Роль молекул адгезії у механізмах синаптичної пластичності

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 577.35: 576.54

РОЛЬ МОЛЕКУЛ АДГЕЗІЇ У МЕХАНІЗМАХ СИНАПТИЧНОЇ ПЛАСТИЧНОСТІ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

НІКОНЕНКО ОЛЕКСАНДР ГЕОРГІЙОВИЧ

Київ 2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі цитології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Науковий консультант: Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Скибо Галина Григорівна зав.відділом цитології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор, чл.-корр.НАН України Веселовський Микола Сергійович зав.відділом фізіології нейрональних мереж Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Доктор медичних наук, професор Яценко Валентин Порфирійович, зав.кафедри медичної кібернетики та телемедицини Міжуніверситетського медико-інженерного факультету Національного технічного університету „КПІ”.

Доктор біологічних наук, професор Корогод Сергій Михайлович зав.кафедрою експериментальної фізики Дніпропетровського національного університету

Провідна установа: Національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біофізики

Захист дисертації відбудеться 06.02.2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул.акад.Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул.акад.Богомольця, 4.

Автореферат розіслано 04.01.2007 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, Сорокіна-Маріна З.О.

Доктор біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Пластичність є важливою та невід'ємною рисою нервової системи, яка допомагає змінювати її структуру та активність у відповідь на дію численних факторів зовнішнього та внутрішнього середовища. Динаміка збудження та гальмування у мережах нервових клітин визначається передачею сигналів у синапсах, у яких вивільнення нейромедиатору та його взаємодія з відповідними рецепторами ведуть до виникнення локальних іонних струмів у постсинаптичній мембрані і, в кінцевому результаті, нервового імпульсу. Для багатьох синапсів ефективність взаємодії між нейромедиатором та відповідними постсинаптичними рецепторами не є постійною і змінюється в залежності від багатьох обставин (Kandel et al., 2000).

Механізми синаптичної пластичності, тобто властивості нервових клітин до адаптивних змін функції, є одним з актуальних питань сучасної нейрофізіології. Феномени пластичності нервової системи базуються на модуляції передачі сигналів через синапси, або змінах кількості синапсів. Синаптична пластичність модифікує зв'язок між конкретними нейронами, активність локальних нейронних мереж та взаємозв'язки між окремими системами мозку (Turrigiano, Nelson, 2004).

Існують як мінімум дві форми діяльності нервової системи, що базуються на феноменах пластичності - навчання та розвиток. Дослідження останніх років показали, що між цими двома процесами існує глибокий внутрішній зв'язок, як на генетичному, так і на фізіологічному рівні. Він проявляється у спільному характері активації генів, експресія яких відбувається на різних етапах онтогенезу і впливає на процеси формування коротко- та довтривалої пам'яті.

Важливою ланкою зв'язку клітин нервової системи з внутрішнім середовищем організму є молекули адгезії. Раніше їх вплив на пластичність нервових структур ігнорувався, головним чином тому, що молекули адгезії не приймають безпосередньої участі у передачі нервових імпульсів, а процеси, які протікають за їх участю, реалізуються набагато повільніше за електричні феномени. Однак, сучасні дані свідчать про те, що молекули адгезії є важливим компонентом багатьох сигнальних шляхів, і їх потенційний ефект на процеси пластичності синапсів не можна недооцінювати.

Розвиток ЦНС включає серію морфогенетичних подій, таких як проліферація клітин, міграція клітин-попередників, координований ріст аксонів, синаптогенез та селективна смерть нейронів (Schachner, 1997). Показано, що у цих подіях приймають участь молекули адгезії, що знаходяться на поверхні клітин, а також у позаклітинному матриксі. Формування зв'язків між нейронами нервової системи хребетних залежить від експресії молекулярних сигналів, які дозволяють аксонам, що ростуть, знаходити відповідні місця для утворення синапсів. Роль таких сигналів можуть виконувати молекули адгезії, які створюють демаркаційні лінії для аксонів, що ростуть (Ranscht, 2000). Крім механічної фіксації, ці молекули також медіюють внутрішньо- та міжклітинні сигнальні події. Механізми таких впливів, особливо в контексті синаптичної пластичності, залишаються в значній мірі нез'ясованими.

Білки клітинної адгезії є, як правило, трансмембранними рецепторами, що пронизують плазматичну мембрану клітини і мають позаклітинний, трансмембранний та внутрішньоклітинний домени (Gottardi, Gumbiner, 2001). Перший домен може зв'язуватись з поверхнею сусідньої клітини або структурою позаклітинного матриксу. Існує декілька родин молекул клітинної адгезії, що відрізняються за структурою та типами лігандів. Їх основні родини включають селектини, інтегрини, імуноглобуліни та кадгерини. Встановлено, що ці молекули, а також молекули позаклітинного матриксу, серед яких чільне місце займають білки - тенасцини, визначають вихідний план зв'язків у мережах нейронів в процесі онтогенетичного розвитку (Bonhoeffer, 1996).

В той же час, дуже мало відомо про участь молекул адгезії в механізмах пластичності нервової системи. Існують непрямі дані про те, що при деяких захворюваннях, наприклад, шизофренії та епілепсії, спостерігаються одночасні порушення пластичності мозку та зміни експресії молекул адгезії (Rougon, Hobert, 2003). Тому дослідження участі адгезійних молекул у механізмах пластичності синапсів, крім суто наукового інтересу, може мати велике практичне значення. Розуміння механізмів розвитку зазначених патологій нервової системи допоможе у пошуку шляхів їх ефективного лікування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи є фрагментом науково-дослідних робіт „Молекулярні механізми, що відповідають за специфіку функції різних мозкових структур” (2000-2003 рр., № держ.реєстрації 0103U003467) та „Пошук ефективних засобів впливу на молекулярні механізми, що обумовлюють збудливість клітин” (2004 -2006 рр., № держ.реєстрації 0104U007220).

Об'єкт дослідження - гальмівні та збуджуючі синапси гіпокампу.

Предмет дослідження - участь молекул клітинної адгезії родини імуноглобулінів, а також молекули позаклітинного матриксу тенасцина-R у механізмах пластичності синапсів.

Методи досліджень - математичне моделювання, комп'ютерна імітація, електронно-мікроскопічні, імуногістохімічні, молекулярно-біологічні, електрофізіологічні та статистичні методи.

