежно від видової приналежності культур, на мінімальному за вмістом поживних речовин середовищі Чапека або при несприятливих температурах інкубації утворювались незабарвлені колонії з незначною щільністю. Найщільніші колонії відмічені на багатих комплексних середовищах з пептоном MPA, MYPA та на СА. До загальних тенденцій необхідно віднести також варіювання текстури, забарвлення колоній та зміну кольору реверзуму на середовищах різного складу. Найбільш різноманітні культуральні ознаки відзначені нами у штамів G. lucidum різного географічного походження, в той час як за результатами молекулярно-біологічних досліджень було доведено, що штами європейського (ІБК-921) та південноазіатського походження (ІБК-1607) належать до одного й того ж виду Ganoderma lucidum. Культуральні ознаки штамів H. marmoreus різного походження, навпаки, були дуже подібними. У культур цього малодослідженого виду нами вперше виявлена наявність хламідоспор та артроконідій на дикаріотичному міцелії, відзначена наявність пряжок, кристалів та анастомозів. Результати порівняльних культурально-морфологічних та молекулярно-біологічних досліджень таксономічного положення колекційних культур видів H. marmoreus та H. tessulatus свідчать про належність їх до одного виду Hypsizygus marmoreus.

Розділ 4. Ріст грибів на рідких поживних середовищах

Культивування макроміцетів на рідких середовищах лежить в основі багатьох сучасних біотехнологій (Соломко, Дудка, 1985; Wasser et al., 2002). Серед факторів середовища, які суттєво впливають на ріст грибів, важливу роль відіграє концентрація іонів водню (рН). Вплив стабілізованих значень рН рідкого синтетичного середовища з глюкозою на ріст міцелію досліджено у попередньо відібраних нами штамів 8 видів. Встановлено, що оптимальні значення цього параметру для росту досліджених штамів G. lucidum та H. erinaceus співпадають з даними літератури (Stamets, 2000; Chang, Miles, 2004; Grigansky et al., 1999). Оптимальні значення рН середовища для росту культур A. aegerita (рН 6,3), G. frondosa (рН 5,0-5,5 та 6,7) та H. marmoreus (рН 7,2) визначено нами вперше. Показано, що різні за походженням штами одного виду можуть відрізнятися за оптимальним для росту значенням рН середовища: G. lucidum 1621 (рН 4,9) та G. lucidum 921 (рН 6,3), G. frondosa 923 (рН 5,0-5,5) та G. frondosa 976 (рН 6,7).

Вперше охарактеризовано накопичення та вихід біомаси по субстрату (глюкозі) 33 штамів 19 видів лікарських грибів у глибинній культурі на ряді синтетичних середовищ (табл. 2). Дослідження динаміки накопичення біомаси в глибинній культурі у штамів практично важливих видів дозволило визначити для них умови отримання фізіологічно активного рідкого посівного матеріалу та рекомендувати найбільш сприятливі за складом рідкі середовища. Так, середовище 1 виявилося оптимальним для росту культур A. auricula-judae (середня швидкість накопичення біомаси (Vсер.) > 0,8 г/л/добу) та А. polytricha (Vсер. > 1,1 г/л/добу), H. marmoreus (Vсер. > 0,8 г/л/добу) та H. erinaceus (Vсер. > 0,9 г/л/добу). Для отримання рідкого посівного інокулюму цих культур визначений термін у 9-10 діб культивування. Для культур A. aegerita крім середовища 1 (Vсер.=1,7 г/л/добу) сприятливим виявилося середовище 3 (C:N=10:2) (Vсер.=1,5 г/л/добу) при терміні культивування 6-7 діб. Штами G. lucidum найбільш активно росли на пивному суслі (Vсер.=2,2-2,4 г/л/добу), термін культивування для отримання рідкого посівного інокулюму у селектованого штаму 1621 становить лише 4 доби, в той час, як у інших 5-6 діб. Для культур L. edodes однаково сприятливими були пивне сусло та середовище 5 (Vсер. > 0,6 г/л/добу), а оптимальний термін культивування - 6-7 діб.

