Цитогенетичні ефекти як біологічний індикатор дії іонізувальної радіації в низьких дозах у ранні та віддалені строки після опромінення у осіб чорнобильського контингенту

Размещено на http://www.allbest.ru/

Академія медичних наук України

Науковий центр радіаційної медицини

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Цитогенетичні ефекти як біологічний індикатор дії іонізувальної радіації в НИЗЬКИХ дозах у ранні та віддалені строки ПІСЛЯ ОПРОМІНЕННЯ у осіб чорнобильського контингенту

03.00.01 - радіобіологія

Мазник Наталія Олександрівна

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті медичної радіології імені С.П. Григор`єва Академії медичних наук України, м. Харків.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України

Гродзинський Дмитро Михайлович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України,

завідувач відділу біофізики та радіобіології

доктор біологічних наук, професор

Серкіз Ярослав Іванович,

Інститут експериментальної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України,

провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук

Зінченко Валентина Андріївна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

науковий співробітник відділу біохімічної генетики

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ

Захист відбудеться “ 14 “ грудня 2005 р. о 14-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 Наукового центру радіаційної медицини АМН України, м. Київ, проспект Перемоги, 119/121

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України за адресою: м. Київ, вул. Мельникова, 53. Автореферат розісланий “ 14 “ листопада 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Л.О.Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

радіація лімфоцит аберація пролонгований

Актуальність проблеми. Катастрофа на Чорнобильській АЕС викликала радіаційне опромінення численних контингентів - евакуйованого населення зони ЧАЕС, учасників ліквідації наслідків аварії та мешканців радіоактивно забруднених територій. Враховуючи доведену шкідливість впливу іонізувальної радіації на геном соматичних клітин людини, визначення ступеня ураженості хромосомного апарату методами цитогенетичного аналізу стало необхідним елементом медико-біологічного моніторингу зазначених категорій осіб. Від таких досліджень очікувалися як аналіз генетичних наслідків дії мутагенних чинників аварійної ситуації, так і біодозиметричні оцінки величин поглинутих доз радіації, потрібні для прогнозування детерміністичних і стохастичних ефектів. Проте, вирішення цих завдань виявилося ускладненим через відсутність уніфікованих підходів до інтерпретації цитогенетичних даних і біологічної дозиметрії променевих навантажень у гетерогенних когортах, які зазнали пролонгованої чи хронічної дії iонiзувальних випромiнювань в низьких дозах, при недостатності даних індивідуальної дозиметрії. Додатковим чинником, що обмежував інформативність результатів, було проведення більшості цитогенетичних обстежень чорнобильських контингентів у скринінговому режимі та здебільшого у віддалені терміни після експозиції. Внаслідок цього, накопичені дані стосовно рівня нестабільних і стабільних цитогенетичних пошкоджень у різні строки після аварії на ЧАЕС та відповідні біодозиметричні оцінки в чорнобильських когортах характеризуються істотною варіабельністю [Пилинская М.А. и др. 1991, 1992, 1999, 2000, 2001; Домрачева Е.В. и др.. 1990; Зайнуллин В.Г. и др., 1992; Шишмарев Ю.Н. и др., 1992; Бочков Н.П., 1993; Семов А.Б. и др., 1994; Шевченко В.А. и др., 1995; Воробцова И.Е. и др., 1994, 2000; Sevan`kaev A.V. et al., 1995, 2000; Lazutka J.R., 1996; Lloyd D.C., Sevan'kaev A.V., 1996; Свирновский А.И. и др., 1998; Snigiryova G. et al., 1997; Littlefield L. et al., 1998; Moore D., Tucker J., 1999; Mikhalevich L. et al., 2000; Нугис В.Ю., 2001, Дьоміна Е.А., 2002; Neronova E. et al., 2003].

Таким чином, проблема коректної інтерпретації результатів цитогенетичного обстеження та оптимізації підходів до біологічної дозиметрії у осіб чорнобильського контингенту в ранні та віддалені терміни після пролонгованого радіаційного опромінення в низьких дозах на тлі впливу інших шкідливих чинників техногенної катастрофи перебуває остаточно невирішеною і представляє актуальне завдання в галузі радіобіології людини.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згiдно з планом наукової діяльності Інституту медичної радiологiї АМН України і містить результати, одержані протягом 1986-2003 рр. в межах 5 планових науково-дослідних робіт і 2 міжнародних проектів: № держреєстрацiї 01830067449 (завдання 02.01 програми С.27) “Изучить уровни инкорпорации радиоактивных веществ и состояние здоровья у лиц, находившихся в зоне повышенной радиации в связи с аварией на Чернобыльской АЭС, для разработки рекомендаций по их диспансеризации”; № держреєстрацiї 01910027510 “Изучить морфофункциональное состояние, процессы регуляции гемопоэза у жителей Харьковской области, участвовавших в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, для раннего выявления гематологических эффектов”; № держреєстрацiї 0193U019905 “Визначити прогностичну цінність аналізу стану генетичного апарату лімфоцитів периферичної крові в осіб, які в різні строки підпали під вплив радіаційного випромінювання в зоні ЧАЕС”; № держреєстрацiї 0193U019916 “Оцiнити в динамiцi значущiсть цитогенетичних порушень в лiмфоцитах периферичної кровi у мешканцiв Харкiвської областi, якi мали контакт з пiдвищеними рiвнями радiацiйного випромiнювання, для можливостi прогнозування соматико-стохастичних ефектiв”; № держреєстрацiї 0198U003156 “Розробити унiфiковану систему оцiнки ступеня променевого ураження геному для прогнозування вiддалених соматикостохастичних ефектiв радiацiйного впливу”; CEC-CIS Experimental collaborative project № 6 “Biological dosimetry for persons irradiated by the Chernobyl accident”; INCO-Copernicus project IC-15-CT98-0220 (DG12-CDPE) “Doses to the Belarus and Ukraine populations resulting from the Chernobyl accident”.

