Взаємодія регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну і конструювання штамів-надсинтетиків цього вітаміну у дріжджів Pichia guilliermondii

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

УДК 582.282.23:017.7:546.72:577.164.12+577.21

ВЗАЄМОДІЯ РЕГУЛЯТОРНИХ ГЕНІВ БІОСИНТЕЗУ РИБОФЛАВІНУ І КОНСТРУЮВАННЯ ШТАМІВ-НАДСИНТЕТИКІВ ЦЬОГО ВІТАМІНУ

У ДРІЖДЖІВ PICHIA GUILLIERMONDII

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КУЦЯБА Василь Іванович

Львів - 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Сибірний Андрій Андрійович, Інститут біології клітини НАН України, директор, завідувач відділу молекулярної генетики і біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор медичних наук, професор Данилейченко Валерій Васильович, Львівський національний медичний університет ім. Д. Галицького МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології

Провідна установа: Національний університет харчових технологій МОН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 3 “ липня 2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 при Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий “ 18 “ травня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.

АНОТАЦІЯ

Куцяба В.І. Взаємодія регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну і конструювання штамів-надсинтетиків цього вітаміну у дріжджів Pichia guilliermondii. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007. біосинтез рибофлавін клонування ген

Дисертація присвячена дослідженню взаємодії регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну (РФ) і конструюванню штамів-надсинтетиків цього вітаміну у дріжджів Pichia guilliermondii. Встановлено, що мутації rib80-22, rib83-6 - рецесивні, ядерні і моногенні. Вони викликають порушення регуляції як біосинтезу РФ, так і асиміляції заліза. Регуляторні гени rib80 і RIB81 та RIB81 і HIT1 взаємодіють між собою за синергідним типом. Суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib80-22 і rib81-131 та rib81-131 і hit1-1 веде до зростання продуктивності флавіногенезу у 2-3,5 раза. Мутація rib83-6 блокує надсинтез РФ і дерепресію синтезу фементів флавіногенезу у мутантів rib80, rib81 і у подвійних мутантів rib80 rib81, тобто вона епістатує над мутаціями rib80-22 і rib81-131. Створено систему для клонування регуляторного гена rib83 позитивного типу дії з використанням як реципієнта сконструйованого потрійного мутанта rib1-86 rib81 rib83. Введенням у геном мутанта генотипу rib80 rib81 мутацій резистентності до аналогів пуринів 8-азагуаніну і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину отримано штами, які синтезують 1,7 г РФ в 1 л синтетичного середовища за 6-7 діб вирощування у лабораторному ферментері. Показано позитивний вплив препарату кормового РФ, отриманого за допомогою одного із селекціонованих штамів, на приріст маси і вагу яєць курей. Таким чином, селекціоновані штами-надсинтетики РФ можуть бути використані для виробництва кормових дріжджів, збагачених вітаміном В₂.

Ключові слова: дріжджі, вітамін В₂, регуляція біосинтезу рибофлавіну, асиміляція заліза, регуляторні гени, клонування генів, штами-надсинтетики рибофлавіну.

АННОТАЦИЯ

Куцяба В.И. Взаимодействие регуляторных генов биосинтеза рибофлавина и конструирование штаммов-сверхсинтетиков этого витамина у дрожжей Pichia guilliermondii. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2007.

Диссертация посвящена исследованию взаимодействия регуляторных генов биосинтеза рибофлавина (РФ) и конструированию штаммов-сверхсинтетиков этого витамина у дрожжей Pichia guilliermondii. Генетический анализ мутации rib80-22 дрожжей P. guilliermondii позволил установить её рецессивность, моногенность и ядерную локализацию. Она вызывает возрастание производительности биосинтеза РФ в 20-30 раз, скорости транспорта железа в 4-10 раз, содержания железа в клетках в 1,5-2 раза при выращивании дрожжей в среде с оптимальным для роста содержанием этого металла. Таким образом, ген rib80 принимает участие как в регуляции биосинтеза РФ, так и ассимиляции железа. Показано, что регуляторные гены rib80 и RIB81, RIB81 и HIT1 взаимодействуют между собой по типу синергизма. Совмещение в одном гаплоидном геноме мутаций rib80-22 и rib81-131 вызывает у мутантов rib80 rib81 по сравнению с мутантами rib81 возрастание продуктивности флавиногенеза в 2 раза, активности ГТФ-циклогидролазы II - 3 раза, скорости транспорта железа - 10 раз, но не вызывает возрастания содержания железа в клетках. Гаплоидные сегреганты генотипа rib81 hit1 по продуктивности флавиногенеза превышают штаммы rib81 в 3-3,5 раза. Однако они накапливали небольшую биомассу (до 1 мг/мл) и быстро ревертировали по признаку „сверхсинтез РФ” до уровня мутантов rib81.

По моногенному типу наследуется также рецессивная мутация rib83-6. Она снижает скорость роста и поглощения железа клетками, их ферриредуктазную активность в условиях дефицита железа в среде. Изучен характер взаимодействия мутации rib83-6 с мутациями rib80-22 и rib81-131. Показано, что она блокирует сверхсинтез РФ и дерепрессию синтеза ферментов флавиногенеза не только у мутантов rib80 и rib81, но и у двойных мутантов rib80 rib81 и даже в железодефицитной среде, когда у мутантов rib80, rib81, rib80 rib81 происходит возрастание синтеза РФ и активностей ферментов флавиногенеза. Таким образом, ген RIB83 осуществляет позитивный контороль как биосинтеза РФ, так и поглощения железа и эпистатирует над генами негативного контроля флавиногенеза rib80 и RIB81.

Создана система для клонирования регуляторного гена rib83 методом функциональной комплементации с использованием как реципиента сконструированного тройного мутанта rib1-86 rib81 rib83. Из банка генов P. guilliermondii отобрана рекомбинантная плазмида, которая, по-видимому, комплементирует или супрессирует мутацию rib83-6.

Совмещение в одном гаплоидном геноме мутаций rib81-131 и резистентности к аналогу аденина 4-аминопиразол[3,4-d]пиримидину, которая вызывает сверхсинтез пуринов, приводит к возрастанию продуктивности флавиногенеза мутантов rib81 в 3 - 3,5 раза. Введением в геном мутанта генотипа rib80 rib81 мутаций резистентности к аналогам пуринов 8-азагуанину и 4-аминопиразол[3,4-d]пиримидину были получены штаммы, которые синтезировали 1,7 г РФ в 1 л синтетической среды при выращивании в лабораторном ферментере. Добавление препарата кормового РФ, изготовленного при использовании сконструированного штамма-сверхсинтетика РФ Agu^r-125 App^r-3, к корму кур позитивно повлияло на прирост массы птицы и вес яиц.