Таким чином, селектовано ряд штамів видів A. аegerita, A. polytricha, G. lucidum, H. erinaceus, L. edodes, P. sajor_caju, Ps. cubensis та деякі інші, які за комплексом отриманих ростових характеристик (швидкість приросту біомаси більша за 1 г абсолютно сухої речовини на 1 л середовища за добу, вихід біомаси за субстратом > 25%), одержаних на рідких середовищах, перспективні для одержання рідкого посівного матеріалу та подальшої розробки біотехнологій отримання лікувально-профілактичних препаратів.

Таблиця 2. Приріст та вихід біомаси по субстрату при глибинному культивуванні окремих досліджених штамів (10-а доба)

Примітки: співвідношення С : N наведених середовищ 20 : 1. Середовище 1 - 50 г/л глюкози, 5 г/л пептону; 2 - 25 г/л глюкози, 2,5 г/л пептону; 5 - 50 г/л глюкози, 2 г/л пептону, 3 г/л (NH₄)₂SO₄.

Б - маса сухого міцелію, г/л; Y_s - вихід біомаси за глюкозою, %; “*“ - 7 діб інкубації; “-“ статистично достовірні дані відсутні.

Poзділ 5. Ріст та плодоношення грибів на рослинних субстратах

Результати проведеного дослідження дозволяють констатувати, що зерно пшениці є найбільш універсальним субстратом для виробництва посівного міцелію відібраних штамів різних видів лікарських грибів, за виключенням G. frondosa 962, який швидше ріс на зерні проса. Використання підібраних нами оптимальних для кожної культури агаризованих середовищ дозволяє скоротити строки отримання посівного міцелію порівняно із строками, зазначеними в літературі для відповідних видів (Yang, Jong, 1989). Застосування рідкого посівного інокулюма, отриманого методом глибинного культивування, на 25_30%, а у деяких випадках навіть на 50% (для F. velutipes та G. frondosa), скорочує час, необхідний для отримання посівного міцелію першої генерації на зерні, що загалом узгоджується з даними наявними в літературі (Yang, Jong, 1989; Stamets, 2000).

Дослідження росту вегетативного міцелію та здатності до утворення стадії телеоморфи в чистій культурі на щільних рослинних субстратах проведено у 14 культур, відібраних нами з 10 видів їстівних та лікарських грибів, які вже широко використовуються у грибівництві різних країн світу: A. aegerita, A.auricula-judae, A. polytricha, F. velutipes, G. lucidum (3 штами), H. erinaceus (2 штами), H. marmoreus (2 штами), L. edodes та Ps. cubensis. На тих чи інших простих субстратах та субстратних сумішах утворення примордіїв та плодових тіл з характерними ознаками одержано у всіх відібраних культур. Деякі із використаних в роботі субстратів були сприятливими для плодоношення більшості видів, інші - менш універсальні - забезпечували плодоношення лише окремих видів. Так, в умовах лабораторних експериментів на тирсі листяних порід дерев, збагаченій пшеничними висівками (10% від маси), утворення примордіїв та плодових тіл спостерігали у всіх культур, крім Ps. cubensis, на пшеничній соломі - у всіх культур, крім H. erinаceus, на лушпинні соняшникового насіння - у всіх культур, крім G. frondosa. На тирсі листяних порід без додатків плодоношення було отримано лише у A. polytricha, на кукурудзяних стрижнях - у A. aegerita. Нами вперше встановлено, що поряд з традиційним для культивування ксилотрофних видів лікарських грибів збагаченим тирсовим субстратом, найбільш універсальним і сприятливим альтернативним субстратом з відходів рослинництва України є лушпиння соняшникового насіння. Важливо зазначити, що цей субстрат та інші відходи сільського господарства, сприятливі для культивування тих чи інших видів, без будь-яких додатків забезпечують швидший розвиток міцелію та скорочення строків появи плодових тіл порівняно із збагаченим тирсовим субстратом.

