Загалом, проведені дослідження дають змогу розширити фундаментальне розуміння механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у нормі та їх зміни при патологічних станах слинних залоз, а також може бути використане для розробки нових клінічних методів їх корекції.

Висновки

У представленій роботі відповідно до поставленої мети та завдань дослідження проведено комплексний аналіз механізмів підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у нормі та при експериментально викликаному цукровому діабеті. З одержаних результатів зроблено наступні висновки:

1. Природній медіатор парасимпатичної нервової системи АХ незалежно від концентрації викликає глобальне транзиєнтне (неосциляторне) підвищення [Ca²⁺]_i, яке ефективно пригнічується блокатором М-холінорецепторів атропіном. Амплітудно-часові параметри [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са²⁺ із внутрішньоклітинних депо, надходження Са²⁺ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР Са²⁺-АТФазою вже під час висхідної фази [Ca²⁺]_і транзиєнту.

2. Важлива роль у регуляції процесу АХ-індукованого вивільнення Са²⁺ з ЕР належить МХ, які попереджують Са²⁺-залежну інактивацію InsP₃ рецепторів за механізмом позитивного зворотного зв'язку, що можливо завдяки їх просторовій колокалізації з ЕР, яку показано методом електронної мікроскопії.

3. У ПМ ацинарних клітин підщелепної слинної залози наявні функціонально активні пуринорецептори Р1 та Р2 типів. Активація Р1 рецепторів аденозином не призводить до змін [Ca²⁺]_і, проте супроводжується потенціацією [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, в основі якої лежить цАМФ-залежна модуляція ФЛЦ-InsP₃ сигнального шляху, оскільки цей ефект відтворюється за умов прямої активації АЦ. Активація Р2 рецепторів АТФ викликає [Ca²⁺]_і транзиєнти з ЕС₅₀=13636 мкМ. Природа АТФ-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів переважно іонотропна, а вклад метаботропних Р2Y рецепторів складає ~ 35%.

4. Шляхом прямої реєстрації амплітудно-часових змін концентрації іонізованого Ca²⁺ всередині ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози вперше показано, що як АХ, так і екзогенний ІnsР₃ викликають транзиєнтне вивільнення Са²⁺ з ЕР, яке повністю пригнічується блокатором ІnsР₃ рецепторів - гепарином. ІnsР₃-чутливе вивільнення Са²⁺ із ЕР дзвоноподібно залежить від Са²⁺ з максимумом в межах його фізіологічних концентрацій у цитоплазмі (100-400 нМ), потенціюється АТФ у низьких (<1 мМ) концентраціях і пригнічується - у високих. Кофеїн модулює ІnsР₃-чутливе вивільнення Са²⁺ із ЕР шляхом конкуретної взаємодії з АТФ-зв'язуючим центром молекули рецептора.

5. Вперше показано вклад ріанодинових рецепторів у [Ca²⁺]_i сигналізацію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Активація ріанодинових рецепторів кофеїном призводить до транзиєнтного зменшення [Ca²⁺]_ЕР (ЕС₅₀=7,31,1 мМ), яке блокується ріанодином, дзвоноподібно залежить від Са²⁺ (з максимумом при 100 нМ), однак не супроводжуться виникненням генералізованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів в інтактних клітинах. Це зумовлено швидким захопленням Са²⁺, який вивільняється із ріанодинових рецепторів, мітохондріями та частково Са²⁺-АТФазами EР чи ПМ. Шляхом прямої реєстрації [Ca²⁺]_ЕР, [Ca²⁺]_i та методом електронної мікроскопії одержано докази колокалізації ріанодинових рецепторів, мітохондрій та Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР.

6. Вперше доведено наявність постійного пасивного витоку Са²⁺ із ЕР ацинарних клітин, який за фізіологічних умов компенсується рівноважним захопленням кальцію Са²⁺-АТФазою ЕР. Пасивне вивільнення Са²⁺ не опосередковується ІnsР₃ та ріанодиновими рецепторами, або реверсивним режимом роботи Са²⁺-АТФази, а здійснюється через транслоконовий комплекс мембрани ЕР.