Проверили способность к росту и синтезу РФ штамма Agu^r-125 App^r-3 и флавиногенных прототрофных сегрегантов диплоида, полученного в результате скрещивания штамма Agu^r-125 App^r-3 с мутантом rib80 rib81, в среде, содержащей только промышленные субстраты - послеспиртовую зерновую барду, мелассу и зерновое сусло (8:1:1, v/v/v). Штамм Agu^r-125 App^r-3 синтезировал 250 мкг РФ/мл среды, тогда как некоторые сегреганты - до 800 мкг РФ/мл, и накапливали при этом большую биомассу. Очевидно, гибридизация и селекция мейотических сегрегантов - эффективный способ адаптации штаммов-сверхсинтетиков РФ к средам определённого состава.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что сконструированный штамм Agu^r-125 App^r-3 может быть использован для создания промышленных штаммов-сверхсинтетиков РФ и технологии производства кормовых дрожжей, обогащённых витамином В₂, на средах, содержащих дешовые отходы пищевой промышленности.

Ключевые слова: дрожжи, витамин В₂, регуляция биосинтеза рибофлавина, ассимиляция железа, регуляторные гены, клонирование генов, штаммы-сверхсинтетики рибофлавина.

SUMMARY

Kutsyaba V.I. Interaction of regulatory genes for riboflavin biosynthesis and construction of riboflavin-overproducing strains in the yeast Pichia guilliermondii. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology by speciality 03.00.07 - Microbiology. - Institute of Cell Biology, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2007.

The interaction of regulatory genes for riboflavin (RF) biosynthesis and construction of RF-overproducing strains in the yeast Pichia guilliermondii were studied in the work. There was demonstrated that mutations rib80-22, rib83-6 are recessive, nucleous and monogenic. rib83 and rib80 genes participate in the regulation of both RF synthesis and iron acquisition in P. guilliermondii. There was shown that the genes rib80 and rib81, rib81 and HIT1 manifested the synergic type of interaction between each other. Some of the double rib80 rib81 and rib81 hit1 mutants were characteryzed by significantly elevated levels of RF productivity (2 - 3.5 - fold). Mutants with the combined mutations of rib83-6 with rib80-22, rib81-131 and rib80-22 rib81-131 were unable to overproduce RF and derepress synthesis the enzymes of flavinogenesis in iron-deficient as well in iron-supplemented media. It suggests that the rib83-6 mutation is epistatic with respect to the rib80-22 and rib81-131 mutations when they are combined in single genome.

The system for cloning of the positive regulatory gene rib83 by means of functional complementation method using the triple mutant rib1-86 rib81 rib83 was designed. The strains carrying mutations rib80-22, rib81-131 and resistance to purine analogues 8-azaguanine and 4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidine were obtained. They produced RF up to 1.7 g/L in synthetic medium when grown aerobically in laboratory fermenter for 6-7 days. The addition of fodder RF obtained by means of the selected strain to a forage of hens had a positive effect on both body and egg weight. Thus, selected RF-overproducing strains of P. guilliermondii are a perspective source of fodder vitamin B₂.

Key words: yeast, vitamin В₂, regulation of riboflavin biosynthesis, iron assimilation, regulatory genes, gene cloning, riboflavin-overproducing strains.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження біосинтезу рибофлавіну (РФ, вітамін В₂) та його регуляції у дріжджів є фундаментальною науковою проблемою, яка має також біотехнологічне значення. Мутантний штам аспорогенних флавіногенних дріжджів Candida famata dep8, отриманий лише методами класичної селекції, використовується у США для промислового виробництва РФ. Характерною особливістю флавіногенних дріжджів є надсинтез РФ у відповідь на дефіцит заліза у середовищі [Tanner et al., 1945], але механізми його виникнення не встановлені.

Зручною моделлю для дослідження цього феномену є спорогенні флавіногенні дріжджі Pichia guilliermondii, для яких на початок виконання дисертаційної роботи були розроблені методи гібридизації та аналізу мейотичних сегрегантів [Сибирный с соавт., 1977], виявлено 6 структурних (RIB1, RIB2, RIB3, RIB5, RIB6, RIB7) і 5 регуляторних (RIB80, RIB81, HIT1 - негативного типу дії, та RIB83, RIB84 - позитивного типу дії) генів флавіногенезу [Шавловский, Логвиненко, 1985, 1988], виділено і досліджено ферменти біосинтезу РФ, здійснено синтез РФ in vitro [Логвиненко с соавт., 1982]. Дослідження мутантів rib80, rib81 і hit1 показало, що крім надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза вони характеризувалися вищою, ніж клітини дикого типу, швидкістю поглинання ⁵⁵Fe, а мутанти rib80 ще й акумулювали підвищені кількості заліза у клітинах [Шавловский с соавт., 1985, 1988, 1993; Стенчук с соавт., 1991]. Вищу швидкість поглинання ⁵⁵Fe мали також клітини дикого типу при вирощуванні їх у залізодефіцитному середовищі. Ці факти могли свідчити про взаємозв'язок регуляції флавіногенезу і асиміляції заліза у дріжджів. Але через недостатнє дослідження властивостей мутантів з пошкодженими регуляторними генами флавіногенезу, характеру взаємодії регуляторних генів між собою, відсутність інформації про моногенність мутацій, які приводили до згаданих фенотипів регуляторних мутантів, було неможливо однозначно говорити про властивості і роль окремо взятих регуляторних генів у регуляції синтезу ферментів флавіногенезу і асиміляції заліза.

Додаткові дослідження властивостей регуляторних мутантів P. guilliermondii є необхідними для більш глибокого розуміння регуляції експресії структурних генів флавіногенезу на генетичному рівні та для з'ясування молекулярних механізмів контролю біосинтезу РФ і асиміляції заліза, взаємозв'язку між цими процесами у флавіногенних дріжджів. Проведені дослідження є необхідні також для створення наукових підходів до конструювання продуцентів вітаміну В₂, виробництво якого в Україні відсутнє.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота була виконана в рамках науково-дослідних робіт відділу регуляції клітинного синтезу низькомолекулярних сполук Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (зараз відділу регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України) за програмою “Молекулярна біологія” під час виконання таких тем: 1. Шифр теми 2.2.1.10, № держреєстрації 01930034441 “Порівняльне дослідження біохімічних і генетичних факторів, що контролюють біосинтез рибофлавіну у дріжджів” (1993-1995 рр); 2. № держреєстрації 0299U000571 “Вплив порушення регуляції біосинтезу ферментів флавіногенезу і пуринового обміну на нагромадження рибофлавіну у дріжджів” в 1996-1998 рр.; 3. Шифр теми 2.2.1.10, № держреєстрації 0199U000954 “Дослідження біохімічних і генетичних механізмів регуляції біосинтезу вітаміну В₂ і асиміляції заліза у дріжджів” (1999-2001 рр.), а також конкурсних тем Державного фонду фундаментальних досліджень № 5.2/72 “Дослідження транспорту і акумуляції заліза у флавіногенних дріжджів” та № 5.3/352 “Дослідження сумісної дії мутацій регуляторних генів флавіногенезу, біосинтезу пуринів, а також трансформації геном RIB1 на утворення рибофлавіну”.

