Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози

Аналіз механізмів підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у нормі та при експериментально викликаному цукровому діабеті. Обґрунтування адекватності стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету як моделі ксеростомії.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 26.08.2014
Размер файла 105,3 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru

1

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Федірко Наталія Вікторівна

удк 612.014.42:612.31:591.431.2

МЕХАНІЗМИ ПІДТРИМАННЯ КАЛЬЦІЄВОГО ГОМЕОСТАЗУ В АЦИНАРНИХ КЛІТИНАХ ПІДЩЕЛЕПНОЇ СЛИННОЇ ЗАЛОЗИ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства науки і освіти України та Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Наукові консультанти:

академік НАН України, доктор біологічних наук

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділом загальної фізіології нервової системи

доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету ім. Івана Франка

Офіційні опоненти:

академік НАН України, доктор біологічних наук

Магура Ігор Сільвестрович,

Фізико-технічний навчально-науковий центр НАН України, професор кафедри молекулярної фізіології та біофізики, член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м'язів Інституту біохімії імені О.В.Палладіна НАН України

доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

завідувач відділом цитофізіології науково-дослідного Інституту фізіології імені Петра Богача Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

гомеостаз ацинарний клітина слинний діабет

Провідна установа: Київський національний медичний університет імені О.О.Богомольця

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад. Богомольця, буд. 4.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Слина - важливий фактор підтримання здорового стану органів ротової порожнини (Zachariasen, 1996). Вона характеризується прямою бактерицидною, антивірусною та антигрибковою активністю, що сприяє нормальному функціонуванню слизової оболонки ротової порожнини, відіграє роль у формуванні смакових відчуттів, жуванні та мовленні (Jensen et al., 2004). Зменшення слиновиділення та зміни складу слини є причиною підвищення ймовірності карієсу, периодонтологічних захворювань та патологій слизової оболонки ротової порожнини (Porter et al., 2004). Відчуття сухості у роті (ксеростомія), зумовлене пригніченням здатності клітин слинних залоз синтезувати та виводити слину, є симптомом багатьох захворювань або побічним ефектом дії лікарських препаратів. Ксеростомія супроводжує С'йогрен синдром, цукровий діабет, радіаційне опромінення ділянок голови чи шиї, хемотерапію та ін. (Porter et al., 2004). Однак, незважаючи на чисельні клінічні дані, клітинні механізми розвитку ксеростомії залишаються нез'ясованими. Враховуючи це, дослідження механізмів, що опосередковують патологічні зміни функціонування слинних залоз є важливим завданням сучасної фізіології.

У ссавців секреція рідкої слини (як базальна, так і стимульована) для зволоження ротової порожнини здійснюється в основному підщелепною слинною залозою (Foskett et al., 1989). Враховуючи це, виникненя ксеростомії вірогідно пов'язане із порушенням функціонування ацинарних клітин саме цієї залози. Також відомо, що синтез і секреція компонентів слини є Са2+-залежними процесами, які регулюються змінами концентрації вільного кальцію в цитоплазмі ([Са2+]i) та ендоплазматичному ретикулумі ([Са2+]ЕР) (Ambudkar, 2001). Виходячи з цього, порушення кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози є вірогідною причиною розвитку ксеростомії. Підтримання гомеостазу кальцію досягається за рахунок узгодженого функціонування Са2+-транспортних систем плазматичної мембрани та внутрішньоклітинних органел та їх взаєморегуляції. Проте дані про зміни кальцієвого гомеостазу при ксеростомії, а також навіть щодо механізмів взаємодії між Са2+-транспортними системами ацинарних клітин за фізіологічних умов практично відсутні, хоча очевидно, що вони відіграють ключову роль у регуляції слиновиділення.

Таким чином, вивчення механізмів [Са2+]i та [Са2+]ЕР сигналізації, вкладу у їх модуляцію інших внутрішньоклітинних органел, таких як мітохондрії, та їх взаємодії між собою зробить вагомий крок до більш детального визначення ролі кальцієвого гомеостазу та внутрішньоклітинних регуляторних органел у процесах слиновиділення та дасть змогу підняти на новий рівень методи терапії дисфункцій слинних залоз.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової тематики кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка: науково-дослідних тем БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100 O 001452, БЛ-114Б “Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872, а також за сприяння Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Об'єкт досліджень - кальцієвий гомеостаз в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.

Предмет досліджень - механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.

Методи досліджень - фізіологічні тести, біофізичні, біохімічні, електронно-мікроскопічні та статистичні методи досліджень.

Мета роботи. Мета виконаної роботи полягала у вивченні механізмів взаєморегулюючого функціонування Са2+-транспортних систем плазматичної мембрани, ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій, а також їх вкладу в підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози в нормі та за умов ксеростомії.

Завдання дослідження

1. Визначити особливості перебігу [Са2+]і сигналізації при холінергічній стимуляції ацинарних клітинах підщелепної слинної залози та вклад різних Са2+- транспортних систем у формування [Са2+]і сигналів.

2. Вивчити перебіг [Са2+]і сигналізації при активації пуринорецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.

3. Розробити методичний підхід для прямої реєстрації концентрації іонізованого Са2+ в ЕР на моделі хімічно пермеабілізованих ацинарних клітин для дослідження кальцієвого гомеостазу всередині Са2+ депо.

4. Вивчити властивості ІnsР3-чутливого депо ЕР та механізми регуляції його функціонування за участю інших Са2+-транспортних систем.

5. Визначити роль ріанодинових рецепторів у [Са2+]і сигналізації в ацинарних клітинах та участь інших Са2+-транспортних систем в її модуляції.

6. Дослідити механізм пасивного витоку кальцію з ЕР ацинарних клітин.

7. Визначити параметри депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини та фізіологічну роль інших Са2+-транспортних систем у його регулюванні.

8. Довести адекватність стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету як моделі ксеростомії шляхом визначення основних паметрів слиновиділення у здорових щурів та тварин із експериментально викликаним діабетом.

9. Провести порівняльний аналіз перебігу [Са2+]і сигналізації при холінергічній стимуляції ацинарних клітин підщелепної слинної залози здорових щурів і тварин хворих на діабет.