Мета і задачі дослідження. Мета - за результатами довгострокового цитогенетичного моніторингу визначити закономірності формування і перебігу цитогенетичних ефектів та підвищити ефективність хромосомної біодозиметрії у ранні та віддалені строки після радіаційного впливу у осіб, які зазнали опромінення в низьких дозах за різних умов експозиції в зоні аварії на ЧАЕС.

Для досягнення мети були вирішені наступні задачі:

1. Визначити кількісні та якісні зміни цитогенетичних показників у лімфоцитах крові осіб, які зазнали радіаційного впливу в зоні аварії на ЧАЕС, в залежності від статусу (евакуйоване населення 30 км зони, ліквідатори), доз опромінення за документами і тривалості перебування в зоні ЧАЕС.

2. Встановити кількісні параметри закономірності “доза-ефект” для виходу нестабільних і стабільних хромосомних перебудов у лімфоцитах крові людини під дією рідкоіонізувального випромінювання в діапазоні низьких доз in vitro.

3. На підставі аналізу даних in vivo та in vitro оцінити інформативність і специфічність різних видів хромосомних пошкоджень як цитогенетичних маркерів для біологічної індикації і дозиметрії радіаційного опромінення у ранні та віддалені строки після експозиції людини в зоні ЧАЕС.

4. Визначити оптимальні строки застосування класичного хромосомного аналізу для реконструкції доз опромінення методом прямої біодозиметрії; провести порівняльну біологічну оцінку доз опромінення у мешканців 30 км зони ЧАЕС в залежності від термінів евакуації; встановити ступінь відповідності документованих доз у ліквідаторів результатам біологічної дозиметрії.

5. Розробити емпіричну модель перебігу цитогенетичних ефектів у лімфоцитах периферичної крові людини в умовах пролонгованого радіаційного впливу в низьких дозах та оцінити інформативність даної моделі для урахування процесу елімінації аберантних клітин при когортній ретроспективній біодозиметрії за частотою нестабільних аберацій у віддалені строки після опромінення.

6. Оцінити ефективність застосування обліку стабільних аберацій хромосом при їх візуалізації методом флуоресцентної in situ гібридізації для визначення рівня цитогенетичних пошкоджень і біологічної детекції радіаційного впливу у ліквідаторів, осіб, які були евакуйовані із 30 км зони ЧАЕС, та мешканців радіоактивно забруднених територій у віддалені строки після аварії на ЧАЕС.

7. Розробити концепцію оптимізованого використання результатів цитогенетичного аналізу для оцінки ступіня пошкодженості геному соматичних клітин і біологічної детекції променевих навантажень на індивідуальному та когортному рівні у потерпілих від аварійного низькодозового радіаційного впливу.

Об`єкт дослідження - ураження хромосомного апарату лімфоцитів крові людини внаслідок радіаційного впливу в зоні аварії на ЧАЕС.

Предмет дослідження - формування картини цитогенетичних ефектів у термінах закономірностей “доза-ефект” і “час-ефект” та інформативність цитогенетичних показників як біологічних індикаторів опромінення в низьких дозах у осіб чорнобильського контингенту.

Методи дослідження - цитогенетичний аналіз культури лімфоцитів крові людини з виявленням хромосомних пошкоджень методами рутинного забарвлення та флуоресцентної in situ гібридізації хромосом (FISH), методи статистичної обробки даних (u-тест Папворта, критерій ч², t-критерій Ст'юдента, метод ітеративно зважених найменших квадратів, апріорно-апостеріорний аналіз Байєса).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в межах одного дослідження, з використанням єдиної методології було одержано розгорнуту картину цитогенетичних ефектів у репрезентативних вибірках осіб, які зазнали пролонгованого радіаційного впливу в зоні аварії ЧАЕС. Визначено особливості формування цитогенетичних ефектів у евакуйованого населення в залежності від тривалості перебування в зоні ЧАЕС, у ліквідаторів - в залежності від документованих доз опромінення і термінів роботи в зоні аварії. Одержано детальні відомості про перебіг частоти аберацій хромосом і геномних порушень у ліквідаторів та евакуйованих осіб від ранніх до віддалених строків після перебування в зоні ЧАЕС. Показано принципову можливість одночасного урахування стохастичності індукції аберацій та рандомізованості розподілів індивідуальних частот аберацій при цитогенетичній біодозиметрії. Одержано біологічні оцінки поглинутих доз у ліквідаторів та евакуйованого населення з побудовою ймовірністних розподілів поглинутих доз пролонгованого та еквівалентно-гострого опромінення в даних когортах осіб. Визначено ступінь відповідності документованих доз опромінення результатам біодозиметрії у ліквідаторів. Одержано задовільну взаємну відповідність між оцінками доз за рівнем стабільних хромосомних обмінів і даними біодозиметрії за частотою нестабільних аберацій у евакуйованих осіб, ліквідаторів і мешканців радіоактивно забруднених територій. Встановлено кількісні параметри елімінації аберантних лімфоцитів у людини з плином часу після пролонгованого опромінення в низьких дозах. Вірогідно показано розвиток віддаленої нестабільності геному в соматичних клітинах ліквідаторів. Встановлено співпадіння виходу незбалансованих та збалансованих хромосомних обмінів на одиницю поглинутої дози in vitro. Оцінено інформативність методу FISH для ретроспективної детекції променевого впливу в низьких дозах за наявності позитивної залежності “вік-ефект” для спонтанної частоти стабільних аберацій.

