Оценка антропогенного загрязнения водоёмов г. Ишима по показателям спонтанного мутирования у Drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВПО «ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Филиал ФГБОУ ВПО «Тюменский государственный университет»

в г. Ишим

Факультет математики, информатики и естественных наук

Кафедра биологии, географии и методики их преподавания

Курсовая работа

Оценка антропогенного загрязнения водоёмов г. Ишима по показателям спонтанного мутирования у Drosophila melanogaster

Работу выполнил:

Григоров Иван Сергеевич

студент 4 курса

611 группы

очной формы обучения

Научный руководитель:

к.б.н., доцент кафедры

Пузынина Галина Георгиевна

Ишим 2015



Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Мутационный процесс

1.2 Генные мутации

1.3 Методы выявления и учета генных мутаций

2. Классификация мутагенов и их характеристика

2.1 Физические мутагены и их влияние на живые клетки

2.1.1 Влияние ионизирующего облучения на живой организм

2.1.2 Влияние ультрафиолетового излучения на живой организм

2.2 Химические мутагены и их влияние на живые клетки

2.2.1 Влияние химических мутагенов на живые клетки

2.3 Биологические мутагены и их влияние на живые клетки

3. Характеристика исследуемых водоёмов

4. Материалы и методы исследований

4.1 Биология, морфология и разведение дрозофилы

4.2 Питательная среда и ее приготовление. Правила работы с дрозофилой, подготовка и постановка опытов

4.3 Материалы и методы

Список использованной литературы



Введение

генный мутация клетка мутаген

Интенсивная антропогенная нагрузка оказывает существенное влияние на поверхностные водные объекты. Современное экологическое состояние природных вод, по мнению специалистов, является неблагоприятным[5]. Как поверхностные, так и подземные воды являются загрязненными различными химическими соединениями. Многие загрязнители, содержащиеся в поверхностных и подземных водах обладают токсическими и мутагенными свойствами и оказывают негативное влияние на живые системы[1.3-6; 9.10]. В комплексе экологических прогнозов связанных с загрязнителями окружающей среды, особое место занимает прогноз возможных генетических последствий и их действия.

Существующая система контроля качества воды основана, в основном, на химико-аналитическом определении отдельных загрязнителей. Однако, в связи большим количеством химических соединений поступающих в водоёмы, такой подход не позволяет определить истинную загрязненность воды, а главное, влияние загрязнителей на живые объекты. В связи с этим более объективный анализ токсических и мутагенных свойств воды дает метод биотестирования, который позволяет выявить присутствие не отдельных веществ, а общебиологический эффект их действий.

Изучение токсикологических свойств природных вод имеет многолетнюю историю. В то время как исследования, направленные на изучение мутагенности природных и питьевых вод, достаточно редки и проведены только в некоторых регионах страны[5].

Целью является исследование токсического и мутагенного влияния воды озера Чертовое и реки Ишим на тест объект плодовая мушка Drosophila melanogaster.

Объектом исследования является внутренние водоёмы находящиеся на урбанизированной территории, река Ишим, озеро чертовое.

Предметом исследования является токсические и мутагенные свойства природных вод озера Чертовое и реки Ишим.

Задачи исследования:

1. По литературным данным ознакомиться со степенью изученность данной проблемы на сопредельных территориях.

2. Отобрать пробы вод озера Чертовое и реки Ишим.

3. Исследовать токсичность и мутагенность отобранных проб воды с помощью тестерной линии Drosophila melanogaster Мёллер-5.

4. Провести статистическую обработку результатов исследования и оценить токсичность и мутагенность исследуемых вод.

Гипотеза исследования:

В ходе исследования, предполагается, что будет выявлен высокий уровень токсичности и мутагенности исследуемых водоёмов.



1. Обзор литературы

1.1 Мутационный процесс

Термин «мутация» (от лат. mutatio - изменение) долгое время использовался в биологии для обозначения любых скачкообразных изменений. Например, немецкий палеонтолог В. Вааген называл мутацией переход от одних ископаемых форм к другим. Мутацией называли также появление редких признаков, в частности, меланистических форм среди бабочек.

Современные представления о мутациях сложились к началу XX столетия. Например, российский ботаник С. И. Коржинский в 1899 г. разработал эволюционную теорию гетерогенезиса, основанную на представлениях о ведущей эволюционной роли дискретных (прерывистых) изменений.