10. Виявити зміни Са2+ сигналізації всередині ЕР та мітохондрій ацинарних клітин при експериментально викликаному діабеті.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше проведено комплексний аналіз перебігу [Са2+]і сигналізації в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози при активації холіно- та пуринорецепторів. Доведено адекватність використання моделі хімічно пермеабілізованих клітин для прямої реєстрації концентрації Са2+ в ЕР та вперше зареєстровано [Ca2+]ЕР транзиєнти в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Вивчено характеристики InsP3-чутливого депо Са2+, особливості модуляції його активності та гетерогенність в ацинарних клітинах. Вперше доведено наявність функціонально-активних ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози, вклад яких у [Са2+]і сигналізацію визначається функціонуванням мітохондрій та Са2+-АТФаз. Вперше одержано фізіологічні та електронно-мікроскопічні свідчення на користь колокалізації мітохондрій, Са2+-АТФаз та ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Вперше показано, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози транслоконовий комплекс ЕР є основним механізмом пасивного вивільнення Са2+ з ЕР. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са2+ та вперше доведено фізіологічну роль мітохондрій у його підтриманні. Показано, що трансмітохондріальне переміщення Са2+ є необхідним для перезаповнення кальцієм депо ЕР.

У роботі вперше одержано докази на користь того, що в основі розвитку ксеростомії при цукровому діабеті лежать зміни гомеостазу Са2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Вперше показано зростання базального рівня [Са2+]і та порушення перебігу [Са2+]і сигналізації при холінергічній стимуляції ацинарних клітин за умов діабету. Виявлено, що за умов діабету пригнічується функціонування Са2+-транспортних систем ЕР, посилюється пасивний витік Са2+ через транслоконовий комплекс та активується додатковий шлях вивільнення Са2+ із мітохондрій. Розроблено гіпотезу, згідно якої посилення пасивного витоку Са2+ з ЕР та зменшення активності Са2+-АТФаз лежать в основі зменшення в ЕР кількості Са2+, здатного вивільнятися при стимуляції, що призводить до пригнічення слиновиділення, а виявлене підвищення чутливості холінорецепторів та споріденості Са2+-АТФази ЕР до ATP є природніми протекторними механізмами для компенсування діабет-індукованих порушень у клітинах слинних залоз.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані результати мають як фундаментальне, так і практичне значення. Комплексний аналіз механізмів підтримання гомеостазу кальцію розширює розуміння шляхів регуляції функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози та є новим кроком до з'ясування причин виникнення патологій слинних залоз. Практична цінність одержаних результатів полягає в тому, що вони вперше вказують на те, що порушення функціонування ацинарних клітин корелює із змінами кальцієвого гомеостазу. Отримані в роботі дані та їх інтерпретація можуть стати основою для теоретичних та практичних рекомендацій при розробці методів терапії та фармакологічної корекції порушення функціонування слинних залоз. На основі одержаних результатів є підстави вважати, що потужні агоністи холінорецепторів та речовини, які модулюють їх активність, можуть бути використані для корекції ксеростомічних станів у хворих на діабет. Отримані дані використовуються при викладанні загальних курсів „Фізіологія людини і тварин”, „Біофізика” та спецкурсів „Фізіологія травлення”, „Клітинні механізми регуляції обміну речовин” у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно сформулювала мету та завдання дослідження, розробила методики вимірювання сумарного вмісту кальцію з одночасною реєстрацією рівня секреторної активності, ізолювання ацинарних клітин, реєстрації концентрації Са2+ в цитоплазмі та ЕР цих клітин. Дисертант самостійно виконувала основну частину експериментів, здійснювала аналіз, статистичне опрацювання й узагальнення результатів. Разом із к.б.н Вац Ю.О розробила методики одержання фракції мембранних везикул клітин слинної залози та визначення у ній активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕР. Разом з к.б.н. Копач О.В. налагодила методику хімічної пермеабілізації та прямої реєстрації концентрації Са2+ в ЕР ацинарних клітин. Деякі експерименти були проведені разом з іншими спіавторами опублікованих робіт - молодшим науковим співробітником к.б.н. Кругликовим І.А., старшим науковим співробітником к.б.н. Півневою Т.А., провідним науковим співробітником Інституту фізіології ім. О. Богомольця д.б.н. Войтенко Н.В., к.б.н. Вац Ю.О., к.б.н. Копач О.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення дисертації були представлені на: школі-семінарі “Мембрани і сигнали” (Київ, 2000 р.), З'їзді Британського фізіологічного товариства (Ліверпуль, 2001), 23му Міжнародному Конгресі фізіологічних наук (Крайсчерч, 2001 р.), 4тій Конференції Чеського Нейрофізіологічного товариства (Прага, 2001 р.), Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинна сигналізація в рослинних та тваринних системах” (Київ, 2001 р.), 16му З`їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002 р.), III з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002 р.), 47му з'їзді Біофізичного товариства (Сан-Антоніо, 2003 р.), 33му з'їзді Товариства Нейронаук (Новий Орлеан, 2003), 3му Конгресі FEPS (Ніцца, 2003 р.), науковій конференції “Сечєнов та Одеська школа фізіологів” (Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO “Receptors, Channels, Messengers” (Ялта, 2004 р.), І Українській конференції “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики” (Xapків, 2004 р.), регіональному біофізичному з'їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), 25му Міжнародному фізіологічному конгресі (Сан-Дієго, 2005 р.), XV Міжнародному біофізичному конгресі (Монтпельєр, 2005 р.), семінарах кафедри фізіології людини і тварин та звітних конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка (2002-2005 рр.), а також на міжкафедральному семінарі біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка та засіданні сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім.О.Богомольця у липні 2005 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 24 статті у фахових наукових журналах та 29 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 381 сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: „Вступ”, „Огляд літератури”, „Методи досліджень”, „Результати досліджень”, „Обговорення результатів досліджень”, „Висновки” та „Список використаних джерел”, який містить 510 посилань. Робота ілюстрована 118 рисунками та 8 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар у віці 1-1,5 міс. Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком експерименту тварину наркотизували внутрішньо-очеревною ін'єкцією кетаміну та лістенону. Слину, яка виводилась протоками підщелепної слинної залози, відбирали за допомогою мікроканюлі, впритул підведеної до проток залози. Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення, б-амілолітичною активністю слини, вмісту у ній загального білка.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 320 од/мг), протягом 25-30 хв (35 С). Базовий зовнішньоклітинний розчин містив (у мМ): NaCl - 140; KCl - 4,7; CaCl2 - 1,3; MgCl2 - 1,0; гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) - 10; глюкоза - 10; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка. Сумарний вміст кальцію в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично з використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу полягає у тому, що іони Са2+ утворюють з арсеназо III комплекс синього кольору, інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са2+ у пробі. Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг білка, який визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію загального білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті та супернатанті.

