Роль молекул адгезії у механізмах синаптичної пластичності

Таким чином можна зробити висновок про те, що дефіцит L1 веде до зменшення перисоматичної аферентації пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу та зменшення ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. В гіпокампі L1^-/- тварин відбувається залежне від активності дегальмування збуджуючої синаптичної передачі, яке в свою чергу веде до аномальної імпульсної активності клітин зони СА1.

Аналіз впливу МКА CHL1 на структуру та функцію синапсів. Не дивлячись на зниження рівня експресії між 1 та 3 тижнями постнатального розвитку, мРНК CHL1 спостерігали у пірамідних клітинах та інтернейронах гіпокампу мишей однорічного віку. З метою аналізу аферентації тіл пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу вивчали покриття перисоматичної мембрани цих клітин активними зонами симетричних синапсів, а також цитоархітектоніку цих синапсів. На відміну від ситуації, що спостерігалась у L1^-/- мишей, CHL1^-/- мутанти мали більше, у порівнянні з контролем, перисоматичних синапсів (Рис.8 А, Б).

Кількість синапсів оцінювали як частку плазматичної мембрани, що вкрита активними зонами. Значення цього параметру у молодих CHL1^-/- тварин складало 6,7±0,3% і на 50% перевищувало значення відповідного показника контролю - 4,4±0,5% (р<0,05). У старих CHL1^-/- тварин частка поверхні клітини, вкрита активними зонами синапсів, була на 36% більша за відповідний показник CHL1^+/+ контролю (р>0,05).

Довжина перетину активних зон у молодих та старих CHL1^-/- тварин приблизно на 10% перевищувала таку у контрольних мишей (р<0,05). Кількість СВ на пресинаптичну терміналь у молодих тварин варіювала у досить широких межах. Незважаючи на те, що у CHL1^-/- мишей значення цього параметру на 16% перевищувало відповідне значення контроля, ця відмінність не досягала рівня статистичної вірогідності (p>0,05). Загальна кількість СВ у перисоматичних синапсах старих CHL1^-/- мутантів була приблизно на 20% нижча за відповідний показник контролю (p>0,05). Аналіз розміру ПГВ показав, що у синапсах молодих CHL1^-/- мишей він є на 25% більшим за такий у контролі (p<0,05). На відміну від цього, у старих тварин не спостерігалось значних відмінностей між розміром ПВГ у CHL1^-/- та контрольних тварин (p>0,05).

Везикули у синапсах молодих CHL1^-/- мишей мали просторовий розподіл відмінний від того, що спостерігався у контрольних тварин (Рис.9 А, Б). Середні значення ВАЗ відрізнялись у двох генотипів, складаючи 307,7±4,1 нм у CHL1^-/- мишей і 350,9±4,9 нм у CHL1^+/+ тварин (p<0,05), а суттєві відмінності у значеннях були відсутні (p>0,05). Навпаки, значні відмінності між двома групами було виявлено у значеннях D_ВНС. Цей параметр у CHL1^-/- мишей дорівнював 257,7 нм і був значно меншим за відповідний параметр CHL1^+/+ контроля - 439,3 нм.

На відміну від молодих тварин, везикули у синапсах старих CHL1^-/- мишей мали просторовий розподіл подібний до того, що спостерігався у відповідного контроля. Середні значення ВАЗ та для двох генотипів практично не відрізнялись (в обох випадках, p>0,05). Не було також значних відмінностей між двома групами і у значеннях D_ВНС. Цей параметр у CHL1^-/- мишей дорівнював 364,2 нм і був трохи вищим за відповідний параметр у CHL1^+/+ контроля - 307,3 нм, що вказувало на те, що кластери везикул у CHL1^-/- синапсах є більш щільними.

Перисоматичну гальмівну передачу вивчали реєструючи перисоматичні унітарні гПСП, що виникали у відповідь на мінімальну стимуляцію інтернейронів. Записи здійснювали у присутності антагоністів глутаматних рецепторів, CNQX та AP-5, які використовували для блокування зПСП (Рис.10). Перісоматичні гПСП мали коротку та стабільну латентность, що була подібною для обох генотипів. Вона складала 1,90,2 мс для CHL1^+/+ та 2,00,1 мс для CHL1^-/- мишей (р>0,05). Перисоматичні гПСП у тварин обох генотипів мали подібну форму з часом зростання 1,80,2 мс та 1,80,1 мс, відповідно у CHL1^+/+ та CHL1^-/- мишей (р>0,05). Такі значення є характерними для перисоматичних гальмівних струмів та дозволяють розрізняти їх від дендритних. На відміну від згаданих характеристик, середня амплітуда перисоматичних гПСП була значно, на 53%, вищою у CHL1^-/- мишей (138±18 пA) у порівнянні з контрольними тваринами (90±10 пA, р<0,01) (Рис.10 В). Струми стимуляції, необхідні для того, щоб викликати перисоматичні гПСП, були подібні у тварин обох генотипів.

З метою оцінки розміру кванту нейромедиатору вимірювали амплітуди мініатюрних гПСП. Розподіли амплітуд мініатюрних ПСП були подібними у CHL1^+/+ та CHL1^-/- мишей (р>0,05). Не спостерігалось відмінностей між двома генотипами у середній амплітуді мініатюрних гПСП (р>0,05). Нормальний розмір кванту та збільшена середня амплітуда унітарних перисоматичних гПСП у CHL1^-/- мишей вказує на те, що кількість квантів, що вивільнюються з пресинаптичної терміналі гальмівного синапсу у відповідь на потенціал дії, є збільшеною у мутантів. На відміну від викликаних гПСП, частота мініатюрних гПСП, яка відповідає вірогідності спонтанного вивільнення, була подібною у тварин обох генотипів (р>0,05).