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи було дослідження властивостей регуляторних мутантів біосинтезу РФ та взаємодії регуляторних генів флавіногенезу дріжджів P. guilliermondii шляхом конструювання гаплоїдних штамів з різними комбінаціями мутантних алелів регуляторних генів, а також впливу мутацій резистентності до аналогів пуринів на продуктивність флавіногенезу. Відповідно до поставленої мети основними завданнями роботи було:

1. перевірити мутації деяких регуляторних генів на моногенність;

2. отримати генетичні докази участі генів, що контролюють біосинтез РФ, у регуляції асиміляції заліза;

3. сконструювати мутанти, які б містили в одному гаплоїдному геномі пошкоджені гени біосинтезу РФ негативного і позитивного типу дії, і дослідити їх властивості;

4. дослідити можливість посилення надсинтезу РФ у мутантів, що містять пошкоджені регуляторні гени біосинтезу РФ негативного типу дії, введенням у їх геном муацій резистентності до аналогів пуринів;

5. перевірити біологічну ефективність РФ, синтезованого сконструйованими штамами-надсинтетиками цього вітаміну, на курах.

Об'єкт дослідження - регуляція біосинтезу РФ та асиміляції заліза у дріжджів P. guilliermondii. Предмет дослідження - властивості мутантів дріжджів з порушеною регуляцією біосинтезу РФ і пуринів; ферменти флавіногенезу; транспорт заліза; регуляторні гени біосинтезу РФ; селекція дріжджів-надсинтетиків РФ. Методи дослідження: кількісна оцінка флавіногенної активності дріжджів та асиміляції заліза із застосуванням методів флуориметрії, хроматографічного аналізу, ізотопних методів, спектрофотометрії; селекція та генетичний аналіз мутантів дріжджів з пошкодженою регуляцією біосинтезу РФ і асиміляції заліза з використанням методів класичної (мутагенізація, комплементаційний та сегрегаційний аналізи) та молекулярної генетики (конструювання та аналіз геномної бібліотеки дріжджів P. guilliermondii у гомологічній системі, виділення і ретрансформація плазмідної ДНК), а також мікробної біотехнології (культивування продуцентів у лабораторному ферментері).

Наукова новизна отриманих результатів.

Отримано прямі докази плейотропної дії гена RIB80, який бере участь у регуляції як біосинтезу РФ, так і асиміляції заліза.

Вперше показано, що гени RIB80 і RIB81 та RIB81 і HIT1 взаємодіють у процесі біосинтезу РФ за типом синергізму.

Вперше показано, що ген RIB83 здійснює позитивний контроль як біосинтезу РФ, так і транспорту заліза. Мутація rib83-6 блокує надсинтез РФ і дерепресію синтезу ферментів флавіногенезу не тільки у мутантів rib80 чи rib81, але й у подвійних мутантів rib80 rib81 і навіть у залізодефіцитних умовах. Вона також знижує швидкість поглинання заліза клітинами і їх фериредуктазну активність.

Сконструйовано стабільний штам-реципієнт генотипу rib1-86 rib81 rib83 і на його основі створено систему для клонування регуляторного гена RIB83.

Показано, що введення у геном мутанта генотипу rib80 rib81 мутацій резистентності до 8-азагуаніну і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину веде до значного посилення надсинтезу РФ, очевидно, внаслідок кращого постачання цього процесу пуринами. В такий спосіб отримано штами, які синтезують до 1,7 г РФ в 1 л синтетичного середовища при вирощуванні у лабораторному ферментері.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи є важливими для розуміння механізму виникнення надсинтезу РФ і науково обгрунтованого конструювання штамів-надсинтетиків РФ у флавіногенних дріжджів. Детальна характеристика властивостей регуляторних мутантів біосинтезу РФ є основою для досліджень молекулярних механізмів регуляції флавіногенезу і асиміляції заліза.

Виготовлено препарат кормового РФ з використанням одного із сконструйованих штамів-надсинтетиків вітаміну. Отримано позитивні результати при дослідженні біологічної ефективності РФ з препарату на курах. Селекціоновано штами, які синтезують до 800 мг РФ в 1 л середовища, що містить зернове сусло, післяспиртову зернову барду, меласу. Вони можуть бути використані для розробки технології виробництва кормових дріжджів, збагачених вітаміном В₂.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження, а також виконано майже весь обсяг експериментальних досліджень. Дослідження швидкості транспорту заліза у регуляторних мутантів проводились спільно із пров.н.с. Федорович Д.В. Визначення активностей ферментів флавіногенезу частково були проведені спільно з пров. інженером Кшановською Б.В. Клонування фрагментів ДНК з банку генів дріжджів P. guilliermondii, які комплементували/супресували РФ-залежність сконструйованого штама-реципієнта rib1-86 rib81 rib83, виконано разом з інженером Пинягою Ю.В. та с.н.с. Борецьким Ю.Р. з відділу молекулярної генетики і біотехнології. Дослідження біологічної ефективності РФ, синтезованого сконструйованим штамом-надсинтетиком цього вітаміну Agu^r-125 App^r-3, проводились в Інституті біології тварин УААН та особисто автором на пташнику ТзОВ “Еней-Пласт”. Планування дослідів, аналіз та обговорення отриманих результатів були проведені спільно з науковим керівником. Написання та оформлення публікацій здобувач здійснював разом з співавторами.

Апробація результатів досліджень. Основні положення роботи доповідались і були представлені на з'їздах Товариства мікробіологів України (Одеса, 1993; Чернігів, 2000; Одеса, 2004), Українських біохімічних з'їздах (Київ, 1992; Чернівці, 2002; Харків, 2006), Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), всесоюзній конференції “Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов” (Пущино, СРСР, 1989), науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, Україна, 2002), всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (Львів, Україна, 1994), VII міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів GIM-94 (Монреаль, Канада, 1994), XXI міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Львів, Україна, 2001), міжнародному конгресі “Bioiron 2003” (Бетесда, США, 2003), ХХІ міжнародній конференції по генетиці і молекулярній біології дріжджів (Гетеборг, Швеція, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 28 наукових праць, у тому числі 8 статей у співавторстві, та тези 20 доповідей на міжнародних і українських наукових конференціях.

Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаних джерел та додатки. Дисертацію викладено на 174 сторінках і проілюстровано 20 рисунками та 18 таблицями. Список літератури включає 255 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається з 5 розділів, в яких охарактеризовано біосинтез РФ та його регуляцію у дріжджів, міцелійних грибів та бактерій. Розглянуто сучасні уявлення про загальні закономірності регуляції експресії генів вищих еукаріот і дріжджів.

Матеріали та методи дослідженнь. У роботі були використані такі штами дріжджів Pichia guilliermondii: АТСС 9058 - дикий тип; штами генетичної лінії L1 ade2-19 MAT⁺, L2 hisX-17 MAT^-, L3 metX-1 MAT⁺, L4 cytX-1 MAT^-; регуляторні мутанти 1018/33 metX-1 rib80-22 MAT⁺, S131/6 metX-1 rib81-131 MAT⁺, SW6-18 hisX-17 rib83-6 MAT⁺, Rop^--13 metX-1 rib83 MAT^-, Rop^--27 metX-1 rib83 MAT^-; РА49 ade2 rib7 MAT⁺ - РФ-залежний мутант; D163 L26 Arg^- rtr^{+ ( I )} MAT^- - мутант, у якого порушений транспорт РФ; Д26/5-3С.6 rib7 rtr⁺ rib81 MAT^- - надсинтетик 6,7-диметил-8-рибітиллюмазину (сконструйований у даній роботі). Всі штами були селекціоновані і підтримуються у відділі регуляторних систем клітини. Бактерійний штам E. coli DH5б lacZ?M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(r_k^-, m_k⁺), supE44, relA1, deoR, ?(lacZYA-argF)U169) використовувався для селекції та ампліфікації плазмід (з колекції відділу молекулярної генетики і біотехнології).

Дріжджі вирощували при 30 ^оС у модифікованому синтетичному середовищі Беркгольдера [Шавловский с соавт., 1978]. Використовували середовища з високим (0,2 мг/л -середовище з оптимальним для росту вмістом заліза) і низьким (0,01 мг/л - залізодефіцитне середовище) вмістом заліза, яке додавали у вигляді солі Мора. Від заліза середовище очищали за допомогою 8-гідроксихіноліну [Warring, Werkman, 1943]. При необхідності у середовище вносили аденін, метіонін, гістидин, цитозин - по 40 мг/л, лізин і РФ - по 200 мг/л. Агаризовані середовища містили 2 % агару.

Бактерії E. coli DH5б вирощували при 37 ^оС у середовищі LB (Ausubel et al., 1990). Для селекції клітин, які містили плазміди, використовували ампіцилін у концентрації 100 мг/л. Для трансформації штами дріжджів вирощували при 30 ^оС у багатому середовищі YPD.

Схрещування ауксотрофних мутантів і аналіз мейотичних сегрегантів проводили за [Сибирный с соавт., 1977], а гібридизацію дріжджів шляхом злиття протопластів - за [Сибирный с соавт., 1982].

Біомасу визначали турбідиметрично на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М. Вміст флавінів у культуральній рідині і екстрактах клітин визначали флуорометрично на приладі ЕФ-3М, використовуючи для стандартного розчину РФ синтетичний вітамін В₂ [Bessey et al., 1949].

Концентрацію негемінового заліза в клітинах визначали за Kurup and Brodie, 1967], загальний вміст заліза у клітинах - за [Ковалёв с соавт., 1984]. Визначення швидкості поглинання заліза клітинами проводили за допомогою циклотронного ⁵⁵FeCl₃ з питомою активністю 16 · 10¹¹ Бк/г в 0,5 N HCl (Ленінградське відділення В/О “Изотоп”). Склад інкубаційної суміші та умови визначення описані в [Шавловский с соавт.. 1988]. Фериредуктазну активність клітин дріжджів визначали за [Lesuisse et al., 1987], використавши для зв'язування Fe(II) його хелатор ,'-дипіридил.

Активності ГТФ-циклогідролази II і РФ-синтази визначали у безклітинних екстрактах за [Логвиненко с соавт., 1982, 1973]. За одиницю активості фермента (Од.) приймали його кількість, яка забезпечує синтез 1 мкмоля продукту за 1 хв. Питому активність виражали числом одиниць на мг білку.

Виділення нуклеотидів з культуральної рідини здійснювали за [Шавловский с соавт.. 1970], а їх ідентифікацію і кількісне визначення за [Шавловский с соавт., 1969]. Мутагенез дріжджів проводили за допомогою УФ-променів [Логвиненко с соавт., 1972], виділення мутантів, резистентних до аналогів пуринів, - за [Pickering, Woods, 1973].

Дослідний препарат кормового РФ готували шляхом кип'ятіння вирощеної культури сконструйованого штама-надсинтетика Agu^r-125 App^r-3. Препарат змішували з кормом курей за допомогою побутового розпилювача “Росинка”.

Молекулярно-генетичні методи, що були використані під час експериментів, описані у [Маниатис с соавт., 1984]. Електротрансформацію дріжджів P. guilliermondii проводили за [Sibirny, 1996], а бактерій E. сoli - за [Tsuji et al., 1990]. Виділення плазмідної ДНК з клітин P. guilliermondii проводили за [Boretsky et al., 1999], а з клітин E. сoli - за [Birnboim and Doly, 1979]. Геномну бібліотеку P. guilliermondii конструювали за схемою, описаною у [Voronovsky et al., 2002]. Статистичну обробку результатів проводили за [Деркач с соавт., 1977].

Результати досліджень та їх аналіз

1. Генетичний і біохімічний аналіз мутантів rib80. Попередні дослідження властивостей мутантів rib80 показали, що вони не тільки здійснюють надсинтез РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза внаслідок дерепресії синтезу ферментів флавіногенезу, але і містять підвищені у 2-4 рази кількості заліза у клітинах і виявляють високу швидкість поглинання цього металу з різних комплексів [Шавловский с соавт., 1985, 1988]. Було висловлене припущення про поліфункціональність гена RIB80, але воно не було перевірене генетично.

Селекція мутантів rib80 була складною [Шавловский с соавт., 1982]. Вона складалася з кількох етапів мутагенізації клітин дріжджів, тому не можна було виключити, що фенотип мутантів rib80 обумовлений не однією, а кількома мутаціями у різних генах. Для перевірки цього припущення було проведено три реципрокні схрещування мутантів rib80 зі штамом дикого типу L2 (hisX-17 MAT^-), використавши для першої гібридизації штам rib80-22 1018/9 (mеtX-1 МАТ⁺). Всі отримані диплоїди „rib80/RIB80” характеризувалися регуляцією флавіногенезу, що властива штамам дикого типу. З цих диплоїдів отримували ауксотрофні мейотичні сегреганти, які відрізнялись між собою за флавіногенною активністю.