Однако наиболее известной стала мутационная теория голландского ботаника Хьюго (Гуго) Де Фриза (1901 г.), который ввел современное, генетическое понятие мутации для обозначения редких вариантов признаков в потомстве родителей, которые не имели этого признака. Де Фриз разработал мутационную теорию на основе наблюдений за широко распространенным сорным растением - ослинником двулетним, или энотерой (Oenotherabiennis). У этого растения существует несколько форм: крупноцветковые и мелкоцветковые, карликовые и гигантские. Де Фриз собирал семена с растения определенной формы, высевал их и получал в потомстве 1…2% растений другой формы. В дальнейшем было установлено, что появление редких вариантов признака у энотеры не является мутацией; данный эффект обусловлен особенностями организацией хромосомного аппарата этого растения. Кроме того, редкие варианты признаков могут быть обусловлены редкими сочетаниями аллелей (например, белая окраска оперения у волнистых попугайчиков определяется редким сочетанием aabb).

Основные положения мутационной теории Де Фриза остаются справедливыми и по сей день (с некоторыми современными уточнениями).

Таблица 1. Положения мутационной теории

	Положения мутационной теории Де Фриза	Современные уточнения
1	Мутации возникают внезапно, без всяких переходов.	существует особый тип мутаций, накапливающихся в течение ряда поколений (прогрессирующая амплификация в интронах).
2	Успех в выявлении мутаций зависит от числа проанализированных особей.	без изменений
3	Мутантные формы вполне устойчивы.	при условии 100%-ной пенетрантности (мутантному генотипу соответствует мутантный фенотип) и 100%-ной экспрессивности (одна и та же мутация проявляется у разных особей в равной степени)
4	Мутации характеризуются дискретностью (прерывистостью); это качественные изменения, которые не образуют непрерывных рядов, не группируются вокруг среднего типа (моды).	существуют ликовые мутации, в результате которых происходит незначительное изменение характеристик конечного продукта
5	Одни и те же мутации могут возникать повторно.	это касается генных мутаций; хромосомные аберрации уникальны и неповторимы
6	Мутации возникают в разных направлениях, они могут быть вредными и полезными.	сами по себе мутации не носят адаптивный характер; только в ходе эволюции, в ходе отбора оценивается «полезность», «нейтральность» или «вредность» мутаций в определенных условиях; при этом «вредность» и «полезность» мутаций зависит от генотипической среды

В настоящее время, принято следующее определение мутаций:

Мутации - это качественные изменения генетического материала, приводящие к изменению тех или иных признаков организма.

Организм, во всех клетках которого обнаруживается мутация, называется мутантом. Процесс возникновения мутаций называют мутагенезом, а факторы среды, вызывающие появление мутаций, -- мутагенами.

По типу клеток, в которых мутации произошли, и по способности передаваться при половом размножении различают соматические и генеративные мутации.

Рис.1. Мутации по месту возникновения

Генеративные мутации возникают в половых клетках, не влияют на признаки данного организма, проявляются только в следующем поколении.

Соматические мутации возникают в соматических клетках, проявляются у данного организма и не передаются потомству при половом размножении. Сохранить соматические мутации можно только путем бесполого размножения (прежде всего вегетативного).

По адаптивному значению выделяют: полезные, вредные (летальные, полулетальные) и нейтральные мутации. В настоящее время считается, что многие мутации не оказывают существенного влияния на жизнеспособность особей; такие мутации называются нейтральными. Нейтральность мутаций часто обусловлена тем, что большинство мутантных аллелей рецессивно по отношению к исходному аллелю. Однако существуют мутации, приводящие к гибели организма (летальные) или заметно снижающие его жизнеспособность (полулетальные). В определенных условиях мутации могут повышать жизнеспособность организмов (как в примере с серповидноклеточной анемией). Следует отметить, что одна и та же мутация в одних условиях может быть полезной, а в других -- вредной.

По характеру проявления мутации могут быть доминантными и рецессивными.

