Нокардіоподібні актинобактерії – деструктори моторних олив

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Хоменко Людмила Анатоліївна

УДК 579.87:665.73-035.83.0028

НОКАРДІОПОДІБНІ АКТИНОБАКТЕРІЇ - ДЕСТРУКТОРИ МОТОРНИХ ОЛИВ

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2007

Дисертація є рукопис.

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор, академік НАНУ

Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фізіології промислових мікроорганізмів

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Пирог Тетяна Павлівна, Національний університет харчових технологій, завідувач кафедри біотехнології мікробного синтезу;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Павленко Микола Ілліч, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач лабораторії екологічних досліджень

Захист відбудеться 19 грудня 2007 року о 10 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано „ 16„ листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

нокардіоподібний актинобактерія моторний деструктивний

Актуальність теми. Однією з важливих екологічних проблем сьогодення є очищення природного середовища від забруднення мінеральними (нафтовими) оливами, із яких найбільш токсичними для живих організмів є моторні оливи. Постійно зростаюча потреба у цих речовинах, загальне світове виробництво яких на даний час перевищує 40 млн. тон на рік, збільшує ризик їх потрапляння у ґрунт та воду і свідчить про необхідність підвищення контролю за їх токсичністю та удосконалення методів очищення забруднених ними середовищ.

Сучасні мінеральні моторні оливи є збалансованим колоїдним розчином базової мінеральної оливи, що представляє собою багатокомпонентну суміш високомолекулярних вуглеводнів та пакету присадок, який складається з індивідуальних функціональних присадок, призначених для підвищення якості олив, і може містити такі високотоксичні речовини як феноляти, дітіофосфати та алкілдітіофосфати металів [Караулов, Худолий, 2000]. Потрапляння в біосферу моторних олив призводить до порушення природних біоценозів водойм та ґрунту і значно погіршує санітарно-гігієнічний стан забруднених об'єктів. При розкладі цих речовин можуть утворюватись канцерогенні сполуки, які викликають зміни у функціонуванні системи імунного захисту людини і, як наслідок, алергічні, онкологічні та інші захворювання [Протасов, Молчанов, 1995; Абрацумян и др., 1999].

З метою попередження і зменшення негативного впливу моторних олив та інших мастильних матеріалів на довкілля та людину в країнах Євросоюзу і в Україні насьогодні запроваджені Державні стандарти [CEC L-33-F-93; ДСТУ, 2004], які зобов'язують та регламентують проведення контролю за основною екологічною характеристикою цих речовин, а саме - їх здатністю до біодеструкції в природних умовах. У цих процесах значну роль можуть відігравати нокардіоподібні актинобактерії родів Rhodococcus, Gordonia і Dietzia, які переважають в забруднених нафтою та нафтопродуктами природних екосистемах і широко використовуються в біотехнологіях очищення довкілля від цих полютантів [Ившина, 1997; Christofi et al., 1998; Ившина и др., 2003]. Незважаючи на широке практичне використання та значний рівень дослідження біологічних властивостей зазначених актинобактерій, їх здатність до біодеструкції мінеральних, в тому числі моторних олив, майже не вивчена. У доступній нам літературі є тільки поодинокі дані про засвоєння моторних олив окремими штамами нокардіоподібних актинобактерій [Звягинцева и др., 2001; Koma et al., 2003; Худокормов, 2006], відсутня інформація про чутливість цих бактерій до токсичних компонентів олив та присадок до них, не вивчені особливості їх росту на цих субстратах як єдиному джерелу вуглецю та енергії. Дослідження вказаних властивостей та процесів дозволить отримати нові дані про біологічні особливості нокардіоподібних актинобактерій та створити умови для розробки на їх основі біотехнологій очищення довкілля від моторних олив.

Зв'язок теми з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямом науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в межах бюджетної тематики відділу фізіології промислових мікроорганізмів “Дослідження систематичного положення та фізіолого-біохімічних особливостей мікроорганізмів, які мають промислове значення” (державний реєстраційний номер 0198V007755, 1999 - 2003 рр.); “Систематика і біосинтетичні можливості бактерій і дріжджів. Розробка наукових основ створення за їх допомогою нових біотехнологічних препаратів і процесів” (державний реєстраційний номер 0104U003000, 2004-2008 рр.); “Збереження та забезпечення належного функціонування об'єкта, що становить національне надбання - Колекція мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України” (державний реєстраційний номер 0105U003954, 2003 - 2006 рр.) прикладної бюджетної тематики відділу “Розробка наукових основ створення біотехнології очищення довкілля від нафтових олив” (державний реєстраційний номер 0107U003512, 2007-2009 рр.).

Мета та завдання досліджень. Мета роботи - скринінг штамів нокардіоподібних актинобактерій-деструкторів мінеральних моторних олив, визначення їх біологічних особливостей та можливості використання в біотехнологіях очищення довкілля від цих мастильних матеріалів

У відповідності із вказаною метою були поставлені наступні завдання:

· виділити з природних джерел та визначити видову належність нокардіоподібних актинобактерій, що засвоюють моторні оливи;

· провести скринінг активних штамів-деструкторів моторних олив та визначити їх здатність до утилізації різних марок мінеральних моторних олив;

· дослідити чутливість штамів актинобактерій до дії токсичних компонентів мінеральних моторних олив, пакетів присадок, індивідуальних функціональних присадок та деяких факторів зовнішнього середовища;

· визначити здатність актинобактерій - деструкторів моторних олив до синтезу поверхнево-активних речовин та очищення відходів пластмасової тари від цих мастильних матеріалів.

Об'єкт дослідження - нокардіоподібні актинобактерії, мінеральні моторні оливи, пакети присадок та індивідуальні функціональні присадки до моторних олив.