Біосинтез РФ - ознака кількісна, на проявлення якої впливає велика кількість взаємодіючих генів (полігенів). Продуктивність флавіногенезу у регуляторних мутантів rib80 визначають як гени основної дії (вони визначають розвиток ознаки), так і гени-модифікатори - інтенсифікатори і супресори. Разом вони складають генетичне оточення мутантного алеля rib80-22, яке може дуже відрізнятися у різних мейотичних сегрегантів одного диплоїда внаслідок рекомбінації геному диплоїда „rib80/RIB80” під час мейозу. У результаті продуктивність флавіногенезу різних мейотичних сегрегантів rib80 може відрізнятися у декілька разів і у деяких з них наближатися до продуктивності флавіногенезу сегрегантів дикого типу.

Для того щоб уникнути помилки включення низькофлавіногенних сегрегантів генотипу rib80 у групу сегрегантів дикого типу, було проведено оцінку меж коливання продуктивності флавіногенезу мейотичних сегрегантів дикого типу. Для цього дослідили продуктивність флавіногенезу мейотичних сегрегантів диплоїда Д64/10, який був отриманий внаслідок схрещування штамів генетичної лінії L2 і L3. Продуктивність флавіногенезу цих сегрегантів коливалася у межах 0,2 - 0,5 мкг/мг, що стало критерієм при розділенні мейотичних сегрегантів диплоїдів генотипу „rib80/RIB80” на сегреганти дикого типу і rib80.

В одному з типових експериментів по аналізу ауксотрофних мейотичних сегрегантів третього покоління диплоїда Д65/1 генотипу „rib80/RIB80” було встановлено, що мейотичне розщеплення за ознакою”надсинтез РФ” було близьким до співвідношення 1:1 (ч²_екс = 2,96; ч²_р=0,05 = 3,84). На основі отриманих результатів було зроблено висновок про моногенність мутації rib80-22, а також про її рецесивність та ядерну локалізацію. Доведення моногенності мутації rib80-22 дозволило також встановити флавіногенний потенціал мутантного алеля rib80-22. При оптимальному генетичному оточенні мутантного алеля rib80-22 окремі флавіногенні мейотичні сегреганти мали продуктвність флавіногенезу до 4,7 мкг РФ/мг сухих клітин. Запропонований підхід був використаний при встановленні флавіногеного потенціалу мутантних алелів генів RIB81 і HIT1 та дослідженні типу взаємодії між регуляторними генами RIB80 і RIB81 та RIB81 і HIT1, коли необхідно було встановити максимально можливу продуктивність подвійних регуляторних мутантів rib80 rib81 і rib81 hit1.

Сегреганти rib80 характеризувалися високою швидкістю поглинання ⁵⁵Fe, приблизно такою ж, як вихідний мутант rib80 1018/189 Сегреганти з низькою продуктивністю флавіногенезу за швидкістю поглинання ⁵⁵Fe не відрізнялись від вихідного штама L2. Між інтенсивністю біосинтезу РФ і швидкістю поглинання заліза існує сильна кореляція (r₁ = + 0,90).

Диплоїд, отриманий внаслідок схрещування мутанта rib80 1018/183 зі штамом дикого типу, не відрізнявся від останнього за продуктивністю флавіногенезу, швидкістю поглинання заліза, а також його вмістом у клітинах.

За допомогою УФ-променів зі штаму rib80 1018/183 було отримано ревертанти, нездатні до надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, що характерно для штамів дикого типу. Майже всі ревертанти містили мутацію rib80, що було показано за допомогою комплементаційного аналізу. Тільки у диплоїда, отриманого схрещуванням ревертанта 1018/183-6 з мутантом rib80 1018/189, продуктивність флавіногенезу була такою ж, як у штаму дикого типу. Дослідження флавіногенезу 144 мейотичних сегрегантів, виділених з диплоїда, що був отриманий схрещуванням ревертанта 1018/183-6 з штамом дикого типу L2, показало, що вони були нездатні до надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, тобто мутантний алель rib80-22 у геномі ревертанта не був виявлений. Клітини ревертанта 1018/183-6 характеризувалися регуляцією флавіногенезу залізом, яка властива клітинам дикому типу, а також не відрізнялись від штаму дикого типу за швидкістю поглинання ⁵⁵Fe і вмістом цього металу. У середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза активності ГТФ-циклогідролази ІІ (0,49 • 10^-5 Од./мг білку) і РФ-синтази (4,22 • 10^-5 Од./мг білку) у ревертанта були близькими до активностей цих ферментів у штаму дикого типу.

Очевидно, у штаму 1018/183-6 відбулася реверсія у мутантному алелі rib80-22, яка привела до того, що швидкість поглинання ⁵⁵Fe і вміст цього металу в клітинах, а також регуляція флавіногенезу і активності ферментів цього процесу залізом повернулися до рівнів, що характерні для штамів дикого типу. Отримані результати однозначно доводять, що мутація rib80-22 є моногенною, рецесивною і має плейотропну дію.

2. Генетичний аналіз мутантів rib81. Дослідженями диплоїдів генотипу „rib81/RIB81” і їх сегрегантів було показано, що мутація rib81-131 рецесивна, ядерна і моногенна [Бабяк с соавт., 1993]. У проведених дисертантом додаткових дослідах по аналізу мейотичних сегрегантів з диплоїдів, отриманих після схрещування штамів rib81 (вони містили мутацію rib81-131) з штамами генетичної лінії L1, L2, L3, було виявлено не дві, а три групи сегрегантів: 1) сегреганти, які у рідкому середовищі Беркгольдера, що містило 0,2 мг Fe/л, мали продуктивність флавіногенезу 5,3 - 22 мкг/мг, і штрихи яких на агаризованому середовищі світилися під УФ; їх фенотип було позначено Rop⁺ (riboflavin overproduction); 2) сегреганти, які у рідкому середовищі мали продуктивність флавіногенезу 0,86 - 3,7 мкг/мг, і штрихи яких на агаризованому середовищі не світились під УФ; їх фенотип було позначено Olm⁺ (overproduction only in liquid medium); 3) сегреганти дикого типу з продуктивністю флавіногенезу 0,15 - 0,5 мкг/мг. В одному з типових дослідів було проаналізовано 120 мейотичних сегреганти диплоїда Д64/5 генотипу „rib81/RIB81”. З них 24 сегреганти мали фенотип Rop⁺ (20 %), 38 - фенотип Olm⁺ (31,7 %), 58 - фенотип дикого типу (48,3 %). Важливо відмітити, що фенотипи Rop⁺ і Olm⁺ разом складають 51,7 % сегрегантів.