Реєстрація [Са2+]i в ацинарних клітинах. [Са2+]i в ацинарних клітинах реєстрували з використанням високоафінного флуоресцентного Са2+ барвника фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин інкубували у базовому розчині, який містив 5 мкМ фура-2/АМ, протягом 30-40 хв при 35 С, після чого відмивали базовим розчином і додатково інкубували протягом 30 хв для повної деетерифікації барвника. Для розрахунку [Ca2+]i використовували формулу Грінкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i = Kd · B · (R - Rmin) / (Rmax - R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9, Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нМ (Grynkiewicz et al., 1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Для пермеабілізації ацинарних клітин використовували детергенти дигітонін та -есцин. Концентрацію детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально. Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до внутрішньоклітинного (НДВ), який містив (у мМ): KCl - 120; NaCl - 20; MgSO4 - 2; HEPES - 10; АТР - 3; EGTA - 1; CaCl2 - 0,75; рН 7,2. Концентрація іонізованого Са2+, розрахована за допомогою програми “WinMAXC v2.10” (Chris Patton, Stanford University), у такому розчині НДВ становила ~100 нМ. Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20 мкг/мл) становила 2-5 хв у всіх експериментах за виключенням окремо згадуваних з -есцином (40 мкг/мл) - 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин контролювали візуально з використанням трипанового синього (0,4 %) під світловим мікроскопом MP-3, а у випадку маг-фура-2/АМ-зафарбованих клітин оцінювали за падінням флуоресцентного сигналу Са2+-барвника.

Реєстрація [Ca2+]ЕР в ацинарних клітинах. Для моніторингу концентрації Са2+ в ЕР ацинарні клітини завантажували низькоафінним флуоресцентним Са2+ барвником маг-фура-2/АМ. Фарбування клітин проводили протягом 45-60 хв при 37 С, що забезпечує компартменталізацію барвника у внутрішньоклітинних органелах (Hofer & Machen, 1993). Для вимивання цитоплазматичної частки барвника проводили хімічну пермеабілізацію клітин. Зміни [Ca2+]ЕР виражали як співвідношення інтенсивності флуоресцентного сигналу маг-фура-2/АМ на довжині хвилі збудження 360 нм до такої на 390 нм (F360/F390), яке прямо пропорційне змінам [Ca2+]ЕР (Hofer & Machen, 1994).

Одержання фракції мембранних везикул. Мембранні везикули підщелепної слинної залози щурів одержували методом диференційного центрифугування. Залозу гомогенізували у буферному розчині, який містив (мМ): сахароза - 250,0; ЕДТА - 1,0; трис-Сl - 10,0 (рН=7.1, t=4С); оуабаїн - 1,0; NaN3 - 1,0. Гомегенат відцентрифуговували (10 хв при 1600 g та 30 хв при 40000 g), кінцевий супернатант видаляли, а осад розводили буферним розчином та зберігали при t=-40оС (Hurley & Martinez 1985). Топологію мембранних фрагментів визначали після їх обробки розчином дигітоніну (0,1 %). Електронно-мікроскопічно показано, що фракція мембранних фрагментів підщелепної слинної залози представлена замкнутими в площині везикулами діаметром 0,5±0,04 мкм (n=89).

Визначення активності Са2+-АТФаз. Аліквоти мембранних везикул переносили у розчин НДВ, який містив в мМ: NaCl - 50,0; KCl - 100,0; трис-Сl - 20,0 (рН=7.4, t=37 С); MgCl2 - 3,0; CaCl2 - 0,01. АТФ-гідролазну реакцію ініціювали додаванням 3 мМ АТФ і через 1,5 хв реакцію зупиняли додаванням 200 мкл 20% трихлороцтової кислоти. Вміст пробірок відцентрифуговували (10 хв, 1600 g) і в супернатанті фотоколориметрично визначали концентрацію Рі (Nakamura et al., 2002). Вміст білка мембранного препарату визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951). Активність Са2+-АТФаз розраховували як різницю між АТФазною активністю в Са2+-вмістному та безкальцієвому середовищах. Сумарну Са2+-АТФазну активність розділяли на тапсигаргін-нечутливу (Са2+-АТФаза ПМ) та -чутливу (Са2+-АТФаза ЕР) складові. Активність АТФаз виражали у мкмоль Рі/год·мг білка.

Метод індукції експериментального діабету. Діабет викликали внутрішньоочеревинною ін'єкцією стрептозотоцину (СТЗ), розчиненого в 0,9% NaCl (80 мг/кг маси тіла тварини). СТЗ-ін'єктовані та контрольні тварини того ж віку утримували на однаковій дієті. Тварин використовували в експерименті через 3-5 тижнів після ін'єкції СТЗ. Концентрація глюкози в плазмі крові здорових тварин становила 5-9 мМ, у хворих на стрептозотоцин-індукований діабет - 14-28 мМ.

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували (12 год, 20оС) у суміші глютаральдегіду (2%) та параформальдегіду (2%), приготовлених на 0,1 М фосфатному буфері (рН=7,2-7,4). Дофіксацію проводили в 1% OsO4 у фосфатному буфері (1 год, 20оС). Фіксовані клітини тричі промивали буферним розчином по 10 хв. Зразки зневоднювали у зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу (аралдит) при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи (60-70 мкм) отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB, Швеція) і контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату. Дослідження проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія) при 80 кВ із збільшенням 5000-40000.

Статистична обробка результатів. Оригінальні записи [Ca2+]і та [Ca2+]ЕР опрацьовували за допомогою програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичне опрацювання результатів здійснювали з використанням Microsoft Excel, аналіз змін співвідношення F360/F390 проводили за допомогою Microcal Origin. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Са2+ сигналізація при активації холінорецепторів. Секреція рідинного компоненту слини знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем, який реалізується медіатором ацетилхоліном (АХ). Зв'язування АХ із холінорецепторами ПМ призводить до підвищення [Са2+]і за рахунок вивільнення Са2+ з депо та входу ззовні (Petersen et al., 2005). Однак, незважаючи на інтенсивне дослідження окремих процесів, які опосередковують [Ca2+]і сигналізацію в ацинарних клітинах, механізми їх взаємодії залишаються нез'ясованими.