Предмет дослідження - деструктивна активність нокардіоподібних актинобактерій щодо моторних олив, їх чутливість до токсичних компонентів цих речовин, деяких факторів зовнішнього середовища та здатність до очищення відходів пластмасових каністр від залишків моторних олив.

Матеріали та методи дослідження. При виконанні поставлених завдань використовувались мікробіологічні, фізико-хімічні, хемотаксономічні, біохімічні та статистичні методи досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів. Досліджена здатність до засвоєння найбільш розповсюджених марок мінеральних моторних олив у 21 свіжоізольованого і 161 колекційного штаму нокардіоподібних актинобактерій, що підтримуються в Українській колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України. Встановлено, що найбільш активні штами-деструктори моторних олив належать до видів Dietzia maris, Gordonia rubripertincta та Rhodococcus erythropolis. Вперше визначена чутливість вказаних видів до різних концентрацій мінеральних моторних олив і присадок до них та її залежність від наявності і кількості в цих речовинах основного токсичного компоненту - дітіофосфату цинку. Отримані нові дані про стійкість штамів-деструкторів олив до окремих складників цих речовин - важких металів, фенолу і сірки. Виявлена здатність вказаних штамів до росту в несприятливих умовах існування - широкому діапазоні кислотності і мінералізації середовища та температури.

Практичне значення одержаних результатів. Відібрані штами нокардіоподібних актинобактерій, які проявляють високу метаболічну активність щодо мінеральних моторних олив, стійкі до токсичних компонентів цих речовин і факторів зовнішнього середовища. Завдяки здатності до ефективного відмивання пластмасової поверхні від моторних олив та їх деструкції, вказані штами перспективні для очищення від цих речовин відходів пластмасової тари, яка є цінною вторинною сировиною. Активні штами-деструктори олив та отримані експериментальні дані можуть бути використані для розробки на їх основі нових біотехнологічних методів ліквідації забруднень довкілля моторними оливами та іншими мастильними матеріалами.

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто: відібрані проби забрудненого нафтопродуктами ґрунту, виділені та ідентифіковані свіжоізольовані штами, досліджена чутливість нокардіоподібних актинобактерій до різних марок мінеральних моторних олив, пакетів присадок, індивідуальних функціональних присадок та окремих їх компонентів, визначений вплив факторів зовнішнього середовища на ріст вивчених штамів. У активних штамів-деструкторів олив досліджені гідрофобно-гідрофільні властивості клітинної поверхні та емульгуюча активність. Проведена статистична обробка даних.

Планування головних напрямків роботи, формулювання основних положень дисертації та підготовка до друку наукових статей проведено під керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи акад. НАНУ В.С.Підгорського. Таксономічні дослідження та скринінг активних деструкторів моторних олив проведено за участі с.н.с., к.б.н. Т.М.Ногіної, визначення деструктивної активності нокардіоподібних актинобактерій щодо олив здійснено спільно з к.б.н. С.Л.Куберською, дослідження здатності штамів актинобактерій до синтезу поверхнево-активних речовин проведені на базі Відділення фізико-хімії горючих копалин Інституту фізико-органічної хімії та вуглехімії НАНУ під керівництвом с.н.с., к.х.н. О.В.Карпенко, які є співавторами відповідних публікацій.

Автор роботи висловлює глибоку вдячність с.н.с. Українського науково-дослідного інституту нафтопереробної промисловості „МАСМА” С.С. Шамкіній за консультації щодо характеристик моторних олив та присадок.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на 69-й науковій конференція молодих вчених, аспірантів і студентів Національного університету харчових технологій (Київ, 2003), конкурсах експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2003, 2004, 2005, 2006); ІІ науково-технічній конференції “Нові технології та обладнання по переробці промислових та побутових відходів і їх медико-екологічне забезпечення” (Східниця, 2003), Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); практичній конференції “Природничі науки на межі століть” (Ніжин, 2004), Щорічній науковій конференції “Дні науки НаУКМА” (Київ 2005), 11-й Міжнародній конференції “Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды” (Саратов, 2005), ІІ-й Міжнародній науковій конференції молодих вчених “Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2005), Першій, другій та третій міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005, 2006, 2007), 10-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология - наука ХХІ века” (Пущино, 2006), Міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006) та The young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology” (Odesa, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, із них 5 статей у фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури (2 розділи), 4 розділів експериментальних досліджень, підсумку, висновків, списку використаних джерел, який включає 225 найменувань (з яких 103 - іноземні) та додатку. Робота викладена на 154 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 45 рисунками і 18 таблицями.

Огляд літератури

Огляд літератури представлений двома розділами, кожний з яких поділяється на два підрозділи. В першому розділі узагальнено літературні дані щодо таксономічної структури нокардіоподібних актинобактерій, які належать до родів Gordonia, Dietzia і Rhodococcus класу Actinobacteria, їх розповсюдження та роль у природі. В другому розділі наведена інформація про здатність цих мікроорганізмів до деструкції вуглеводнів нафти та нафтопродуктів, включаючи мінеральні оливи. В окремих підпунктах узагальнені літературні дані про характеристику і властивості мінеральних моторних олив, а також перспективи використання нокардіоподібних актинобактерій в біотехнологіях очищення навколишнього середовища від цих мастильних матеріалів.