7. Депо-керований вхід Са²⁺ є основним шляхом надходження Са²⁺ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози, активація якого відбувається незалежно від способу спустошення депо ЕР (InsP₃-залежного чи InsP₃-незалежного). Амплітуда депо-керованого входу Са²⁺ пропорційна мірі спустошення ЕР, а однакова кінетика розвитку депо-керованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів незалежно від способу спустошення ЕР свідчить про єдиний механізм їх виникнення.

8. Вперше показано, що МХ визначають амплітудно-часові параметри депо-керованого входу Са²⁺, здійснюючи контроль за станом депо-керованих каналів ПМ шляхом попередження їх Са²⁺-залежної інактивації за механізмом позитивного зворотного зв'язку. Блокування Са²⁺-уніпортеру мітохондрій призводить до пригнічення входу Са²⁺ як у випадку InsP₃-незалежного, так і InsP₃-чутливого способу спустошення депо. Блокування захоплення Са²⁺ мітохондріями при InsP₃-чутливому спустошенні ЕР викликає більш виражене пригнічення депо-керованого входу Са²⁺, що відображає як регуляцію мітохондріями безпосередньо каналів ПМ, так і додатково InsP₃ рецепторів. Така регуляція можлива завдяки просторовій локалізації мітохондрій безпосередньо під ПМ та оточених ламелами ЕР, що показано методом електронної мікроскопії.

9. Вперше показано, що транс-мітохондріальне переміщення Са²⁺ є необхідним для підтримання депо-керованого входу Са²⁺ та процесу перезаповнення депо ЕР. Вклад МХ в перезаповнення депо ЕР залежить від тривалості стимуляції клітин. За умов спустошенння ЕР короткочасною дією АХ, його перезаповнення здійснюється, в основному, за рахунок прямого захоплення Ca²⁺ в EР і, додатково, за рахунок транс-мітохондріального транспорту Са²⁺. За умов тривалої стимуляції клітин, депо-керований вхід Са²⁺ здійснюється лише у ділянках колокалізації ПМ та МХ, які захоплюють Са²⁺ з-під вустя SOC каналів. Кальцій, захоплений МХ, після транс-мітохондріального переміщення вивільняється до ділянок його захоплення Са²⁺-АТФазою ЕР, що і відображає єдиний механізм перезаповнення ЕР у присутності InsP₃.

10. В експериментах по визначенню параметрів слиновиділення in vivo виявлено, що у щурів із СТЗ-індукованим діабетом істотно знижується швидкість слиновиділення, активність амілази та концентрація білка слини порівняно до таких у контрольних тварин.

11. Вперше виявлено зміни гомеостазу кальцію у ацинарних клітинах підщелепної слинної залози за умов СТЗ-індукованого діабету. Показано зростання [Са²⁺]_і в стані спокою, чутливості М-холінорецепторів до АХ та КХ та зниження активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР. Виявлені зміни є причиною розвитку цитоплазматичної кальцієвої перегрузки та сповільненої кінетики спаду [Са²⁺]_і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів.

12. Вперше виявлено, що за умов діабету порушується гомеостаз кальцію у Са²⁺ депо таких як ЕР та МХ. Показано зменшення вивільнення Са²⁺ із ЕР незалежно від механізму його активації (агоніст-, ІnsР₃- чи кофеїн-індукованого, або рецептор-незалежного). Також виявлено зростання пасивного вивільнення кальцію через транслоконову пору ЕР. Виявлені зміни свідчать про зменшення кількості Са²⁺ в ЕР. За умов діабету виявлено відсутній у здорових тварин шлях пасивного вивільнення Са²⁺ із мітохондрій, опосередкований порою перемінного проникнення. Комплекс змін кальцієвого гомеостазу, виявлений нами в мітохондріях та ЕР, є найбільш ймовірною причиною пригнічення процесів синтезу та секреції компонентів слини при діабеті.