З метою аналізу залежної від використання модуляції перисоматичної гальмівної передачі реєстрували перисоматичні гПСП у відповідь на стимуляцію парними імпульсами та коротку тетанічну стимуляцію. Стимуляція парними імпульсами з інтервалом у 10 та 20 мс викликала сильну депресію, до 30-60%, у тварин обох генотипів. Депресія була навіть ще сильнішою після тетанічної стимуляції з тими ж інтервалами. При інтервалах між імпульсами, що дорівнювали 50, 100 та 200 мс, депресія досягала приблизно 80% від базового рівня, а посттетанічна депресія доходила до рівня 50% у тварин обох генотипів. гПСП, записані через 200 мс після тетанічної стимуляції, демонстрували приблизно 50-60% рівень відновлення при всіх міжімпульсних інтервалах. Можна зробити висновок про те, що у CHL1^-/- мишей відсутні значні порушення у залежній від активності модуляції гальмівної синаптичної передачі.

Було зроблено припущення, що підвищена ГАМК-ергічна передача може викликати послаблення ДП у CHL1^-/- мишей.Як виявилось, між CHL1^+/+ та CHL1^-/- була відсутня відмінність у відношенні між амплітудою польових зПСП та інтенсивністю стимуляції (Рис.11 A). Порівняння полегшення після дії парних стимулів з різними інтервалами між стимулами також не виявило порушень у CHL1^-/- мишей у порівнянні з контролем (Рис.11 Б).

Однак, короткотривала потенціація та ДП, викликана 5 серіями стимуляції з частотою и-ритму, були слабшими у CHL1^-/- тварин. Короткотривала потенціація складала 1444% у CHL1^-/- тварин та 1839% у CHL1^+/+ мишей (р0,01) (Рис.11 В). ДП дорівнювала 1243% у CHL1^-/- мутантів і була вірогідно відмінною від відповідного значення контролю, 1485% (р0,01) (Рис.11Г).

Було вивчено ДП після блокування ГАМК_A-рецепторів пікротоксином. Короткотривала потенціація та ДП, записані у присутності пікротоксину, були подібними у мишей обох генотипів. Короткотривала потенціація складала 20317% у CHL1^-/- та 16211% у CHL1^+/+ мишей р>0,05). ДП складало 17912% у CHL1^-/- мутантів та 16211% у контрольних тварин (р>0,05). Таким чином можна зробити висновок про те, що порушення ДП у CA3-CA1 синапсах CHL1^-/- мишей відбувається завдяки підвищеній ГАМК-ергічній передачі.

Гальмівний вплив на тіла пірамідних нейронів СА1 зони забезпечують головним чином два типи корзинчастих клітин, один з яких ідентифікують за експресією парвальбуміну. Тому підраховували кількість перисоматичних плям, імунопозитивних на парвальбумін (PV⁺) та VGAT - маркер ГАМК-ергічних синапсів (VGAT⁺). У CHL1^-/- мишей лінійна щільность PV⁺ VGAT⁺ та PV^- VGAT⁺ перисоматичних плям перевищувала таку у контрольних тварин, відповідно на 22% та 31%. Результати імуногістохімічного аналізу підтверджують ультраструктурні дані та свідчать, що збільшене синаптичне покриття у мутантів забезпечується підвищеною інервацією з боку як PV⁺, так і PV^- інтернейронів. Загальна кількість пірамідних нейронів у зоні СА1 була на 13% більшою у CHL1^-/- тварин у порівнянні з CHL1^+/+ мишами, однак, ця відмінність не була такою значною у порівнянні з різницею у кількості PV⁺ інтернейронів - 94%. Таким чином, співвідношення PV⁺ та пірамідних клітин було значно вищим у CHL1^-/- тварин, вказуючи на те, що окремий пірамідний нейрон інервується більшим за нормальне числом інтернейронів.

Можна зробити висновок про те, що дефіцит CHL1 викликає підвищення перисоматичної аферентації пірамідних нейронів зони СА1 зони гіпокампу та зростання ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. У цих синапсах CHL1^-/- тварин у відповідь на потенціал дії вивільнюється більша кількість квантів нейромедиатору. Дефіцит СНL1 викликає залежне від ГАМК_А-рецепторів послаблення коротко- та довготривалої потенціації збуджуючої синаптичної передачі.

Аналіз впливу МКА NCAM на структуру та функцію синапсів. Аналіз морфології головного мозку NCAM^-/- мишей показав, що його структура зберігає риси, властиві контрольним тваринам. Не було знайдено значних змін у структурі гіпокампу. Разом з тим, у NCAM^-/- мутантів було виявлено деякі відмінності у будові асиметричних збуджуючих синапсів у радіальному шарі зони СА1 гіпокампу. Активні зони цих синапсів були меншими за розмірами у порівнянні з такими у контрольних мишей.

Довжина та ширина перетинів постсинаптичного ущільнення у NCAM^-/- тварин була відповідно на 10% та на 20% менше, ніж у NCAM^+/+ мишей (р<0,05). Якщо апроксимувати форму ущільнення диском, то виявлені зміни відповідали зменшенню її поверхні та об'єму, відповідно, на 20% та 30%. Загальна кількість СВ на пресинаптичну терміналь у NCAM^-/- мишей була на 25% меншою ніж у NCAM^+/+ тварин (p<0,05), причому це зменшення відбувалось за рахунок органел пулу, що рециклює та резервного пулу.

На додаток, СВ у синапсах NCAM^-/- тварин мали просторовий розподіл відмінний від такого у контрольних синапсах. У NCAM^-/- мишей везикули мали тенденцію до знаходження на більших відстанях від активної зони, ніж у контрольних тварин. Середнє значення ВАЗ, підраховане для повної популяції проаналізованих везикул, складало 184,8±2,8 нм для синапсів NCAM^-/- тварин і було на 15% меншим за показник контролю, 218,0±2,8 нм (р<0,05). До того ж, у NCAM^-/- синапсах спостерігалося більш дифузне розташування СВ у порівнянні з контролем. Значення були статистично відмінними між двома генотипами (p<0,05).