Матеріали та методи досліджень

Об'єктами досліджень були 21 свіжоізольовані штами актинобактерій, виділені з ґрунту на території м. Чернігова та смт. Пуща-Водиця в місцях локальних забруднень мастильними матеріалами і з активного мулу міських очисних споруд м. Києва (смт. Бортничі). В роботі досліджувались, також, 161 колекційні штами нокардіоподібних актинобактерій, що належать до видів D.maris, G.rubrіpertincta, R.erythropolis, R.fascians, R.longus, R.opacus та R.ruber, які підтримуються в Українській колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Як субстрат для культивування актинобактерій використовували базову мінеральну оливу (БМО) марки НС 22/130 та універсальні мінеральні моторні оливи (ММО) класу 15W-40 торгових марок “Азмол-Супер”, “Havoline Рremium”, “Esso Uniflo”, “Luxoil Super” і “Titan Truck SHPD”. В роботі досліджувались наступні марки пакетів присадок (ПП) до моторних олив: Hitec 9227, Hitec 2854, Infenium 1272, Infenium 2281, Infenium 3354 і Infenium 5265 та основні типи індивідуальних функціональних присадок (ІФП) марок Hitec 611, С-150 Нафтан, Детерсол-140, Komad-302 (мийно-деспергувальні), Hitec 623, Плексол, Полібутен (в'язкісно-депресорні), Liqui Moly (антифрикційна) та Multadit OB (протизношувальна).

Виділення штамів-деструкторів моторних олив проводили методом накопичувальних культур або прямим висівом на агаризоване мінеральне середовище Мюнца (г/л): KNO₃ - 1,0; MgSO₄ - 0,1; KH2PO₄ - 0,14; NaCl - 1,0 [Звягинцев, 1991] в яке додавали 1,0 % (об. частка) гексадекану.

Первинний скринінг штамів, що засвоюють моторні оливи, проводили за результатами вимірювання оптичної густини (ОГ) культуральної рідини після росту культур при температурі 28°С при перемішуванні (n=240 об/хв) впродовж 5 діб на середовищі Мюнца, в яке додавали 0,1 % (об. частка) суміші (1:1:1) мінеральної (“Азмол-Супер”), частково синтетичної (“Liqui Moly”) та синтетичної (“Лукой Синтетик”) моторних олив. Інокулятом слугувала водна суспензія дводобових бактеріальних культур (титр клітин 10⁸ кл/мл), вирощуваних на агаризованому поживному середовищі №53 [Catalogue of strains DSMZ, 1989]. Для подальших досліджень відбирали штами, ОГ яких перевищувала 0,6 одиниць при початковому її значенні 0,05.

Ідентифікацію культур проводили за визначниками Bergey's [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1986, 1989] та монографією О.А.Нестеренко та ін. [1985]. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки нокардіоподібних бактерій, визначення ізомерів діамінопімелінової кислоти, моноцукридного складу гідролізатів клітин, наявності та типу міколових кислот вивчали загальноприйнятими методами [Герхардт, 1983; Лабинская, 1972; Звягинцев, 1991]. Отримання та визначення амінокислотного складу пептидоглікану клітинних стінок проводили за описаним раніше [Ногина и др., 1989] модифікованим методом K.N.Schleifer і O.Kandler [1972].

Чутливість штамів до різних концентрацій ММО та їх компонентів визначали методом дифузії в агар з використанням лунок [Егоров, 1986; Аржаков и др., 2004]. В лунки діаметром 8 мм вносили розчинені в базовій мінеральній оливі ММО, ПП та ІФП у концентраціях (г/мл): 1,0; 0,8, 0,6; 0,4; 0,2, 0,1; 0,08; 0,05; 0,04; 0,02; 0,01; 0,008; 0,004; 0,0008 та 0,0004. Водний розчин фенолу використовували в концентраціях (мг/мл) - 10, 25, 50, а розчинену в гексадекані молекулярну сірку в концентраціях (мг/мл) - 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 та 4,0 [Комарова и др., 2003]. Показником чутливості бактерій до зазначених речовин слугувала наявність чи відсутність зони затримки росту культур навколо лунок в агарі. Для порівняння ступеня антимікробної дії досліджуваних речовин використовували такий показник як мінімальна пригнічуюча концентрація (МПК), що відповідала останній концентрації речовини, після якої не утворювались зони затримки росту культур. Чутливість штамів до іонів важких металів вивчали на агаризованому середовищі Мюнца, в яке додавали розчини солей: ZnSO₄, Pb(NO₃)₂, CuSO₄, FeSO₄ та Al(NO₃)₃ у концентраціях (мг/л): 2, 5, 10, 100, 200, 500 та 1000 [Richards et al., 2002].

В усіх подальших дослідах штами вирощували в умовах як описано для первинного скринінгу.

Для вивчення поверхнево-активних властивостей клітин та визначення ліпідів штами вирощували на середовищі Гудвіна (г/л): K₂HPO₄ - 2,0; KH₂PO₄ - 2,0; MgSO₄ х 7H₂O - 0,5; NaNO₃ - 3,0 ; цитрат Na - 1,0; дріжджовий екстракт - 1,0 [Донец и др., 1970], в яке вносили 1 % (об. частка) гексадекану. Інокулят готували так само як описано для скринінгу штамів. Дослідження змін гідрофобності клітинної поверхні проводили за методом Rosenberg et al. [1980]. Емульгуючу активність визначали за індексом емульгування (Е₂₄) методом Купера у модифікації Турковської та ін. [2002]. Поверхневий натяг (ПН) досліджували за методом Вільгельмі з використанням платинової пластинки [Абрамзон и др., 1988].

Вміст загальних ліпідів визначали ваговим методом після їх екстрагування сумішшю Фолча з культуральної рідини, попередньо видаливши з неї гексаном залишки гексадекану. Якісний склад ліпідів вивчали методом тонкошарової хроматографії у системі розчинників: хлороформ-метанол-вода (85:15:1). Ліпіди ідентифікували після проявлення пластинок 5 %-ним спиртовим розчином фосфорномолібденової кислоти і анісовим альдегідом із застосовуванням маркерного аналізу.