Практичне значення одержаних результатів. В роботі розроблено та впроваджено уніфіковану систему оцінки променевого ураження геному людини, яка призначена для максимально ефективного використання даних скринінгових цитогенетичних досліджень у потерпілих при широкомасштабній радіаційній аварії. Визначено інформативність різних цитогенетичних показників для біодозиметрії при пролонгованому опроміненні на тлі дії інших мутагенних чинників техногенної катастрофи. Встановлено оптимальні строки для реконструкції доз опромінення методом прямої цитогенетичної дозиметрії. На базі моделі елімінації аберантних лімфоцитів з часом після радіаційного впливу в низьких дозах in vivo розроблено новий спосіб ретроспективної біодозиметрії, який розширив період ефективного визначення доз опромінення за даними класичного хромосомного аналізу у ліквідаторів до 10 років після експозиції. Оригінальний спосіб трактовки даних FISH-дослідження дозволив істотно підвищити біодозиметричну інформативність цього методу. Запропонований алгоритм апріорно-апостеріорного аналізу Байєса вможливив біодозиметричну інтерпретацію цитогенетичних даних при малих обсягах аналізу та будь-якій низькій частоті аберацій (в т.ч. при нульовому значенні). Побудовані in vitro базові залежності “доза-ефект” для виходу нестабільних і стабільних хромосомних обмінів в лімфоцитах крові людини можуть бути використані для біологічної дозиметрії in vivo у широкому спектрі сценаріїв радіаційного впливу. Одержані дані про ступінь пошкодження хромосомного апарату та його зміни в термінах закономірності “час-ефект” у осіб чорнобильського контингенту знайшли використання в галузі генетичного моніторингу наслідків впливу мутагенних чинників аварійної ситуації в зоні ЧАЕС. Біодозиметричні оцінки у ліквідаторів, евакуйованого населення і мешканців радіоактивно забруднених територій, з урахуванням ознак розвитку віддаленої нестабільності геному у ліквідаторів в строки понад 10 років після перебування в зоні аварії ЧАЕС, можуть становити основу для формування груп підвищеного ризику віддалених радіогенних ефектів. Впровадження результатів досліджень сприяє оптимізації диспансерного нагляду за особами, які постраждали від дії радіації внаслідок Чорнобильської катастрофи та інших радіаційних аварій. Способи практичного застосування результатів викладені у Реєстрі медико-біологічних і науково-технічних нововведень МОЗ України та АМН України. На спосіб ретроспективної біодозиметрії з урахуванням елімінації аберантних клітин одержано патент України.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто розроблено концепцію дисертаційної роботи та фрагментів чи цілих науково-дослідних робіт, результати яких становлять основу дисертації, сформульовано мету і задачі дисертації; здійснено класичний цитогенетичний аналіз у ліквідаторів та евакуйованого населення у різні строки після перебування в зоні ЧАЕС; організовано динамічний цитогенетичний моніторинг в означених когортах на базі лабораторії радіаційної цитогенетики ІМР; проведено цитогенетичне обстеження евакуйованих осіб, ліквідаторів і мешканців радіоактивно забруднених територій методом FISH у віддалені строки після аварії ЧАЕС; верифіковано результати мікроскопічного аналізу, що проводився співробітниками лабораторії радіаційної цитогенетики ІМР; проаналізовано всі точки кривої “доза-ефект” для виходу нестабільних і стабільних хромосомних пошкоджень в лімфоцитах крові людини при опроміненні in vitro; розроблено оригінальний спосіб інтерпретації результатів FISH-дослідження; розроблено алгоритм біодозиметричної інтерпретації результатів цитогенетичного дослідження у випадках опромінення в низьких дозах методом аналізу Байєса; узагальнено результати власних досліджень, проведено їх співставлення з даними літератури, сформульовано всі висновки дисертації та положення, що виносяться до захисту. У співавторстві зі ст. наук. співроб. лабораторії радіаційної цитогенетики ІМР АМНУ, канд. біол. наук В.А. Вінніковим розроблено спосіб ретроспективної цитогенетичної біодозиметрії. Методологічні підходи до вибору цитогенетичних показників для FISH-дозиметрії частково розроблені у співробітництві з працівниками НКРЗ Великобританії д-ром Д. Ллойдом і д-ром А. Едвардсом.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертацiйної роботи були представлені на: міжнародній конференції “Биологические и радиоэкологические аспекты последствий аварии на ЧАЭС” (Зелений Мис, 1990); науково-практичній конференції “Актуальные проблемы ликвидации медицинских последствий аварии на ЧАЭС” (Київ, 1992); науково-практичній конференції “Чернобыль и здоровье людей” (Київ,1993); Радіобіологічному з'їзді (Київ,1993); мiжнародній конференцiї “International Workshop on Determination of Radiation Doses among Critical Groups of the Population in the FSU after Chernobyl” (Neuherberg, Germany, 1994); міжнародній науково-технічній конференції “Итоги 10 лет работ по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС” (Зелений Мис, 1996); III з'їзді з радіаційних досліджень (Москва, 1997); ІІІ симпозіумі Агенції з охорони навколишнього середовища США “The evolution of Environmental Monitoring and Assessment Program” (Albany, USA, 1997); міжнародному симпозіумі “Актуальные проблемы дозиметрии” (Мінськ, 1999); міжнародній конференції “Чрезвычайные ситуации: предупреждение и ликвидация последствий” (Харків, 2000); міжнародній конференції “Проблемы радиационной генетики на рубеже веков” (Москва, 2000); IV з'їзді з радіаційних досліджень (Москва, 2001); міжнародній конференції “Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций” (Москва, 2002); ІІІ з'їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003); міжнародній конференції “Парадигми сучасної радіобіології. Радіаційний захист персоналу об`єктів атомної енергетики” (Чорнобиль, 2004); міжнародній конференції “Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 48 робіт: 23 статті, 22 тез доповідей, 1 патент і 2 нововведення.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 485 сторінках, з них 378 сторінок основного тексту, ілюстрована 28 рисунками і 50 таблицями. Дисертація містить вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, два розділи з результатами власних досліджень, розділ із обговоренням результатів, висновки та список літератури із 374 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Загальна характеристика обстежених осіб.

