Взаємодія регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну і конструювання штамів-надсинтетиків цього вітаміну у дріжджів Pichia guilliermondii

9. Виділення мутантів rib80 rib81, резистентних до 8-азагуаніну і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину. Використавши УФ-промені як мутаген і аналоги пуринів 8-азагуанін і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідин як селективні фактори, з одного з мутантів генотипу rib80 rib81 отримано колекцію мутантів, резистентних до цих аналогів. Один з них (Agu^r-125 App^r-3) синтезував більше 800 мг РФ в 1 л синтетичного середовища за 7 діб вирощування у колбах або пробірках, вірогідно, за рахунок кращого постачання флавіногенезу пуринами. Серед флавіногенних прототрофних сегрегантів диплоїда Д86/2, отриманого внаслідок схрещування штама Agu^r-125 App^r-3 з мутантом rib80 rib81, були виявлені такі, що синтезували до 1 г РФ в 1 л синтетичного середовища. Два з них при вирощуванні у лабораторному ферментері, коли концентрація розчиненого кисню не опускалась нижче критичної межі (4 - 6 %), синтезували до 1,7 г РФ/л. При цьому вони значно відрізнялися за інтенсивністю росту і флавіногенезу, а також потребували різної інтенсивності аерації для максимального синтезу РФ.

Селекціоновані штами-надсинтетики дріжджів P. guilliermondii можуть мати практичне значення для виробництва дешевих кормових дріжджів, збагачених вітаміном В₂. Перевірили здатність рости і синтезувати РФ штама Agu^r-125 App^r-3 і флавіногенних прототрофних сегрегантів диплоїда Д86/2 у середовищі, що містило лише промислові субстрати - післяспиртову зернову барду, меласу і зернове сусло (8:1:1, v/v/v). Штам Agu^r-125 App^r-3 синтезував лише 250 мг РФ/л середовища, тоді як деякі з сегрегантів - до 800 мг РФ/л, і нагромаджували більшу біомасу. Очевидно, гібридизація і селекція мейотичних сегрегантів - ефективний спосіб адаптації штамів-надсинтетиків РФ до середовищ, що містять відходи харчової промисловості (післяспиртову зернову барду, меласу).

10. Біологічна ефективність РФ, синтезованого штамом Agu^r-125 App^r-3. Додавання препарату кормового РФ, виготовленого з використанням штама Agu^r-125 App^r-3 до раціону курей-молодок кросу „Білорусь-9” привело до збільшення маси птиці на 6,7 % порівняно з контрольною групою. Збільшення вмісту РФ у кормовому раціоні курей-несучок породи Izabrown за рахунок препарату кормового РФ привело до зростання середньої ваги яєць на 2,2 %, а частки відбірних яєць вагою понад 65 г - у 2 рази. Отримані результати свідчать про те, що РФ, який синтезує штам Agu^r-125 App^r-3, проявляв біологічну активність в організмі курей.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проведено генетичне та біохімічне дослідження мутантів P. guilliermondii з пошкодженою регуляцією біосинтезу рибофлавіну, зокрема, взаємодії мутантних алелів регуляторних генів при їх суміщенні в одному гаплоїдному геномі та впливу мутацій резистентності до аналогів пуринів на продуктивність флавіногенезу мутантів з пошкодженими регуляторними генами негативного типу дії. Основні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Генетичний аналіз мутації rib80-22 дріжджів P. guilliermondii показав, що вона є моногенною, ядерною і рецесивною, викликає зростання продуктивності біосинтезу рибофлавіну у 20 - 30 разів, швидкості транспорту заліза у 4 - 10 разів, вмісту заліза у клітинах в 1,5 - 2 рази при вирощуванні у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза. Таким чином, ген rib80 бере участь у регуляції як біосинтезу рибофлавіну, так і асиміляції заліза.

2. Показано, що регуляторні гени rib80 і RIB81та RIB81 і HIT1 взаємодіють між собою за синергідним типом. Суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib80-22 і rib81-131 веде до зростання продуктивності флавіногенезу у 2 рази, активності ГТФ-циклогідролази ІІ - 3 рази, швидкості транспорту заліза - 10 разів, але не викликає зростання вмісту заліза у клітинах мутантів rib80 rib81. Гаплоїдні сегреганти генотипу rib81 hit1 за продуктивністю флавіногенезу перевищують штами rib81 у 3 - 3,5 раза. Однак вони нагромаджують невелику біомасу (до 1 мг/мл) і швидко ревертують за ознаками „нагромадження біомаси” і „надсинтез рибофлавіну” до рівня мутантів rib81.