Строки повного обростання щільних субстратів, появи примордіїв і плодових тіл залежать не лише від компонентного складу субстратів, а й від особливостей біології конкретного штаму і виду гриба. Так, міцелій штаму G. lucidum 1621 з групи швидкоростучих культур, набагато швидше за інші колонізував усі досліджені субстрати (6-12 діб), в той час, як найбільш перспективний із групи повільноростучих видів штам H. marmoreus 1612 колонізував рослинні субстрати лише за 22-30 діб. Швидкоростучі штами утворювали і стадію телеоморфи за більш короткий термін культивування, ніж відібрані штами, віднесені нами за показником швидкості росту міцелію до середніх та повільноростучих. Таким чином, результати лабораторних досліджень підтвердили правильність застосованої нами стратегії та критеріїв вибору культур нових видів на попередніх етапах експериментальної роботи.

Порівняльні дослідження з плодоношення різних штамів видів G. lucidum та H. marmoreus були проведені нами у виробничих умовах діючого господарства "Weser-Champignon" (Німеччина) на класичному тирсовому субстраті з кукурудзяним борошном в умовах, що використовуються для виробництва плодових тіл L. edodes. Важливо зазначити, що і у виробничих умовах саме штамам H. marmoreus 1612 та G. lucidum 1621, відібраним нами як перспективні за швидкістю росту міцелію на агаризованих середовищах та щільних субстратах, були властиві коротші строки колонізації субстрату до початку плодоношення та найвища врожайність серед широкого кола досліджених штамів відповідних видів. Отримані дані щодо виходу плодових тіл, які складали для G. lucidum 2,9-3,2%, а для H. marmoreus 7-9%, - дещо нижчі за дані, наведені в літературі (Stamets, 1993, 2000), що свідчить про доцільність подальшої оптимізації технології культивування відібраних нами штамів.

В результаті проведеного дослідження створено наукові засади технології отримання плодових тіл ряду видів лікарських грибів, нових для грибівництва України. За комплексом досліджених ознак відібрано перспективні штами A. aegerita, A. polytricha, G. lucidum, H. erinaceus, H. marmoreus та ін., для яких визначені сприятливі умови отримання посівного міцелію (склад та рН агаризованих і рідких середовищ, значення температури), а також підібрані щільні субстрати, сприятливі для їх плодоношення. Для практичного використання складено методичні рекомендації з інтенсивного культивування селектованого штаму H. marmoreus.

Висновки

Дослідження росту вегетативного міцелію 52 видів (147 штамів) лікарських базидіоміцетів у поверхневій та глибинній культурі, визначення морфологічних, культуральних, фізіологічних та молекулярно-біологічних ознак вегетативного міцелію та умов відтворення стадії телеоморфи у чистій культурі дозволило отримати нові для науки відомості про біологію окремих видів та створити вагому базу даних для подальшого розвитку нових грибних біотехнологій в Україні.

У 136 культур грибів, які належать до 49 видів 27 родів відділу Basidiomycоtа вперше на агаризованих середовищах різного складу визначено радіальну швидкість росту вегетативного міцелію. 23 штами 7 ксилотрофних видів, узагальнена середня швидкість росту яких (V_R) перевищує 8 мм/добу (0,3 мм/год), віднесені до швидкоростучих. Максимальною швидкістю росту відзначаються Pleurotus djamor 1526 (16,9 мм/добу чи 0,7 мм/год), Volvariella volvaceae 1605 (12 мм/добу чи 0,5 мм/год), Ganoderma lucidum 1621 (11,8 мм/добу чи 0,49 мм/год). До повільноростучих культур віднесено 36 штамів 15 видів, які мають узагальнене значення V_R < 4 мм/добу (0,17 мм/год). Серед них культури гумусових сапротрофів та копротрофів родів Psilocybe, Marasmius, Coprinus та досліджені штами таких ксилотрофних видів, як Hericium erinaceus та Hypsizygus marmoreus. Найбільшу групу (49% досліджених культур) становили такі, що ростуть із середньою швидкістю (V_R від 4 до 8 мм/добу або 0,17-0,3 мм/год).