Евакуйоване населення 30-км зони ЧАЕС: 57 чоловіків і 55 жінок віком від 4 до 66 років, які були евакуйовані з м. Прип'яті та інших населених пунктів 30 км зони ЧАЕС до Харківської області у терміни 2-11 діб після аварії. Строки цитогенетичного обстеження становили від 2 діб до 14.8 років після евакуації.

Ліквідатори наслiдкiв аварiї на ЧАЕС: 384 чоловіків і 36 жінок віком від 19 до 66 років, якi брали участь у роботах з лiквідацiї наслiдкiв аварiї на ЧАЕС у 1986-1990 рр. 66 осіб були обстежені декількаразово; загальна вибірка складалася з 507 індивідуальних досліджень, здійснених у терміни від 2 діб до 15.8 років після закінчення роботи в зоні ЧАЕС. Початок роботи в зоні аварії у 56.4 % випадків припадав на травень-липень 1986 р., у 23.7 % - на серпень-грудень 1986 р., у 14.6 % - на 1987 р., у 5.3 % - на 1988-1990 рр. Тривалість перебування в зонi ЧАЕС становила від 2 до 30 діб у 214 випадках, від 32 до 62 діб - у 164 випадках, від 65 до 395 діб - у 129 випадках. Дози опромiнення були зазначенi в документах 306 ліквідаторів i становили вiд 3.5 до 1244 мГр зовнiшнього опромiнення; у 244 випадках доза не перевищувала 250 мГр, у 111 осіб - дорівнювала 250 мГр.

Мешканці радіоактивно забруднених територій (РЗТ): 6 осіб чоловічої і 15 - жіночої статі віком від 15 до 26 років, які мешкали у регіонах Бєлорусі з рівнем забруднення ¹³⁷Cs від 1.5 до 859.3 кБк/м² і були обстежені у терміни 13-15 років після аварії на ЧАЕС.

Контроль: 19 чоловіків і 31 жінка віком від 16 до 58 років, мешканці м. Харкова і Харківської області, які не зазнавали впливу визнаних мутагенних чинників в умовах професійної діяльності чи терапевтичного опромінення та не проходили рентгендіагностичних процедур протягом 3 місяців до обстеження.

Всі ліквідатори, евакуйовані та особи контрольної групи були обстежені методом класичного хромосомного аналізу. Всі мешканці РЗТ, а також 18 евакуйованих осіб, 16 ліквідаторів і 12 осіб контрольної групи були обстежені у віддалені строки після аварії на ЧАЕС методом FISH. Загалом було здійснено 679 індивідуальних досліджень методом класичного хромосомного аналізу і 67 досліджень методом FISH. Відбір ліквідаторів, евакуйованого населення і контрольної групи для цитогенетичного обстеження здійснювали в Інституті медичної радіології АМН України (м. Харків). Зразки крові мешканців радіоактивно забруднених регіонів Бєлорусі були одержані від зав. лабораторією цитогенетики Інституту генетики і цитології Академії наук Бєлорусі, к.б.н. Л.С. Міхалєвич при виконанні міжнародного проекту INCO-Copernicus “Doses to the Belarus and Ukraine populations resulting from the Chernobyl accident”.

Побудова залежностей “доза-ефект” для виходу цитогенетичних пошкоджень в лімфоцитах крові людини при опроміненні in vitro. Технічна частина експерименту, а саме - опромінення зразків крові двох здорових донорів-чоловіків, культивування лімфоцитів і приготування препаратів, була виконана співробітниками Центру медичної радіології (Обнінськ, Росія, зав. лабораторією радіаційної цитогенетики, проф. О.В. Сєванькаєв), в межах міжнародного наукового проекту ЕСР-6 “Biological dosimetry for persons irradiated by the Chernobyl accident” [Lloyd et al, 1996]. Опромінення проводили від джерела ⁶⁰Co в дозах 0.0; 0.10; 0.25; 0.50; 0.75 та 1.0 Гр при потужності дози 0.5 Гр/хв. Цитогенетичний аналіз препаратів здійснювався дисертантом класичним хромосомним методом на всіх дозових точках у зразках від обох донорів. Процесінг препаратів методикою FISH проводили в зразках одного донора на точках 0.0; 0.25; 0.75 та 1.0 Гр.

Цитогенетичний аналiз лiмфоцитiв периферичної кровi людини. Лімфоцити периферичної крові, стимульовані фітогемагглютиніном, культивували за стандартною методикою [IAEA, 1986] у суміші середовища Ігла та сироватки великої рогатої худоби (4:1) при температурі 37.5 ^оС протягом 50 год. Зупинку мітозів здійснювали розчином колхіцину (0.1 мкг/мл) за 3-4 години до фіксації. Після гіпотонічної обробки проводили фіксацію клітин метанолом і крижаною оцтовою кислотою (3:1). Суспензію клітин наносили на предметне скло і висушували. Для рутинного аналізу метафазні препарати забарвлювали за Гімза та досліджували під світловими мікроскопами МБІ-11, Біолам-І та МБІ-6 при збільшенні 900-1000. В індивідуальних дослідженнях аналізували від 50 до 1200 метафаз в залежності від проліферативної активності лімфоцитів в культурі. При розпізнанні цитогенетичних пошкоджень реєстрували дицентричні та кільцеві хромосоми з супутніми фрагментами, вільні хромосомні фрагменти, хроматидні обміни, хроматидні фрагменти, гіперплоїдні та поліплоїдні клітини.