Мета роботи. Метою роботи стало вивчення ролі молекул адгезії у механізмах пластичності синапсів гіпокампа.

Завдання дослідження.

1. Розробити методи, які б дали можливість досліджувати просторові феномени, що корелюють з синаптичною функцією.

2. Дослідити ефект дефіциту молекули клітинної адгезії L1 на аферентацію пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу та структуру гальмівних перисоматичних синапсів.

3. Вивчити вплив дефіциту L1 на ефективность гальмівних перисоматичних синапсів, а також на характеристики збуджуючої синаптичної передачі у зоні СА1 гіпокампу.

4. Дослідити ефект дефіциту молекули клітинної адгезії СНL1 на аферентацію пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу та цитоархітектоніку перисоматичних синапсів.

5. Вивчити вплив дефіциту СНL1 на ефективность гальмівних перисоматичних синапсів та характеристики збуджуючої синаптичної передачі у зоні СА1 гіпокампу.

6. Дослідити ефект дефіциту молекули клітинної адгезії NCAM на структурні характеристики збуджуючих аксо-дендритних синасів радіального шару зони СА1 гіпокампу.

7. Вивчити молекулярні механізми участі NCAM у формуванні постсинаптичного ущільнення у збуджуючих синапсах.

8. Дослідити ефект дефіциту молекули позаклітинного матриксу тенасцина-R на структуру гальмівних перисоматичних синапсів пірамідного шару та збуджуючих аксо-дендритних синапсів радіального шару зони СА1 гіпокампу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше запропоновано метод інтерпретації просторового розподілу синаптичних везикул (СВ), що базується на аналізі випадкових ультратонких зрізів, математичному моделюванні та комп'ютерній імітації. Цей метод відкрив нові можливості для вивчення просторової дінаміки окремих пулів СВ і запропонував альтернативу складним та витратним методам тривимірної (3В) реконструкції на основі серійних ультратонких зрізів та електронної томографії.

Вперше запропоновано метод інтерпретації просторового розподілу імунопозитивних епітопів, що базується на аналізі ультратонких зрізів, математичному моделюванні та комп'ютерній імітації. Запропоновано декілька модифікацій методів топографічного аналізу внутрішньоклітинних структур, які було втілено у відповідних комп'ютерних програмах.

Вперше продемонстровано ефект дефіциту молекули клітинної адгезії L1 на аферентацію клітин пірамідного шару зони СА1 гіпокампу та структуру перисоматичних синапсів. Морфологічні аспекти проявляються у зменшенні поверхневої щільності та розмірів активних зон перисоматичних синапсів, зменшенні чисельності везикул, пришвартованих до активної зони, та більш дифузному розподілі СВ у порівнянні з контролем.

Вперше виявлено вплив дефіциту L1 на ефективність гальмівних перисоматичних синапсів, що полягає у зменшенні середньої амплітуди та частоти унітарних перисоматичних гПСП, а також зменшенні частоти мініатюрних гПСП. Виявлено, що порушення гальмівної передачі викликає аномальну імпульсну активність клітин зони СА1 гіпокампу.

Вперше продемонстровано парадоксальний ефект дефіциту молекули клітинної адгезії СНL1, що веде до збільшення аферентації пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу та відповідних змін структури перисоматичних синапсів. синапс молекула адгезія нейрон

Вперше показано, що дефіцит CHL1 викликає зростання ефективності гальмівних перисоматичних синапсів та збільшення кількості квантів нейромедиатора, що вивільнюється у відповідь на потенціал дії. Показано, що для CHL1-дефіцитних тварин властиве послаблення коротко- та довготривалої потенціації збуджуючої синаптичноїі передачі.

Вперше показано вплив дефіциту NCAM на структуру аксо-дендритних синапсів СА1 зони гіпокампу та стан їх рецепторного апарату. Відкрито досі невідомий механізм організації постсинаптичного ущільнення у збуджуючих синапсах, відповідно до якого NCAM сприяє збірці та підтримці постсинаптичного цитоскелетного комплексу, сформованого на основі спектрину.

Відкрито ефект дефіциту молекули позаклітинного матриксу - тенасцина-R (TnR), який викликає зменшення аферентації клітин пірамідного шару СА1 зони гіпокампу та зміни структури перисоматичних синапсів, що свідчать про зменшення їх ефективності.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Теоретичні положення, отримані за результатами проведеної роботи, розширюють уявлення про механізми синаптичної пластичності, що лежить в основі важливих феноменів навчання та пам'яті. Отримані дані свідчать про те, що молекули клітинної адгезії (МКА) родини імуноглобулінів, а також молекула позаклітинного матриксу TnR, є важливими факторами, що впливають на структуру та функцію синапсів та визначають діапазон їх пластичних змін. Ці зміни зачіпають як структурні, так і функціональні аспекти синаптичної передачі у різних ділянках гіпокампу. Дані про участь адгезійних молекул у процесах пластичності нервової системи можуть бути використані при дослідженні механізмів розвитку певних патологій нервової системи, перелік яких включає епілепсію та шизофренію, а також у пошуках шляхів їх ефективного лікування. Запропоновані у даній роботі методи кількісної оцінки просторового розподілу синаптичних везикул та імунопозитивних епітопів, що базуються на оригінальній ідеології математичного моделювання та комп'ютерної імітації, можуть бути застосовані у практиці наукових досліджень.

Особистий внесок здобувача. Автор даної роботи зробив основний внесок у всі стадії роботи, в тому числі у постановку задач дослідження, розробку нових методів дослідження, включаючи розробку відповідних математичних моделей, процедур комп'ютерної імітації та програмного забезпечення, проведення більшості експериментів, аналіз результатів експериментів та написання статей.

Деякі експерименти, пов'язані з культивуванням органотипових зрізів та дисоційованих клітин гіпокампу, було проведено разом із співавторами опублікованих робіт, співробітниками відділу цитології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України: д.м.н., проф. Скибо Г.Г. та ст.наук.спів., к.б.н. Ніконенко І.Р. Експерименти, присвячені дослідженню молекулярних механізмів участі NCAM у формуванні постсинаптичного цитоскелетного каркасу, були проведені разом із співавторами опублікованих робіт, співробітниками Центру молекулярної нейробіології, Медичного факультету Університету Гамбурга (Німеччина): ст.наук.спів., к.б.н. Ситником В.М. та ст.наук.спів., к.б.н.Лещинською І.О.