13. Загалом, одержані дані свідчать про те, що підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітин підщелепної слинної залози забезпечується за рахунок комплексної взаємодії між Са²⁺-регулюючими системами ПМ, ЕР та мітохондрій. Взаємодія між Са²⁺-регулюючими системами здійснюється за рахунок процесів зворотної взаєморегуляції, можливих завдяки їх просторової колокалізації. Порушення функціонування систем підтримання гомеостазу кальцію є ймовірною причиною розвитку патологічних станів слинних залоз.

СПИСОК СТАТЕЙ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Kopach O.V., Vats Ju.O., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Сhanges in functioning of rat submandibular salivary gland under streptozotocin-induced diabetes are associated with alterations of calcium signaling and calcium transporting pumps // Biochem. Biophys. Acta. - 2006. - Vol. 1762, № 3. - Р.294-303.

2. Копач О.В., Кругликов І.А., Костюк П.Г., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Властивості інозитолтрифосфат-чутливого депо Ca²⁺ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. - 2006. - Т. 52, № 1. - С. 30-40.

3. Федірко Н.В., Копач О.В., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. АТФ-індукована кальцієва сигналізація в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози //Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2005. - Т. 37, № 5/6. - С. 395-402.

4. Федірко Н.В., Копач О.В., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. Модулюючий вплив аденозинових Р1 пуринорецепторів на кальцієву сигналізацію, викликану активацією холінорецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози // Вісн. Харк. ун-ту ім. В.Н.Каразіна, № 716. Біофіз.вісник. - 2005. - Вип. 2 (16). - С. 75-79.

5. Копач О.В., Кругликов И.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федирко Н.В. Механизмы утечки кальция из эндоплазматического ретикулума экзокринных клеток // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2005. - Т. 37, № 4. - С. 339-346.

6. Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Тапсигаргінчутливе та нечутливе внутрішньоклітинне кальцієве депо в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. - 2005. - Т. 51, № 1. - С. 62 -70.

7. Вац Ю.О., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Кінетичні характеристики Са²⁺, Mg²⁺-ATPаз клітин підщелепної слинної залози щурів // Укр. біохім. журнал. - 2004. - Т. 76, № 6. - С. 44-54.

8. Копач О.В., Федірко Н.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. Зміни функціонування підщелепної слинної залози щурів за умов експериментально-індукованого діабету // Клінічна та експериментальна медицина. - 2004. - Т. 3, № 2. - С. 462-463.

9. Пасович О.Б., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Зміни внутрішньоклітинного вмісту Са²⁺ в екзокринних клітинах підщелепної слинної залози щурів за гіперкалієвої деполяризації їх мембрани // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 35. - С. 236-244.

10. Пасович О.Б., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Адренергічна регуляція Са²⁺-гомеостазу та секреторної активності підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія Біологічна. - 2004. - Вип. 38. - С. 171-177.

11. Копач О.В., Федірко Н.В. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин слинних залоз при дії агоністів холінергічної природи // Вісник Львівського ун-ту. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 37. - С. 205-212.

12. Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федірко Н.В. Пермеабілізовані клітини слинних залоз, як модель для вивчення кальцій-транспортних систем мембрани ендоплазматичного ретикулуму // Фізіол. журнал. - 2003. - Т. 49, № 5. - С. 31-42.

13. Fedirko N., Kopach O., Kruglikov I., Kostyuk P., Voitenko N. Imaging of intrareticular calcium concentration in permeabilized cells // Neurophysiology. 2003. - Vol. 35, № 3/4. - P. 345-346.

14. Пасович О.Б., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Стаціонарний та депо-керований вхід кальцію у секреторні клітини підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2003. - Вип. 32. - С. 195-202.

15. Федирко Н.В., Вац Ю.А., Kригликов И.A., Войтенко Н.В. Изменения функционирования Са²⁺-АТФаз экзокринных клеток крыс при экспериментальном диабете // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2003. - Т. 35, № 5. - С. 355-360.