Процесінг метафазних препаратів методом FISH проводили за протоколом НКРЗ Великобританії [Finnon et al., 1997]. Використовували флуоресцеін-ізотіоціанат (FITC)-мічені проби для комбінацій хромосом 1 і 4; 1, 2 і 4 або 6, 9, 15 і 21 (Cambio), та біотін-мічені панцентромірні зонди (Oncor) до всіх хромосом; для базового забарвлення хромосом застосовували діамідіно-2-феніліндол (DAPI). Аналіз здійснювали на флуоресцентних мікроскопах (Zeiss, Nickon). Розпізнання цитогенетичних пошкоджень з залученням FITC-мічених хромосом проводили за власною модифікацією гібридної класичної/РАІNT номенклатури. На додаток до всіх вищезазначених видів аберацій, реєстрували повні транслокації t_comp, неповні транслокації t_inc(Ab), t_inc(Ва*) - з залученням усієї FITC-забарвленої хромосоми, t_inc(Ва+ас) - з супровідним фрагментом, t_inc(ВаМР) - з втраченим фрагментом FITC-забарвленої хромосоми, інсерції та делетовані FITC-забарвлені хромосоми з втраченим фрагментом. В кожному індивідуальному дослідженні аналізували від 102 до 2000 метафаз. Конвертацію кількості реально проаналізованих клітин у значення числа геном-еквівалентів здійснювали за формулою Лукаса [Lucas J. et al, 1992] для монохромного забарвлення.

В дослідженнях in vivo було проаналізовано 133332 метафази при забарвленні за Гiмза і 57012 метафаз методом FISH; при побудові кривих “доза-ефект” in vitro - 8810 метафаз при забарвленні за Гiмза і 4269 метафаз методом FISH.

Статистичні методи обробки даних. В індивідуальних дослідженнях in vivo визначали частоту цитогенетичних пошкоджень на 100 клiтин; рандомізованість поклітинного розподілу хромосомних перебудов оцінювали u-тестом Папворта. При об'єднаннi iндивiдуальних результатiв розраховували зваженi середньогрупові частоти цитогенетичних пошкоджень. Стандартні похибки середніх для всіх параметрів оцінювали за реальною дисперсією індивідуальних значень у вибірці. Співставлення розподілів індивідуальних частот цитогенетичних пошкоджень між групами та емпіричних розподілів з теоретично очікуваним розподілом Пуассона проводили за критерієм ². При міжгруповому порівнянні середніх цитогенетичних показників застосовували t-критерiй Ст'юдента для незв'язаних вибірок, при побудові регресій - метод ітеративно зважених найменших квадратів. Ймовірностну інтерпретацію цитогенетичних даних проводили методом апріорно-апостеріорного аналізу Байєса у власній модифікації.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Цитогенетичні ефекти у евакуйованих мешканців 30 км зони ЧАЕС

Загальний перебіг. Індивідуальні результати досліджень методом класичного хромосомного аналіза у евакуйованих осіб були об`єднані в 5 інтервалах часу після виходу із зони ЧАЕС (табл. 1). Діапазон індивідуальних значень сумарного рівня аберацій становив 1.2-12.0 на 100 клітин в групах, що були обстежені до 1 року, а в подальшому скорочувався до 1.2-9.0 на 100 клітин у строки 1.4-3.7 років та 0.0-5.0 на 100 клітин в інтервалі від 4.6 до 14.8 років. Спектр цитогенетичних показників у евакуйованих характеризувався збільшеною пропорцією обмінних аберацій, зокрема дицентриків і кілець, внесок яких досягав 30-40 % серед усіх аберацій хромосомного типу протягом першого року, 18-29 % у віддалені терміни, при 13.4 % в контролі. При цьому клітини з більш ніж одним хромосомним обміном не спостерігалися.

Таблиця 1

Частота цитогенетичних пошкоджень у евакуйованих мешканців 30-км зони ЧАЕС у різні строки після виходу із зони аварії у співставленні з контролем

Примітка: SE - стандартна похибка середнього; А Кл - аберантні клітини; А Хс - аберації хромосомного типу; А Хт - аберації хроматидного типу; ГП - сума геномних порушень (гіпер- та поліплоїдів).

Середні значення загальних цитогенетичних показників у евакуйованих осіб перебували на плато від першої до третьої точки часу, при цьому середній рівень аберантних клітин перевищував контроль в 4 рази, частота геномних порушень та аберацій хромосомного типу - в 4-6 разів, частота аберацій хроматидного типу - в 3-4 рази (p<0.001 для всіх показників). В подальший час спостерігали елімінацію клітин з цитогенетичними пошкодженями; статистична різниця між евакуйованими і контролем за частотою геномних порушень зникала у термін 7.99 років, за рівнем аберантних клітин та аберацій різних типів - у термін 14.3 років.

Вплив факторів статі і віку. Аналіз картини ранніх цитогенетичних ефектів у вибірці з 60 осіб, обстежених протягом перших 12 міс. після евакуації, показав, що між групами жінок і чоловіків не існувало різниці за цитогенетичними параметрами. В групах дітей і підлітків (10 осіб, 4-17 років), дорослих (30 осіб, 23-35 років) та осіб більш старшого віку (20 осіб, 36-66 років) значення надспонтанного ексцесу для частоти дицентриків і кілець, відповідно, становили 0.84; 1.23 і 1.31 на 100 клітин, для частоти вільних хромосомних фрагментів - відповідно, 1.06; 1.76 і 1.68 на 100 клітин. Перевищення спонтанного рівня за всіма видами аберацій хромосом у трьох вікових групах евакуйованих осіб було рівновірогідним (р<0.001). Додатковий аналіз даних у вибірці, обмеженій тільки дорослими особами, засвідчив, що частота хроматидних обмінів була вищою у чоловіків, ніж у жінок (відповідно, 0.55-0.57 на 100 клітин проти 0.17-0.33 на 100 клітин), а у жінок віком 23-35 років визначався вищий рівень поліплоїдів (0.55 на 100 клітин), ніж в інших статево-вікових підгрупах (0.09-0.22 на 100 клітин).