Встановлено, що склад агаризованих середовищ впливає на швидкість росту вегетативного міцелію переважної більшості досліджених культур. Для 30% з них визначено одне оптимальне середовище. Для 22%, 15% та 11% штамів однаково сприятливими виявилися два, три та чотири середовища відповідно. Швидкість росту міцелію 22% досліджених макроміцетів статистично не відрізнялася і була однаковою на усіх використаних у роботі органічних, напівсинтетичному та мінеральному середовищах. Ця ознака значною мірою характерна для штамів, віднесених нами до повільноростучих.

На швидкість росту міцелію та життєздатність культур різних видів суттєво впливає температурний фактор. Діапазон температур від +26 до +28С визначений як найбільш сприятливий для росту більшості (64%) досліджених культур. Відсоток таких, що добре росли у більш широких діапазонах, а саме від +26 до +30С, або від +20 до +28С становить 14% та 10% відповідно. Температура +30С була оптимальною для окремих штамів видів Pleurotus ostreatus та Peniophora gigantea, які становлять лише 4% від загальної кількості досліджених культур. Для 104 штамів 39 видів досліджена життєздатність при критичних температурах (+4°С та +37°С) і встановлено, що культури видів Pleurotus djamor та Volvariella volvaceae втрачають життєздатність при +4°С, а культури Sсhizophyllum commune, на відміну від усіх інших досліджених видів, здатні активно рости при +37°С.

Із застосуванням світлової та скануючої електронної мікроскопії встановлено маркерні ознаки на видовому рівні (пряжки, анастомози, кристали на гіфах), які можуть бути використані для ідентифікації та контролю чистоти культур видів Agrocybe aegerita, Auricularia polytricha, A. auricula-judae та Hypsizygus marmoreus. Вперше виявлена наявність хламідоспор та артроконідій на дикаріотичному міцелії малодослідженого лікарського гриба H. marmoreus.

За наслідками проведених культурально-морфологічних та молекулярно-біологічних досліджень, включаючи характеристику нуклеотидних послідовностей ITS регіонів рибосомальної ДНК, встановлена належність колекційних штамів H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow (південноазіатського походження) та штаму H. tessulatus (Bull.: Fr.) Singer (північноамериканського походження) до одного й того ж виду - Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow.

Для 8 видів (12 штамів) лікарських грибів визначені оптимальні для росту вегетативного міцелію значення рН середовища. Вперше ці значення встановлені для культур видів Agrocybe aegerita (рН 6,3), Grifola frondosa (рН 5,0_5,5 та 6,7) та Hypsizygus marmoreus (рН 7,2). Показано, що значення рН середовища, сприятливі для росту вегетативного міцелію окремих видів (Ganoderma lucidum, Grifola frondosa та ін.), можуть бути штамоспецифічною фізіологічною ознакою.

В результаті порівняльного дослідження росту та виходу біомаси по субстрату у 33 культур 19 видів базидіальних грибів на рідких синтетичних середовищах з глюкозою відібрані окремі штами видів Agrocybe aegerita, Auricularia polytricha, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Lentinula edodes, Pleurotus sajor - caju та Psilocybe cubensis, перспективні для створення біотехнологій, заснованих на глибинному культивуванні продуцентів. Показано доцільність застосування рідкого посівного інокулюма, отриманого методом глибинного культивування для суттєвого (на 30-50%) скорочення часу, необхідного для виробництва посівного міцелію.

За комплексом досліджених ознак відібрано перспективні штами нових для грибівництва України видів їстівних та лікарських грибів (Agrocybe aegerita, Auricularia spp., Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Hypsizygus marmoreus, Flammulina velutipes, Lentinula edodes, Pleurotus spp.), для яких визначені сприятливі умови отримання посівного міцелію (склад та рН агаризованих і рідких середовищ, значення температури), а також показана здатність до плодоношення на щільних субстратах. Дослідження плодоношення 7 штамів Ganoderma lucidum та 3 штамів Hypsizygus marmoreus, проведені в реальних виробничих умовах фірми “Weser-Champignon” (Німеччина), підтвердили обґрунтованість використаних критеріїв відбору.