Комп'ютерні імітації, проведені у відповідності до 2В оцінок, показали, що NCAM^-/- мутанти зберігають загальні риси розподілу везикул у пресинаптичній терміналі. Однак, можна побачити, що імітована популяція СВ у NCAM^-/- синапсі (n=154) (Рис.12Б) позбавлена значної частини резервного пулу органел у порівнянні з ситуацією у синапсі контрольної тварини (n=228) (Рис.12А).

Відомо, що NCAM накопичується в області синапсів, що формуються. Потенційну роль NCAM у сприянні накопичення спектрину в області цих структур аналізували у NCAM^+/+ та NCAM^-/- нейронах, що підтримували в умовах гомо- та гетерогенотипової культури протягом 4 днів та фарбували антитілами проти спектрину та МАР2. Результати показали, що у NCAM^+/+ нейронах спостерігалось накопичення спектрину з характерним максимумом у центрі контакту. Накопичення спектрину у контактах з одним або обома NCAM^-/- відростками, було зменшеним. Білок МАР2 в області контактів нейронів обох генотипів не накопичувався.

Для того, щоб з'ясувати, чи є важливими для накопичення спектрину гомофільні взаємодії NCAM, аналізували контакти, утворені між нейронами у гетерогенотиповій культурі нейронів гіпокампу. Накопичення спектрину у таких контактах було зменшеним. Лише 32% контактів NCAM^+/+ аксонів з NCAM^-/- дендритами та 25,4% контактів NCAM^-/- аксонів з NCAM^+/+ дендритами помітно накопичували спектрин. Це свідчило про важливу роль гомофільних взаємодій між молекулами NCAM для накопичення спектрину у аксо-дендритних синапсах.

На наступному етапі аналізували, чи впливає утворення кластерів NCAM на клітинній поверхні на інтеграцію інших постсинаптичних компонентів у молекулярний каркас, асоційований з NCAM. Живі культивовані нейрони інкубували з антитілами проти позаклітинного домену NCAM з метою викликати утворення кластерів білку на поверхні клітин. Ці нейрони обробляли 1% Тритоном X-100, видаляючи таким чином розчинні у детергенті молекули, але залишаючи незмінним цитоскелетний каркас. Було помічено підвищений ступінь перекривання кластерів NCAM з нерозчинними у детергенті накопиченнями спектрину, б-актиніну, PSD95, CAMKIIб та білку Shank на поверхні культивованих нейронів після дії антитіл. В той же час, утворення кластерів NCAM не впливало на розподіл тубуліну, актину та МАР2.

Цікаво, що інші білки постсинаптичного каркасу, такі як PSD95 та б-актинін, локалізовані проксимально до плазматичної мембрани, а також Shank, що концентрується на цитоплазматичній поверхні постсинаптичного ущільнення, теж інтегрувались у кластери NCAM. Це свідчило про те, що NCAM не тільки впливає на утворення протеїнових кластерів, але сприяє формуванню організованої структури, що нагадує справжнє постсинаптичне ущільнення. Важливим також є те, що було виявлено перерозподіл CAMKIIб - фермента, що концентрується у постсинаптичному ущільненні.

Вплив NCAM на функціональні параметри синапсів досліджували за допомогою напівкількісного аналізу рівнів NMDA- та AMPA-рецепторів у постсинаптичних ущільненнях синапсів. Аналіз результатів фарбування тонких зрізів тканини гіпокампа антитілами проти субодиниці NMDA-рецептору NR1 показав, що кількість NMDA-рецепторів у цих структурах у NCAM^-/- тварин (Рис.13Б) була нижчою за відповідний показник контролю (Рис.13А). Мода розподілу кількості часточок золота на постсинаптичне ущільнення у синапсах тварин обох генотипів відповідала нульовим значенням, але у контрольних мишей вона була значно меншою (44%), ніж у NCAM^-/- мутантів (63%).

Аналіз імуноцитохімічного фарбування субодиниці GluR1 АМРА-рецепторів виявив, що кількість АМРА-рецепторів у двох генотипів суттєво не відрізнялась (Рис.13В,Г). Відомо, що за деякими оцінками CAMkII складає до50% загального білку у постсинаптичному ущільненні. Тому була зроблена спроба з'ясувати, чи пов'язане зменшення розміру цієї структури у NCAM^-/- тварин з падінням рівню CAMkII. Фарбування антитілами проти CAMkII показало, що рівень цього білку у структурах NCAM^-/- синапсів був помітно нижчим за такий у NCAM^+/+ синапсах. Мода розподілу кількості часточок золота у NCAM^+/+ синапсах відповідала ущільненням з однією часточкою (40%), в той час як у NCAM^-/- синапсах частіше зустрічались зони, позбавлені міток (41%). Аналогічна тенденція була виявлена для білка спектрину. Мода розподілу кількості часточок золота у NCAM^+/+ та NCAM^-/- синапсах відповідала ущільненням, що були позбавлені міток, але у контрольних мишей вона була значно меншою (57%), ніж у NCAM^-/- мишей (70%).

З метою аналізу ролі спектрину у опосередкованій NCAM інтеграції білків у постсинаптичне ущільнення проводили трансфекцію нейронів гіпокампу вІ_2-3-фрагментом спектрину і після цього аналізували накопичення постсинаптичних компонентів у синапсах. Для того, щоб надійно ідентифікувати трансфіковані нейрони, їх додатково трансфікували зеленим флюоресцентним білком (GFP). Після цього нейрони підтримували у культурі протягом 14 днів, а потім фарбували відповідними антитілами. Трансфекція вІ_2-3-фрагментом спектрину викликала статистично вірогідне зменшення (p<0,05) накопичення NR1 у постсинаптичному сегменті. Кластери NR1 у нейронах, трансфікованих вI_2-3, мали менший розмір, ніж у контролі. У цих синапсах було також виявлено зменшення накопичення білку PSD95 (p<0,05) та GluR1 (p>0,05).