Вплив тривалості перебування в зоні аварії. Особливості початкових етапів динаміки частоти дицентриків і кілець та фрагментних аберацій в залежності від строків евакуації (2 доби чи 3-11 діб після аварії) представлено в табл. 2. Зміни частоти хроматидних фрагментів протягом перших 2 років проявилися як повільна елімінація у осіб з терміном евакуації 2 доби та накопичення у осіб, які залишили зону ЧАЕС через 3-11 діб після аварії. Динаміка частоти хромосомних фрагментів представляла певне зниження у першій групі та накопичення з виходом на плато у другій групі, тобто була якісно асоційованою з відповідним перебігом рівня хроматидних фрагментів. Початкове зростання частоти дицентриків і кілець від перших днів до 0.6-0.7 років після виходу із зони ЧАЕС відбувалося на 50 % у осіб з терміном евакуації 2 доби та на 68 % в групі “3-11 діб”. Тенденція до підвищеності рівня дицентриків і кілець у евакуйованих через 3-11 діб після аварії, порівняно з мешканцями, які залишили зону ЧАЕС у перші 2 доби, зберігалася протягом 2 років після експозиції.

Таблиця 2

Вплив тривалості перебування в зоні аварії ЧАЕС на ранні цитогенетичні показники у евакуйованих мешканців

Примітка: SE - стандартна похибка середнього; Диц+ЦК - дицентрики і кільця; Хс Фр - хромосомні фрагменти; Хт Фр - хроматидні фрагменти; вірогідні відмінності (р<0.05): a - між групами “2 доби” і “3-11 діб” в аналогічні строки; b - між першою і другою точками; c - між першою і третьою точками часу в групі “3-11 діб”.

Цитогенетичні ефекти у ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС

Загальний перебіг. Для аналізу перебігу рівня аберацій хромосом і геномних порушень обстежена вибірка ліквідаторів була розподілена на 12 груп в залежності від часу, що минув після перебування в зоні ЧАЕС, із узагальненням індивідуальних показників на усереднених точках часу (табл. 3). Метафази з більш ніж 1 аберацією виявлялися спорадично; параметри розподілу хромосомних перебудов по клітинах відповідали розподілу Пуассона на всіх термінах обстеження. Максимальні значення частоти цитогенетичних пошкоджень в індивідуальних дослідженнях спостерігалися протягом 1-2 роки після експозиції, дорівнюючи 15-16 на 100 клітин для суми аберацій і 4 на 100 клітин - для геномних порушень. Спектр цитогенетичних пошкоджень у ліквідаторів відрізнявся від контроля збільшеною пропорцією обмінних аберацій, зокрема значним внеском дицентриків і кілець. В терміни до 1 міс. після виходу із зони ЧАЕС середній рівень аберантних клітин у ліквідаторів перевищував контрольне значення в 5 разів, частота аберацій хромосомного типу - в 6 разів, частота аберацій хроматидного типу - в 4 рази, геномних порушень - в 6 разів (p<0.001 для всіх показників).

Таблиця 3

Динаміка загальних цитогенетичних показників у ліквідаторів з плином часу після перебування в зоні ЧАЕС

Примітка: SE - стандартна похибка середнього; А Кл - аберантні клітини; А Хс - аберації хромосомного типу; А Хт - аберації хроматидного типу; ГП - геномні порушення; а - різниця з контролем статистично незначуща (p>0.05).

Картина змін частоти геномних порушень з плином часу містила незначне зниження протягом перших 3.5 років і вихід на плато з перевищенням контроля в 2-2.5 рази (p<0.01) у подальший період. В динаміці частоти структурних аберацій визначалися 3 фази:

- плато середніх частот аберацій хромосомного і хроматидного типів протягом перших 2-2.5 років, яке забезпечувалося відповідним синхронізованим перебігом рівня хромосомних і хроматидних фрагментів;

- поступова елімінація аберантних лімфоцитів в інтервалі 2-9 років, з досягненням вірогідних відмінностей відносно первиних значень за рівнем хромосомних і хроматидних аберацій на точці 3.5 роки (р<0.05) і максимальним наближенням рівня всіх видів перебудов до контроля через 9 років;

- помірне, але вірогідне (p<0.05-0.01) зростання частоти всіх видів обмінних і фрагментних аберацій de novo в терміни 9-10.5 років, зі стабілізацією показників в інтервалі 10.5-13 років при перевищенні контроля в 1.5-2 рази (p<0.05-0.01).

Елімінація клітин з дицентриками і кільцями була достатньо монотонною; вірогідне зниження відносно вихідного рівня визначали у термін 1.35 роки (p<0.05). Залежність “час-ефект” для цього показника відповідала експоненційній моделі

Y_t = c + Y₀ e ^-kt, (1)

де Y_t - частота аберацій у термін t після експозиції, с - спонтанний рівень аберацій, Y₀ - первинно-індукований рівень аберацій, k - коефіцієнт, що визначає швидкість елімінації (роки-¹). Регресійний аналіз методом ітеративно зважених найменших квадратів показав, що модель має найкращий фіттінг в інтервалі від 0 до 10.6 років після експозиції (ч²=7.15; р=0.62), при Y₀=1.410 на 100 клітин, k=0.310±0.029 роки-¹, що відповідало швидкості елімінації клітин з дицентриками і кільцями 26.7 % за рік і періоду напівелімінації Т_1/2=2.24 роки.

Цитогенетичні показники у ліквідаторів в залежності від дози опромінення за документами і тривалості перебування в зоні ЧАЕС. Враховуючи модальність значення дози опромінення 250 мГр, яке становило 36 % всіх документованих доз, вибірка ліквідаторів була розподілена на 4 групи: Д₁ - з дозами від 3.5 до 240 мГр (в середньому 138 мГр); група Д₂ - з дозою 250 мГр; група Д₃ - з дозами від 260 до 1244 мГр (в середньому 458 мГр); група Д-₄ - особи з невідомою дозою. Вплив тривалості перебування в зоні аварії визначався з розподілом вибірки на групи Т₁ - від 2 до 30 діб (в середньому 21 доба), Т₂ - від 32 до 62 діб (в середньому 47 діб) і Т₃ - від 65 до 395 діб (в середньому 118 діб). Обгрунтуванням даного розподілу стала модальність терміну перебування в зоні ЧАЕС 1-2 міс. (32 % всієї вибірки). Картина змін цитогенетичних показників у даних групах представлена на рис. 3.