Визначення деструктивної активності штамів щодо олив проводили після їх росту на середовищі Мюнца з 1,0 % (об. частка) базової або 0,1 % (об. частка) мінеральної моторної оливи. Як інокулят використовували культури з експоненційної фази росту (28 - 36 год), вирощені на середовищі Гудвіна. Кількість залишкових вуглеводнів у культуральній рідині визначали гравіметричним методом [Лурье, 1971] після їх екстракції хлороформом. Фракційний склад вуглеводневих компонентів БМО вивчали методом рідинної хроматографії з використанням гранульованого силікагелю марки КСГК (завод “РИАП”, м. Київ). Фракціонування вуглеводнів проводили розчинниками у такій послідовності: гексан, гексан - бензол (1:1), бензол, хлороформ. Зміни у складі базової оливи після росту штамів актинобактерій визначали на хромато-масспектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert (Germany).

Процес очищення забруднених моторними оливами відходів пластмасових каністр досліджували на середовищі Мюнца за розробленою нами методикою. Інокулят готували так само як описано при визначенні деструктивної активності штамів. Єдиним джерелом вуглецю та енергії слугували вуглеводні моторних олив, що знаходились на поверхні внесених у середовище попередньо зважених 5,0 г пластинок з середнім розміром 1-2 х 3-4 см, які отримували шляхом подрібнення пластмасових каністр з-під моторних олив. Кількість вуглеводнів на цих пластинках до початку та в кінці дослідів визначали гравіметричним методом після їх екстракції хлороформом [Лурье, 1971]. Для підрахунку загальної початкової кількості вуглеводнів на дослідних пластинках (С₀) за основу брали попередньо визначену нами середню розрахункову кількість вуглеводнів на 1,0 г пластинок (С_П), яка дорівнювала 0,0554±0,003 г. Аналіз результатів процесу очищення пластинок від олив проводили за такими показниками: ефективність відмивання поверхні пластмаси (Е_В), яку оцінювали шляхом порівняння вмісту вуглеводнів на забруднених і відмитих пластинках та ступенем деструкції олив (Е_Д), змитих з пластинок у середовище в процесі культивування бактерій. Вказані показники визначали за формулами:

Статистична обробка одержаних результатів проводили з використанням комп'ютерної програми Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Засвоєння різних марок мінеральних моторних олив нокардіоподібними актинобактеріями та їх деструктивна активність. Із забрудненого мастильними матеріалами ґрунту і активного мулу міських очисних споруд виділено 21 штам бактерій, які за морфолого-культуральними та фізіолого-біохімічними ознаками відповідали характеристикам нокардіоподібних актинобактерій. Дослідження хемотаксономічних ознак показало, що діагностичною кислотою їх клітинних стінок є мезо-діамінопімелінова кислота (мезо-ДАПК). У моноцукридному складі гідролізатів клітин переважають арабіноза і галактоза, амінокислоти пептидоглікану містять мезо-ДАПК, аланін і глютамінову кислоту у співвідношенні 1:2:1, що відповідає прямопоперековозв'язаному типу пептидоглікана (варіація А1г), який притаманний нокардіоподібним актинобактеріям з IV типом клітинної стінки. Показано, що всі досліджені штами містять міколові кислоти, які відрізняються між собою за величиною R_f на хроматограмі.

За комплексом досліджених ознак ізольовані з ґрунту штами УКМ Ас-212, УКМ Ас-220, УКМ Ас-222, УКМ Ас-223, УКМ Ас-205 та УКМ Ас-586 віднесені до виду Dietzia maris, УКМ Ас-242 - до Rhodococcus fascians, а виділений з активного мулу штам АИ-1 - до Rhodococcus erythropolis (табл.1).

Первинний скринінг деструкторів моторних олив проведений серед свіжоізольованих (21 штам) та колекційних (161 штам) культур нокардіоподібних актинобактерій показав, що найбільша кількість штамів, які засвоюють оливи як єдине джерело вуглецю та енергії, належала до видів D.maris (76,0 % від досліджених), R.erythropolis (52,0 %) та G.rubripertinctа (45,0 %).

Таблиця 1. Видова належність та основні диференцюючі ознаки ізольованих штамів

Значно менша кількість деструкторів олив виявлена серед штамів R.opacus (17,0 %) та R.fascians (13,0 %). Жоден із представників видів R.longus і R.ruber не ріс на середовищі з моторними оливами.

На основі проведених досліджень відібрано 8 свіжоізольованих та 15 колекційних штамів актинобактерій, що належали до видів R.erythropolis, G.rubropertincta та D.maris і краще за інших росли (ОГ = 1,2 - 4,2 одиниць) на суміші (1:1:1) мінеральної, частково-синтетичної та синтетичної олив. Вивчення здатності цих штамів до утилізації базової оливи та кожної з 5-ти досліджених марок мінеральних моторних олив показало, що незалежно від таксономічної належності, всі штами краще засвоювали БМО. Це можна пояснити тим, що БМО не містить присадок і, відповідно, токсичних для мікроорганізмів речовин, які можуть негативно впливати на їх життєздатність.

Засвоєння актинобактеріями досліджених олив як єдиного джерела вуглецю та енергії підтверджується значним приростом у них біомаси при культивуванні на мінеральному середовищі з цими оливами. Встановлено, що при рості штамів R.erythropolis УКМ Ас-50, G. rubripertincta УКМ Ас-179 та D.maris УКМ Ас-205 на базовій оливі титр клітин у них з початкового значення 1,1 х 10⁶ - 1,3 х 10⁶ КУО/мл збільшувався на початку стаціонарній фазі росту (48 - 60 год) до 1,2 х 10⁸ - 2,6 х 10⁸ КУО/мл.