Показано, що із відходів рослинництва України найбільш універсальним та сприятливим субстратом для культивування відібраних видів ксилотрофних макроміцетів є лушпиння соняшникового насіння.

За результатами досліджень, проведених у лабораторних та виробничих умовах, складено методичні рекомендації з інтенсивного культивування селектованих штамів нового для європейського грибівництва виду їстівного лікарського гриба Hypsizygus marmoreus.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Ломберг М.Л. Дослідження Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigelow (Agaricales) у культурі // Укр. ботан. журн. - 2002. -Т. 59, N 3 - С. 292-298.

2. Соломко Е.Ф., Ломберг М.Л., Митропольська Н.Ю., Чоловська О.В. Ріст окремих видів лікарських макроміцетів на поживних середовищах різного складу // Укр. ботан. журн. - 2000. - Т. 57, N 2. - С. 119-126.

3. Lomberh M., Buchalo A., Solomko E., Grygansky A., Kirchhoff B. Investigations of mycelium growth and fruit body development of different strains of the beech mushroom Shimeji (Hypsizygus marmoreus Bull.: Fries) Singer // "XV Science and Cultivation of Edible Fungi". - Maastricht (Netherlands). - 2000. - Vol. 2. - P. 763 _ 770.

4. Lomberh M.L., Renker C., Buchalo A.S., Solomko E.F., Kirchhoff B., Buscot F. Micromorphological and Molecular Biological Study of Culinary-Medicinal Mushroom Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigel. (Agaricomycetideae) // Int. J. Med. Mushr. - 2003. - Vol. 5, N3.- P. 307-312.

5. Lomberh M.L., Solomko E.F., Buchalo A.S., Kirchhoff B. Studies of medicinal mushrooms in submerged culture // 4th Int. Confer. "Mushroom Biology and Mushroom Products": Proc. - Cuernavaca (Mexico). - 2002. - P. 367-378.

6. Moldavan M.G., Grodzinskaya A.A., Solomko E.F., Lomberh M.L., Wasser S.P., Storozhuk V.M. The effect of Psilocybe cubensis extract on hippocampal neurons in vitro // Фізіологічний журн. - 2001. - Т. 47, N 6. - С. 15-23.

7. Moldavan M.G., Solomko E.F., Grodzinskaya A.A., Wasser S.P., Storozhuk V.M., Lomberh M.L. Neurotropic effect of extracts from the hallucinogenic mushroom Psilocybe cubensis (Earle) Sing. (Agaricomycetideae). In vitro studies // Int. J. Med. Mushr.- 2000. - Vol. 2. - P. 329-338.

8. Ломберг М.Л. Сравнительное исследование роста ценного съедобного и лекарственного гриба Hypsizygus marmoreus (Bull.: Fries) Singer на твердых и жидких питательных средах // Тез. докл. 1-го съезда микологов России. - Москва. - 2002. - С. 283.

9. Бухало А.С., Соломко Е.Ф., Митропольська Н.Ю., Григанський А.Ф., Ломберг M.Л. Скрининг культур лекарственных видов базидиальных макромицетов // Мат. I-ой Междунар. конф. "Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов". - Донецк. - 1997.- С. 10-12.

10. Бухало А.С., Соломко Э.Ф., Бисько Н.А., Вассер С.П., Митропольская Н.Ю., Григанский А.Ф., Ломберг М.Л. Исследование культур лекарственных базидиальных макромицетов // Мат. Междунар. конф. "Микология и криптогамная ботаника в Росии: традиции и современность". - Санкт-Петербург. - 2000. - С. 79-81.

11. Бухало А.С., Бісько Н.А., Соломко Е.Ф., Митропольська Н.Ю., Білай В.Т.. Григанський А.П., Поєдинок Н.Л., Ломберг М.Л., Михайлова О.Б. Дослідження культур їстівних та лікарських шапинкових грибів // Мат. XI з'їзду Українського ботанічного товариства - Харків. - 2001. - С. 55-56.