В окремих дослідженнях, представлених у роботі, приймали активну участь співавтори публікацій.

Апробація результатів дисертації. По усіх матеріалах дисертації зроблено доповіді на засіданнях Сектору клітинної біології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України та на Всеукраїнських та міжнародних наукових форумах: 3-й Міжнародній конференції з комп'ютерізованої цитологічної лабораторії у Чікаго, США (березень, 1994), 8-му Міжнародному симпозіумі з кількісної патології у Амстердамі, Нідерланди (вересень, 1994), 12-му Міжнародному цитологічному конгресі у Мадріді, Іспанія (травень, 1995), 4-й Міжнародній конференції з комп'ютерізованої цитологічної лабораторії у Чікаго, США (березень, 1996), 15-й Міжнародній зустрічі Британської асоціації нейронаук у Хероугейті, Великобританія (квітень, 1999), 5-му конгресі IBRO у Єрусалімі, Ізраїль (липень, 1999), Установчій конференції Українського товариства нейронаук у Києві, Україна (вересень, 1999); 1-й Зустрічі федерації Європейских товариств нейронаук (FENS) у Брайтоні, Великобританія (червень, 2000), 30-й Зустрічі товариства нейронаук (SFN) у Новому Орлеані, США (жовтень, 2000), 5-й Зустрічі товариства нейронаук Німеччини у Штутгарті, Німеччина (жовтень, 2003), 35-й Зустрічі товариства нейронаук (SFN) у Сан Дієго, США (жовтень, 2005), 5-й Зустрічі федерації Європейских товариств нейронаук (FENS) у Відні, Австрія (липень, 2006), 4-му з'їзді Українського біофізичного товариства у Донецьку, Україна (грудень, 2006).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 20 статей (4 з них одноособові) та 13 тез доповідей, які опубліковані у профільних вітчизняних та закордонних журналах, матеріалах з'їздів та конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 302 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, основної частини, що містить огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих результатів, висновків, списка використаних літературних джерел, який включає 480 найменувань. Робота ілюстрована 82 рисунками.

Матеріали і методи досліджень

Загальна характеристика об'єктів дослідження. В експериментах використовували L1-дефіцитних (L1^-/-) мишей, що були створені за допомогою контрольованого тетрацикліном трансактиватора, вбудованого у другий екзон гена L1. Також досліджували CHL1-дефіцитних (CHL1^-/-) мишей різного віку, дорослих NCAM-дефіцитних (NCAM^-/-) самців миші, а також самців тенасцин-R-дефіцитних (TnR^-/-) мишей 10, 20 та 80 денного віку. Як контроль для L1^-/-, L1^-/- та NCAM^-/- використовували мишей аналогічної статі дикого типу з того ж самого приплоду. Експериментальні та контрольні групи складались як мінімум з 5 тварин. У дослідженнях чутливості методів топографічного аналізу використовували тканину мозку дорослих самців щура, культивовані зрізи гіпокампу від щурів 7-денного віку, а також дисоційовані культури нейронів гіпокампу ембріонів щура. Зрізи гіпокампу щурів 7-денного віку культивували in vitro на межі між поживним середовищем та газовою фазою протягом 7 днів. Дисоційовані клітини гіпокампу NCAM^+/+ та NCAM^-/- мишей були висіяні на скельця, вкриті полі-L-лізіном, та вирощувались in vitro на протязі 12 днів.

Морфометричні методи дослідження. Кількість симетричних синапсів, сформованих на тілах пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу, визначали як щільність поверхні активних зон на тонких зрізах, що аналізували за допомогою електронної мікроскопії на збільшенні Ч5000. Щільність поверхні підраховували за методом (Baddeley et al., 1986) як відношення площі контакту та референс-об'єму, одиницею виміру були мкм^-1 (мкм²/мкм³). В деяких випадках визначали частку поверхні як відношення поверхневих щільностей активних зон та плазматичної мембрани пірамідних нейронів. Для визначення числової щільності асиметричних синапсів було застосовано метод дайсектору (Sterio, 1984), з використанням тонких зрізів, що аналізували за допомогою електронної мікроскопії на збільшенні Ч7000. Довжину та товщину перетинів постсинаптичного ущільнення, площу перетину пресинаптичної терміналі, довжину сегментів перетинів перисоматичної мембрани вимірювали на випадково обраних цифрових зображеннях, зроблених цифровою камерою MegaView II (Soft Imaging System, Німеччина) на збільшенні Ч50000. Виміри на оцифрованих зображеннях робили за допомогою програми UTHSCSA ImageTool версія 2 (Університет Техасу, США). Лінійну щільність перисоматичних синапсів оцінювали як кількість активних зон на одиницю довжини перетину плазматичної мембрани. Відстань між епітопами NCAM, поміченими часточками колоїдного золота, оцінювали на електронограмах випадково обраних горизонтальних тонких зрізів культивованих клітин, зроблених при збільшенні Ч10000. Часточки колоїдного золота підраховували у асиметричних синапсах на збільшенні Ч50000. Для оцінки просторового розподілу пірамідних нейронів у зоні СА1 гіпокампу, а також СВ у межах пресинаптичної терміналі було використано метод мінімального остовного дерева (МОД) (Dussert et al., 1987). Координати об'єктів визначали за допомогою програми ImageTool на оцифрованих мікрофотографіях. Для оцінки просторового розподілу СВ застосовували метод визначення відстані до 1-го найближчого сусіда (ВНС) (Clark, Evans, 1954). Формалізм методу ВНС був використаний для розробки методу визначення локальних характеристик просторового розподілу СВ. З метою просторової інтерпретації двовимірних (2В) розподілів перетинів СВ, а також розподілів імуноцитохімічних маркерів було створено відповідні математичні моделі.