Характеристики АХ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів. В стані спокою [Ca2+]i в ацинарних клітин підщелепної слинної залози становаить 954 нМ (n=124). Аплікація (10 с) до клітин АХ (5 мкМ) викликала [Ca2+]i транзиєнти з амплітудою 215±22 нМ (n=124, рис. 1А). Амплітуда другого АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту була меншою за першу на 15%, а при наступних прикладаннях АХ _ не змінювалась (n=8), що свідчить про відсутність швидкої десинситизації холінорецепторів. Розрахована ЕС50 для АХ складала 0,830,06 мкМ (рис. 1В,Г), причому АХ викликав глобальне підвищення [Ca2+]i незалежно від діючої концентрації (рис. 1В). Аплікація АХ на фоні атропіну (10 мкМ) приводила до зменшення [Ca2+]i транзиєнтів на 79±5% (n=8, p<0.001), що свідчить про основний вклад у їх формування мускаринових (М) холінорецепторів. При тривалій аплікації АХ (5 мкМ, 5 хв) виникав [Ca2+]i транзиєнт тієї ж амплітуди, що й при короткочасному прикладанні, однак не спостерігалось відновлення [Ca2+]i до вихідного рівня протягом дїї АХ (n=5, рис. 1Б). Новий стаціонарний рівень [Ca2+]i в присутності АХ може відображати надходження в Са2+ цитоплазму через депо-керовані Са2+ канали ПМ. Ряд ефективності агоністів М-холінорецепторів можна розташувати у наступній послідовності: АХ > карбахолін (КХ) > пілокарпін. Розрахована ЕС50 для КХ (негідролізуємого аналогу АХ) складала 4,70,6 мкМ.

Механізми формування АХ-індукованих [Ca2+] транзиєнтів. Для багатьох типів незбудливих клітин доведено, що при активації М-холінорецепторів формування висхідної фази [Ca2+]і транзиєнтів забезпечується тільки за рахунок вивільнення Са2+ із депо ЕР (Ambudkar, 2001; Clapham et al., 2001). З метою вивчити вклад у формування амплітудно-часових параметрів АХ-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів саме процесу вивільнення Са2+ із депо ЕР порівняно із входом Са2+ ззовні, ми прикладали до клітин АХ за умов безкальцієвого середовища (1 мМ ЕГТА). З'ясувалось, що на відміну від кальційвмісного середовища, внаслідок багаторазового прикладання АХ відбувалось значне зменшення амплітуди АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнтів та їх зникнення після 4-5 прикладань АХ (рис. 2А). Довготривала аплікація АХ (5 мкМ, 5 хв) за умов безкальцієвого середовища призводила до появи [Ca2+]і транзиєнту, проте на відміну від такого у Са2+-вмісному розчині, спостерігалось відновлення початкового рівня [Ca2+]і навіть у присутності АХ (рис. 2Б). Час напівспаду такого [Ca2+]і транзиєнту складав 36±7 с (n=15). Таким чином, за умов неможливості перезаповнення депо ЕР АХ здатний повністю спустошувати доступний для вивільнення запас Са2+ в ЕР. Для оцінки вкладу перезаповнення депо Са2+ у АХ-індуковані [Ca2+]і транзиєнти ми блокували Са2+-АТФазу ЕР (SERCA), яка є єдиною системою транспорту Са2+ в ЕР (Putney, 1985; Berridge, 2004). Для цього ми використовували блокатори SERCА: реверсивний - циклопіазонова кислота (СРА) та незворотний - тапсигаргін (TG). Ми виявили, що обидва блокатори викликали зростання [Ca2+]i ~100 нМ (n=10), яке характеризувалось виходом на плато та зберігалось протягом усього часу присутності блокатора. В присутності СРА АХ-індуковані [Ca2+]i транзиєнти зменшувались: перший на 31±8%, другий на 56±9%, а наступна дія АХ не викликала змін [Ca2+]і (n=8). Після відмивання СРА АХ-індуковані [Ca2+]i транзиєнти відновлювались до початкової амплітуди. При використанні незворотнього блокатора TG було виявлено зміни аналогічного характеру, за виключенням більш вираженого пригнічення амплітуди першого АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту (на 75±8%, n=8, рис. 3Б). Отже, переважний внесок у формування АХ-індукованих [Ca2+]і відповідей належить процесу вивільнення Са2+ з ЕР.

За умови що вивільнення Са2+ з депо ЕР є єдиним механізмом формування [Ca2+]і відповідей, не повинно було б спостерігатись відмінностей абсолютної амплітуди та форми АХ-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних у Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах.

Однак, виявлено: і) амплітуда АХ-індукованої [Ca2+]і відповіді в безкальцієвому розчині зменшувалась на 36±9% (n=19; p<0,001, рис. 4А); іі) час напівзростання АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту складав 1,6±0,2 с та 1,1±0,1 с в Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах відповідно (n=19; p<0,001); ііі) час напівспаду складав 12±1 с та 6,2±0,6 с відповідно (рис. 4Б). Виявлені відмінності можуть бути зумовлені тільки активацією входу Са2+ ззовні, єдиним механізмом якого є депо-керований вхід Са2+ (Putney, 1986). З метою візуалізувати такий вхід Са2+ ми прикладали АХ (5 мкМ) у безкальцієвому середовищі, а після завершення АХ-індукованої [Ca2+]і відповіді додавали до зовнішньоклітинного розчину Са2+ (2 мМ). При цьому відбувалось швидке зростання [Ca2+]і з амплітудою 97±13 нМ та часом напівзростання 19,74,2 с (n=12, рис.5). Підсумовуючи, ми вважаємо, що хоча ІnsP3-індуковане вивільнення Са2+ з ЕР є первинним процесом, який ініціює появу АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту, однак, його амплітудно-часові параметри визначаються суперпозицією двох процесів: вивільнення Са2+ з ЕР та більш повільного депо-керованого надходження Са2+ ззовні, яке активується вже під час висхідної фази [Ca2+]i транзиєнту.