Рис.2. Мутации по характеру проявления

Если доминантная мутация является вредной, то она может вызвать гибель ее обладателя на ранних этапах онтогенеза. Рецессивные мутации не проявляются у гетерозигот, поэтому длительное время сохраняются в популяции в «скрытом» состоянии и образуют резерв наследственной изменчивости. При изменении условий среды обитания носители таких мутаций могут получить преимущество в борьбе за существование.

В зависимости от того, выявлен ли мутаген, вызвавший данную мутацию, или нет, различают индуцированные и спонтанные мутации. Обычно спонтанные мутации возникают естественным путем, индуцированные -- вызываются искусственно, возникают под воздействием мутагенов.

Мутации классифицируют на основании различных критериев. Например, по уровню фенотипического проявления различают следующие мутации: биохимические (изменяется структура белков); физиолого-биохимические (изменяется обмен веществ); онтогенетические (изменяется характер онтогенеза); физиолого-репродуктивные (изменяются плодовитость, границы репродуктивного периода); анатомо-морфологические (изменяется внутреннее и внешнее строение организмов); этологические (поведенческие).

По уровню организации генетического материала, в зависимости от уровня наследственного материала, на котором произошла мутация затронутого изменением, все мутации делят на генные, хромосомные и геномные.

Рис.3. Мутации по уровню возникновения



Обобщенно все многочисленные виды мутаций можно представить рисунком 4

Рис.4. Виды мутаций

В рамках темы курсовой работы особый интерес представляют генные мутации, ниже они будут рассмотрены подробно.

1.2 Генные мутации

Генная, или точковая, мутация представляет собой изменение последовательности нуклеотидов в пределах одного гена, приводящее к изменению характера действия гена. Как правило, это молекулярное изменение в гене, которое вызывает фенотипический эффект. Допустим, что какой-то ген содержит в некоторой своей точке кодов, или триплет, ЦТТ, кодирующий одну из аминокислот полипептидной цепи -- глутаминовую кислоту. В результате замены всего лишь одного нуклеотида кодон ЦТТ может превратиться в кодон ГТТ, Этот новый кодон обусловливает синтез уже не глутаминовой кислоты, а глутамина, так что в полипептидной цепи, синтезируемой под действием измененного гена, на месте глутаминовой кислоты окажется глутамин. Первоначальная и мутантная молекулы белка отличаются одна от другой, и вполне возможно, что это влечет за собой другие, вторичные, фенотипические различия.

Стабильность генов на протяжении последовательных поколений клеток и особей, а, следовательно, и консервативность наследственности обусловлены точностью процесса копирования при репликации гена, однако процесс копирования несовершенен. Время от времени при копировании возникают ошибки. Генные мутации можно рассматривать как такие ошибки копирования.

Новый мутантный аллель точно реплицируется до тех пор, пока не произойдет следующее мутационное изменение. Таким образом, в результате генной мутации появляется пара или серия гомологичных аллелей. И наоборот, наличие аллельной изменчивости по любому гену, в конечном счете, означает, что этот ген в то или иное время претерпел мутацию.

Любой ген, входящий в состав генотипа, по-видимому, подвержен мутированию. Во всяком случае, в генах, контролирующих весьма разнообразные признаки, наблюдаются мутации. Например, у Drosophilamelanogaster известны мутанты со слегка сморщенными крыльями, сильно укороченными крыльями или вообще бескрылые; мутанты с белыми или пурпурными глазами; мутанты с разнообразными изменениями щетинок и т. п. Известен ряд мутантных разновидностей смородинного томата (Lycopersiconpimpinellifolium), различающихся по форме листьев. Биохимические мутации, затрагивающие различные звенья метаболических процессов, хорошо известны у микроорганизмов и имеются, хотя и гораздо менее изучены, у высших организмов.

По степени фенотипического проявления генные мутации варьируют в широком диапазоне -- от мутаций со слабыми эффектами до мутаций, вызывающих значительные изменения фенотипа. Эти два экстрёмальных типа называют соответственно малыми мутациями и макромутациями. Хорошо заметные, но не обладающие сильным действием мутации типичны для средней части диапазона. Примерами малых мутаций служат мутанты Drosophilamelanogaster со статистически незначительными отклонениями от нормальной жизнеспособности или от нормального числа щетинок. Примером макромутации служит мутант tetraptera у D. melanogaster с четырьмя крыльями вместо двух. Он представляет собой резкое отклонение от двукрылости, характерной для сем. Drosophilidae и для отряда Diptera.