Для того, щоб з`ясувати, чи відбиває цей феномен зменшення кількості функціональних синапсів, було проведено трансфекцію NCAM^+/+ нейронів GFP та фрагментом спектрину вI_2-3 або вI_N. Кількість синапсів, навантажених фарбою FM64-4 вздовж дендритів у клітинах, трансфікованих вІ_2-3-фрагментом, виявилась на 40% меншою у порівнянні з контролем. Це вказувало, що опосередковане NCAM накопичення спектрину та асоційованих з ним білків є необхідним для формування синапсів.

Накопичення NR1, NR2B та PSD95 у постсинаптичному сегменті було також зменшеним у NCAM^-/- нейронах, в той час як акумуляція синаптофізину у пресинаптичних сегментах не змінювалась (Рис.14). Аналіз виявив менший розмір NR1 та GluR1 кластерів у постсинаптичному сегменті NCAM^-/- синапсів. Ці зміни вказують на порушення формування структур постсинаптичного ущільнення у нейронах гіпокампу, що виникає при дефіциті NCAM.

Було висловлено припущення, що аномальна організація постсинаптичного ущільнення у NCAM^-/- тварин може впливати на передачу сигналів, необхідну для ДП. Дійсно, в той час як загальний рівень CAMKIIб у мозку NCAM^-/- мишей є підвищеним, вміст активної форми CAMKIIб, аутофосфорильованої у області треоніну 286, є зменшеним, що корелює зі зменшеними рівнями NMDA-рецепторів у постсинаптичних ущільненнях.

Активація CAMKIIб, залежна від NMDA-рецепторів, супроводжується її переносом у постсинаптичний сегмент і регулюється кількістю ділянок, придатних для причалювання CAMKIIб у постсинаптичному ущільненні. CAMKIIб, аутофосфорильована по треоніну 286, у реакції ко-імунопреципітації локалізується разом з NCAM, що свідчить про можливу роль NCAM-асоційованого каркасу як молекулярного сигналу, що спрямовує активовану форму CAMKIIб в область синапсу.

З метою вивчення залежного від активності транспорта CAMKIIб у синапси порівнювали вміст CAMKIIб у синапсах культивованих NCAM^+/+ та NCAM^-/- нейронів у стані спокою та після інкубації їх з 50 мкМ глутамату разом з 5 мкМ гліцину протягом 20 с відповідно до протоколу, який викликає залежний від NMDA-рецепторів переніс CAMKIIб до синапсів.

Нейрони було пофарбовано антитілами проти CAMKIIб та PSD95 для ідентифікації постсинаптичних ущільнень та визначення інтенсивності фарбування CAMKIIб у межах кластерів PSD95. У стані спокою рівні CAMKIIб у постсинаптичному ущільненні були нижчими для NCAM^-/- нейронів, у порівнянні з контролем. Стимуляція глутаматом вела до збільшення рівня CAMKIIб у постсинаптичних ущільненнях NCAM^+/+ нейронів. Інтеграція CAMKIIб у постсинаптичні ущільнення NCAM^-/- нейронів була значно меншою.

У кільтивованих NCAM^+/+ клітинах, трансфікованих siРНК вІ фрагменту спектрину, було також загальмовано перерозподіл CAMKIIб до синапсів. Разом ці дані свідчать про те, що NCAM-асоційований постсинаптичний сигнальний каркас є необхідним для ефективного, залежного від активності переносу CAMKIIб у постсинаптичне ущільнення.

Таким чином, можна зробити висновок про те, що дефіцит NCAM веде до цілої низки змін у будові збуджуючих синапсів гіпокампу, головними з яких є порушення постсинаптичного цитоскелетного каркасу, зменшення рівня NMDA-рецепторів, CAMkII та спектрину у постсинаптичному ущільненні та зменшення резервного пулу СВ. Ці зміни визначають зменшення ефективності цих синапсів у NCAM^-/- мишей.

Аналіз впливу молекули позаклітинного матриксу Tn-R на структуру та функцію синапсів. TnR^-/- миші є життєспроможними і структура їх головного мозку та гіпокампу не має значних відмінностей від норми. Однак, навіть на світлооптичному рівні у TnR^-/- тварин можна виявити ознаки дезорганізації пірамідного шару зони СА1.

Зменшене вивільнення ГАМК з перисоматичних терміналей в зоні СА1 гіпокампу, виявлене раніше у TnR^-/- мишей, може бути наслідком дефіциту кількості гальмівних синапсів, аномальної архітектури чи функції індивідуальних синаптичних контактів. Для того щоб розрізнити ці можливості, аналізували покриття тіл пірамідних нейронів активними зонами симетричних синапсів у зоні СА1.

Підрахунок кількості активних зон персоматичних синапсів на одиницю довжини контакту між терміналлю та перетином тіла нейрону не виявив різниці між генотипами та віковими групами (в усіх випадках p>0,05). Навпаки, кількість активних зон на одиницю довжини перетину тіла нейрону була значно нижчою у TnR^-/- мишей ніж у контрольних тварин. Розбіжності варіювали у діапазоні 30-40% у різних вікових групах (р<0,05). Значення частки поверхні для активних зон симетричних синапсів також суттєво розрізнялось між контрольними та мутантними мишами (Рис.15А). Показник був приблизно на 45% нижчий у TnR^-/- мишей ніж у контрольних тварин у всіх досліджених вікових групах (р<0,05).

Крім цього, аналізували деякі аспекти архітектури перисоматичних синапсів. Довжина перетинів активних зон у TnR^-/- тварин була приблизно на 8-14% меншою за відповідний показник контролю (Рис.15Б) (p<0,05). Цікаво відмітити, що загальна кількість СВ була вищою у перисоматичних синапсах 80-денних TnR^-/- мишей у порівнянні з відповідним контролем (p<0,05). Розмір ПГВ у TnR^-/- мишей складав 9,2±0,7 і не мав статистично вірогідних відмінностей від контроля, 10,9±0,8 (p>0,05). Кількість СВ, що були далі за 100 нм від активної зони синапсу, у TnR^-/- мишей була на 75% вищою ніж у контроля (p<0,05). Везикули у синапсах TnR^-/- мишей демонстрували просторовий розподіл, відмінний від такого у контрольних тварин (Рис.16).