Для встановлення природи сегрегантів Olm⁺, їх схрестили з штамами rib81, дикого типу і Olm⁺ протилежного типу спарювання. Диплоїди „Olm⁺/rib81” мали продуктивність флавіногенезу як сегреганти Olm⁺ (0,5 - 3,5 мкг/мг), диплоїди „Olm⁺/дикий тип” - як штами дикого типу, диплоїди „Olm⁺/Olm⁺” - більшу від штамів дикого типу (0,5 - 2,0 мкг/мг). Аналіз мейотичних сегрегантів диплоїдів „Olm⁺/дикий тип” і „Olm⁺/Olm⁺” не виявив у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза сегрегантів фенотипу Rop⁺.

На основі цих результатів можна зробити припущення, що фенотип Olm⁺ обумовлений супресією мутації rib81-131 супресорною(-ними) мутацією(-іями), які присутні у штамах генетичної лінії. Природа їх невідома. Вони могли виникнути у штамах генетичної лінії під час селекції. Отримані результати є важливими для молекулярно-генетичних досліджень та конструювання штамів-надсинтетиків РФ дріжджів Р. guilliermondii, тому що при цьому використовуються мутанти, що є похідними штамів генетичної лінії.

3. Генетичний і біохімічний аналіз мутантів rib83. Мутанти rib83, на відміну від штамів дикого типу, у залізодефіцитному середовищі не здатні до надсинтезу РФ. За цих умов у них не відбувається дерепресія синтезу ферментів флавіногенезу, що, очевидно, і є причиною відсутності надсинтезу вітаміну [Шавловский с соавт., 1989]. Для того щоб вияснити, чи ця властивість мутантів rib83 визначається однією мутацією, було отримано диплоїд Д88/37 генотипу „rib83/RIB83” і проаналізовано характер мейотичного розщеплення у його сегрегантів за ознакою „надсинтез РФ” у залізодефіцитних умовах. У випадковій вибірці з 75 мейотичних сегрегантів 39 з них (52 %) синтезували РФ в межах 0,4 - 0,8 мкг/мл, тобто були нездатні до його надсинтезу. У інших 36 сегрегантів (48 %), як і у диплоїда Д88/37, спостерігали надсинтез РФ (15 - 76 мкг/мл). Таким чином, співвідношення між двома групами мейотичних сегрегантів (39:36) диплоїда Д88/37 є близьким до теоретично очікуваного 1:1. Отримані результати свідчать про моногенність, рецесивність мутації rib83-6 та її ядерну локалізацію.

Регуляторні гени RIB80, RIB81 і HIT1 у P. guilliermondii беруть участь у контролі не тільки біосинтезу РФ, але і транспорту заліза [Шавловский с соавт., 1988, 1993]. З метою встановлення, чи ген RIB83 володіє такою ж поліфункціональністю, було досліджено вплив мутації rib83-6 на швидкість поглинання заліза, фериредуктазну активність та вміст заліза у клітинах мутантів rib83, що були вирощені у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза і залізодефіцитному середовищі. З представлених у табл. 3 результатів видно, що у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза клітини штамів дикого типу і мутантів rib83 не відрізнялись суттєво за інтенсивністю поглинання ⁵⁵Fe. Дефіцит заліза у середовищі посилює його поглинання клітинами, але рівень цього посилення (співвідношення радіоактивності клітин у залізодефіцитному середовищі до радіоактивності клітин у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза) у мутантів rib83 майже втричі менший, ніж у штамів дикого типу. Очевидно, мутація rib83-6 послаблює швидкість транспорту заліза у клітини за умови його дефіциту у середовищі.

Зниження швидкості поглинання заліза у клітинах мутантів rib83 могло бути викликане негативною дією мутації rib83-6 на фериредуктазну активність клітин, яка є необхідною для відновлення Fe(ІІІ) до Fe(ІІ) (відновлення заліза є одним з етапів високоафінного транспорту цього металу). Тому досліджували вплив мутації rib83-6 на ріст, флавіногенез, а також на фериредуктазну активність і вміст заліза в клітинах штамів 43-Д88/37 (дикий тип) і 60-Д88/37 (мутант rib83). У середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза не було виявлено суттєвих відмінностей між двома штамами за згаданими властивостями, тоді як у залізодефіцитних умовах мутація rib83-6 викликає зниження інтенсивності росту штама 60-Д88/37 і блокує у нього надсинтез РФ. Крім того, у штама дикого типу, на відміну від мутанта, після стаціонарної фази спостерігали другу логарифмічну фазу, в кінці якої його біомаса досягала більше 3 мг/мл, тоді як у мутанта rib83 вона залишалась на рівні 0,7 мг/мл.

Що стосується фериредуктазної активності клітин, що були вирощені у залізодефіцитних умовах, то у процесі росту штамів їх здатність до відновлення Fe(ІІІ) знижувалась, але після 45 год. культивування у штама дикого типу вона поступово зростала, а у мутанта rib83 залишалась на низькому рівні . Вірогідно, зростання фериредуктазної активності штама дикого типу у залізодефіцитних умовах сприяє кращому забезпеченню його залізом і є причиною диауксії росту у нього. Вміст заліза у його клітинах, як і у клітинах мутанта rib83, при цьому не змінювався і на протязі досліду становив 20 - 25 мкг/г сухих клітин. Таким чином, ген RIB83 дріжджів Р. guilliermondii проявляє плейотропну дію, здійснюючи позитивний контроль не тільки біосинтезу РФ, але і поглинання заліза.

4. Властивості подвійних мутантів rib80 rib81. Як було показано вище, регуляторні гени RIB80 і RIB83 є поліфункціональними: вони контролюють як біосинтез РФ, так і транспорт заліза. Таку ж поліфункціональність проявляють гени RIB81 і HIT1 [Шавловский с соавт., 1985, 1993; Стенчук с соавт., 1991]. Можна було припустити, що продукти цих генів якимось чином взаємодіють між собою. З метою вивчення можливої взаємодії регуляторних генів RIB80 і RIB81 було отримано штами, що містили їх мутантні алелі в одному гаплоїдному геномі. Для цього схрестили між собою мутанти 9-Д52/71 rib80 та 4-Д77/3 rib81 і з отриманого диплоїда виділили гаплоїдні мейотичні сегреганти. Наявність мутацій rib80-22 та rib81-131 у кожного з відібраних сегрегантів визначали шляхом його гібридизації з мутантами rib80 та rib81. Висока флавіногенна активність диплоїдів обох типів свідчила про те, що сегрегант має генотип rib80 rib81.