Імуногістохімічні методи дослідження. Імуногістохімічне виявлення L1, CHL1, парвальбуміну та везикулярного ГАМК транспортера (VGAT) проводили на фронтальних кріостатних зрізах головного мозку. З метою візуалізації перинейрональних мереж проводили імуногістохімічне фарбування з використанням аглютинину Wisteria floribunda. Виявлення РНК, що відповідала позаклітинному домену CHL1, проводили за методом гібридизації іn situ. Підрахунок перисоматичних імунопозитивних зон проводили на пакетах зображень зрізів тканини товщиною 1 мкм, що отримували за допомогою конфокального мікроскопа LSM 510 (Zeiss, Німеччина). Числову щільність імунопозитивних клітинних тіл оцінювали за допомогою методу оптичного дайсектору. Імуноцитохімічне (рreembedding) фарбування епітопів NCAM на плазматичній мембрані проводили на культивованих in vitro дисоційованих нейронах гіпокампу щура. Імуноцитохімічне (рostembedding) фарбування субодиниць NMDA (NR1) та AMPA (GluR1) рецепторів, кальмодулінкінази ІІ (CAMKII) та спектрину було проведено на тонких зрізах тканини мозку, яку після процедури заморожування-заміщення було інфільтровано смолою Lowicryl HM20 та полімерізовано під ультрафіолетовим світлом.

В експериментах з дослідження ролі NCAM у механізмах формування постсинаптичного цитоскелетного каркасу використовували поліклональні та моноклональні антитіла проти NCAM, поліклональні антитіла проти синаптофізину (Santa Cruz Bioteсhnology, США), поліклональні антитіла проти спектрину еритроцитів, CAMKIIб, моноклональні антитіла проти б-актиніну (Sigma-Aldrich, США), NR1 та NR2B (BD Biosciences, Німеччина), моноклональні антитіла проти PSD95 (Upstate Biotechnology, США) та CAMKII (Stressgen Biotechnologies, США).

Електрофізіологічні методи дослідження. Петч-клемп записи та реєстрацію польових збуджуючих постсинаптичних потенціалів (зПCП) проводили на зрізах гіпокампу, що постійно промивались аерованою карбогеном штучною цереброспинальною рідиною. Клітини у зоні CA1 було візуалізовано за допомогою інфра-червоної мікроскопії. Для записів синаптичних струмів при підтримуючому потенціалі -60 мВ використовували метод петч-клемпу в конфігурації „повна клітина”. Для запису гальмівних постсинаптичних потенціалів (гПСП) внутрішньоклітинну концентрацію іонів Cl^- було підвищено. Мініатюрні та викликані гПСП були розділені шляхом використання антагоністів AMPA- та NMDA-рецепторів глутамату, відповідно, CNQX (25 мкМ) та AP-5 (50 мкМ). Для запису мініатюрних гПСП було додатково використано блокатор Na⁺-каналів TTX (1 мкМ). Такі потенціали було зареєстровано за допомогою програми AxoGraph 4 (Axon Instruments, США), як події з відношенням сигналу до шуму більше ніж 3. Петч-клемп записи від цілої клітини здійснювали з використанням підсилювача EPC-9 (Heka Electronik, Німеччина). Унітарні перисоматичні гПСП записували у відповідь на мінімальну стимуляцію. Для дослідження залежної від використання модуляції синаптичної ефективності проводили стимуляцію подвійними імпульсами чи імпульсами з різними інтервалами 10-20 разів. Через 200 мс після останнього стимулу серії генерували окремий імпульс для реєстрації відновлення гПСП. Для того, щоб позбутися впливу пресинаптичних ГАМК_B-рецепторів, використовували антагоніст ГАМК_B-рецепторів CGP54626 (200 нМ). Польові зПСП записували за допомогою скляних піпеток, що мали опір 2-3 M. Довготривалу потенціацію (ДП) викликали за допомогою п'яти циклів стимуляції з частотою и-ритму, що повторювали кожні 20 с. Кожний цикл складався з 10 пакетів частотою 5 Гц. Кожен пакет складався з 4 стимулів частотою 100 Гц. Тривалість імпульсів складала 0,2 мс. Значення ДП разраховували як максимальну потенціацію на протязі першої хвилини після індукції ДП. Рівень ДП розраховували як збільшення середніх амплітуд польових зПСП, зареєстрованих через 50-60 хв після індукції ДП. Для того, щоб викликати утворення популяцій множинних імпульсів у зоні СА1 використовували аферентну стимуляцію колатералей Шафера з частотою 1 Гц протягом 30 с. Колатералі Шафера стимулювали біполярним платиновим електродом у пірамідному шарі на відстані приблизно 400 мкм від записуючого електроду. Тривалість стимулюючих імпульсів складала 0,2 мс, а сила стимуляції була обрана такою, щоб викликати виникнення популяції імпульсів максимальної амплітуди. В усіх експериментах зону СА3 відокремлювали від зони СА1 за допомогою механічного перерізу, щоб запобігти імпульсній активності, яка виникає внаслідок зворотнього збудження зони СА3.

Статистичні методи. Статистичний аналіз цифрових даних виконували за допомогою програми Statistica вер.6 (StatSoft, США). Непараметричний дво-направлений тест Колмогорова-Смірнова використовували для визначення статистичної вирогідності відмінностей. Вірогідними вважали розбіжності при p<0,05. В окремих випадках проводили аналіз лінійної кореляції. Методи інтерпретації просторових феноменів, що корелюють с синаптичною функцією, було втілено у оригінальному програмному забезпеченні, написаному з використанням Turbo Pascal вер.7 (Borland International, США) та Delphi вер.5 (Borland International, США).

Результати досліджень

Розробка методів аналізу просторових феноменів у синапсах та на поверхні клітинних мембран. Зміни функції синапсу пов'язані з складними перебудовами його структури, і ці структурні зміни можуть бути джерелом цінної інформації щодо базових механізмів синаптичної передачі сигналів. Однак, на заваді стає відсутність відповідних методів кількісного аналізу. Тому було проведено пілотне дослідження 2В розподілів перетинів СВ за допомогою методу мозаїки Вороного, спрямоване на вивчення чутливості даного методу та його спроможності виявляти базові просторові феномени, що корелюють з синаптичною функцією. Під час пілотного дослідження було проаналізовано електронограми пресинаптичних терміналей дисоційованої культури нейронів гіпокампу щура. З метою вивчення дискримінативної сили процедури, всі терміналі було поділено на дві групи: з “дифузним” та “кластерним” розподілом органел. Аналіз показав, що метод дозволяє виявляти розбіжності у просторових розподілах СВ. Однак, значні крайові ефекти, пов'язані з невизначеністю форми полігонів, побудованих навкруги крайових точок, обмежують його чутливість.