Вклад мітохондрій у регулювання АХ-індукованої [Ca2+]і сигналізації. Відомо, що мітохондрії (МХ) також є депо Са2+, однак захоплення Са2+ низькоафінним Са2+-уніпортером ізольованих МХ активується лише при [Ca2+] 1 мкМ (Gunter et al., 2004). Враховуючи це, вклад МХ в АХ-індуковану [Ca2+]і сигналізацію та взаємодія МХ з іншими механізмами формування [Ca2+]і сигналів є незрозумілим. Для пригнічення захоплення Са2+ МХ ми використовували СCCP (10 мкМ) - протонофор, який порушує потенціал внутрішньої мембрани МХ, або ротенон (1 мкМ) - інгібітор комплексу І ланцюга транспорту електронів в комбінації з олігоміцином (1 мкМ) - інгібітором АТФ-синтази. Нами виявлено, що припинення Са2+-акумулюючої функції МХ призводить до зростання [Ca2+]і з амплітудою ~37 нМ, а блокування Na+/Ca2+-обмінника МХ за допомогою CGP 37157 (20 мкМ) на фоні СССР не призводить до змін [Ca2+]i. Отже, в стані спокою МХ містять певну кількість Са2+, єдиним механізмом вивільнення якого є Na+/Ca2+-обмінник. Аплікація АХ (5 мкМ) на фоні блокування захоплення Са2+ МХ призводить до зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів на 346% (рис. 6А) та часу їх напівзростання на 5912% (p<0,001; n=24). З метою з'ясувати, чи здійснюють МХ захоплення Са2+ під час висхідної фази АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту ми прикладали СССР одразу після досягнення піку [Ca2+]i транзиєнту. Виявилось, що за таких умов виникає додаткове транзиєнтне підвищення [Ca2+]i з амплітудою 14732 нМ (n=15, рис. 6Б) в Са2+-вмісному та 389,6 нМ (n=15, рис. 6В) в безкальцієвому середовищі. Таке підвищення [Ca2+]i свідчить про потужне захоплення Са2+ МХ вже під час висхідної фази [Ca2+]i. Менш виражене СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i на спаді АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту у безкальцієвому розчині ми пов'язуємо із відсутністю за цих умов входу Ca2+ ззовні. Оскільки АХ активує депо-керований вхід Са2+, ми припускаємо, що МХ розташовані близько до SOC каналів, що дає їм змогу захоплювати Са2+ безпосередньо з-під ПМ. З іншого боку, за умов відсутності захоплення Са2+ МХ порушується здатність АХ викликати [Ca2+]i транзиєнт.

Отже, МХ відіграють важливу роль у формуванні амплітудно-часових характеристик АХ-індукованих [Ca2+]i відповідей, що обумовлено їх здатністю захоплювати як Са2+, що входить ззовні, так і регулювати InsP3-залежне вивільнення Са2+ із депо ЕР.

2. Роль пуринергічних рецепторів у [Ca2+]i сигналізації. Незважаючи на те, що секреція рідинного компоненту слини знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем, існують дані про ймовірну роль зовнішньоклітинних нуклеотидів у регулюванні функціонування ацинарних клітин слинних залоз (Soltoff et al. 1998; Turner et al. 1999).

Вклад Р2Х та Р2Y рецепторів у формуванні АТФ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів. Доведено, що у клітинах підщелепної слинної залози експресуються іонотропні Р2Х та метаботропні Р2Y нуклеотидні рецептори (Park & Turner 1998, Bruce et al. 2005), проте їх вклад у [Ca2+]i сигналізацію залишається нез'ясованим. Ми показали, що аплікація (10 с) АТФ (100 мкМ) у Са2+-вмісному середовищі викликала [Са2+]i транзиєнти з амплітудою 115±20 нМ (n=18), які не десенситизувались при кількаразовій дії АТФ. Розраховане ЕС50 для АТФ становило 130±36 мкМ (рис. 7А,Б). Прикладання АТФ (100 мкМ) на фоні блокатора іонотропних Р2Х рецепторів РРАDS (50 мкМ) призводило до зменшення амплітуди [Ca2+]і транзиєнту на 72±7% (n=9; p<0,05; рис.7В). Аплікація АТФ у безкальцієвому середовищі та при блокуванні SERCA (за неможливості перезаповнення депо ЕР) призводила до появи [Ca2+]і транзиєнтів з амлітудою на 65±7 % (n=10, p<0,001) нижчою. Прикладання ж АТФ (100 мкМ) після попереднього спустошення Са2+-депо ЕР внаслідок 20-ти хв дії TG (3 мкМ) у безкальцієвому середовищі не супроводжувалось змінами [Ca2+]і (n=10). Одержані дані свідчать про вклад у формування АТФ-індукованих [Са2+]і сигналів як Р2Х, так і P2Y рецепторів. Активація кожного із цих рецепторів призводить до підвищення [Са2+]і, однак основний вклад у амплітуду АТФ-індукованих [Са2+]і сигналів вносять Р2Х рецептори, а P2Y-опосередковане підвищення [Са2+]і є менш вираженим і складає ~ 35 %.

Вклад аденонозинових (Р1) рецепторів у [Ca2+]i сигналізацію. Лімітуючим фактором активності АТФ є її швидкий гідроліз, який здійснюється екто-АТФазою, ідентифікованою у ПМ клітин підщелепної слинної залози (Murphy et al., 1994). При гідролізі АТФ швидко розпадається до АДФ > АМФ > аденозину (Gordon, 1986). Аденозин активує окремий підтип пуринорецепторів - Р1, вклад яких у процеси [Ca2+]i сигналізації нез'ясований. Ми виявили, що аденозин (1 мкМ) не викликає достовірних змін [Ca2+]і (n=5), проте ефективно потенціює [Ca2+]і транзиєнти, викликані активацією М-холінорецепторів. Так, прикладання АХ (200 мкМ) разом з аденозином (1 мкМ) викликає зростання амплітуди [Ca2+]і транзиєнтів на 43±12% (n= 6; p<0,05) порівняно з дією лише АХ (рис. 8А). Прикладання АХ (500 нМ) разом з аденозином викликало потенціацію АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту на 58±7% (n=9, p<0,05).

Однак, ми не спостерігали потенціюючого ефекту аденозину на [Ca2+]і транзиєнти, викликані субмаксимальною концентрацією АХ (рис. 8А).

Потенціюючий ефект аденозину не залежав від способу активації М-холінорецепторів, оскільки спостерігався також при дії КХ. Зокрема, амплітуда [Ca2+]і транзиєнту, викликаного КХ (5 мкМ) на фоні аденозину, зростала на 26±6% (n=7, p<0,001, рис. 8Б). Потенціюючий ефект аденозину відтворювався форсколіном (активатором аденілат циклази (АЦ)). Так, аплікація АХ (500 нМ) на фоні форсколіну (2 мкМ) призводила до збільшення амплітуди АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту на 32±5% та маскувала ефект аденозину (n=5, p<0,001, рис. 8В). Отже, активація Р1 рецепторів ацинарних клітин підщелепної слинної залози призводить до модулювання PLC-InsP3 сигнального шляху, яке, найбільш ймовірно, опосередковане активацію АЦ.

3. Механізми функціонування внутрішньоклітинних депо Са2+. Механізми підтримання гомеостазу кальцію у внутрішньоклітинних депо остаточно нез'ясовано, що обумовлено складністю проведення таких досліджень через вибіркову проникність ПМ. З метою вивчити властивості та регуляцію функціонування Са2+ депо в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози ми розробили методику для прямої реєстрації амплітудно-часових параметрів змін концентрації іонізованого Са2+ в люмені ЕР ([Ca2+]ЕР) у хімічно пермеабілізованих клітинах, завантажених низькоафінним Са2+ індикатором маг-фура-2/АМ, який акумулюється у депо ЕР.