16. Fedirko N., Vats Ju., Klevets M., Kruglikov I., Voitenko. N. Neuronal control of the exocytosis and calcium homeostasis // Neurophysiology. - 2002. - P. 144-147.

17. Вац Ю., Федирко Н., Клевец М., Войтенко Н., Роль SH-групп в функционировании кальций-транспортных АТФаз, регулирующих кальциевый гомеостаз и экзоцитоз // Нейрофизиология/Neurophysiology.- 2002.- Т. 34, № 1. - С. 7-17.

18. Федірко Н.В., Вац Ю.О., Клевець М.Ю. Ідентифікація Са²⁺-активованої, Mg²⁺-залежної АТФ-ази мікросомальної фракції мембран секреторних клітин ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2002. - Вип. 28. - С. 303-310.

19. Petersen O.H., Fedirko N.V. Calcium signalling: store-operated channel found at last // Current Biology. - 2001. - Vol. 11, № 13. - P. 520-523.

20. Федірко Н.В., Клевець М.Ю., Кругліков І.А., Вац Ю.О. Зміни концентрації катіонів кальцію у секреторних клітинах ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів під впливом ацетилхоліну та норадреналіну // Біофізичний вісник. - 2001. - Т. 1(8), № 525.- С. 54-57.

21. Fedirko N., Klevetz M., Kruglikov I., Voitenko N. Mechanisms supporting calcium homeostasis in rat submandibular salivary gland acinar cells // Neurophysiology. - 2001. - Vol. 33, № 4. - Р. 252-259.

22. Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Вплив еозину Y і ортованадату на базальну секрецію та стаціонарний вхід Ca²⁺ у секреторні клітини екзокринних залоз // Фізіол. журнал. - 2000. - Т. 46, № 6. - С. 3-9.

23. Fedirko N., Klevets M., Vats Ju. Isolated acini as an object for the investigation of the Ca²⁺-transporting system of the secretory cell membranes // Neurophysiology.- 2000.- Vol. 32, № 3 - P. 183-184.

24. Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Докази cтаціонарного входу Ca²⁺ у клітини слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. larvae та його роль у базальній секреції // Фізіол. журнал. - 1999. - Т. 45, № 4. - Р. 84-91.

Матеріали доповідей на конференціях:

1. Kopach О., Kruglikov І., Рivneva Т., Voitenko Н., FedirkoН. Role of mitocondria and Ca²⁺-ATPases in Ca²⁺ signalling induced by activation of ryanodine receptors in rat submandibular acinar cells // Biophysicаl J. - 2006. - Vol. 90 - P. 2552.

2. Fedirko N.V., Kopach O.V., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Store-operated Ca²⁺ entry is regulated by mitochondria in acinar cells of rat submandibular salivary gland // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International Biophysics Congress, August 27-Sept. 1 2005, Montpellier, France. - Europ. Biophys. J. - 2005. - Vol. 34, № 6. - Р. 544.

3. Kopach O.V., Voitenko N.V., Fedirko N.V. Basal Ca²⁺ leak from endoplasmic reticulum of sub-mandibular acinar cells // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International Biophysics Congress, August, 27 - Semp. 1 2005, Montpellier, France. - Europ. Biophys. J. - 2005. - Vol. 34, № 6. - Р. 803.

4. Копач О.В., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Депо-керований вхід кальцію у секреторні клітин щурів // III конференція Українського товариства нейронаук, 22-25 травня 2005, м. Донецьк. - Донецьк. - 2005. - С. 58.

5. Kopach O., Kruglikov I., Voitenko N., Fedirko N. Caffeine-induced changes of Ca²⁺ homeostasis in rat submandibular salivary cells // Regional Biophysics Meeting, 16-20 March 2005, Zrece, Slovenija. - 2005.- P. 42.

6. Копач О.В., Федірко Н.В., Войтенко Н.В. Функціонування кофеїн-чутливого Са²⁺ депо ендоплазматичного ретикулуму у секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи”, 7-9 жовтня 2004 р., м. Львів. - Львів. - 2004. - С. 37.

7. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Дослідження ролі адренорецепторів в регуляції секреторної активності та Са²⁺-гомеостазу в клітинах підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи”. - Львів, 7-9 жовтня, 2004. - С. 60.

8. Копач О.В., Федірко Н.В. Тапсигаргін-індуковані зміни Са²⁺-гомеостазу у секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // І Українська наукова конференція “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики”, 20-22 вересня 2004 р., м. Харків. - Xapків. - 2004. - С. 143.

9. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Вплив агоністів та антагоністів адренорецепторів на кальцієвий гомеостаз в ізольованих секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // І Українська наукова конференція “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики”. - 20-25 вересня, 2004. Харків. - Xapків. - 2004. - С. 116.

10. Копач О., Федірко Н., Кругліков І., Войтенко Н., Костюк П. Пуринергічна внутрішньоклітинна Са²⁺-сигналізація у ацинарних клітинах слинних залоз щурів // Установчий з'їзд українського товариства клітинної біології, 25-28 квітня 2004 р., м. Львів. - Львів. - 2004. - С. 35.

11. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу в клітинах підщелепної слинної залози щурів під впливом норадреналіну // Установчий з'їзд українського товариства клітинної біології. - 25 - 28 квітня, 2004, м.Львів. - Львів. - 2004. - С. 36.

12. Kopach O.V., Kruglikov I.A., Kostyuk P.G., Fedirko N.V., Voitenko N.V.. Caffeine- induced changes of intrareticular Ca²⁺ homeostasis in rat submandibular salivary cells // IBRO advanced school of neuroscience “Receptors, Channels, Messengers”, September 16-28 2004. - Yalta (Ukraine). - Р. 17.

13. Fedirko N.V., Vats Ju., Klevets M.Yu. Role of Endoplasmic Ca²⁺-stores in Cholinergic Ca²⁺ Signaling in Rat Salivary Acinar Cells // 47^th Annual Meeting of the Biophysical Society, 2-7 March 2003, San-Antonio, Texas, USA. - Biophysical J. - 2003. - Vol. 84, № 2. - P. 228.

14. Fedirko N., Vats J., Voitenko N. Effect of streptozotocin-induced diabetes on salivary secretory cells Ca²⁺-ATPase // 3^rd FEPS Congress, 28 June-2 July, 2003, Nice, France. - Abstract book. - P. 16.

15. Kопач O., Федірко Н. Пермеабілізовані ацинарні секреторні клітини слинних залоз як модель вивчення Са²⁺-транспортних систем мембрани внутрішньоклітинних структур // Збірник тез доповідей VII міжнародного медичного конгресу студентів та молодих учених, 21-23 травня 2003 р., м. Тернопіль. - Тернопіль. - 2003. - С. 202.

16. Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Дослідження Ca²⁺-, Mg²⁺-ATФазних активностей плазматичної та ендоплазматичної мембран секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів// 16-й з`їзд українського фізіологічного товариства. 28-30 травня, 2002 р., Вінниця. - Фізіол. журн. - 2002. - Т. 48, № 2. - С. 130-131.

17. Федірко Н.В., Вац Ю.О., Пасович О.Б., Копач О.В., Клевець М.Ю. Дослідження механізмів підтримання Са²⁺-гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.// III з'їзд Українського біофізичного товариства. 8-11 жовтня 2002 р., Львів - Тези доповідей. - С. 68.

18. Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Залежність функціональної активності Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз від концентрації АТФ // Матеріали міжнародної конференції, присвяченої пам'яті професора Шостаковської І.В. 11-12 жовтня - 2002 - Львів - С. 14.

19. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Депо-керований вхід Cа²⁺ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції присвяченої пам'яті професора І.В. Шостаковської. 11-12 жовтня - 2002 - Львів - С. 15.

20. Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Vats Ju.A., Klevets M.Yu. Possible mechanism of steady-state Ca²⁺ increase in the acinar secretory cells of rat submandibular salivary glands // Fourth Conference of the Czech Neuroscience Society, October 23-25, 2001, Prague. - Abstract. - 2001. - P. 68.

21. Vats Ju., Klevets M., Fedirko N. Involvement of SH-groups in the regulation of PMCA and SERCA functional activity // Proceedings of the Physiological Society Meeting, Liverpool, July 8-12, 2002. - J. Physiol (Lond). - 2001. - Vol. 543. - P. 66.

22. Fedirko N., Klevets M., Manko V. Role of Ca²⁺ cations in the plasma membrane functioning of the secretory cells of exocrine glands // Programme and abstract book European research meeting “Calcium as a molecule for cellular integration”, Wye College, Kent, 21-24 July, 2000: Abstract.: 34-5.

23. Fedirko N., Manko V., Klevets M. Affinity of Na⁺-Ca²⁺-exchanger in secretory cell membrane to divalent cations // XIII International Biophysics Congress, September 19-24, 1999, New Delhi, India: Abstracts. - Journal of Biosciences. - 1999 - Vol. 24, № 1(131) - P. 281.

анотаціЇ

Федірко Н.В. Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена аналізу механізмів підтримання гомеостазу Са²⁺ у клітинах підщелепної слинної залози в нормі та при патології. Виявлено, що параметри АХ-індукованого підвищення [Ca²⁺]_i визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са²⁺ з ЕР, входу Са²⁺ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР. Мітохондрії (МХ) регулюють АХ-індуковане вивільнення Са²⁺ з ЕР, попереджуючи Са²⁺-залежну інактивацію InsP₃ рецепторів. Доведено наявність функціонально активних Р1 та Р2 пуринорецепторів. Активація Р1 рецепторів призводить до потенціації АХ-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів за рахунок цАМФ-залежної модуляції ФЛЦ-InsP₃ шляху. Вперше доведено наявність функціонально активних RyR, причому Са²⁺, який вивільняється з них, захоплюється в основному МХ, тоді як Са²⁺-АТФази ПМ та ЕР відповідають за форму [Ca²⁺]_i сигналу. Виявлено пасивний витік Са²⁺ з ЕР через транслоконовий комплекс. Вперше виявлено, що МХ визначають амплітудно-часові параметри депо-керованого входу Са²⁺. Виявлено зміни гомеостазу Са²⁺ у клітинах підщелепної слинної залози за умов СТЗ-індукованого діабету: зростання [Са²⁺]_і в стані спокою, чутливості М-холінорецепторів та зниження активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР. Вперше виявлено, що за умов діабету порушується гомеостаз Са²⁺ кальцію в ЕР та МХ ацинарних клітин. Загалом, підтримання Са²⁺ гомеостазу забезпечується взаємодією Са²⁺-регулюючих систем ПМ, ЕР та МХ, порушення роботи яких є причиною розвитку патологій слинних залоз.

Ключові слова: підщелепна слинна залоза, ендоплазматичний ретикулум, М-холінорецептори, ІnsР₃ рецептори, ріанодинові рецептори, мітохондрії, транслоконовий комплекс, депо-керований вхід Са²⁺, діабет.

Федирко Н.В. Механизмы поддержания кальциевого гомеостаза в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Институт физиологии им. О.О.Богомольца НАН Украини, Киев, 2006.