У диплоидных животных и растений значительную долю новых мутаций составляют рецессивные мутации, а гены дикого типа доминируют. Важное следствие рецессивности многих мутантных аллелей заключается в том, что они не подвергаются действию отбора немедленно, но могут сохраняться в диплоидной популяции на протяжении многих поколений.

Генные мутации классифицируют по следующим типам и группам: в зависимости от характера молекулярного изменения в гене и по своим последствиям.

Точковые мутации можно разделить на несколько типов в зависимости от характера молекулярного изменения в гене.

Генные, или точечные, мутации бывают в основном 3 видов:

· замены, при которых одно азотистое основание в ДНК замещается на другое;

· вставки, обеспечивающие внедрение в молекулу ДНК одного или нескольких дополнительных нуклеотидов;

· делеции (или выпадения) одного или нескольких нуклеотидов, при которых происходит укорочение молекулы ДНК.

1. Мутации по типу замены возникают в результате замены одного азотистого основания на другое, что вызывает изменение в одном из кодонов мутантного гена. Если кодирующий триплет, в котором находится изменённый нуклеотид, из-за вырожденности кода вызывает включение в белок той же аминокислоты, что исходный кодон (или кодон "дикого" типа), то такую мутацию называют "молчащей", и белковый продукт остаётся тем же.



	Триплет "дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-GGT-5' З'-	3'-GGA-5'
Кодон мРНК	ССА-З' -Про-	5'-CCU-3'
Аминокислота		-Про-

Когда замена одного основания приводит к замене аминокислоты в мутантом белке, то такую мутацию называют "миссенс-мутация". В ряде случаев, несмотря на произошедшую замену, белок сохраняет биологическую активность. Это, как правило, связано с тем, что изменённая аминокислота находится в участке белка, не имеющем функционального значения, и к тому же она по структуре и свойствам напоминает исходную аминокислоту. Такая мутация тоже будет "молчащей", а замена - эквивалентной.

	Триплет "дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-ТАА-5'	3`'-GAA-5'
Кодон мРНК	5'-AUU-3'	5'-CUUU-3'
Аминокислота	-Иле-	-Лей-

Иногда аминокислота, оказавшаяся заменённой, располагается в области, важной для проявления функциональной активности белка, и её замещение приводит к образованию функционально неактивного продукта. Так, точечная мутация в кодоне серина (Сер - важнейший структурный компонент активного центра сериновых протеаз: трипсина, химотрипсина и некоторых других ферментов) приводит к полной потере активности. Если подобный фермент участвует в реакциях главных метаболических путей, то такая "неэквивалентная" замена может стать летальной.



	Триплет"дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-АGА-З'	3'-ААА-5'
Кодон мРНК	5'-UCU-3'	5'-UUU-3' -
Аминокислота	-Сер-	Фен-

В ряде случаев мутантный белок, несмотря на входящую в него изменённую аминокислоту, сохраняет способность вьшолнять свою функцию, но может быть не столь эффективным, как белок "дикого" типа. В результате мутации у фермента может оказаться более высоким значение К_m или более низким значение V_max, а иногда то и другое одновременно. Такие частично функционирующие белки называют мутантными белками с не полностью подавленной функцией.

Изредка в результате мутации белковый продукт гена оказывается лучше приспособленным к выполнению своей функции. Такие мутации дают потомству преимущества в борьбе за существование, а серия соответствующих мутаций может привести к появлению нового вида.

Наибольшим повреждающим действием обладают мутации, приводящие к образованию одного из терминирующих кодонов (нонсенс-мутация). В процессе синтеза белка работа рибосомы будет остановлена на мутантном триплете мРНК: UAA, UAG или UGA. Проявление нонсенс-мутаций зависит от их внутригенной локализации. Чем ближе мутация к 5'-концу гена, т.е. к началу транскрипции, тем короче её белковый продукт, а следовательно, тем меньше он способен к осуществлению биологической функции.