3. Мутація rib83-6 успадковується за моногенним типом, має ядерну локалізацію і є рецесивною. Вона блокує надсинтез рибофлавіну не тільки у мутантів rib80 і rib81, але і у подвійних мутантів rib80 rib81 навіть у залізодефіцитному середовищі, а також знижує швидкість поглинання заліза клітинами, їх фериредуктазну активність і приводить до того, що за умов дефіциту заліза у середовищі мутанти rib83 не ростуть. Отже, ген RIB83 здійснює позитивний контроль як біосинтезу рибофлавіну, так і транспорту заліза та епістатує над генами негативного контролю rib80 та RIB81.

4. Створено систему для клонування регуляторного гена rib83 методом функціональної комплементації з використанням як реципієнта сконструйованого потрійного мутанта rib1-86 rib81 rib83. З банку генів P. guilliermondii відібрано рекомбінантну плазміду, яка комплементує або супресує мутацію rib83-6.

5. Суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib81 і резистентності до аналога аденіну 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину, яка викликає надсинтез пуринів, призводить до зростання продуктивності флавіногенезу мутантів rib81 у 3 - 3,5 раза. Введенням у геном мутанта генотипу rib80 rib81 мутацій резистентності до аналогів пуринів 8-азагуаніну і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину отримано штами, які синтезують 1,7 г рибофлавіну в 1 л синтетичного середовища при вирощуванні у лабораторному ферментері.

6. Додавання препарату кормового рибофлавіну, виготовленого з використанням сконструйованого штама-надсинтетика Agu^r-125 App^r-3, до раціону курей позитивно впливає на приріст маси птиці і вагу яєць. Штам Agu^r-125 App^r-3 може бути використаний для створення промислових штамів-надсинтетиків рибофлавіну і технології виробництва кормових дріжджів, збагачених вітаміном В₂, на середовищах, що містять дешеві відходи харчової промисловості (післяспиртову зернову барду, меласу).

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сибирный А.А., Шавловский Г.М., Кшановская Б.В., Куцяба В.И. Внутривидовая и межвидовая гибридизация дрожжей путем слияния протопластов. // Сб. “Молекулярная биология”. - 1982. - Вып.32. - С. 16-24.

(Дисертантові належить опрацювання робочих схем експериментів, участь у написанні та оформленні статті.)

2. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Куцяба В.И., Бабяк Л.Я., Стенчук Н.Н. Участие гена RIB80 в регуляции биосинтеза рибофлавина и транспорта железа у Pichia guilliermondii. // Генетика. - 1992. - Т.28, №9. - С. 25-32.

(Дисертантові належить опрацювання робочих схем експериментів, аналіз даних літератури і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті. Він особисто отримав генетичні докази плейотропності гена RIB80.)

3. Шавловський Г.М., Стенчук М.М., Федорович Д.В., Куцяба В.І. Про взаємодію факторів негативного контролю біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Pichia guilliermondii. // Доповіді АН України. - 1994, №10. - С. 138-140.

(Дисертантові належить майже весь експериментальний матеріал статті. Ним особисто сплановано експеримент, в якому показано, що гени RIB80 і RIB81 взаємодіють за типом синергізму.)

4. Шавловский Г.М., Стенчук Н.Н., Куцяба В.И., Федорович Д.В. Совместное влияние мутаций rib80, rib81 и резистентности к 8-азагуанину на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii. // Прикл. биохим. и микробиол. - 1997. - Т.33, №1. - С. 61-65.

(Дисертантові належить опрацювання робочих схем експериментів, аналіз даних літератури і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті. Майже весь експериментальний матеріал статті отримано за його участі.)

5. Стенчук Н.Н., Куцяба В.И., Кшановская Б.В., Федорович Д.В. Влияние мутации rib83 на биосинтез рибофлавина и ассимиляцию железа у дрожжей Pichia guilliermondii. // Микробиология. -2001. - Т.70, №6. - С. 753-758.