Середні значення ВАЗ значно відрізнялись у двох генотипів, складаючи 409,5±4,7 нм у TnR^-/- мишей і 275,1±4,1 нм у контрольних тварин (p<0,05). Аналогічна тенденція спостерігалась по відношенню до параметрів ВНС (Рис.16 А, Б). дорівнювало 58,6±0,2 нм у TnR^-/- синапсах та 55,5±0,3 нм у синапсах контрольних тварин (p<0,05). Разом ці дані вказували на те, що у перисоматичних синапсах TnR^-/- мишей більш численні СВ розташовані більш дифузно та гомогенно.

Комп'ютерні імітації, проведені у відповідності до 2В оцінок, показали, що TnR^-/- мутанти мають 3В розподіл везикул у пресинаптичній терміналі, відмінний від такого у контрольних тварин. Імітований розподіл органел у TnR^-/- синапсі (n=503) ілюструє надмірне накопичення СВ у резервному пулі та порушення кластеру органел, що відповідає пулу, що рециклює (Рис. 17 Б), у порівнянні з ситуацією у синапсі контрольної тварини (n=230) (Рис.17 А).

Також було перевірено, чи супроводжувались зміни у пірамідному шарі зони СА1 гіпокампу відповідними перебудовами синаптичного апарату радіального шару. Аналіз показав відсутність суттєвих розбіжностей між щільністю асиметричних синапсів між TnR^-/- та контрольними мишами в усіх досліджених вікових групах (р>0,05). Ситуація з асиметричними синапсами, що мали перфоровану постсинаптичну щільність, різко відрізнялась. В усіх досліджених вікових групах було виявлено підвищення щільності таких синапсів у TnR^-/- тварин (р<0,05).

Разом отримані результати показують, що дефіцит молекули TnR викликає зміни зони СА1 гіпокампу, які проявляються у вигляді зменшеного покриття клітинних тіл пірамідних нейронів активними зонами симетричних синапсів, менших розмірів активних зон цих синапсів, аномальної кількості та просторового розподілу СВ в перисоматичних синапсах. В радіальному шарі зони СА1 гіпокампу TnR^-/- тварин спостерігається збільшена, у порівнянні з контролем, кількість асиметричних синапсів з перфорованим постсинаптичним ущільненням.

Узагальнюючи отримані результати можна зазначити, що дефіцит молекул клітинної адгезії L1, CHL1, NCAM та їх партнера по зв'язуванню - TnR веде до значних змін структури та функції синапсів гіпокампу. Так, мутації, що ведуть до втрати L1 або TnR викликають зменшення, а дефіцит CHL1 - збільшення перисоматичної аферентації пірамідних нейронів СА1 зони гіпокампу та відповідні зміни у ефективності перисоматичних синапсів. Дефіцит NCAM порушує структуру постсинаптичного цитоскелетного каркасу та викликає зменшення ефективності збуджуючих синапсів радіального шару зони СА1 гіпокампа. Отримані дані свідчать про те, що молекули адгезії є важливими чинниками підтримки нормальної структури та функції гальмівних та збуджуючих синапсів гіпокампу та відіграють важливу роль у феноменах синаптичної пластичності.

Висновки

Молекули адгезії грають важливу роль у процесах передачі інформації між поза- та внутрішньоклітинним середовищем. Участь молекул клітинної адгезії та молекул позаклітинного матриксу у системах передачі сигналів у нервовій тканині є важливим чинником адаптивних змін синаптичних контактів.

1. Молекула клітинної адгезії L1 є одним з компонентів гальмівних перисоматичних синапсів зони СА1 гіпокампу, що визначають їх структуру та функцію. Дефіцит L1 викликає зменшення кількості та розмірів активних зон цих синапсів, кількості синаптичних везикул, що готові до вивільнення, а також порушує просторову структуру кластерів везикул. Для аналізу просторового розподілу синаптичних везикул було розроблено принципово новий метод, що базується на математичному моделюванні та комп'ютерній імітації.

2. Дефіцит L1 веде до зменшення ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. У L1-дефіцитних мишей виявлено зниження середньої амплітуди та частоти унітарних перисоматичних гПСП. Розмір кванту нейромедіатора у L1-дефіцитних тварин залишався нормальним, в той час як вірогідність спонтанного вивільнення нейромедіатора зменшувалась.

3. Дефіцит L1 не впливає на характеристики залежної від активності модуляції гальмівної та збуджуючої синаптичної передачі. В той же час, для L1-дефіцитних властиве збільшення розмірів вторинних імпульсів, які генерують пірамідні нейрони зони СА1 гіпокампу у відповідь на стимуляцію колатералей Шафера.

4. Молекула клітинної адгезії СНL1 є одним з важливих компонентів гальмівних перисоматичних синапсів зони СА1 гіпокампу, що визначають їх структуру та функцію. Дефіцит СНL1 викликає збільшення кількості та розмірів активних зон цих синапсів, та кількості синаптичних везикул, що готові до вивільнення.

5. Дефіцит СНL1 веде до збільшення ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. Кількість квантів нейромедиатору, що вивільнюються у відповідь на потенціал дії, у перисоматичних синапсах CHL1-дефіцитних мишей є збільшеною, в той час як розмір кванту та вірогідність спонтанного вивільнення нейромедиатора відповідають нормі.

6. Дефіцит СНL1 не впливає на характеристики залежної від активності модуляції гальмівної передачі, однак викликає послаблення коротко- та довготривалої потенціації збуджуючої синаптичної передачі у зоні СА1 гіпокампу, які нормалізуються при блокаді ГАМК_А-рецепторів.

7. Молекула клітинної адгезії NCAM є одним з компонентів збуджуючих аксо-дендритних синапсів зони СА1 гіпокампу, що визначають їх структуру та функцію. Дефіцит NCAM викликає зменшення розмірів активної зони, кількості NMDA-рецепторів, CAMkII та спектрину у постсинаптичному ущільненні цих синапсів, а також зменшення резервного пулу синаптичних везикул.