Для того, щоб встановити характер взаємодії регуляторних генів RIB80 і RIB81, порівнювали продуктивності флавіногенезу найбільш флавіногенних сегрегантів генотипу rib80 rib81 з продуктивністю флавіногенезу не вихідних штамів rib80 та rib81, а найбільш флавіногенних сегрегантів диплоїдів „rib80/RIB80” та „rib81/RIB81”. Вірогідно, таким способом можна обійти негативний вплив супресорних мутацій і порівнювати флавіногенні потенціали мутантних алелів регуляторних генів, коли вони знаходяться в оптимальному генетичному оточенні. Найпродуктивніші сегреганти генотипу rib81 диплоїда „rib81/RIB81” синтезували до 20 - 22 мкг РФ/мг сухих клітин, а генотипу rib80 диплоїда „rib80/RIB80” - до 3,5 - 4,5 мкг РФ/мг сухих клітин. Очевидно, що максимальна продуктивність флавіногенезу сегрегантів генотипу rib80 rib81 (40 - 45 мкг/мг) є значно вищою, ніж це могло б бути у випадку простого сумування максимальних ефектів мутацій rib80-22 і rib81-131. Отже, мутації rib80-22 та rib81-131, що знаходяться в одному гаплоїдному геномі, стимулюють біосинтез РФ у Р. guilliermondii за типом синергізму.

Виявилось, що синергідна взаємодія мутацій rib80 та rib81 проявляється також на рівні дерепресії синтезу ГТФ-циклогідролази ІІ. У штаму 9-Д78/2 активність ГТФ-циклогідролази ІІ була у 3,5 раза вищою від максимальних значень активностей цього фермента у мутантів rib81, відомих з літератури [Шавловский с соавт., 1990, 1993; Бабяк с соавт., 1993]. Рівні активності РФ-синтази сегрегантів rib80 rib81 і мутантів rib81 суттєво не відрізнялися.

Для всіх досліджених сегрегантів генотипу rib80 rib81 характерна дуже висока швидкість поглинання ⁵⁵Fe - на порядок вища, ніж у батьківських штамів. Таким чином, і в цьому випадку спостерігається синергідна дія мутацій rib80-22 і rib81-131. Визначення вмісту заліза в клітинах сегрегантів rib80 rib81 показало, що за його вмістом вони не відрізнялися суттєво від мутанта rib80. Тобто у цьому випадку синергідна взаємодія мутацій rib80-22 та rib81-131 не відбувається.

5. Властивості подвійних мутантів rib81 hit1. Для вивчення флавіногенного потенціалу мутації hit1-1 схрестили мутант 30-Д84/1 hit1 з штамом генетичної лінії L1. З отриманого диплоїда Д87/8 виділили мейотичні сегреганти, у яких визначили продуктивність флавіногенезу. Як і у випадку сегрегантів rib80 та rib81, для сегрегантів hit1 була характерна висока флавіногенна мінливість, очевидно, внаслідок різного генетичного оточення мутації hit1-1 у кожного окремо взятого сегреганта. Найбільш флавіногенні мейотичні сегреганти hit1 мали продуктивність флавіногенезу 4,5 - 5,5 мкг/мг.

Для того щоб отримати штами генотипу rib81 hit1, схрестили між собою мутанти 18-Д84/1 hit1-1 та 4-Д77/3 rib81-131 і з отриманого диплоїда Д85/122 виділили гаплоїдні мейотичні сегреганти. Наявність мутантних алелів обох регуляторних генів у окремих флавіногенних сегрегантів перевіряли за допомогою комплементаційного аналізу, схрещуючи їх з мутантами rib81 та hit1 протилежного типу спарювання. Висока флавіногенна активність диплоїдів обох типів, що були вирощені у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, свідчила про те, що сегрегант має генотип rib81 hit1. Продуктивність флавіногенезу у частини подвійних сегрегантів досягала 70 - 80 мкг РФ/мг біомаси. Ці сегреганти росли у синтетичному середовищі значно гірше, ніж інші сегреганти диплоїда Д85/122, і швидко (протягом 2 - 3 тижнів) ревертували за ознакою „надсинтез РФ” до рівня сегрегантів rib81.

Враховуючи те, що у найбільш флавіногенних сегрегантів генотипу rib81 диплоїда „rib81/RIB81” продуктивність флавіногенезу становила 20 - 22 мкг/мг, а у сегрегантів hit1 диплоїда „hit1/HIT1” - лише 4,5 - 5,6 мкг/мг, можна зробити висновок, що мутації rib81-131 та hit1-1 взаємодіють між собою за типом синергізму у процесі біосинтезу РФ

6. Властивості потрійних мутантів rib80 rib81 rib83. Про те, що мутація rib83-6 епістатує над мутаціями rib80-75 та rib81-131 повідомлялося у 1989 році [Шавловский с соавт., 1989]. Такий висновок було зроблено на основі того, що подвійні мутанти rib80 rib83 і rib81 rib83 були нездатні до надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза. Однак моногенність згаданих мутацій не була досліджена, а активності ферментів флавіногенезу у таких подвійних мутантів не визначались. Для того, щоб встановити тип взаємодії між мутацією rib83-6 і мутаціями rib80-22 та rib81-131, моногенність яких була доведена, сконструювали гаплоїдні штами генотипу rib80 rib83, rib81 rib83 та rib80 rib81 rib83. Представлені на рис. 4 результати свідчать про те, що мутація rib83-6 блокує надсинтез РФ не тільки у подвійних мутантів rib80 rib83 і rib81 rib83, але і у потрійного мутанта rib80 rib81 rib83 як у залізодефіцитному середовищі, так і у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, незважючи на те, що мутації rib80-22 і rib81-131 при сумісній дії посилюють біосинтез РФ за типом синергізму, а у залізодефіцитному середовищі у мутантів rib80, rib81 та rib80 rib81 відбувається ще й додаткове зростання надсинтезу РФ.

Раніше було показано, що у мутантів rib83 у залізодефіцитному середовищі дерепресія синтезу ферментів флавіногенезу не відбувається [Шавловский с соавт., 1989] і це, очевидно, є причиною їх нездатності до надсинтезу РФ порівняно з штамами дикого типу. Відсутність дерепресії синтезу ГТФ-циклогідролази ІІ і РФ-синтази було виявлено не тільки у подвійних мутантів rib80 rib83 і rib81 rib83, але і у потрійного мутанта rib80 rib81 rib83 як у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, так і у залізодефіцитному середовищі. Це, вірогідно, і є причиною нездатності цих мутантів до надсинтезу РФ. Очевидно, ген RIB83 відіграє центральну роль у регуляції біосинтезу РФ. Пошкодження цього гена приводить до блокування дії всіх відомих факторів, що викликають надсинтез РФ.