(Дисертант брав участь в опрацюванні робочих схем експериментів, аналізі даних літератури і власних результатів. Він особисто отримав результати, які дали можливість зробити висновок про поліфункціональність гена RIB83.)

6. Куцяба В.И., Стенчук Н.Н., Федорович Д.В. Усиление сверхсинтеза рибофлавина у дрожжей Pichia guilliermondii с помощъю 4-аминопиразол[3,4-d]пиримидина. // Прикл. биохим. и микробиол. - 2002. - Т.38, №3. - С. 268-272.

(Дисертантові належить весь експериментальний матеріал статті. Ним проведено аналіз даних літератури і власних результатів, виконано основну роботу по написанню та оформленню статті.)

7. Стенчук М.М., Федорович Д.В., Куцяба В.І., Шах Є.С., Стояновська Г.М. Селекція високофлавіногенних штамів дріжджів Pichia guilliermondii з підвищеним вмістом заліза в клітинах та біологічна ефективність їх біомаси. // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - 2001. - Вип. 1-2. - С. 326-331.

(Дисертант узагальнив власні результати та опрацював дані літератури, приймав безпосередню участь у написанні статті. Він виготовив препарат кормового РФ, біологічна ефективність якого перевірялась на курах.)

8. Куцяба В.І., Федорович Д.В., Стенчук М.М., Процайло Є.В., Конюхівський І.В., Тарасюк І.В., Процайло А.І. Вплив препарату кормового вітаміну В₂, отриманого за допомогою високофлавіногенних дріжджів Pichia guilliermondii, на продуктивність і масу яєць курей-несучок породи Izabrown. // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - 2002. - Вип. 4, №1. - С. 84-88.

(Дисертантові належить весь експериментальний матеріал статті. Ним проведено аналіз даних літератури і власних результатів. Він особисто проводив експерименти на пташнику ТзОВ “Еней-Пласт”.)

9. Стенчук М.М., Кшановська Б.В., Куцяба В.І., Шавловський Г.М. Особливості біосинтезу рибофлавіну у мутантів Pichia guilliermondii з пошкодженими генами позитивного і негативного типу регуляції флавіногенезу. // Тези доп. VI Українського біохімічного з'їзду. - Київ. - 1992. - Ч.1. - С. 52.

10. Kutsiaba V.I., Stenchuk M.M. Selection of riboflavin overproducing Pichia guilliermondii strains using purine analogues and hybridization. // Proc. 21^st International specialized symposium on yeasts. - Lviv (Ukraine). - 2001. - P. 25.

11. Куцяба В.І., Стенчук М.М. Про взаємодію регуляторних генів негативного типу дії RIB81 і HIT1 у процесі біосинтезу рибофлавіну дріжджами Pichia guilliermondii. // Тези доп. VIII з'їзду Українського біохімічного товариства. - Чернівці. - 2002. - С. 162.

12. Boretsky Y.R., Kapustiak K.Ye., Stenchuk M.M., Stasyk O.V., Kutsyaba V.I., Sybirny A.A. Interrilationship between riboflavin biosynthesis and iron transport in the yeast Pichia guilliermondii. // Proc. The International Bioiron Society World Congress on Iron Metabolism “Bioiron 2003”. - Bethesda (USA). - 2003. - Р. 312.

13. Boretsky Y., Kapustyak K., Pynyaha Y, Fayura L., Kutsyaba V., Prokopiv T., Protchenko O., Babyak L., Stenchuk M., Fedorovych D., Sibirny A. Identification of regulatory genes and promoter seguences involved in regulation of riboflavin synthesis in the yeast Pichia guilliermondii. // Proc. First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv (Ukraine). - 2004. - P. 369.

14. Бабяк Л.Я., Капустяк К.Є., Куцяба В.І, Прокопів Т.М., Протченко О.В., Борецький Ю.Р., Стенчук М.М., Сибірний А.А., Федорович Д.В. Генетичні аспекти регуляції біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Pichia guilliermondii. // Тези доп. Х з'їзду Товариства мікробіологів України. - Одеса. - 2004.

15. Борецький Ю.Р., Пиняга Ю.В., Капустяк К.Є., Куцяба В.І., Борецький В.Ю., Федорович Д.В., Фаюра Л.Р., Сибірний А.А. Біотехнологія мікробного синтезу флавінів. // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. - Харків. - 2006. - Т.2. - С. 140.

Размещено на Allbest.ru