8. NCAM сприяє збірці та підтримці постсинаптичного протеїнового каркасу на базі спектрину і, таким чином, забезпечує досі невідомий механізм організації постсинаптичного ущільнення у збуджуючих синапсах. Зміни постсинаптичного цитоскелетного каркасу у синапсах NCAM-дефіцитних тварин блокують залежне від активності накопичення CAMkІІ, яке необхідне для довготривалих змін ефективності синапсів.

9. Молекула позаклітинного матриксу тенасцин-R є одним з компонентів позаклітинного матриксу, що визначають структуру та функцію гальмівних синапсів зони СА1 гіпокампу. Дефіцит тенасцину-R викликає зменшення кількості та розмірів активних зон гальмівних синапсів, а також аномальне накопичення синаптичних везикул резервного пулу, яке свідчить про порушення балансу між екзо- та ендоцитозом синаптичних везикул.

10. Молекули клітинної адгезії L1, CHL1, NCAM, а також молекула позаклітинного матриксу тенасцин-R є важливими чинниками підтримки нормальної структури та функції гальмівних та збуджуючих синапсів зони СА1 гіпокампу, які відіграють значну роль у механізмах синаптичної пластичності.

Список статей опублікованих за темою дисертації

1. Никоненко А.Г. Применение имитационных вычислительных моделей в морфологическом исследовании нейроцитов гипоталамуса // Межведом. науч. сб. “Проблемы физиологии гипоталамуса”. Нац.университет им. Т.Шевченко. К: Либідь, 1992. Вып. 26. С. 58-62.

2. Nikonenko A.G. The Cell Sectioning Model. Nuclear/cytoplasmic ratio studied by computer simulation // Analyt.Quant.Cytol.Histol. 1996. Vol.18, №1. Р.23-34.

3. Nikonenko A.G. Computer simulation as a tool in evaluating intracellular spatial arrangement of an organelle using random section data // Microsc.Res.Techn. 1998. Vol.42, №6. Р. 451-458.

4. Никоненко А.Г., Никоненко И.Р., Скибо Г.Г. Количественный анализ пространственного распределения синаптических везикул с помощью метода минимального остовного дерева // Доп. НАНУ. 1999. №11, С. 156-161.

5. Ніконенко О.Г., Шейченко А.В., Скибо Г.Г. Просторовий розподіл везикул у синаптичних терміналях: комп'ютерна імітація // Нейрофізіологія. 1999. Т.31, №4. С. 332-336.

6. Никоненко А.Г., Шейченко А.В., Никоненко И.Р., Никандрова Е.А., Скибо Г.Г. Анализ пространственного распределения везикул в пресинаптических терминалях гиппокампа in vivo и in vitro с помощью метода ближайшего соседа // Нейрофизиология. 2000. Т.32, №5. С. 300-304.

7. Nikonenko A.G., Nikonenko I.R., Skibo G.G. Computer simulation approach to the quantification of immunogold labelling on plasma membrane of cultured neurons // J.Neurosci.Meth. 2000. Vol.96, №1. Р. 11-17.

8. Nikonenko A., Schmidt S., Skibo G., Brьckner G., Schachner M. (2003) Tenascin-R-deficient mice show structural alterations of symmetric perisomatic synapses in the CA1 region of the hippocampus // J.Comp.Neurol. 2003. Vol.456, №4. Р. 338-349.

9. Law J.W.S., Lee A.Y.W., Sun M., Nikonenko A.G., Chung S.K., Dityatev A., Schachner M., Morellini F. Decreased anxiety, altered place learning, and increased CA1 basal excitatory synaptic transmission in mice with conditional ablation of the neural cell adhesion molecule L1 // J.Neurosci. 2003. Vol.23, №32. Р. 10419-10432.

10. Nikonenko A.G. Technique to study three-dimensional spatial arrangement of synaptic vesicles using data from single sections // Microsc.Res.Tech. 2003. Vol.62, №3. Р. 201-210.

11. Saghatelyan A.K., Nikonenko A.G., Sun M., Rolf B., Putthoff P., Kutsche M., Bartsch U., Dityatev A., Schachner M. Reduced GABAergic transmission and number of hippocampal perisomatic inhibitory synapses in juvenile mice deficient in the neural cell adhesion molecule L1 // Mol.Cell. Neurosci. 2004. Vol.26, №1. Р. 191-203.

12. Nikonenko A.G., Skibo G.G. Technique to quantify local clustering of synaptic vesicles using single section data // Microsc.Res.Tech. 2004. Vol.65, №6. Р. 287-291.

13. Ніконенко О.Г., Скібо Г.Г. Локальні особливості просторового розподілу синаптичних везикул у перисоматичних синапсах зони СА1 гіпокампу мишей // Доп. НАНУ. 2006. №4. С. 158-162.

14. Nikonenko A.G., Sun M., Lepsveridze E., Apostolova I., Petrova I., Irintchev A., Dityatev A., Schachner M. Enhanced perisomatic inhibition and impaired long-term potentiation in the CA1 region of juvenile CHL1 deficient mice // Eur.J.Neurosci. 2006. Vol.23, №7. Р. 1839-1852.

15. Anderson R.B., Turner K.N., Nikonenko A.G., Hemperly J., Schachner M., Young H.M. The cell adhesion molecule L1 is required for chain migration of neural crest cells in the developing mouse gut // Gastroenterology. 2006. Vol.130, №4. Р. 1221-32.

16. Никоненко А.Г., Скибо Г.Г. Оценка количества синаптических везикул в асимметричных синапсах гиппокампа // Нейрофизиология. 2006. Т.38, №3. С. 219-223.

17. Никоненко О.Г., Скібо Г.Г. Порівняльний аналіз просторової організації пулів синаптичних везикул у симетричних та асиметричних синапсах гіпокампу // Доп.НАНУ. 2006. №10. С. 163-167.

