Варіабельність рДНК деяких видів роду gentiana L. У природі та в культурі in vitro

Andreev I.O., Spiridonova K.V., Mel'nyk V.M., Solovyan V.T. Do DNA rearrangements in cultured plant cells represent random events or provide realization of natural genome variability? // Ukrainian-U.K. Workshop on Plant Biotechnology “Biotechnology approaches to engineering plant growth”. Yalta, Ukraine, 14-16 March 2004. - Yalta, 2004. - P. 7-8.

АНОТАЦІЯ

Мельник В.М. Варіабельність рДНК деяких видів роду Gentiana L. у природі та в культурі in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2005.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню варіабельності рибосомної ДНК видів роду Gentiana L. у природі та в культурі in vitro. В результаті проведення комплексу експериментальних робіт отримано нові дані стосовно варіабельності рДНК деяких видів роду Gentiana L. Показано наявність індивідуальної та міжпопуляційної варіабельності 18S-25S рДНК для виду G.lutea, а також міжвидового поліморфізму ДНК, і рДНК зокрема, для чотирьох досліджуваних видів роду Gentiana L. (G.acaulis, G.asclepiadea, G.lutea, G.punctata). За допомогою проведеного картування 18S-25S рибосомної ДНК тирличів встановлено, що виявлені відмінності довжини повторів рДНК зумовлені варіабельністю в ділянці нетранскрибованого міжгенного спейсера, тоді як транскрибовані частини 18S-25S рДНК є консервативними в усіх видів. Показано, що геноми клітин видів роду Gentiana L. (G.acaulis, G.lutea, G.punctata) при культивуванні в умовах in vitro зазнають змін на молекулярному рівні. Встановлено, що зміни 18S-25S рДНК G.lutea в умовах ізольованого росту клітин на штучних живильних середовищах не виходять за рамки внутрівидової мінливості. Виявлена закономірність геномних перебудов у процесі адаптації клітин до умов росту in vitro в певній мірі дає можливість прогнозувати ці зміни в культурі in vitro.

Ключові слова: види роду Gentiana L., культура in vitro, рДНК, рестрикційне картування, блот-гібридизація, міжгенний спейсер, геномна мінливість, індивідуальна, міжпопуляційна та міжвидова варіабельність.

Мельник В.Н. Вариабельность рДНК некоторых видов рода Gentiana L. в природе и в культуре in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертационная работа посвящена исследованию вариабельности рибосомной ДНК видов рода Gentiana L. в природе и в культуре in vitro. В результате проведения комплекса экспериментальных работ получено новые данные, касающиеся вариабельности рДНК некоторых видов рода Gentiana L. Показано наличие индивидуальной и межпопуляционной вариабельности 18S-25S рДНК для вида G.lutea, а также межвидового полиморфизма ДНК, и рДНК в частности, для четырех изучаемых видов рода Gentiana L. (G.acaulis, G.asclepiadea, G.lutea, G.punctata). С помощью проведенного картирования 18S-25S рибосомной ДНК горечавок установлено, что выявленные отличия длины повторов рДНК обусловлены вариабельностью в области нетранскрибированного межгенного спейсера, тогда как транскрибированные части 18S-25S рДНК являются консервативными у всех видов. Показано, что геномы клеток видов рода Gentiana L. (G.acaulis, G.lutea, G.punctata) при культивировании в условиях in vitro подвергаются изменениям на молекулярном уровне. Установлено, что изменения 18S-25S рДНК G.lutea в условиях изолированного роста клеток на искусственных питательных средах не выходят за рамки внутривидовой изменчивости. Выявленная закономерность геномных перестроек в процессе адаптации клеток к условиям роста in vitro в определенной степени дает возможность прогнозировать эти изменения в культуре in vitro.

Ключевые слова: виды рода Gentiana L., культура in vitro, рДНК, рестрикционное картирование, блот-гибридизация, межгенный спейсер, геномная изменчивость, индивидуальная, межпопуляционная и межвидовая вариабельность.

Mel'nyk V.M. Variability of rDNA of some Gentiana L. species in nature and in culture in vitro. - Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D) in Biology, speciality 03.00.15 - genetics. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

Dissertation is devoted to investigation of Gentiana L. species rDNA variability in nature and in in vitro conditions. We have studied the details of culture initiation in vitro for Gentiana L. species (G. acaulis L, G. asclepiadea L., G. lutea L., G. punctata L.). Conditions for root, stem and leaf originated calli induction and culture have been chosen. Optimal composition (phytohormone and СаСl₂ levels) and pH values of nutrient medium were shown to vary with species, specific natural environments of particular population and type of original explant. We found that callus formation from root and stem explant is promoted most effectively by MS/2 medium supplemented with BAP and 2,4-D in 1:5 ratio. Long-term maintained callus cultures of G.acaulis L, G.lutea L., G.punctata L. were obtained.

By means of restriction analysis we have performed a comparative study of the intact plants Gentiana L. species, cultured cells G.lutea and G.punctata genomes. Species specificity of restriction fragment patterns for studied representatives of genus Gentiana L. were revealed. We have observed differences between electrophoretic patterns of digested DNA purified from rhizome and leaf G.lutea and G.punctata. The changes in genomes of G.lutea and G.punctata cells cultured in vitro were detected as compared to the intact plant genomes.

The restriction maps of 18S-25S ribosomal DNA from 4 species of Gentiana L. were constructed based on the results of blot-hybridization. Some features of structural organization of Gentiana 18S-25S rDNA were revealed: 1) interspecies and intragenomic variability of rDNA repeat length; 2) conservatism of transcribed region; 3) variability of non-transcribed spacer with respect to length and location of HindIII-site; 4) interspecies variability in copy number. Comparison of restriction maps of Gentiana species and some other plants showed their similarity in location of restriction endonuclease cleavage sites in transcribed region of 18S-25S rDNA.

Our data evidence the absence of qualitative rearrangements of HindIII, BamHI, EcoRI, TaqI restriction fragments set of 18S-25S rDNA in G.punctata and G.acaulis tissue culture in comparison with those of intact plant. Therewith, the decrease copy number of rDNA in in vitro culture as compared to the intact plant was shown.

It is shown that the 18S-25S rDNA from various populations of intact plant and tissue cultures G.lutea is different by size as well as by presence of additional HindIII site. Generally, the genome of individual plant involves several variants of 18S-25S rDNA repeat. Variability in proportion of the 18S-25S rDNA variants within the plant genomes from different populations also was found. Callus tissues as compared with the plant from the original population appear to exhibit changes in the set of the rDNA repeat variants, which however failed to extend beyond the limits of intraspecies variability.

The 5S rRNA genes were studied in cultured cells and different plant tissues of Gentiana L. species. Interspecies polymorphism of the genes revealed. We did not found significant rearrangements of 5S rDNA in culture in vitro. The variation in DNA hydrolysis was revealed in cultured cells as well as in differentiated tissues from different plant organs.

The revealed feature, i.e. non-randomness of the genome changes in the course of cell adaptation to growth conditions in vitro, would make it possible to a certain degree anticipate these changes occurrence in tissue culture.

According to our data it is possible to use G.acaulis, G.lutea, G.punctata tissue cultures and growth conditions for conservation of the germ-plasm of this rare medicinal plants of Ukrainian Carpathians.

Key words: species of genus Gentiana L., in vitro culture, rDNA, restriction mapping, blot-hybridization, nontranscribed spaser, genome variation, individual, interpopulation and interspecies variability.

Размещено на Allbest.ru