На наступному етапі вивчали придатність методу ВНС для аналізу просторових синаптичних феноменів. Використовували вихідний варіант методу, а також той, що передбачає нормування параметрів експериментального розподілу до таких, що відповідають процесу Пуассона. Порівняльний аналіз просторового розподілу СВ у пресинаптичних терміналях нейронів зони СА1 гіпокампу щура в умовах in vivo та in vitro показав, що значення середнього () та дисперсії (D_ВНС) ВНС для терміналей культивованих клітин вірогідно перевищували значення цих параметрів для терміналей у нативній тканині (p<0,05). Ситуація з нормованими показниками ВНС ( []_з та [D_ВНС]_з ) нагадувала таку для варіанту методу без нормування та дозволяла надійно розрізняти просторові розподіли СВ in vivo та in vitro (p<0,05).

Результати свідчать, що базові та нормовані показники ВНС не дозволяють розрізняти випадки кластерного та дифузного розподілу везикул in vivo (p>0,05). Показано, що лише значення були статистично відмінні для терміналей з кластерним та дифузним разподілом везикул in vitro, складаючи, відповідно, 70,92,8 та 96,55,9 нм (p<0,05). В той же час, вибірки D_ВНС, []_з та [D_ВНС]_з таких відмінностей не мали.

На основі отриманих даних було зроблено висновок про те, що метод ВНС має достатню чутливість для аналізу просторових синаптичних феноменів. Застосування варіанту, що передбачає нормування до параметрів розподілу Пуассона, не є доцільним. Він не є інтуїтивним, і в жодному випадку не виявив більшої чутливості у порівнянні з вихідним варіантом методу.

Формалізм ВНС було використано для розробки методу, що дозволяє визначати положення СВ по відношенню до активної зони синапсу, а також вимірювати відстань між самими везикулами. З цією метою 2В розподіл n точок, які ідеалізовано представляють СВ, розглядали як множину V={v₁,v₂,v₃,..v_N}. M точок іншої множини, A={a₁,a₂,a₃,…a_M}, які є мітками перетину плазматичної мембрани активної зони, використовували для ідеалізованого представлення активної зони синапсу. Для кожної точки з множини V визначали відстань до її першого найближчого сусіда з множини А (відстань до активної зони, ВАЗ). Відстань від кожної точки з множини V до її першого найближчого сусіда з тієї ж самої множини V (ВНС) використовували для оцінки просторових зв'язків між СВ.

З метою вивчення придатності методу для аналізу просторових розподілів СВ досліджували симетричні синапси, що утворені на тілах пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу миші. Аналіз показав, що більше половини СВ знаходилось не далі ніж 300 нм від активних зон, в той час як для майже 75% цих органел значення ВАЗ варіювали у діапазоні від 0 до 500 нм. Кореляція між індивідуальними значеннями ВАЗ та ВНС була практично відсутня (r=+0.130). На наступному етапі вимірювали ВАЗ та ВНС для загальної популяції СВ цих синапсів та використовували індивідуальні значення ВАЗ як критерій групування СВ, що було проведено з 50 нм інтервалами. Показано, що по мірі віддалення від активних зон синапсів відбуваються закономірні зміни середніх інтервальних значень ВНС. Фактично було показано, що значення ВАЗ можна використовувати як своєрідну „координату” відносного положення везикули у пресинаптичній терміналі, а запропонований метод є достатньо чутливим для того, щоб виявляти зміни у просторовому розподілі СВ.

Досліджували також чутливість методу мінімального остовного дерева (МОД), у рамках якого сукупність перетинів СВ може розглядатись як граф, сформований з множини вершин (центри перетинів СВ) та множини гілок, котрі з'єднують ці вершини, уникаючи утворення замкнених шляхів. Два параметри (середнє - та стандартне відхилення у_МОД) вибірки довжин гілок МОД дозволяють визначати сукупні статистичні властивості просторового розподілу СВ.

У дослідженні чутливості методу МОД до варіацій просторового розподілу СВ використовували електронограми 50 пресинаптичних терміналей СА1 зони культивованих зрізів гіпокампу щура. Вибірки x,y-координат центрів перетинів СВ було проаналізовано з нормуванням та у_МОД одним з двох способів: а) до площі перетину терміналі ( []_A та [у_МОД ]_A); б) до середнього діаметру перетину везикули ([]_V та [у_МОД ] _V).

З загальної виборки терміналей було відібрано дві групи: з домінуванням кластерів та з дифузним розподілом везикул. За іншими ознаками терміналі обох груп були подібні і не мали статистично вірогідних відмінностей ні за площею перетину терміналі (р>0,05), ні за кількістю перетинів СВ (р>0,05).

Виявлено, що показники МОД, нормовані до площі перетину терміналі ([]_A та [у_МОД ]_A), не дозволяють розрізняти кластерні та дифузні розподіли органел (p>0,05). В той же час, відмінності між значеннями []_V для двох груп терміналей були вірогідними (р < 0,001). Був зроблено висновок, що метод МОД є адекватним для вивчення просторового розподілу СВ і дозволяє розрізняти випадки кластерного та дифузного розподілу органел. В той же час, нормування показників МОД до площі перетину пресинаптичної терміналі не є доцільним, тому що фактично знижує чутливість методу.

Модель імітації утворення випадкових зрізів клітини. Випадковий тонкий зріз неповно представляє положення СВ у внутрішньоклітинному просторі. Тому було розроблено метод, який за допомогою математичного моделювання та комп'ютерної імітації дозволяє інтерпретувати внутрішньоклітинне положення везикул на основі 2В оцінок, зроблених на випадкових зрізах. На першому етапі було створено математичну модель для перевірки принципової можливості розробки такого методу.

Запропонована модель базується на таких положеннях: 1) форма терміналі та везикули апроксимована еліпсоїдом обертання; 2) положення везикули всередині терміналі може змінюватись; 3) зрізи терміналі є випадковими за положенням та орієнтацією; 4) зрізи мають нульову товщину.

Рівняння еліпсоїда обертання є таким:

, де a (=b) < c - піввісі. (1)

Для того, щоб отримати рівняння перетину еліпсоїду площиною Щ, перепишемо рівняння (1) у координатах, трансформованих таким чином: а) перше обертання координатної системи відбувається навкруги вісі z на кут ; б) друге обертання відбувається навкруги вісі y' на кут ; c) координатна система зсувається вздовж вісі z" (сегмент OM) на відстань d (довжина сегменту ОМ) (Рис.1А). В результаті ми отримаємо:

, де (2)

,

,

.