Тапсигаргін-чутлива та -нечутлива складові Са2+ депо ЕР. Питання щодо функціональної організації депо Са2+ на сьогодні залишається відкритим. Для деяких типів клітин показано, що основне депо Са2+ в ЕР утворене просторово розмежованими одиницями (Golovina & Blaunstein, 1997). Для виявлення можливої гетерогенності депо Са2+ у ацинарних клітинах досліджуваної залози ми підібрали умови для максимального спустошення депо ЕР та АХ. При дослідженні динаміки зміни сумарного вмісту кальцію виявлено, що кількість кальцію, який вивільняється при блокуванні SERCA тапсигаргіном (3мкМ) протягом 20 хв, складає ~30% від загального його вмісту у депо. Для з'ясування чи мішенню дії TG і АХ є одне і те ж депо Са2+, ми спустошували депо TG, після чого інкубували клітини з АХ. Виявилось, що 10-ти хв дія АХ (5 мкМ) викликала додаткове зменшення сумарного вмісту кальцію на 277% (р<0,01; n=9), яке повністю елімінувалось блокатором ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+ гепарином (300 мкг/мл). За допомогою флуоресцентної реєстрації [Ca2+]і нами також зареєстровано АХ-індуковані [Ca2+]і транзиєнти після 20-ти хв інкубації клітин з TG (рис. 4В). Останнє свідчить про те, що TG не повністю спустошує ІnsР3-чутливе депо Са2+, що підтверджується шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР. Зокрема, виявлено, що: і) інгібітор TG-нечутливої Са2+-АТФази - ванадат (Pinton et al., 1998) викликав додаткове зменшення [Ca2+]ЕР на фоні TG; іі) АХ (5 мкМ) також викликав додаткове зменшення [Ca2+]ЕР на фоні TG, яке не спостерігалось на фоні ванадату. Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявне TG-чутливе та -нечутливе Са2+ депо, обидва з яких є ІnsР3-залежні.

Властивості ІnsР3-чутливого депо Са2+. Основний вклад у формування [Ca2+]і сигналів при активації М-холінорецепторів належить InsP3-індукованому вивільненню Ca2+ з ЕР (Petersen, 1996; Fedirko et al., 2001), проте супроводжуючі його процеси [Ca2+]ЕР сигналізації вивчені недостатньо. Для дослідження цього ми провели реєстрацію змін [Са2+]ЕР при активації М-холінорецепторів ПМ АХ та при дії екзогенного InsP3. Ми показали, що АХ (5 мкМ) викликав транзиєнтне вивільнення Са2+ з ЕР, що виражалось у зменшенні співвідношення F360/F390 на 0,1±0,02 (n=23). Екзогенний ІnsP3 також викликав транзиєнтне зменшення [Ca2+]ЕР з ЕС50=1,30,21 мкМ (n=23, рис. 9А,Б). Викликане АХ та InsP3 зменшення [Ca2+]ЕР повністю пригнічувалось гепарином (300 мкг/мл), а отже, опосередковане активацією тільки InsP3-рецепторів. Ми також показали, що InsP3-чутливе вивільнення Са2+ із ЕР потенціюється Са2+ в фізіологічних концентраціях (100-400 нМ) та модулюється АТФ. Зокрема, АТФ в низьких концентраціях (1 мМ) потенціював InsP3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР на 27± 4,6% (n=6, p<0,01), а у високих (20 мМ) - пригнічував на 15±2,6% (n=6, p<0,05). Ми також виявили, що сумісна дія InsP3 (2 та 20 мкМ) та кофеїну (4 мМ) призводила до потенціювання [Са2+]ЕР транзиєнтів на 65±12% (р<0,01; n=8) та 41±10% (n=7, р<0,05) відповідно (рис. 10). Ми вважаємо, що можливим механізмом такого потеціювання є активація кофеїном ріанодинових рецепторів (RYR) мембрани ЕР.

Ідентифікація ріанодин-чутливого вивільнення Ca2+ з ЕР. У клітинах підщелепної слинної залози молекулярно-біологічними методами виявлено експресію RyR (Giannini et al., 1995; Lee et al., 1997), проте здатність ріанодинових рецепторів здійснювати вивільнення Са2+ із ЕР у досліджуваних клітинах не виявлено.

Для індукування вивільнення Са2+ через канал RyR ми використовували кофеїн (Sitsapesan & Williams, 1990). Ми виявили здатність кофеїну викликати транзиєнтне зменшення [Ca2+]ЕР у пермеабілізованих клітинах з ЕС50 7,31 мМ (рис. 11А), яке було нечутливим до гепарину та дзвоноподібно регулювалось Са2+ (з максимумом при фізіологічних концентраціях 100-400 нМ). Ріанодин у високих концентраціях (100 мкМ, рис.11Б) блокував кофеїн-індуковане вивільнення Са2+, а в середніх (10 мкМ) - переводив канал RYR в напіввідкритий стан (n=6). Таким чином, шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР ми показали, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонують RyR, активація яких призводить до вивільнення Ca2+ з ЕР.

Цитоплазматична [Cа2+]і сигналізація при активації RYR. Виявлене нами на пермеабілізованих клітинах кофеїн-індуковане вивільнення Ca2+ із ЕР повинно супроводжуватись відповідним ростом [Cа2+]і. Однак нами, як і іншими авторами (Seo et al., 1997), не було виявлено достовірних змін [Ca2+]i в інтактних клітинах при аплікації 10-40 мМ кофеїну (рис. 12А). Відсутність [Ca2+]i відповіді на кофеїн не може бути зумовлена відсутністю в ЕР кальцію, здатного до вивільнення, оскільки наступна аплікація АХ викликала [Ca2+]i транзиєнт значної амплітуди (рис. 12А). Можливою причиною відсутності змін [Ca2+]i при кофеїн-індукованому вивільненні Са2+ з ЕР є його швидке захоплення внутрішньоклітинними органелами, розташованими безпосередньо біля RyR.