Представлені дані свідчать про те, що штами діетзій, гордоній та родококів відрізняються між собою за здатністю до засвоєння різних марок моторних олив, яка залежить від складу цих речовин та індивідуальних особливостей штамів. Кращий ріст більшості з них спостерігався при засвоєнні олив марок “Luxoil Super”, “Азмол Супер” та “Havoline Premium” ніж „Esso Uniflo” та “Titan Truck SHPD”. Найвищі показники ОГ (1,5- 4,9 одиниць) при рості на цих оливах виявлено у штамів D. maris УКМ Ас-205, G.rubrіpertincta УКМ Ас-179 і УКМ Ас-190, R.erythropolis УКМ Ас-50 і УКМ Ас-77.

Визначення активності деструкції актинобактеріями базової оливи показало, що найвищим (81,0-84,0 %) цей показник був у штамів R.erythropolis УКМ Ас-50, G. rubripertincta УКМ Ас-179 та D. maris УКМ Ас-205 (табл. 2). Ці результати перевищують більше ніж в 2 рази наведені Koma et al. [2003] дані для штамів Rhodococcus sp. та Gordonia sp. при вивченні їх здатності до деструкції базової оливи класу SAE 10. Відносно інших досліджених нами штамів встановлено, що деструкція оливи у R.erythropolis АИ-1 та більшості штамів D. maris складала (72,0 % - 80,0 %). Менші значення цього показника (52,0%-63,0%) виявлені у G. rubripertincta УКМ Ас-178, УКМ Ас-190 та R.erythropolis УКМ Ас-48, УКМ Ас-58 і УКМ Ас-73; ще нижчою (25,0-49,0 %) деструкція була у решти досліджених штамів.

Таблиця 2. Деструкція базової мінеральної оливи марки НС 22/130 штамами Gordonia rubripertincta, Rhodococcus erythropolis та Dietzia maris

Визначення кількості та фракційного складу вуглеводнів базової оливи та моторних олив марок “Азмол Супер” і “Havoline Premium”, які найкраще засвоювались більшістю досліджених штамів, показало, що вони містять від 100 % до 72,3 % вуглеводнів, основними компонентами яких є парафіно-нафтенова фракція, що складає 90,7 - 96,9 % від загального вмісту вуглеводнів, в незначній кількості представлені ароматична (1,9 - 4,3 %) та смолисто-асфальтенова (1,2 - 2,5 %) фракції. Встановлено, що деструктивна активність штамів G.rubripertincta УКМ Ас-179, R. erythropolis УКМ Ас-50 та D.maris УКМ Ас-205 визначена через 5 діб культивування, була найвищою (56,9-64,6 %) щодо парафіно-нафтенової фракції базової оливи (табл. 3). Найбільшу ступінь деструкції ароматичної (40,5 %) та смолисто-асфальтенової (61,7 %) фракції вуглеводнів проявляв D.maris УКМ Ас-205. Активність деструкції цих фракцій у штаму R.erythropolis УКМ Ас-50 була нижчою на 5,5 % та 20,1%, а у G.rubripertincta УКМ Ас-179 - на 15,0 % та 21,6 %, відповідно. Результати наших досліджень дещо перевищують дані, які отримані K.Jiraspripongpun et al. [2002] при дослідженні здатності до біодеградації різних груп вуглеводнів моторних олив марки Hokkaido представниками інших видів родів Gordonia та Rhodococcus.

Таблиця 3. Деструкція окремих фракцій вуглеводнів базової мінеральної оливи марки НС 22/130 штамами G. rubripertincta, R.erythropolis та D.maris

Якісні та кількісні зміни у складі базової оливи, які відбуваються після 5 діб культивування з активними штамами-деструкторами олив, підтверджено методом хромато-масспектрометрії, за допомогою якого встановлено, що найбільший рівень деструкції (61,3 %) цієї оливи мав штам R.erythropolis УКМ Ас-50 і менші - G.rubrірertinctа УКМ Ас-179 (50,8%) та D.maris УКМ Ас-205 (30,8%).

Вплив високих концентрацій мінеральних моторних олив та присадок на життєздатність штамів нокардіоподібних актинобактерій. Враховуючи наявність у складі моторних олив токсичних сполук, які можуть негативно впливати на життєздатність мікроорганізмів, ми провели визначення чутливості штамів до різних концентрацій базової оливи та використаних у роботі марок мінеральних моторних олив, пакетів присадок і індивідуальних функціональних присадок. Нами встановлено, що у 100 % концентрації БМО не впливала на ріст штамів актинобактерій, а всі досліджені моторні оливи проявляли різну ступінь антимікробної дії щодо цих мікроорганізмів. Найменше пригнічувала ріст штамів олива “Азмол-супер”, середнє значення МПК якої дорівнювало 0,8 г/мл. Більшу антимікробну активність (МПК=0,5 - 0,7 г/мл) щодо досліджених штамів проявляли оливи марок “Luxoil Super” і “Havoline Рremium”. Найбільш чутливими актинобактерії були до олив “Titan Truck” і “Esso Uniflo”, які мали середні значення МПК 0,18-0,22 г/мл.

Визначення антимікробної дії пакетів присадок показало, що всі вони пригнічували ріст досліджених штамів, за винятком HITEC 320N ? єдиного із досліджених 7 пакетів, який не містить дітіофосфату цинку (ДТЦ). Встановлено, що значення МПК пакетів присадок знаходилось в прямій залежності від кількості в них ДТЦ. Найменшу антимікробну дію (МПК=0,04-0,08 г/мл) проявляли пакети Infеnium D2281 та D3354, які містили 0,7 - 0,8 % ДТЦ. Значно більше пригнічували ріст досліджених штамів решта пакетів присадок (МПК= 0,015 - 0,022 г/мл), концентрація ДТЦ в яких була в 2-3 рази більшою.