Таке рівняння є відмінним від канонічного тільки зи рахунок зсуву центру еліпсу на величину d·(E/D). Остання дорівнює відстані, на яку може зсуватись точка М (проекція центру еліпсоїду на зріз) по відношенню до центру самого зрізу (точка M₁, Рис.1Б). З рівняння (2) є очевидним, що цей зсув (довжина відрізку MM₁) може відбуватись тільки вздовж довгої вісі еліпсу зрізу терміналі. Значення цього зсуву використовується на четвертому етапі процедури трансформації координат для того, щоб визначити центр перетину терміналі, іншими словами, початок нової координатної системи.

Положення зрізу терміналі визначається довжиною та орієнтацією у просторі прямолінійного вектору, OM, який є перпендикуляром до площини Щ (Рис.1A). Орієнтація вектору OM у просторі визначається кутами ц та и, що формуються між цим вектором та, відповідно, вісями x та z координатної системи. Визначено, що 0 ? ц ? 2р та 0?и?р. Довжина вектору OM (d) приймає значення у діапазоні між 0 та верхньою границею, що залежить від куту и наступним чином:

Будь-який зріз еліпсоїда обертання, що представляє терміналь, є еліпсом. Коли Щ перетинає органелу, координати її центру Q на площині Щ (Рис.1A) задаються такими рівняннями:

.

Можуть також використовуватись відносні значення координат центру перетину органели на площині Щ, отримані шляхом нормалізації значень u_Q та v_Q до довжин відповідних півосей:

та ,

де U, V є півосями еліпсу та H=cos²и + (a/c)² * sin² и. Значення ж та з можуть змінюватись у інтервалі від 0 до 1. Для того, щоб імітувати утворення випадкових зрізів, значення d повинно бути випадковим у інтервалі: 0 ? d ? d_max. Ізотропний напрям вектору OM у просторі імітується за допомогою підстановки незалежних випадкових чисел (x₁, x₂) рівномірно розподілених у інтервалі (0,1) у рівняння:

та .

Аналіз результатів, отриманих у трьох серіях комп'ютерних випробувань, показав, що статистичні характеристики вибірок координат центру перетину СВ дозволяють надійно розрізняти випадки з різним розташуванням органели у внутришньоклітинному просторі, а також те, що створена модель є математично коректною.

Метод інтерпретації 2В розподілів перетинів СВ у термінах тривимірного (3В) простору. З метою інтерпретації 2В розподілів перетинів СВ, що спостерігаються на випадкових зрізах синапсів, у термінах 3В простору було розроблено метод, що базується на математичному моделюванні та комп'ютерній імітації. На першому етапі процедури кількісна оцінка 2В розподілу СВ на оцифрованій електронограмі проводиться за допомогою методу МОД. Одночасно, на тому ж зображенні оцінюється 2В щільність перетинів СВ (Щ_2В). Потім відбувається імітація 3В розподілу СВ (другий етап). На третьому етапі імітується процес утворення випадкових зрізів терміналі. На четвертому етапі імітований 2В розподіл аналізується, а на п'ятому - його параметри порівнюються з параметрами експериментального розподілу. Етапи процедури від другого до п'ятого можуть циклічно повторюватись, доки не буде досягнута відповідність між імітованим та експериментальним розподілами. В останньому випадку вважають, що 3В щільність СВ (Щ_3В) та відповідний 3В розподіл СВ відповідають ситуації у реальній популяції СВ.

Тести показали, що математична процедура, яка складає центральну частину методу, є чутливою до змін у Щ_3В. Між значеннями Щ_2В та Щ_3В спостерігалась чітка лінійна кореляція (r=+0,999; p=0,05). У послідовності тестів Щ_3В збільшувалась у 40 разів, паралельно з 4-кратним зменшенням значень та 6-кратним зменшенням значень у_МОД. Через те, що значення та у_МОД змінювались нелінійно, вони були log₁₀-трансформовані з метою оцінити їх залежність від Щ_3В за допомогою тесту лінійної регресії. Між Щ_3В, з одного боку, і log₁₀() та log₁₀(у_МОД), з іншого боку, існував сильний негативний зв'язок (r= -0,935 та r=-0,976, відповідно, обидва p=0,05).

Тести іншої серії показали, що 2В параметри моделі корелюють також з 3В розподілом СВ. Випадковий розподіл (Рис.2А,Г) та два розподіли, з „малими” (Рис.2Б, Д) та „великими” (Рис.2В, Е) кластерами везикул, було імітовано з константним значенням Щ_3В.

виявилось дуже чутливим до змін у 3В розподілі СВ. Його значення було максимальним для випадково розподілених СВ, вдвічі меншим для „малих” кластерів (p<0,05), і навіть ще меншим - для „великих” кластерів СВ (p<0,05). Зміни у_МОД не були такими значними, як зміни. Наприклад, його значення було подібним для випадкового розподілу та розподілу з „малими” кластерами везикул (p>0,05). Однак, для розподілу з „великими” кластерами значення у_МОД було на 40% меншим, якщо порівнювати його з двома іншими випадками (p<0,05). Таким чином можна зробити висновок про те, що запропонована процедура є достатньо чутливою для дослідження 3В просторових розподілів СВ і може застосовуватись для інтерпретації просторових феноменів у реальних синапсах.

Метод просторової інтерпретації даних імуногістохімічного аналізу. З метою розробки методу, який би дозволяв кількісно аналізувати імуногістохімічне фарбування з використанням колоїдного золота, було запропоновано математичну модель, що базується на таких умовах: 1) форма ділянок плазматичної мембрани, що мають незначну кривизну апроксимується евклідовою площиною; 2) мікротомний ніж відсікає від мембрани смужки заданої ширини за випадковим або систематичним сценаріями; 3) розмір часточок колоїдного золота є незмінним.