	Триплет "дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-GTC-5'	3'-АТС-5'
Кодон мРНК	5'-CAG-3'	5'-UAG-3'
Аминокислота	-Глн-	Стоп-кодон



2. Мутации по типу вставки или делеции нуклеотидов. Более многочисленны и опасны для клеток мутации по типу вставки или делеции (утраты) нуклеотидов. Если мутация приводит к вставке или делеции в ген одной нуклеотидной пары или участка двухцепочечной молекулы ДНК с числом мономеров, не кратным 3 , то это вызывает изменение считывания всех последующих кодонов, так как происходит сдвиг "рамки считывания" ДНК и нарушение соответствия между кодонами в ДНК и аминокислотами в конечном продукте - белке (рис. 5).

Рис. 5. Делеции (А) или вставки (Б) нуклеотидов вызывают мутации со сдвигом "рамки считывания"

Как видно из рис. 5, нарушения в прочтении информации начинаются с участка, в котором произошла мутация, так как именно в этом месте происходит сдвиг "рамки считывания" информации. Белковый продукт за точкой мутации будет иметь случайную последовательность аминокислот. Мутации со сдвигом рамки считывания часто приводят к появлению внутреннего терминирующего кодона, вызывающего преждевременное прекращение синтеза полипептидной цепи и образование укороченного продукта, лишённого биологической активности.

Мутации со сдвигом "рамки считывания" индуцируют ингибиторы матричных синтезов - "интеркаляторы". Их большие плоские молекулы, похожие на обычные азотистые основания или пары оснований, встраиваются между двумя соседними парами оснований, в результате в ДНК "как бы" появляется лишнее основание. В ходе репликации такой изменённой цепи ДНК в дочернюю нить в результате ошибочного спаривания с "интеркалированной" молекулой может встроиться дополнительный нуклеотид.

Иногда, хотя и крайне редко, теряется или включается в ДНК олигодезоксинуклеотид, состоящий из 3 или кратного 3 числа нуклеотидов. Такие мутации называют делециями или вставками без сдвига "рамки считывания" ДНК. В образующемся белковом продукте в этом участке окажется пропущенной или, наоборот, включённой дополнительно одна или несколько аминокислот, тогда как вся остальная аминокислотная последовательность будет соответствовать исходной молекуле. Такие мутации, как правило, не приносят большого вреда.

Генные мутации, таким образом, выражаются в изменении структуры отдельных участков ДНК.

По своим последствиям генные мутации делятся на две группы: мутации без сдвига рамки считывания и мутации со сдвигом рамки считывания.

Мутации без сдвига рамки считывания происходят в результате замены нуклеотидных пар, при этом общая длина ДНК не изменяется. В результате возможна замена аминокислот, однако из-за вырожденности генетического кода возможно и сохранение структуры белка.

Пример: Замена аминокислотного остатка в составе полипептида (миссенс-мутации).

В состав молекулы гемоглобина человека входят две a-цепи (a-цепь закодирована в 16-ой хромосоме) и две b-цепи (b-цепь закодирована в 11-ой хромосоме). В состав b-цепи входит 146 аминокислотных остатков, при этом в нормальной b-цепи шестым аминокислотным остатком является глутаминовая кислота. С участием нормальной b-цепи образуется нормальный гемоглобин - HbA. В нетранскрибируемой нити участка ДНК, кодирующего b-цепь, глутаминовая кислота закодирована триплетом ГАА. Если же в результате мутации в ДНК произойдет замена триплета ГАА на триплет ГТА, то на месте глутаминовой кислоты в молекуле гемоглобина в соответствии с генетическим кодом появится валин. В итоге вместо гемоглобина HbA появится новый гемоглобин - HbS. Такая замена всего лишь одного нуклеотида и одной аминокислоты приводит к развитию тяжелого заболевания - серповидноклеточной анемии.

На клеточном уровне серповидноклеточная анемия проявляется в том, что при гипоксии (недостатке кислорода) эритроциты приобретают форму серпа и теряют способность к нормальному транспорту кислорода. Гомозиготы HbS/HbS умирают в раннем детстве. Зато гетерозиготы HbA/HbS характеризуются слабо измененными эритроцитами. При этом изменение формы эритроцитов значительно повышает устойчивость гетерозигот к малярии. Поэтому в тех регионах Земли, где свирепствует малярия (например, в Африке), отбор действовал в пользу гетерозигот. Таким образом, серповидноклеточная анемия - это пример относительности «полезности» и «вредности» мутаций.