Між групами Д₁-Д₄ не спостерігали істотної різниці за характером динаміки аберантних клітин та всіх видів структурних хромосомних перебудов, проте частота геномних порушень у період до 6 років після перебування в зоні ЧАЕС була підвищеною у осіб з дозами за документами >250 мГр порівняно з іншими групами. Середній рівень дицентриків і кілець у терміни 0.5-1.0 роки був вірогідно вищим у осіб з дозами >250 мГр, ніж у групах Д₂ і Д₄ (p<0.01), але при співставленні груп Д₃ і Д₁ відмінності були статистично незначущими. Початкове плато частоти хромосомних фрагментів і хроматидних перебудов також було більш виразним в групі Д₃, проте у подальший час будь-яка кореляція цитогенетичних показників з документованими дозми зникала внаслідок флуктуацій в групі “250 мГр”. Рівні дицентриків і кілець та інших видів аберацій поступово знижувалися з часом без утворення певних дозових трендів. Період нормалізації частоти аберацій становив 5-6 років у групі Д₁ і 8-9 років у групах Д₂-Д₄. Тенденція до помірного підвищення рівнів аберацій у терміни 10-13 років після виходу із зони ЧАЕС проявлялася незалежно від доз за документами.

Первинні рівні дицентриків і кілець та геномних порушень мали від`ємну залежність від тривалості експозиції, з утворенням значущих відмінностей між групами Т₁ і Т₃ за даними показниками на першій точці часу (p<0.05); у подальший час дана залежність зникала. Частота решти аберацій в групах Т₁-Т₃ не розрізнялася протягом всього інтервалу спостереження. Перебіг рівня геномних порушень мав вигляд флуктуативних коливань у достатньо вузькому діапазоні, без утворення трендів залежності показника від тривалості перебування в зоні ЧАЕС. Нормалізація рівня структурних хромосомних перебудов відбувалася через 6 років у групі Т₃ та через 8-9 років у осіб з коротшою тривалістю роботи в зоні аварії. Помірне накопичення аберацій у період 10-13 років після експозиції було однаково виразним в усіх групах і відбувалося без будь-якої кореляції з тривалістю перебування ліквідаторів в зоні ЧАЕС.

Рівень цитогенетичних пошкоджень, що визначався у експонованих осіб методом FISH у віддалені терміни після аварії на ЧАЕС

Розподіли індивідуальних частот всіх видів цитогенетичних пошкоджень, що визначалися методом FISH в групах евакуйованих мешканців 30 км зони ЧАЕС, ліквідаторів, мешканців РЗТ і контроля, були рандомізованими і вкладалися в межі дисперсії, передбаченої статистикою Пуассона. Метафази з комплексними перебудовами були представлені декількома клітинами з інсерціями, клітиною з повною і неповною транслокаціями в однієї з евакуйованих та клітиною з повною транслокацією й ацентричним фрагментом у одного з мешканців РЗТ, що при об`єднанні індивідуальних результатів не порушувало загальну рандомізованість розподілу аберацій по клітинах. При статистичному аналізі окремі складові даних комплексів враховувалися як незалежні аберації.

Порівняння результатів FISH та класичного аналізу. Аналогічні цитогенетичні показники, що визначалися двома методами в групах експонованих осіб і контроля, представлені в табл. 4. Середні рівні аберантних клітин, дицентриків і кілець та поліплоїдів не розрізнялися при FISH і класичному аналізі. Спільними тенденціями в групах контроля, евакуйованих і ліквідаторів були збільшений рівень хромосомних фрагментів і гіперплоїдів і зменшена частота хроматидних фрагментів при аналізі FISH, порівняно з класичним методом. Частота нестабільних аберацій, що визначалася при FISH-дослідженні у осіб чорнобильського контингенту, не мала вірогідної різниці з контролем; статистичне перевищення спонтанного рівня спостерігали тільки за частотою гіперплоїдії у евакуйованих та ліквідаторів (р<0.05).

Таблиця 4

Частота нестабільних аберацій і геномних порушень при використанні класичного хромосомного аналізу (Giemsa-забарвлення) і методу FISH в групах експонованих осіб та контроля у віддалені строки після аварії на ЧАЕС

Примітка: SE - стандартна похибка середнього; Аб Кл - аберантні клітини; Диц+ЦК - дицентрики і центричні кільця; Хс Фр - хромосомні фрагменти; Хт Фр - хроматидні фрагменти; Гіпер - гіперплоїдні клітини; Полі - поліплоїдні клітини; * - при FISH-дослідженні частоту аберацій і гіперплоїдів подано на 100 геном-еквівалентів, частоту поліплоїдії розраховано на 100 реально проаналізованих клітин.

Рівень аберацій хромосом, які ексклюзивно виявлялися методом FISH. Середні частоти повних і неповних транслокацій, інсерцій і делетованих хромосом в групах осіб чорнобильського контингенту і контроля наведені в табл. 5. Виявилося, що рівень кожного зазначеного виду аберацій проявив тенденцію до накопичення з віком донорів в контролі. Безпосереднє порівняння показників було можливим в узагальнених групах евакуйованих осіб, ліквідаторів і контроля завдяки співпадінню середнього віку (38-40 років). Вірогідне перевищення спонтанного рівня аберацій у евакуйованих і ліквідаторів спостерігали за частотою повних транслокацій, сумою неповних транслокацій і сумою транслокацій та інсерцій (р<0.05-0.01). У мешканців РЗТ визначалася вірогідно вища частота інсерцій, сума неповних транслокацій і сума транслокацій та інсерцій (р<0.05-0.001), ніж у наймолодшій підгрупі контроля.