7. Розробка підходів та конструювання штаму-реципієнта для клонування гена RIB83 з банку генів дріжджів P. guilliermondii методом функціональної комплементації. Властивість мутації rib83-6 епістатувати над мутацією rib81-131 була використана при конструюванні штама реципієнта, за допомогою якого була створена система для клонування гена RIB83. У 1991 році було описано мутант rib1-86, який за своїм фенотипом нагадував мутанти rib1 (фенотип Rib^-), але, на відміну від них, втрачав свою РФ-залежність після пошкодження у нього гена RIB81 [Шавловский с соавт., 1991]. Пізніше було показано, що виділений мутант rib1-86 є брадітрофним (leaky) мутантом по гену RIB1, а також виявлено значне підвищення експресії гена RIB1 у мутанта rib81, що був вирощений у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза [Boretsky et al., 2005]. Вірогідно, мутація rib81-131 викликає надсинтез мутованого білка ГТФ-циклогідролази II. Це приводить до синтезу невеликої кількості РФ, достатньої для росту подвійного мутанта rib1-86 rib81 (фенотип Rib⁺).

Введення мутації rib83-6 у геном мутанта rib1-86 rib81 приводило до РФ-ауксотрофності (фенотип Rib^-) потрійного мутанта rib1-86 rib81 rib83 - реципієнта. Очевидно, мутація rib83-6 повністю виключає дію мутації rib81-131, тому введення гена RIB83 у складі плазмід у клітини такого потрійного мутанта буде приводити до відновлення дії мутації rib81-131 і, як наслідок, до появи клонів з фенотипом Rib⁺, які можна було б відбирати на синтетичному середовищі без РФ. Це спостереження стало основою для розробки системи клонування гена RIB83 Р. guilliermondii з бібліотеки генів цих дріжджів методом функціональної комплементації.

Для того, щоб провести таке клонування, було відібрано стабільний штам rib1-86, сконструювано стабільний потрійний мутант rib1-86 rib81 rib83 (реципієнт), підібрано метод трансформації і оптимальні параметри електропорації, сконструйовано бібліотеку генів дріжджів Р. guilliermondii, проведено трансформацію реципієнта банком генів, перевірено відібрані трансформанти на наявність плазмід, здійснено ретрансформацію реципієнта виділеними плазмідами. В одному з дослідів по трансформації штама E. coli DH5б плазмідним препаратом з дріжджового трансформанта №21 було отримано 6 колоній, з яких була виділена плазміда, що мала більший розмір, ніж вихідний вектор рUC-ARS. Ця плазміда (позначена pN1) з низькою ефективністю (10 трансф./мкг ДНК) трансформувала штам-реципієнт до прототрофності за РФ. Виділена з дріжджових трансформантів плазміда pN1 за молекулярною масою не відрізнялась від плазміди, що була виявлена у трансформантах E. coli. Було проведено рестрикційний аналіз плазмід рUC-ARS і pN1 за допомогою ендонуклеаз рестрикції ЕсоR1 і HincII.

Рестрикційний аналіз плазміди pN1за допомогою рестриктази ЕсоR1 (варіант № 6) показав, що вона розщеплюється на два фрагменти: вихідний вектор рUC-ARS (3,5 т.п.н.) і фрагмент хромосомної ДНК Р. guilliermondii, що несе, вірогідно, ген RIB83 або його супресор (1,7 т.п.н.). Рестрикційний аналіз плазміди pN1 за допомогою рестриктази HincII (варіант № 5) показав, що вона розщеплюється на чотири фрагменти, одним з яких є фрагмент хромосомної ДНК Р. guilliermondii, що несе ARS-послідовність (0,82 т.п.н.), яка міститься і у вихідній плазміді рUC-ARS. Очевидно, клонований фрагмент хромосомної ДНК Р. guilliermondii містить чотири сайти рестрикції HincII. На основі цих результатів запропонована схема плазміди pN1, а також зроблено висновок про клонування фрагмента геному Р. guilliermondii АТСС 9058, який містить ген (можливо, неповний), що комплементує або супресує мутацію rib83-6. Його ідентифікація потребує окремих досліджень.

8. Суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib81 і резистентності до 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину. Дослідження надсинтезу РФ у про- і еукаріотичних мікроорганізмів показало, що важливу роль у цьому процесі має як активність ферментів флавіногенезу, так і його постачання пуринами. Однак ефект суміщення мутацій, що пошкоджують регуляторні гени флавіногенезу негативного типу дії з мутаціями, що порушують регуляцію біосинтезу пуринових нуклеотидів, в одному гаплоїдному геномі на біосинтез РФ до цього часу не досліджувався, хоч це питання важливе для розуміння механізмів надсинтезу РФ у мікроорганізмів і науково обгрунтованої селекції високоактивних продуцентів цього вітаміну.

На першому етапі такого завдання з штаму дикого типу 7-Д82/1 LysX виділили більше 90 мутантів, резистентних до 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину (фенотип мутантів - App^r). У культуральній рідині мутанта App^r-27 було виявлено підвищені кількості урацилу і ксантину. Якщо у вихідного штаму 7-Д82/1 продуктивність біосинтезу урацилу становила 0,39 мкг/мг сухих клітин, а ксантину - 0,2 мкг/мг, то у мутанта App^r-27 - 1,82 і 3,84 мкг/мг, що, відповідно, у 4,6 і 19,4 раза більше. Очевидно, у мутанта App^r-27 порушена регуляція біосинтезу пуринів і піримідинів de novo мутацією (-ями) app^r.

Для того щоб встановити, чи буде посилюватися синтез РФ у мутантів rib81 після введення в їх геном мутації (-ій) app^r, схрестили мутант 4-Д77/3 rib81 як зі штамом дикого типу 7-Д82/1, так і з мутантом App^r-27. З отриманих диплоїдів виділяли мейотичні сегреганти і досліджували їх флавіногенну активність. Продуктивність флавіногенезу окремих сегрегантів першого диплоїда досягала 22,7 мкг/мг (84 мкг/мл), а другого - 74,4 мкг/мг (186 мкг/мл). Вірогідно, більш високий рівень продуктивності флавіногенезу сегрегантів другого диплоїда є наслідком того, що вони містять у своєму геномі мутації rib81-131 і app^r. Перша з них викликає дерепресію синтезу ферментів флавіногенезу, а друга (-і) - посилює (-ють) синтез пуринів - попередників РФ.