Роль МХ та Са2+-АТФаз у кофеїн-індукованій [Ca2+]i сигналізації. Ми виявили, що аплікація кофеїну (30 мМ) на фоні припинення захоплення Са2+ МХ призводила до зростання [Ca2+]i на 484 нМ (n=8, p< 0.001, рис. 12Б). Однак таке зростання [Ca2+]i було нетранзиєнтним, на відміну від відповідного зменшення [Ca2+]ЕР, що свідчить про вклад додаткових систем в формування кофеїн-індукованого [Ca2+]i транзиєнту. Для виявлення вкладу Са2+-АТФази ПМ ми використовували блокатор широкого спектра Са2+-АТФаз - ванадат, який у низьких концентраціях (10 мкМ) эфективно блокує Са2+-АТФазу ПМ (Carafoli, 1991). Виявилось, що ванадат викликає нетранзиєнтне підвищення [Ca2+]i на 255 нМ (n=11), прикладання ж кофеїну на фоні ванадату не супроводжувалось подальшими змінами [Ca2+]i, проте наступна аплікація СССР (10 мкМ) викликала потужне транзиєнтне зростання [Ca2+]i на 18439 нМ (n=5, p<0.001).

Для дослідження вкладу SERCA, ми використовували її блокатор _ TG (3 мкМ). Прикладання кофеїну на фоні TG не викликало достовірних змін [Ca2+]i, однак наступна аплікація СССР (10 мкМ) призводила (як і у випадку блокування Са2+-АТФази ПМ) до потужного транзиєнтного зростання [Ca2+]i на 19149 нМ (n=5, p<0.01). Отже, блокування тільки Са2+-АТФази ПМ чи ЕР не відображається на процесі швидкого захоплення Са2+, а Са2+, який вивільняється із RyR захоплюється МХ. На основі цього ми припустили, що у визначенні кінетики кофеїн-індукованої [Ca2+]i відповіді беруть участь одночасно декілька Са2+-транспортних систем. Для перевірки цієї гіпотези ми аплікували до ацинарних клітин кофеїн на фоні попарного блокування МХ та Са2+-АТФази ПМ чи ЕР. Виявилось, що аплікація СССР (10 мкМ) на фоні блокування Са2+-АТФази ПМ ванадатом (10 мкМ) приводить до зростання [Ca2+]i на 7919 нМ, а наступне прикладання кофеїну (30 мМ) супроводжується виникненням [Ca2+]i транзиєнта з амплітудою 17668 нМ (n=6, p<0.001, рис. 13А). В свою чергу, прикладання СССР на фоні TG викликало зростання [Ca2+]i на 19339 нМ, а наступна аплікація кофеїну (30 мМ) також викликала появу транзиєнтної [Ca2+]i відповіді з амплітудою 13740 нМ (n=6, p<0.001, рис. 13Б). Отже, у ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявні функціонально активні RYR, причому Са2+, який вивільняється при їх активації захоплюється в основному МХ, тоді як Са2+-АТФази ПМ та ЕР відповідають за визначення форми [Ca2+]i сигналу.

Механізм пасивного вивільнення Са2+ із ЕР. В стані спокою вміст Са2+ всередині депо ЕР визначається балансом між активним захопленням Са2+ SERCA та його пасивним вивільненням через “канали витоку” (Hofer et al., 1996). Наявність пасивного витоку можна візуалізувати шляхом блокування компенсаторного захоплення Са2+ SERCA. Пригнічення захоплення Са2+ SERCA можна досягнути за умов: i) перфузії клітин безкальцієвим НДВ-розчином для пригнічення прямого (але не реверсивного) режиму SERCA; ii) блокування обох режимів роботи SERCA тапсигаргіном. Найбільш виражене зменшення F360/F390 з амплітудою 0,113±0,036 (n=5) та лінійною швидкістю 0,68Ч10-2 хв-1 було зареєстроване при активації реверсивного режиму роботи SERCA шляхом перфузії клітин безкальцієвим розчином (рис. 14А). За умов блокування обох режимів роботи SERCA тапсигаргіном ми виявили залежність амплітуди та швидкості пасивного витоку від наявності Са2+ в омиваючому ЕР розчині. Зокрема, у Са2+-вмісному (100 нМ) розчині НДВ, який містило TG, [Ca2+]ЕР зменшувалась на 0,75±0,037 (n=8) зі швидкістю 0,4Ч10-2 хв-1 (n=8, рис. 14А). У безкальцієвому середовищі таке зменшення було більш вираженим (на 0,96±0,017) і швидким (0,84Ч10-2 хв-1; n=10, рис. 14А). Це свідчить про наявність SERCA-залежного (~35%) та -незалежного (~65%) компонентів пасивного витоку Са2+, причому SERCA-незалежний компонент пропорційний градієнту [Са2+]. Останнє може свідчити на користь того, що пасивний витік кальцію здійснюється через неселективну пору. Враховуючи, що SERCA-незалежне вивільнення Са2+ виявилось нечутливим до інгібіторів InsP3- та ріанодинових рецепторів _ гепарину (300 мкг/мл) та рутенієвого червоного (10 мкМ), воно не опосередковується жодним із зазначених механізмів вивільнення Са2+ із ЕР. З іншого боку, пасивне вивільнення Са2+ індукувалось антибіотиком пуроміцином (0,1-1 мМ), який від'єднує новоутворені поліпептиди від рибосомально-ЕР транслоконового комплексу (Simon & Blobel, 1991). Таке пуроміцин-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину, рутенієвого червоного. Крім того, ефект пуроміцину не пов'язаний із зменшенням активності SERCA, оскільки він потенціює ефект тапсигаргіну, підвищуючи вдвічі швидкість тапсигаргін-індукованого витоку Са2+ із ЕР (n=5, рис. 14Б). Пуроміцин-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР пригнічувалось анізоміцином (200 мкМ) - інгібітором пептидил трансферази та витоку Са2+ через транслоконовий комплекс (рис.14В). Таким чином, основним механізмом пасивного вивільнення Са2+ з ЕР є його витік через транслоконовий комплекс ЕР.

4. Депо-керований вхід Са2+ в ацинарні клітини. Депо-керований вхід Са2+, який активується при спустошенні ЕР, є основним шляхом перезаповнення депо, а також підвищення [Ca2+]і у незбудливих клітинах (Putney, 1986; Parekh & Penner, 1997), проте механізми такого входу остаточно нез'ясовані. Для візуалізації депо-керованого входу Са2+ ми стимулювали клітини агоністами у безкальцієвому розчині для спустошення Са2+ депо ЕР, після чого додавали до розчину Са2+ (2 мМ). В першу чергу, ми довели, що інкубування клітин у безкальцієвому середовищі pеr se незалежно від тривалості не призводить до активації входу Са2+. Спустошення депо ЕР внаслідок блокування SERCA тапсигаргіном (3 мкМ) викликає потужний вхід Са2+ у клітини (n=10, p<0,01; табл. 1, рис.15). Такий депо-керований [Ca2+]і транзиєнт на 6912% (n=5, рис. 15) пригнічувався блокатором SOC-каналів ПМ _ 2-АРВ (50 мкМ) (Bootman et al., 2002).