Часточки золота розглядаються як елементи кінцевої множини Р, що займає обмежений 2В простір, який відповідає зовнішній поверхні плазматичної мембрани. Положення часточки р_і на плазматичній мембрані визначається координатами x_i та y_i. Мікротомний ніж ріже мембрану на смужки товщиною W (товщина зрізу), що можуть мати довільне положення та орієнтацію. Положення часточки, що потрапила у межі такої смужки, визначається координатами x'_i та y'_i у системі координат, вісь x' якої співпадає з довшим виміром смужки. Відповідність між двома системами координат визначається такими рівняннями:

,

, де ц - це кут, утворений між x- (x'-) та x”-вісями; a та b відповідають початку нової координатної системи.

Часточка золота попадає у зріз, якщо значення її y”-координати відповідає інтервалу: 0 ? y”_i ? W. Через те, що у реальній ситуації визначають не відстань між часточками, а її проекцію на поверхню зрізу, модель вимірює різницю між значеннями х”_i- координати для сусідніх часточок (тобто відстань між часточками, ВмЧ). У тому випадку, коли перетин мембрани містить одну або жодної часточки, він вважається пустим та відкидається.

Дослідження моделі проводили за допомогою імітації розподілу часточок у межах цілочисельної матриці (500Ч500), що відповідала ділянці мембрани площею 56,2 мкм². Була проведена серія тестів, у яких часточки були розподілені випадково з різною 2В щільністю. Було показано, що середнє вибірки ВмЧ () знаходиться у залежності від 2В щільності (r=-0,929).

Вплив характеру 2В розподілу часточок на характеристики вибірки ВмЧ досліджували у трьох тестах, у яких часточки були розподілені відповідно до різних типів розподілів, але з незмінною 2В щільністю, 10 часточок/мкм². Використовували: 1) випадковий розподіл об'єктів, що самовідштовхуються; 2) ортогональний розподіл; 3) „рафтовий” розподіл. Було показано, що параметри вибірки ВмЧ знаходяться у значній залежності від характеру 2В розподілу і є статистично відмінними для всіх імітованих розподілів.

Дослідження чутливості методу було також проведено на препаратах дисоційованих культур нейронів гіпокампу щура, які були помічені антитілами проти NCAM. Зовнішня поверхня плазматичної мембрани культивованих нейронів була помірно помічена часточками золота, що були кон'юговані з антитілами. Часточки рідко формували агрегати на соматичній мембрані і були розташовані на різній відстані одна від одної (Рис.3А).

Імітації показали, що статистичні параметри експериментальної вибірки ВмЧ відповідали 2В розподілу випадково розташованих „рафтів” з рівномірно випадковим розташуванням часточок у межах „рафтів”. Рис.3 В, Г ілюструє результати окремої імітації з високою відповідністю між моделлю та експериментальними даними (у = 6,86). Було зроблено висновок про те, що запропонована процедура може бути використана для кількісної інтерпретації результатів імуногістохімічного фарбування у термінах 2В простору.

Аналіз впливу МКА L1 на структуру та функцію синапсів. Загальна морфологія головного мозку та його окремих структур у L1^-/- мишей не відрізнялась від таких у L1^+/+ тварин. Попередній аналіз електронограм показав, що на тілах пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу L1^-/- мишей спостерігалась менша, у порівнянні з контролем, кількість перисоматичних (гальмівних) синапсів. З метою кількісної оцінки цих синапсів визначали щільность поверхні - стереологічний параметр, що дозволяє вимірювати площу контакту між активними зонами та перисоматичною мембраною. Виявлено, що щільність поверхні активних зон у L1^-/- мишей складала 0,0071±0,0006 мкм^-1 і була приблизно на 30% нижча за рівень відповідного параметру у контрольних тварин, 0,0106±0,0005 мкм^-1 (p<0,05) (Рис.4А).

Додатково вимірювали довжину перетину активних зон перисоматичних синапсів, яка у L1^-/- мутантів була на 12% меншою за відповідний показник контролю (p<0,05) (Рис.4Б). Через те, що розміри активної зони накладають фізичні обмеження на процес екзоцитозу СВ, можна вважати, що менші активні зони перисоматичних синапсів L1^-/- мишей свідчать про їх знижену активність.

З метою знайти додадкові докази змін активності цих синапсів визначали кількість СВ у пресинаптичній терміналі. Між середніми значеннями цього параметру у L1^-/- мишей та L1^+/+ тварин не було виявлено статистично вірогідних відмінностей (p>0,05) (Рис.4В). На відміну від цього, розмір пулу СВ, готових до вивільнення (ПГВ), був меншим у синапсах L1^-/- мишей, ніж у контрольних тварин (р>0,05) (Рис.4Г).

Аналіз, проведений за допомогою програми LoClust, дозволив виявити відмінності у просторовому розподілі СВ між двома генотипами. У L1^-/- мишей ці органели мали тенденцію до знаходження на більшій відстані від активної зони, ніж у контрольних тварин (Рис.5). На точковому графіку можна побачити дещо інший характер розподілу значень ВАЗ для синапсів тварин експериментальної та контрольної груп. Складається враження, що у L1^-/- мутантів загальний пул СВ зберігає свої кількісні параметри, але змінює свої просторові характеристики. Середнє значення ВАЗ у L1^-/- тварин було на 8% більшим за відповідний показник контролю (р<0,05).

СВ у синапсах L1^-/- тварин були розташовані більш дифузно у порівнянні з контролем. Значення у L1^-/- мишей складало 48,4±0,5 нм і було вірогідно більшим за показник L1^+/+ контролю, 43,1 ±0,3 нм (p<0,05). Значення D_ВНС у L1^-/- тварин, 335,3 нм, було вдвічі більшим за значення відповідного показника L1^+/+ мишей, 175,3 нм, що вказувало на більшу гетерогенність у відстанях між індивідуальними СВ у L1^-/- тварин.

Через те, що зменшення перисоматичної аферентації пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу могло викликати компенсаторні зміни асиметричних синапсів радіального шару, було проведено аналіз кількості останніх за допомогою стереологічного методу дайсектор. Однак, як показав аналіз, числова щільність асиметричних синапсів не мала значних відмінностей між двома генотипами (р>0,05).

Зміни у перисоматичних синапсах L1^-/- мишей можуть відбуватись внаслідок втрати інгібіторних інтернейронів. Аналіз показав, що кількість парвальбумін-позитивних (PV⁺) інтернейронів у пірамідному шарі зони СА1 не відрізняється у L1^-/- та контрольних тварин (p>0,05).