12. Кучеренко О.В., Ломберг М.Л., Соломко Е.Ф. Дослідження лікарського гриба Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst. у штучній культурі // Конф. молодих вчених-ботаніків України “Актуальні проблеми ботаніки та екології”. - Ніжин.- 2001.- С. 92-93.

13. Соломко Е.Ф., Ломберг М.Л., Митропольська Н.Ю. Вплив температури та складу поживного середовища на ріст вегетативного міцелію окремих видів лікарських макроміцетів // Тез. доп. X-го з`їзду Українського ботанічного товариства “Проблеми ботаніки і мікології на порозі третього тисячоліття”. - Київ-Полтава. - 1997. - C. 105.

14. Соломко Э.Ф., Ломберг М.Л., Бухало А.С. Разработка условий глубинного культивирования лекарственных видов макромицетов // Мат. Междунар. конф. “Проблемы микробиологии и биотехнологии - Минск. - 1998. - С. 132.

15. Соломко Э.Ф., Ломберг М.Л. Перспективы использования лечебно-профилактических свойств культивируемых грибов в 21 веке // Мат. наук.-практ. конф. "Нові технології при вирішенні медико-екологічних проблем". - Київ. - 2000.- С. 84-87.

16. Соломко Э.Ф., Ломберг М.Л., Балагура А.Н. Альтернативные субстраты для культивирования лекарственных грибов // Мат. 3-го всероссийского конгресса "Успехи медицинской микологии". - Москва. - 2005. - Т. 5. - С. 223-226.

17. Lomberg M.L., Solomko E.F., Kucherenko O.V., Kleschenko P.N. Some medicinal mushrooms in submerged culture // An іnt. confer. "Perspective of medicinal mushrooms in health care and nutrition in the 21^st century": Abstr. - Київ. - Int. J. Med. Mushr. - 2001. - Vol. 3, N 2-3. - P. 176.

18. Moldavan M.G., Grodzinskaya A.A., Wasser S.P., Solomko E.F., Lomberg M.L., Storozhuk V.M. Hallucinogenic mushrooms extracts effect on hippocampal pyramidal neurons // Bogomoletz-Nencki meeting: Abstr.- Sulejow (Poland). - 2001.

19. Moldavan M.G., Grodzinskaya A.A., Wasser S.P., Solomko E.F., Lomberh M.L., Storozhuk V.M. Neutropic action of Amanita and Psilocybe mushrooms extract // IXth Latin American Congress of Mycology "Studies on the Latin American Fungi": Abstr.- Xalapa (Mexico). - 2002. - P. 546.

20. Solomko E.F., Buchalo A.S., Lomberh M.L. Submerged culture of medicinal mushrooms // XIV Congress of European mycologists: Abstr.- Ялта.-2003. - P. 106.

Ломберг М.Л. Лікарські макроміцети у поверхневій та глибинній культурі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.21 - мікологія.- Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню біологічних властивостей культур 52 видів (147 штамів) відділу Basidiomycоtа, відомих своїми лікарськими властивостями. Кількісно охарактеризована радіальна швидкість росту вегетативного міцелію 49 видів (136 штамів) грибів і вивчена її залежність від складу агаризованих поживних середовищ та температури інкубації; визначена життєздатність культур при критичних температурах. При дослідженні культуральних, морфологічних та молекулярно-біологічних характеристик окремих видів встановлені певні маркерні ознаки, важливі для їх ідентифікації та контролю чистоти у культурі, і зокрема при вирішенні критичних питань таксономії видів Hypsizygus marmoreus та Ganoderma lucidum. При дослідженні росту грибів на рідких поживних середовищах вперше встановлені значення кислотності середовища (рН), сприятливі для росту культур Agrocybe aegerita, Grifola frondosa та Hypsizygus marmoreus, охарактеризовані концентрація та вихід міцеліальної біомаси за субстратом у 33 штамів 19 видів у глибинній культурі, підібрані модифікації синтетичних середовищ з глюкозою та умови отримання фізіологічно-активного рідкого інокулюма для 10 практично важливих виді...