...

Подобные документы

  • Управління обміном вуглеводів. Математичний аналіз системи регуляції рівня кальцію в плазмі. Основна модель регуляції обміну заліза у клітинах. Управління обміном білків, жирів і неорганічних речовин. Баланс тепла в організмі. Регуляція температури тіла.

    реферат [25,9 K], добавлен 09.10.2010

  • Предмет, структура та основні поняття біофізики і біосистем. Об’єкти дослідження фізики клітинних процесів. Жива клітина – основна форма життя. Мембранний транспорт речовин у клітинах. Механізми активного транспорту речовин через біологічні мембрани.

    реферат [305,7 K], добавлен 10.02.2011

  • Кальцій як біологічний елемент, його роль для здоров'я людини. Функції та фізіологічні перетворення кальцію в організмі. Клінічні прояви і вплив на структури вмісту кальцію в організмі, гіпокальціємічні стани: лікування і профілактика. Препарати кальцію.

    курсовая работа [47,4 K], добавлен 21.09.2010

  • Утворення лізосом шляхом взаємодії комплексу Гольджі і гранулярної ендоплазматичної сітки. Історія їх відкриття та основні особливості. Розщеплення чужих речовин до речовин самої клітини, які наявні у клітинах грибів та тварин. Ферментний склад лізосом.

    презентация [162,3 K], добавлен 15.12.2013

  • Загальна характеристика гемоглобінової системи в крові риб та її роль в підтриманні гомеостазу організму. Стан системи гемоглобіну (крові) за дії екстремальних факторів довкілля, температури, кислотних дощів. Токсикологічна характеристика інсектицидів.

    дипломная работа [358,7 K], добавлен 16.09.2010

  • Зовнішня та внутрішня будова миші хатньої. Постачання всіх органів і тканин поживними речовинами, киснем, виведення з них продуктів життєдіяльності. Органи чуття, дотику, слуху і рівноваги. Залози внутрішньої секреції. Видові відмінності терморегуляції.

    курсовая работа [967,7 K], добавлен 19.10.2013

  • Загальновизнана гіпотеза походження води Світового океану. Роль води в житті людини. Підтримання постійної температури організму. Аномалії води. Кругообіг води в природі. Жива вода. Мінеральна вода. Срібна вода. Тала вода. Активована вода.

    реферат [35,9 K], добавлен 03.01.2007

  • Загальні закономірності діяльності залоз внутрішньої секреції. Роль підзгірно-гіпофізарної системи в процесах саморегуляції функції ендокринних залоз. Поняття про гормони та їх вплив на обмін речовин. Гормональна функція кори надниркових залоз.

    реферат [59,6 K], добавлен 29.11.2009

  • Кросинговер як явище обміну ділянками гомологічних хромосом після кон’югації у профазі-1 мейозу. Аналіз проміжних структур в сумчастих грибів. Основні способи розділення структур Холлідея. Розгляд особливостей молекулярних механізмів кросинговеру.

    курсовая работа [1,8 M], добавлен 12.03.2013

  • Біологія розвитку, видовий склад перетинчастокрилих. Розміри, голова, крила, груди, черевце та ротові органи. Центральна нервова система. Статеві залози самок. Копулятивний (совокупний) орган самців. Роль суспільних комах в біоекології півдня України.

    курсовая работа [1,6 M], добавлен 11.07.2015

  • Сальні та потові залози, їх будова та функції. Епіфіз, його роль у птахів і ссавців як нейроендокринного перетворювача. Зв'язок епіфізу з порушеннями у людини добового ритму організму. Регуляція біологічних ритмів, ендокринних функцій та метаболізму.

    контрольная работа [18,3 K], добавлен 12.07.2010

  • Розгляд загальних положень механізму трансформації бактерій, рослин та тварин. Дослідження трансформації листових дисків тютюну шляхом мікроін’єкцій. Методика отримання трансформованих пагонів, їх підтримання і розмноження за допомогою брунькових пазух.

    курсовая работа [349,3 K], добавлен 15.10.2014

  • Характеристика компонентів адгезивної міжклітинної комунікації олігодендроцитів та нейронів. Класифікація неоплазій, що виникають у головному мозку ссавців. Патологія міжклітинних контактів гліоцитів і нейронів при дисембріогенетичних новоутвореннях.

    курсовая работа [2,3 M], добавлен 31.01.2015

  • Порушення гомеостазу в організмі внаслідок гемопаразитарної інвазії. Методи оцінки стану організму. Ступень напруження адаптаційних процесів Pelophylax ridibundus, що інвазовані гемопаразитами. Застосування інтегральних індексів лейкоцитарної формули.

    статья [999,7 K], добавлен 21.09.2017

  • Компоненти якірних контактів еритроцитів. Представники інтегринової родини. Адгезивні компоненти системи білка Rac-1. Рецепторно-опосередкована взаємодія типу "ліганд-рецептор". Патологія міжклітинних контактів при гострому еритромієлозі. Білок смуги 3.1.

    курсовая работа [4,2 M], добавлен 31.01.2015

  • Розташування грибів роду та ознаки, покладені в основу систематики. Морфологічні особливості вегетативних та репродуктивних стадій. Біологічні особливості основних видів роду. Джерела інфекції та шляхи їх розповсюдження. Механізми мінливості патогенів.

    курсовая работа [1,4 M], добавлен 16.03.2014

  • Будова і рівні регуляції репродуктивної системи ссавців. Доімплантаційний розвиток та роль стероїдних гормонів в імплантаційних процесах. Фізіологічні та молекулярні механізми імплантації. Роль білкових ростових факторів у становленні вагітності.

    реферат [48,8 K], добавлен 09.02.2011

  • Сутність і визначення основних понять учення про інфекцію. Інфекційна хвороба як крайній ступінь розвитку патологічного процесу, етапи її розвитку. Характеристика збудників. Класифікація мікроорганізмів за їх впливом на організм, механізми їх передачі.

    контрольная работа [149,2 K], добавлен 20.01.2017

  • Позиція валеології – людина як система. Три рівні побудови цієї системи. Біологічне поле людини. Індійська та китайська системи. Механізми валеогенезу - автоматичні механізми самоорганізації людини задля формування, збереження та закріплення здоров’я.

    контрольная работа [20,9 K], добавлен 09.01.2009

  • Вміст цинку у земній корі і грунті. Концентрації і значення цинку у живій речовині. Характеристика проявів патологічних змін від нестачі та надлишку вмісту кальцію в організмах людини та рослин. Передозування цинку у кормах тварин і його наслідки.

    курсовая работа [5,7 M], добавлен 05.05.2015

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.