Стимуляція колатералей Шафера з частотою и-ритму вела до розвитку стійкої ДП польових зПСП, записаних у пірамідному шарі зони СА1 контрольних мишей. Середнє зростання ізольованих зПСП, записаних після такої стимуляції, складало 139±2,3% від базового рівня. Зростання польових зПСП, викликане нететанічною стимуляцією, не виявляло довготривалих змін. Рівні ДП у L1^-/- складали 139,1±4,1% і не мали відмінностей від значень, знайдених у L1^+/+ мишей (р>0,1). Потенціація, що миттєво слідувала за стимуляцією з частотою и-ритму, у L1^-/- тварин також була нормальною. За допомогою методу петч-клемп записів у конфігурації „повна клітина”, що дозволяє більш жорстко контролювати постсинаптичну деполяризацію у процесі індукції ДП, також отримали підтвердження індукції нормальної ДП у L1^-/- мишей.

Парування низькочастотної стимуляції колатералей Шафера з постсинаптичною деполяризацією при 0 мВ викликало стійке підвищення амплітуди зПСП, записаних через 50 хвилин після індукції ДП як у L1^-/-, так і у L1^+/+ мишей. Рівні потенціації у L1^-/- та L1^+/+ мишей складали, відповідно, 188,7±13% та 191±25,2% (р>0,05).

Аналіз полегшення польових зПСП після парних імпульсів показав, що цей параметр також не має відмінностей між двома генотипами. Рівні полегшення викликанних постсинаптичних струмів при міжімпульсному інтервалі у 50 мс були нормальними у L1^-/- мишей, 1,64±0,06, у порівнянні з L1^+/+ тваринами, 1,66±0,10. Зв'язок між інтенсивністю стимулу та зростанням польових зПСП були подібними у L1^-/- та L1^+/+ мишей, що свідчило про нормальну базальну збуджуючу синаптичну передачу у L1^-/- мишей.

Так як L1 експресують не тільки пірамідні нейрони гіпокампу, а також і інтернейрони, у L1^-/- мишей досліджено гальмівні струми. Унітарні перисоматичні гПСП записували у присутності блокаторів CNQX та АР-5 у відповідь на мінімальну стимуляцію перисоматичних інтернейронів. З метою встановлення мінімальної сили стимулу, який за припущенням активує окремий пресинаптичний нейрон, було проаналізовано графіки залежності відповіді від інтенсивності стимулу, і для аналізу було обрано лише відповіді у межах першого чіткого плато.

Аналіз показав, що гістограми амплітуд перисоматичних гПСП, записаних у L1^-/- мишей, були зміщені у бік меншиx значень у порівнянні з контролем (Рис.6 А, Б), що свідчило про зменшення середньої амплітуди та збільшення кількості втрат унітарних перисоматичних гПСП. Середня амплітуда гПСП зменшувалась з 13,0±1,5 пА у L1^+/+ мишей до 6,7±1,4 пА у L1^-/- мишей (р<0,01), тоді як вірогідність втрат збільшилась з 0,06±0,02 до 0,26±0,06 (р<0,01) (Рис.6 Б, В).

Дефіцит L1 у мутантів також викликав значне збільшення коефіцієнту варіації амплітуди унітарних перисоматичних гПСП, з 22,3±1,6% у L1^+/+ до 40,5±6,1% у L1^-/- мишей (р<0,01) (Рис.6 Г). Відношення депресії після дії парних стимулів, записаних для унітарних гПСП з міжімпульсним інтервалом у 50 мс не мало значних відмінностей у тварин двох генотипів (Рис.6 В).

З метою подальшого аналізу залежної від використання модуляції гальмівних струмів, реєстрували композитні перисоматичні гПСП у відповідь на стимуляцію парними імпульсами та коротку тетанічну стимуляцію. Стимуляція парними імпульсами з міжімпульсним інтервалом у 10 та 20 мс викликала сильну депресію, до 30-60% вихідного рівня, у тварин обох генотипів.

Депресія була ще більш значною, до 20%, після тетанічної стимуляції з аналогічними міжімпульсними інтервалами, можливо завдяки тому, що після 10 імпульсів у процесі екзоцитозу зникає більша частка везикул, ніж після двох імпульсів. При використанні інтервалів у 50, 100 та 200 мс депресія була слабшою, до 80% вихідного рівня, а тетанічна стимуляція вела до 50% депресії у тварин обох генотипів. гПСП, записані через 200 мс після тетанічної стимуляції, показували відновлення до рівня 50% при всіх міжімпульсних інтервалах у тварин обох генотипів. Можна зробити висновок про те, що відмінності між L1^-/- та контрольними тваринами у залежній від використання модуляції синаптичної передачі були відсутні.

Для того, щоб оцінити розмір кванту гПСП, вимірювали амплітуди мініатюрних гПСП у L1^-/- мишей. У мутантів було виявлено нормальну середню амплітуду мініатюрних гПСП (13,8±1,4 пА) у порівнянні з L1^+/+ контролем (14,0±1,6 пА). В той же час частота цих потенціалів зменшувалась з рівня 5,0±0,5 Гц у L1^+/+ мишей до 1,8±0,3 Гц у L1^-/- тварин. Нормальний розмір кванту та зменшена частота унітарних перисоматичних гПСП у L1^-/- тварин свідчить про те, що у відповідь на потенціал дії, що надходить у пресинаптичну терміналь, у цих тварин вивільнюється, в середньому, менша кількість квантів нейромедиатора.

Далі аналізували чи може дефіцит у гальмуванні, що спостерігається у L1^-/- тварин, сприяти появі множинних імпульсів у зоні СА1 у відповідь на повторну стимуляцію. Вважають, що множинні імпульси свідчать про залежне від активності дегальмування збуджуючої синаптичної передачі. Повторна стимуляція терміналей Шафера з частотою 1 Гц вела до появи вторинних імпульсів у пірамідних клітинах зони СА1 як у L1^+/+, так і у L1^-/- мишей (Рис.7 А).

Не було виявлено значних відмінностей у кількості вторинних імпульсів між двома генотипами (р>0,05), але їх площа була значно більшою у L1^-/- мишей в порівнянні з контролем (р<0,05) (Рис.7 Б). Статистично значущі відмінності між тваринами двох генотипів спостерігали на початку і в кінці стимуляції, що вказувало на те, що дефіцит гальмування у L1^-/- мишей веде до аномальної імпульсної активності пірамідних клітин зони СА1.