Диссертация посвящена исследованию механизмов поддержания кальциевого гомеостаза в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы крыс в норме и при патологии. Обнаружено, что не зависимо от концентрации, природный агонист М-холинорецепторов ацетилхолин (АХ) вызывает глобальное повышение концентрации свободного цитоплазматического Са²⁺ ([Ca²⁺]_i), которое необходимо для активации Cа²⁺-зависимых К⁺- и Сl^--проводимостей расположенных соответственно в базальном и апикальном полюсах ацинарной клетки и, как следствие, инициации секреции жидкого компонента слюны. При анализе кинетики АХ-индуцированных [Ca²⁺]_і транзиентов обнаружено замедление скорости их развития и спада, а также увеличение амплитуды в Са²⁺ содержащей среде, что свидетельствует о наложении на быстрое высвобождение Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума (ЭР) более медленного процесса - входа Са²⁺ из внеклеточной среды. Путем прямой регистрации депо-управляемого входа Са²⁺, вызванного опустошением депо ЭР с помощью АХ, обнаружено, что его амплитуда больше чем разница между амплитудами АХ-индуцированного [Ca²⁺]_і транзиента в Са²⁺-содержащей и бескальциевой средах, что свидетельствует о захвате кальция Са²⁺-АТФазой ЭР уже во время восходящей фазы АХ-индуцированного [Ca²⁺]_і транзиента. Таким образом, несмотря на то, что ІnsP₃-индуцированное высвобождение Са²⁺ из ЭР, является первичным процессом, инициирующим возникновение [Ca²⁺]_і транзиента, мы показали, что амплитудно-временные параметры [Ca²⁺]_i транзиентов, вызванных активацией М-холинорецепторов, определяются суперпозицией процессов высвобождения Са²⁺ из внутриклеточных депо, входа Са²⁺ в клетку, а также его обратного захвата в ЭР Са²⁺-АТФазой. Установлено, что митохондрии (МХ) модулируют АХ-индуцированные [Ca²⁺]_i транзиенты путем предупреждения Са²⁺-зависимой инактивации ІnsP₃-рецепторов по механизму положительной обратной связи, что возможно благодаря их пространственной локализации в непосредственной близости от ЭР, наличие которой показано методом электронной микроскопии. Нами обнаружено наличие активных ионотропных Р2Х и метаботропных P2Y рецепторов в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы. Преобладающий вклад в формирование АТФ-индуцированных [Ca²⁺]_i транзиентов вносят Р2Х рецепторы представленые Р2Х₇ подтипом, а метаботропная компонента представлена P2Y₂ подтипом. Мы не обнаружили [Ca²⁺]_і транзиентов, вызванных активацией аденозиновых рецепторов, но показали способность аденозина потенциировать [Ca²⁺]_і ответы, вызванные активацией М-холинорецепторов. Путем прямой регистрации концентрации свободного Са²⁺ в ЭР ([Са²⁺]_ЭР) показано, что АХ и экзогенный ІnsP₃ вызывают транзиентное высвобождение Са²⁺ из ЭР, которое колоколообразно зависит от [Са²⁺] и модулируется АТФ. Впервые описано участие рианодиновых рецепторов (RyR) в Са²⁺ сигнализации в данном типе клеток. Показано, что активация RYR вызывает высвобождение Ca²⁺ из депо ЭР, но не приводит к глобальному повышению Ca²⁺ в цитоплазме. Это обусловлено быстрым захватом Са²⁺, высвобождаемого через RYR, митохондриями тогда как Са²⁺-АТФазы ПМ и ЕР отвечают за форму [Ca²⁺]_i ответа, что возможно благодяря пространственной колокализации этих систем. Впервые установлено, что основным путем пассивного вытока Са²⁺ из ЭР исследуемых клеток является транслоконовый комплекс ЭР. Впервые показано, что МХ регулируют депо-управляемый вход Са²⁺ в клетки, предупреждая Са²⁺-зависимую инактивацию SOC каналов, что возможно благодаря локализации МХ непосредственно под ПМ. Впервые обнаружено, что транс-митохондриальный транспорт Са²⁺ играет существенную роль в поддержании депо-управляемого входа Са²⁺, а также процесса перезаполнения ЭР. Вклад МХ в перезаполнение ЭР определяется длительностью стимуляции клеток. Так, при опустошении ЭР кротковременной аппликацией АХ, его перезаполнение происходит в основном путем прямого захвата Ca²⁺ в ЭР и, дополнительно опосредовано МХ. При длительной стимуляции, депо-управляемый вход Са²⁺ осуществляется только в местах колокализации ПМ и МХ. После захвата МХ, кальций транс-митохондриально перемещается и высвобождается к учаскам его захвата Са²⁺-АТФазой ЭР, что является единственным механизмом перезаполнения ЭР в присутствии InsP₃. Суммируя, полученные данные поддержание внутриклеточного кальциевого гомеостаза достигается за счет взаиморегуляции Са²⁺-транспортных систем ПМ, ЭР и МХ, что возможно благодаря их пространственной колокализации.