18. Коваленко Т.М., Осадченко І.О., Сможаник К.Г., Ніконенко О.Г., Скибо Г.Г. Ультраструктурні основи відстроченої загибелі нейронів гіпокампу після експериментальної ішемії мозку // Вісник наукових досліджень (Тернопіль). 2006. №3. С. 42-44.

19. Sytnyk V., Leshchyns'ka I., Nikonenko A.G., Schachner M. NCAM promotes assembly and activity-dependent remodeling of the postsynaptic signaling complex // J.Cell Biol. 2006. Vol.174, №7. P. 1071-1085.

20. Ніконенко О.Г., Скибо Г.Г. Вікові зміни пулів синаптичних везикул в аксо-соматичних синапсах на пірамідних нейронах зони СА1 гіпокампа миші // Нейрофизиология. 2006. Т.38, №5-6. С. 407-411.

Тези доповідей

1. Nikonenko A.G. Algorithm for computer simulation of cell cutting process // Anal.Quant. Cytol.Histol. 1994. V.16, №1. P. 61-62.

2. Nikonenko A.G. Histograms' interpretation algorythm for DNA ploidy analysis in tissue sections // Abstracts of 8^th Int. Symp. on Diagn. Quant. Pathol., Amsterdam, 14-16 September, 1994. P. 179.

3. Nikonenko A.G. Evaluation of intracellular position of an organelle on random sections with the help of computer simulation // Acta Cytologica. 1995. V.39, №2. P. 337.

4. Nikonenko A.G. Simulational modeling as a tool of computerized morphometry // Anal.Quant. Cytol.Histol. 1996. V.18, №1. P. 87.

5. Nikonenko A.G., Sheichenko A.V., Nikonenko I.R., Nikandrova Y., Skibo G.G. Spatial arrangement of synaptic vesicles in synaptic terminals of hippocampal neurons analysed with computer simulation // Abstracts of 15^th British Neuroscience Association Meeting, Harrogate, 11-14 April, 1999. P. 88.

6. Ushakova G.A., Nikonenko I.R., Nikonenko A.G., Skibo G.G. Free heparin in substrates takes part in the regulation of neurite outgrowth // Abstracts of 15^th British Neuroscience Association Meeting, Harrogate, 11-14 April, 1999. Р. 46.

7. Nikonenko A.G., Nikonenko I.R., Nikandrova Y.A., Skibo G.G. 3D spatial distribution of synaptic vesicles can be quantified in random sections using computer simulation // Abstracts of 5^th IBRO Congress, Jerusalem, 11-15 July, 1999. Р. 166.

8. Skibo G.G., Nikonenko A.G., Nikandrova Y.A., Sheichenko A.V., Nikonenko I.R. Comparative study of vesicle spatial pattern in rat hippocampal synapses in vivo and in vitro // Abstracts of FENS Meeting, Brighton, 24-28 June, 2000. Р. 388.

9. Nikonenko A.G., Nikonenko I.R., Skibo G.G. Spatial dimensions of synaptic vesicle cycle studied in organotypic hippocampal slice culture // Abstracts of SFN Meeting, New Orleans, 4-9 November, 2005. P. 437.

10. Bukalo O., Nikonenko O., Schachner M., Dityatev A. Mice deficient for the extracellular matrix glycoprotein tenascin-R show increased hippocampal polyspiking activity and shifted thresholds for induction of long-term potentiation and depression // Proceedings of 5^th Meeting of German Neuroscience Society, Stuttgart, 2003. P. 708-709.

11. Bukalo O., Nikonenko O., Schachner M., Dityatev A. Gabaergic inhibition and metaplasticity: insights from analysis of mice deficient in the extracellular matrix glycoprotein tenascin-R // Abstracts of SFN Meeting, San Diego, 12-16 November, 2005. P. 304.

12. Bukalo O., Nikonenko O., Schachner M., Dityatev A. Regulation of perisomatic inhibition and synaptic plasticity by the extracellular matrix glycoprotein tenascin-R // Abstracts of 5th FENS Meeting, Vienna, 8-12 July, 2006. P. 205.

13. Ніконенко О.Г. Вплив дефіциту молекул клітинної адгезії L1 та CHL1 на структуру та функцію гальмівних синапсів // Тези доповідей IV з'їзду Укр.Біофізичного Товариства, Донецьк, 19-21 грудня, 2006. С.

Анотація

Ніконенко О.Г. Роль молекул адгезії у механізмах синаптичної пластичності. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Інститут фізіології ім О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню ролі молекул адгезії у механізмах адаптивних перебудов гальмівних та збуджуючих синапсів. В роботі запропоновані нові методи аналізу просторових феноменів, що корелюють з синаптичною функцією. Вперше показано, що дефіцит молекул клітинної адгезії L1 та СНL1 веде до значних змін структури та функції гальмівних перисоматичних синапсів та модифікації імпульсної активності пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу. Зменшення ефективності перисоматичних синапсів у L1-дефіцитних тварин визначається зменшенням кількості квантів нейромедиатора, який вивільнюється у відповідь на потенціал дії. Встановлено, що гальмівна перисоматична передача у CHL1-дефіцитних мишей є підвищеною, що викликає у цих тварин послаблення коротко- та довготривалої потенціації збуджуючих синапсів. Відкритий досі невідомий механізм, завдяки якому NCAM сприяє формуванню постсинаптичного протеїнового каркасу і, таким чином, визначає організацію постсинаптичного ущільнення у збуджуючих синапсах. Вперше показано, що молекула позаклітинного матриксу тенасцин-R впливає на структуру та функцію гальмівних та збуджуючих синапсів зони СА1 гіпокампу. Дефіцит тенасцину-R викликає зменшення гальмівної аферентації пірамідних нейронів зони СА1. Встановлено, що молекули адгезії є важливими чинниками формування та підтримки нормальної структури та функції синапсів, які відіграють значну роль у феноменах синаптичної пластичності.

Ключові слова: гіпокамп, молекули адгезії, синаптична пластичність, синаптична функція, хімічний синапс.