Таблиця 5

Рівні хромосомних перебудов, які ексклюзивно визначалися методом FISH у групах експонованих осіб та контрольних донорів різного віку

Примітка: SE - стандартна похибка середнього; t_comp - повні транслокації; t_inc - неповні транслокації; Ins - інсерції; Del Chrs - делетовані хромосоми.

Для додаткового аналізу були сформовані групи евакуйованих мешканців віком 16-40 років (Е₁) та 44-55 років (Е₂), ліквідаторів з тривалістю перебування в зоні ЧАЕС 9-44 діб (L₁) та 60-122 діб (L₂) і мешканців регіонів з рівнем забруднення радіонуклідами ¹³⁷Cs 1.5-44 кБк/м² (R₁) та 110-860 кБк/м² (R₂). Сумарні рівні транслокацій та інсерцій у цих групах були співставлені з квадратичною регресією “вік-ефект”, побудованою для спонтанного рівня показника за результатами дослідження в контролі: Y_sp = (0.394 + 5.1510^-4A²) ± 0.180, де Y_sp - частота на 100 геном-еквівалентів, A - вік, роки.

Серед евакуйованих відмінність від контроля була значно виразнішою у осіб молодшого віку (р<0.01), порівняно зі старшою групою (p>0.05). Надспонтанний ексцесс рівня транслокацій та інсерцій у ліквідаторів виявився вдвічі більшим у осіб з коротшою тривілістю перебуванням в зоні ЧАЕС, хоча вірогідне перевищення контроля визначалося в обох підгрупах (р<0.05).

Слід зазначити, що при розподілі ліквідаторів в залежності від дози опромінення за документами середня частота транслокацій та інсерцій не розрізнялася поміж групами з дозами 48-200 мГр (2.07 на 100 клітин), 250 мГр (2.25 на 100 клітин) та 300-978 мГр (2.21 на 100 клітин).

У мешканців РЗТ спостерігали позитивну залежність сумарної частоти транслокацій та інсерцій від рівня забруднення місцевості радіонуклідами ¹³⁷Cs, що супроводжувалося вірогідними відмінностями за даним показником між групою R₂ і регресією контроля (р<0.001), а також між групами R₂ і R₁ (р<0.05), при тому, що середня частота дицентриків і кілець, відповідно, становила 0.13 і 0.08 на 100 клітин у групах з місцевостей з меншим та більшим рівнем забруднення.

Закономірності “доза-ефект” для виходу цитогенетичних пошкоджень в лімфоцитах крові людини при дії г-випромінення в низьких дозах in vitro

Дозова залежність виходу нестабільних аберацій. За результатами класичного хромосомного аналізу було встановлено, що в клітинах культури лімфоцитів людини після г-опромінення in vitro в діапазоні 0.0-1.0 Гр від джерела ⁶⁰Со відбувалося дозозалежне зростання частоти дицентриків, кілець і вільних хромосомних фрагментів, на тлі відсутності змін частоти аберацій хроматидного типу і геномних порушень (табл. 6).

Таблиця 6

Вихід цитогенетичних пошкоджень в лімфоцитах крові людини під дією г-випромінення ⁶⁰Со в низьких дозах in vitro

Примітка: SE - стандартна похибка середнього; Диц фр - дицентрики з супутніми фрагментами; ЦК фр - центричні кільця з супутніми фрагментами; Хс Фр - вільні хромосомні фрагменти; А Хт - аберації хроматидного типу; ГП - геномні порушення.

Закономірність “доза-ефект” для виходу аберацій хромосомного типу відповідала лінійно-квадратичній моделі

Y = c +бD + вD ², (2),

де Y - частота аберацій, с - спонтанний рівень, б і в - коефіцієнти регресії, D - доза опромінення. Коефіцієнти рівнянь “доза-ефект” для різних показників представлено в табл. 7.

Таблиця 7

Коефіцієнти рівнянь “доза-ефект” та їх стандартні похибки (SE) для виходу нестабільних аберацій хромосом в лімфоцитах крові людини при г-опроміненні

При побудові кривих in vitro не було виявлено жодних ознак плато у виході аберацій в діапазоні 100-250 мГр. Наведені коефіцієнти регресії для дицентриків виявилися найбільш близькими до параметрів усередненого рівняння “доза-ефект” за результатами міжнародного проекту ЕСР-6, в межах якого здійснювався експеримент. Розрахунки за рівняннями табл. 7 засвідчили, що дворазове зростання частоти вільних хромосомних фрагментів відносно спонтанного рівня можна очікувати при дозі г-опромінення 110 мГр, а частоти дицентриків і кілець - при дозі 30 мГр, що визначало практичну чутливість методу для біодозиметрії.

Дозові залежності виходу цитогенетичних пошкоджень, які виявлялися методом FISH. Результати визначення частоти аберацій хромосом, детектованих методом FISH в донорських лімфоцитах після опромінення крові in vitro, наведені в табл. 8, а відповідні лінійно-квадратичні рівняння “доза-ефект” - в табл. 9. Коефіцієнти дозової регресії для дицентриків і кілець при FISH-дослідженні співпали з одержаними за даними класичного хромосомного аналізу. Це вказало на рівномірну залученість FIТС-забарвлених хромосом у формування обмінів відповідно до їх сумарної довжини і засвідчило адекватність екстраполяції частоти аберацій з обраних комбінацій хромосом (6, 9, 15, 21 та 1, 2, 4) на весь геном за формулою Лукаса. У випадку транслокацій позитивна кореляція з дозою визначалася для перебудов t_comp, t_inc(Аb), t_inc(Ba*) і t_inc(Ba+ас). Для рівня аберацій, що супроводжувалися втратою частини FIТС-забарвленої хромосоми - t_inc(BaМР) і делетованих хромосом - залежності від дози <...