Дослідження антимікробної дії 9 марок індивідуальних функціональних присадок на штами-деструктори олив показало, що всі вони були стійкими до мийно-диспергувальних, в'язкістних, депресорних і антифрикційних присадок, які не містять дітіофосфат цинку. На відміну від цього всі, без винятку, штами були чутливі до протизношувальної присадки Multadit OB, кількість ДТЦ в якій складає 8 %.

Мінімальна пригнічуюча концентрація цієї присадки для більшості штамів G.rubripertincta дорівнювала 10 мг/мл, для D.maris - 8 мг/мл, а R.erythropolis - 4 мг/мл. Найбільшу стійкість до цієї присадки (МПК = 20 мг/мл) проявляли штами D.maris УКМ Ас-222 та R.fascians УКМ Ас-242.

Стійкість штамів актинобактерій до окремих компонентів олив та деяких факторів середовища. Відомо, що моторні оливи у складі компонентів присадок містять сполуки цинку, сірки та фенолу. В результаті експлуатації олив в них можуть накопичуватися такі метали як мідь, залізо, алюміній та свинець, підвищуватись мінералізація та знижуватись рН [Караулов, Худолий, 2000]. Враховуючи це, нами досліджена стійкість штамів-деструкторів олив до вказаних металів, сірки та фенолу, а також, до деяких несприятливих факторів середовища (високих та низьких значень рН, концентрацій NaCl і температури).

Встановлено, що штами актинобактерій проявляли різну чутливість до іонів досліджених металів, з яких найбільш токсичний ефект проявляли Cu²⁺, Al³⁺ та Zn²⁺. За ступенем токсичності щодо штамів-деструкторів моторних олив іони металів можна розташувати у наступній послідовності: Cu²⁺ (МПК = 2-5 мг/л) > Al³⁺ (МПК = 50 мг/л) > Zn²⁺ (МПК = 50 - 100 мг/л) > Pb²⁺ (МПК = 200 - 500 мг/л) > Fe ²⁺ (МПК = 500 мг/л). Це узгоджується з даними інших авторів [Мельников, 2005; Худокормов, 2006], які визначали вплив іонів важких металів на деяких представників родів Rhodococcus, Gordonia і Dietzia.

Вивчення впливу елементарної сірки на ріст штамів актинобактерій показало, що більшість з них були стійкими до її концентрації 0,2-0,4 мг/мл. Найбільшу чутливість до сірки проявляли D.maris УКМ Ас-205 та УКМ Ас-586, затримка росту яких спостерігалась при її найменшій концентрації (0,2 мг/мл). Встановлено, також, що всі актинобактерії були стійкими до концентрації фенолу 5 мг/мл, більшість з них проявляли стійкість до 10 мг/мл і значно менша кількість - до 25 мг/мл. Концентрація цього дезинфектанта 50 - 60 мг/мл пригнічувала ріст всіх штамів незалежно від їх видової належності.

Визначення чутливості штамів-деструкторів моторних олив до різних значень мінералізації середовища показало, що всі вони росли в присутності 1,0 - 5,0 % NaCl, а більшість з них - при 7 % NaCl. Галотолерантними виявилися штами R.fascians УКМ Ас-242, G.rubripertincta УКМ Ас-189 та R.erythropolis УКМ Ас-44, які були стійкими до 10 % NaCl, а також, R.erythropolis УКМ Ас-50, який ріс при 15 % NaCl в середовищі. Всі досліджені штами проявляли життєздатність в діапазоні рН від 6 до 10 одиниць, росли за температури 15-42°С та проявляли стійкість до нагрівання при 60°С впродовж 15 хвилин, що свідчить про їх переваги перед іншими мікроорганізмами - деструкторами вуглеводнів при рості в несприятливих умовах існування.

Характеристика гідрофобності клітинної поверхні штамів-деструкторів моторних олив та їх здатність до синтезу поверхнево-активних речовин. Враховуючи те, що при засвоєнні нерозчинних у воді речовин, до яких відносяться і мінеральні моторні оливи, значну роль відіграють поверхневі властивості клітин, нами були вивченні зміни гідрофобності клітинної поверхні активних штамів-деструкторів олив в процесі засвоєння ними вуглеводнів. Встановлено, що впродовж фази активного росту до початку стаціонарної фази відбувається значне підвищення показника гідрофобності клітинної поверхні досліджених штамів, який змінювався у G. rubripertincta УКМ Ас-179 - з 18 % до 82 %, а у R. erythropolis УКМ Ас-50 - з 5 % до 80 %. Виявлені нами закономірності підтверджуються і роботами інших авторів [Bredholt et al., 2002], які досліджували гідрофобно-гідрофільні властивості клітинної поверхні штамів родококів при їх рості на вуглеводневих субстратах.

Нами встановлено, що засвоєння вуглеводнів штамами-деструкторами моторних олив супроводжується синтезом поверхнево-активних речовин, про що свідчить зниження поверхневого натягу в середовищі культивування з 72,0 мН/м до 43,0 мН/м у штаму G.rubripertincta УКМ Ас-179, до 45,3 мН/м - у D.maris УКМ Ас-205 та 35,0 мН/м - у R.erythropolis УКМ Ас-50. Значний рівень зниження поверхневого натягу штамом R.erythropolis УКМ Ас-50 свідчить про його перспективність як продуцента біоПАР. За нашими даними основними компонентами біоПАР, що синтезують досліджені штами, є трегалозомономіколати і трегалозодиміколати, які, як відомо з літератури [Коронелли и др., 1990], є основними гліколіпідними біополімерами їх клітинних стінок.