Аннотация

Никоненко А.Г. Роль молекул адгезии в механизмах синаптической пластичности. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Институт физиологии им.А.А.Богомольца, Киев, 2007.

Диссертация посвящена исследованию роли молекул клеточной адгезии и адгезивных молекул внеклеточного матрикса в механизмах адаптивных перестроек тормозных и возбуждающих синапсов. В работе предложены новые методы интерпретации пространственных феноменов, коррелирующих с синаптической функцией, которые основаны на идеологии математического моделирования и компьютерной имитации. Эти методы, нацеленные на анализ пространственного распределения везикул в синапсах гиппокампа и иммунопозитивных эпитопов на плазматической мембране нервных клеток, воплощены в оригинальном программном обеспечении. Изучено влияние дефицита молекулы клеточной адгезии L1 на тормозную афферентацию клеток пирамидного слоя зоны СА1 гиппокампа и ультраструктуру перисоматических синапсов. Впервые показано, что дефицит L1 приводит к значительным физиологическим и структурным аномалиям тормозных синапсов, которые модифицируют импульсную активность пирамидных нейронов в зоне СА1. У мутантов происходит уменьшение количества и размеров активных зон перисоматических синапсов, а также уменьшение размера пула везикул, готовых к выбросу нейромедиатора. Впервые выявлены уменьшение амплитуды и частоты унитарных тПСП, большая вариабельность амплитуды, а также уменьшение частоты миниатюрных тПСП у этих животных. Показано, что в ответ на потенциал действия, который приходит в пресинаптическую терминаль, у L1-дефицитных животных происходит освобождение меньшего числа квантов нейромедиатора. Впервые установлено, что молекула клеточной адгезии СНL1 является важным компонентом тормозных синапсов, который в значительной степени определяет их структуру и функцию. Ее дефицит вызывает увеличение количества и размеров активных зон тормозных синапсов на телах пирамидных нейронов в зоне СА1 гиппокампа. Пространственное распределение СВ свидетельствует о повышенной активности перисоматических синапсов, что подтверждается большей амплитудой унитарных тормозных постсинаптических потенциалов. Для СНL1-дефицитных животных свойственно уменьшение долговременной потенциации в СА3-СА1 синапсах. В работе изучен эффект дефицита молекулы клеточной адгезии NCAM на структуру возбуждающих синапсов радиального слоя зоны СА1 гиппокампа, а также на постсинаптический цитоскелетный каркас и рецепторный аппарат постсинаптических плотностей асимметричных синапсов. Показано, що дефицит NCAM приводит к уменьшению размеров активной зоны, уровней NMDA- рецепторов, CAMkII и спектрина в постсинаптической плотности, а также резервного пула синаптических везикул. Открыт неизвестный ранее механизм формирования постсинаптического цитоскелета при участии, NCAM, который определяет структуру постсинаптической плотности. Исследовано влияние дефицита молекулы внеклеточного матрикса тенасцина-R на структуру пирамидного слоя зоны СА1 гиппокампа, афферентацию пирамидных нейронов и ультраструктуру перисоматических синапсов. Выявлено, что дефицит тенасцина R вызывает уменьшение активных зон симметричных синапсов, а также аномальное накопление синаптических везикул в резервном пуле. Установлено, что молекулы адгезии являются важным фактором формирования и поддержки нормальной структуры и функции тормозных и возбуждающих синапсов. Сделан вывод о том, что молекулы клеточной адгезии и адгезивные молекулы внеклеточного матрикса нервной ткани играют значительную роль в механизмах синаптической пластичности.

Ключевые слова: гиппокамп, молекулы адгезии, синаптическая пластичность, синаптическая функция, химический синапс.

Annotation

Nikonenko A.G. Role of adhesion molecules in the mechanisms of synaptic plasticity. - Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Biological Sciences in specialty 03.00.02 - Biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology, Kiev, 2007.

The thesis focuses on the issue of cell adhesion playing the role in synaptic plasticity. Within the frame of this study, new methods were developed to analyze vesicles' spatial patterns in hippocampal synapses, as well as distribution of immunopositive epitopes on plasma membrane. The effect of cell adhesion molecule L1 deficiency on inhibitory input to hippocampal CA1 pyramidal cells was analyzed. It was revealed that L1 deficiency leads to major physiologic and ultrastructural abnormalities of inhibitory synapses modifying spіking patterns of hippocampal CA1 pyramidal cells. Fewer and smaller active zones of inhibitory synapses, reduced readily releasable pool (RRP) size and unitary iPSPs amplitude were observed. Higher amplitude variability, larger number of release failures as well as the decrease in frequency but not in the amplitude of miniature iPSPs were also typical of L1^-/-animals. It was shown that CHL1 deficiency induces changes both in the size and number of active zones of symmetric synapses formed on hippocampal CA1 pyramidal cell bodies. Spatial distribution of vesicles and larger RRP size indicating the increased activity of perisomatic synapses were confirmed by the increase in unitary iPSP amplitude. Decrease in LTP of CA3-CA1 synapses was typical of СНL1^-/- animals. The effect of NCAM deficiency on the structure of asymmetric synapses in hippocampal CA1 stratum radiatum as well as on postsynaptic cytoskeletal scaffold and receptors was studied. It was shown that NCAM deficiency leads to the decrease in active zone size, levels of NMDA-receptors, CAMkII and spectrin in postsynaptic density, as well as in reserve vesicle pool size. The effect of deficiency in extracellular matrix protein - tenascin-R -on the inhibitory afferentation of CA1 pyramidal cells and structure of perisomatic synapses was investigated. It was revealed that tenascin-R deficiency results in the decrease of coverage of pyramidal cell bodies by active zones. It was concluded that cell adhesion molecules and extracellular matrix molecules present an important link between extra- and intracellular media, and property of these molecules to react to extracellular environment changes is indispensable factor of synaptic plasticity.

Keywords: cell adhesion, chemical synapse, hippocampus, synaptic function, synaptic plasticity.

Размещено на Allbest.ru