Впервые показано, что уменьшения интенсивности секреции слюны и снижение ее белкового состава при сахарном диабете сопрождаются драматическими изменениями кальциевого гомеостаза в клетках подчелюстной железы. В частности обнаружено увеличение [Са²⁺]_і в состоянии покоя, чувствительности М-холинорецепторов, а также угнетение активности Са²⁺-АТФаз ПМ та ЭР. Показано также уменьшение высвобождения Са²⁺ из ЭР (ІnsР₃- и RyR-чувствительного, или рецептор-независимого); увеличение пассивного вытока Са²⁺ из ЭР, а также активацию высвобождения Са²⁺ из МХ через пору переменной проницаемости (отсутствуещее у здоровых животных). Выявленные изменения внутриклеточной Са²⁺ сигнализации в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы можно рассматривать как вероятный механизм нарушения процессов секреции при сахарном диабете.

Проведенное исследование дает возможность расширить фундаментальное понимание механизмов поддержания кальциевого гомеостаза в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы в норме и их роль при патологических состояниях слюнных желез, а также может быть использовано для разработки новых клинических методов их коррекции.

Ключевые слова: подчелюстная слюнная железа, эндоплазматический ретикулум, М-холинорецепторы, ІnsР₃ рецепторы, рианодиновые рецепторы, митохондрии, транслоконовый комплекс, депо-управляемый вход Са²⁺, диабет.

Fedirko N.V. Mechanisms maintaining the calcium homeostasis in acinar cells of submandibular salivary gland - Manuscript.

Dissertation for doctor of science degree by specialty 03.00.13 - Нuman and аnimal physiology. A.A.Bogomoletz Institute of Physiology NAS of Ukraine, Kiev, 2006.

The dissertation is devoted to studying the mechanisms of Ca²⁺ homeostasis in cells of rat submandibular gland in physiological and pathological conditions. It was shown that parameters of ACh-induced [Ca²⁺]_i transient are determined by superposition of Ca²⁺ release from ER, Ca²⁺ influx and Ca²⁺ uptake into ER. Mitochondria (Mit) regulate ACh-induced Ca²⁺ release from ER by preventing Ca²⁺-dependent inactivation of InsP₃ receptors. We also showed the availability of functionally active P1 and P2 purinoreceptors. Activation of P1 receptors leads to potentiation of ACh-induced [Ca²⁺]_i transients via cAMP-dependent modulation of PLC-InsP₃ pathway. We showed for the first time the presence of functionally active RyRs, whereas Ca²⁺ that is released from them is captured preferentially by Mit, while Ca²⁺-ATPases of ER and PM are responsible for the shape of the signal. We described the passive leak from ER that is mediated by a translocon complex. We showed for the first time that Mit define the amplitude-temporal parameters of store-operated Ca²⁺ influx. We found the changes of Ca²⁺ homeostasis in acinar cell under STZ-induced diabetes: rise in resting [Са²⁺]_і, sensitivity of M-cholinoreceptors and decrease in the activity of Ca²⁺-ATPases of ER and PM. We found for the first time the impairement of Ca²⁺ homeostasis inside ER and Mit under experimental diabetes. In conclusion, the balance of Ca²⁺ homeostasis is maintained by coordinated activity of Ca²⁺-regulating systems of PM, ER amd Mit, while its impairement causes the development of salivary cells' pathological state.

Кey words: submandibular salivary gland, endoplasmic reticulum, ІnsР₃-receptors, ryanodine receptors, mitochondria, store-operated Са²⁺entry, translocon complex, diabetes.

Размещено на Allbest.ru