Дослідження емульгуючої активності штамів-деструкторів моторних олив показало, що вони здатні утворювати емульсії типу “олія у воді”, які стабільні понад 30 діб спостережень. Найбільші значення індексу емульгування (Е₂₄) - 40,3 - 57,3 % виявлені у суспензіях клітин відмитих від культуральної рідини, дещо меншим (Е₂₄ = 36,2 - 57,8 %) цей показник був у культуральної рідини вказаних штамів. Самі низькі значення Е₂₄ (1,7- 13,0 %), виявлені у супернатантів культуральної рідини G.rubripertincta УКМ Ас-179, D.maris УКМ Ас-205 та R.erythropolis УКМ Ас-50, свідчать про те, що синтезовані ними емульгатори асоційовані з клітинами. Отримані результати узгоджуються з літературними даними про здатність нокардіоподібних актинобактерій при рості на вуглеводневих субстратах синтезувати клітиннозв'язані біоПАР, які проявляють емульгуючі властивості [Philp et al., 2002; Куюкина, 2006].

Враховуючи те, що активні штами-деструктори моторних олив синтезують поверхнево-активні речовини, ми дослідили здатність цих бактерій очищати поверхню використаних пластмасових каністр від олив з метою подальшого її використання як вторинної сировини у виробництві пластмаси. Актуальність цієї проблеми пояснюється тим, що в останні роки значно збільшується забруднення довкілля тарою з-під олив, яка не розкладається в природних умовах. Проведені нами дослідження показали, що самим високим рівнем ефективності відмивання поверхні пластмаси та деструкції олив у середовищі характеризувався штам R. erythropolis, для якого вказані показники досягали значень 58,2 % та 55,1 %, відповідно, дещо меншими вони були у штамів G. rubripertincta та D.maris (табл. 6). Спільне культивування вказаних штамів призводило до підвищення в 1,1 - 1,9 рази ефективності цих процесів.

Таблиця 6. Результати очищення актинобактеріями пластмасових каністр від олив

ВИСНОВКИ

1. Встановлена належність до видів Dietzia maris, Rhodococcus fascians та Rhodococcus erythropolis штамів нокардіоподібних актинобактерій, ізольованих із забруднених мастильними матеріалами ґрунтів та активного мулу міських очисних споруд. Скринінг деструкторів моторних олив серед 21 свіжоізольованого та 161 колекційного штаму актинобактерій показав, що більшість з них належить до видів D.maris (76,0 % із досліджених), R.erythropolis (52,0 %) та G.rubripertincta (45 %).

2. Вперше виявлена здатність видів родів Dietzia, Gordonia і Rhodococcus до утилізації базової мінеральної оливи та 5 марок мінеральних моторних олив класу 15W-40. Найвищу деструктивну активність щодо базової оливи (81,0 -84,0 %) та моторних олив (40,3 - 66,9 %) проявляють штами G. rubripertincta УКМ Ас-179, R. erythropolis УКМ Ас-50 та D. maris УКМ Ас-205.

3. Вперше визначена чутливість актинобактерій до високих концентрацій мінеральних моторних олив та присадок до них і показано, що вона є штамовоспецифічною характеристикою, яка залежить від складу цих речовин та їх вмісту у середовищі. Найбільшу антимікробну дію щодо актинобактерій проявляли оливи марок “Esso Uniflo” і “Titan Truck SHPD” (МПК = 0,05 -0,4 г/мл), пакети присадок Infenium D1272, Infenium Р5265, Hitec D2854 і Hitec 9227 (МПК = 0,006 - 0,02 г/мл) та протизношувальна присадка Multadit OB (МПК = 0,0004 - 0,002 г/мл), що обумовлено найвищим вмістом в них основного токсичного компоненту олив - дітіофосфату цинку.

4. Штами-деструктори моторних олив проявляють різну чутливість до важких металів, які присутні в оливах. За збільшенням ступеня токсичного впливу на актинобактерії іони важких металів можна розташувати у такій послідовності: Cu²⁺ > Al³⁺ > Zn²⁺ > Pb²⁺ > Fe²⁺. Більшість досліджених штамів проявляють життєздатність в широкому діапазоні рН (6-10), температури (5-42°С) та мінералізації середовища (1-7 % NaCl), стійкі до концентрації сірки 0,2 - 4,0 мг/мл та фенолу 5 - 10 мг/мл.

5. Процес засвоєння нокардіоподібними актинобактеріями вуглеводневих компонентів моторних олив супроводжується значним підвищенням (з 1,8 -12,5 % до 53,0 - 83,0 %) рівня гідрофобності клітинної поверхні та синтезом поверхнево-активних речовин, які знижують поверхневий натяг у середовищі до 45,3 - 35,0 мН/м, проявляють емульгуючі властивості (Е₂₄=40,3 - 57,3 %) та здатні до утворення стійких емульсій типу “олія у воді”. Штами R.erythropolis УКМ Ас-50, D.maris УКМ Ас-205 та G.rubripertincta УКМ Ас-179 - найбільш активні деструктори моторних олив, здатні очищати пластмасову тару від залишків олив.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Ногіна Т.М., Хоменко Л.А., Підгорський В.С. Характеристика штамів алканотрофних нокардіоподібних актинобактерій, що засвоюють нафтові мастила // Наукові записки НаУКМА. Серія Біологія та екологія. ? 2004. ? Т.29. ? С. 49-55 (Здобувачем самостійно вивчена здатність колекційних штамів актинобактерій до росту на моторних оливах та досліджена динаміка їх росту на мінеральному середовищі з оливами).

2. Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Куберська С.Л. Деградація моторних мастил нокардіоподібними актинобактеріями // Вісник Одеського Національного Університету. - 2005. ? T.10. ? Випуск 7. ? С. 90-95 (Здобувачем самостійно вивчена здатність актинобактерій до засвоєння суміші різних типів олив та отримані зразки для їх хроматографічного аналізу).

3. Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Підгорський В.С. Здатність штамів R.erythropolis до утилізації мінеральних моторних олив та їх стійкість до деяких стресових факторів // Наукові записки НаУКМА. Серія Біологія та екологія. ? 2005. - T.43. - С.38-42 (Здобувачем самостійно досліджений ріст на різних марках мінеральних моторних олив штамів R.erythropolis та їх чутливість до різних концентрацій цих речовин).

4. Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Підгорський В.С. Вплив мінеральних моторних олив та пакетів присадок до них на ріст штамів Gordonia rubripertincta // Науковий вісник Чернівецького Університету. Серія Біологія. ? 2006. ? Випуск 297. ? С. 117-121 (Здобувачем самостійно досліджена здатність до росту на моторних оливах штамів G.rubripertincta та їх стійкість до різних концентрацій цих речовин).

5. Ногіна Т.М., Хоменко Л.А., Підгорський В.С., Шамкіна С.С. Природні штами нокардіоподібних актинобактерій-деструктори моторних олив // Наукові записки НаУКМА. Серія Біологія та екологія. ? 2006. ? T.54. - С. 31-35 (Здобувачем самостійно досліджені морфолого-культуральні та фізіологічні властивості 8 свіжоізольованих штамів актинобактерій, вивчена їх чутливість до моторних олив та пакетів присадок).

6. Підгорський В.С., Ногіна Т.М., Думанська Т.У., Куберська С.Л., Хоменко Л.А. Перспективи використання алканотрофних бактерій для очищення відходів пластмаси від залишків моторних мастил // Труди ІІ науково-технічної конференції „Нові технології та обладнання по переробці промислових та побутових відходів і їх медико-екологічне забезпечення (17-20 лютого 2003р). ? смт. Східниця. - 2003. ? С.118-121.

7. Чернишенко А.С., Хоменко Л.А. Нокардіоподібні бактерії-деструктори нафтопродуктів // 69-та Наукова конференція молодих вчених, аспірантів та студентів НУХТ (22-24 квітня 2003 р), Київ, НУХТ, 2003. ? C. 69.

8. Хоменко Л.А., Ногіна Т.М. Здатність нокардіоподібних актинобактерій до біодеградації нафтових мастил // Матеріали науково-практичної конференції “Природничі науки на межі століть” (23-25 березня 2004). ? Ніжин. ? 2004. ? С.103-104.

9. Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Куберська С.Л. Деградація моторних мастил нокардіоподібними актинобактеріями // Тези доповідей Х з'їзду Товариства мікробіологів України (15-17 вересня 2004р). ? Одеса: Астропринт. ? 2004. ? С.89.

10. Хоменко Л.А., Ногіна Т.М. Вплив деяких компонентів моторних олив на ріст вуглеводеньокислюючих штамів нокардіоподібних актинобактерій // Тези доповідей пер-шої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (11-14 квітня 2005 р). ? Львів - 2005. ? С.96.

11. Ногина Т.М., Хоменко Л.А., Подгорский В.С. Влияние различных типов присадок на рост штаммов R.erythropolis - деструкторов моторных масел // Тезисы докладов Международной конференции “Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды” (14-16 сентября 2005 г). ? Саратов. ? 2005. ? С.38-39.

12. Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Куберська С.Л. Біорозщеплюваність моторних олив під дією вуглеводеньокислюючих бактерій // Тези доповідей другої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (21-24 березня 2006р). ? Львів. ?2006. ? С. 328-329.

13. Хоменко Л.А., Ногина Т.М. Чувствительность природных изолятов нокардиоформ к антимикробному действию моторных масел // Тезисы 10-й Пущинской Школы-конференции молодых ученых (посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН), (17-21 апреля 2006 г). ? Пущино. ?2006. ? С.218.

14. Ногина Т.М., Подгорский В.С., Хоменко Л.А. Особенности бактериальной деструкции минеральных моторных масел // Тези доповідей Міжнародної наукової конференції „Мікробні біотехнології” (11-15 вересня 2006 р) - Одеса: Астропринт. - 2006. - С.198

15. Пристай М.И., Хоменко Л.А. Здатність штамів Rhodococcus erythropolis, Gordonia rubripertincta і Dietzia maris до синтезу поверхнево-активних речовин // Тези доповідей третьої наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь і поступ біології” (23 - 27 квітня 2007 р). ? Львів. ? 2007. ? С. 359

16. Homenko L., Nogina T. Ability actinobacteria of genus Rhodococcus and Gordonia to clear waste products of plastic container of motor oils rests // Modern problems of Microbiology and Biotechnology: Book of abstracts: Матеріали Міжнародної конференції молодих учених і студентів / Голов. ред. В.О. Іваниця. - Одеса: Астропринт, 2007. - С.80.

АНОТАЦІЯ

Хоменко Л.А. Нокардіоподібні актинобактерії - деструктори моторних олив. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Встановлена здатність нокардіоподібних актинобактерій родів Dietzia, Gordonia і Rhodococcus до деструкції 5 марок мінеральних моторних олив класу 15W-40. Найвища деструктивна активність (40,3 - 66,9 %) щодо цих олив виявлена у штамів G.rubripertincta УКМ Ас-179, R.erythropolis УКМ Ас-50 та D.maris УКМ Ас-205. Показано, що чутливість актинобактерій до високих концентрацій олив та присадок корелює з присутністю і кількістю в них дітіофосфату цинку. Серед важких металів, які містяться в оливах, найбільшу токсичну дію на досліджені штами виявляли іони міді, алюмінію та цинку. Більшість штамів-деструкторів олив життєздатні в широкому діапазоні рН (6 - 10), температури (5 - 42°С) і мінералізації (1-7 % NaCl) середовища, витримують нагрівання при 60°С впродовж 15 хвилин, проявляють стійкість до концентрації сірки 0,2 - 4,0 мг/мл та фенолу 5 - 10 мг/мл.