Пример: Мутация без замены аминокислотного остатка в составе полипептида (сеймсенс-мутации).

Если в нетранскрибируемой нити участка ДНК кодирующего b-цепь гемоглобина, произойдет замена триплета ГАА на триплет ГАГ, то из-за избыточности генетического кода замены глутаминовой кислоты не произойдет. В итоге структура b-цепи гемоглобина не изменится, и в эритроцитах будет обнаруживаться только нормальный гемоглобин HbA. Таким образом, вовсе не любая генная мутация проявляется в фенотипе.

Особую группу образуют ликовые мутации, в результате которых происходит незначительное изменение характеристик конечного продукта. Это связано с заменой аминокислотных остатков в пассивной части белка: такие замены не оказывают существенного влияния на структуру и функции белка.

Мутации со сдвигом рамки считывания (фреймшифты) происходят в результате вставки или потери нуклеотидных пар, при этом общая длина ДНК изменяется. В результате происходит полное изменение структуры белка.

Однако если после вставки пары нуклеотидов происходит потеря пары нуклеотидов (или наоборот), то аминокислотный состав белков может восстановиться. Тогда две мутации хотя бы частично компенсируют друг друга. Это явление называется внутригенной супрессией.

Мутации со сдвигом рамки считывания составляют ~ 80% от всех генных мутаций. Вставки иначе называются инсерциями, а потери - эксцизиями. Процесс образования вставок называется инсерционным мутагенезом. Инсерционный мутагенез необходимо учитывать в генной инженерии.

Нонсенс-мутации. Особую группу генных мутаций составляют нонсенс-мутации с появлением стоп-кодонов (замена смыслового кодона на стоп-кодон). Нонсенс-мутации могут возникать как вследствие замен нуклеотидных пар, так и с потерями или вставками. С появление стоп-кодонов синтез полипептида вообще обрывается. В результате могут возникать нуль-аллели, которым не соответствует ни один белок. Соответственно, возможно и обратное явление: замена нонсенс-кодона на смысловой кодон. Тогда длина полипептида может увеличиваться.

Существуют особые мутации, влияющие на экспрессию генов у эукариот:

1. Мутации, изменяющие степень компактизации ДНК. В гигантских политенных хромосомах и в хромосомах типа ламповых щеток описаны мутации, инактивирующие ген, расположенный в каком-либо одном участке ДНК, т.е. блокирующие декомпактизацию хроматина. Скрещивание гетерозигот по таким регуляторным мутациям в F2 дает расщепление 3:1, указывая на то, что они затрагивают единичные менделирующие факторы.

2. Гомеозисные мутации. Изменяют порядок экспрессии генов. Фенотипический эффект гомеозисных мутаций заключается в превращении одних органов в другие. Например, у мушки дрозофилы мутация группы bithorax, контролирующих развитие грудных и брюшных сегментов у дрозофилы, может приводить к появлению крылоподобных образований вместо галтеров; мутации группы antennapedia выражаются в том, что у насекомых на месте антенн вырастают ножки; мутации ophthalmoptera - развитие крыла из имагинального диска глаза; мутации proboscipedia - развитие ноги или части антенны (в зависимости от температуры) вместо хоботка; у мутантов tumoroushead ткани головы замещаются другими типами тканей, включая структуры, характерные для гениталий.

Некоторые мутации обладают плейотропным действием, т.е. приводят к изменению сразу нескольких признаков:

Ароматические аминокислоты - триптофан, фенилаланин, тирозин - образуются из хоризмовой кислоты. Если некоторая мутация заблокирует хотя бы один этап синтеза хоризмовой кислоты, то клетка (организм) утрачивает способность к синтезу сразу трех аминокислот.

Один и тот же фермент (трансаминаза) контролирует синтез валина (из б-кетоизовалериановой кислоты) и изолейцина (из б-кето-в-метилвалериановой кислоты). Если некоторая мутация нарушит функции этого фермента, то клетка (организм) утрачивает способность к синтезу сразу двух аминокислот.

Один и тот же полипептид (продукт экспрессии одного гена) может входить в состав разных ферментов. Например, белок-апоферментлипоатдегидрогеназы кишечной палочки в качестве субъединицы входит в состав других ферментов: пируватдегидрогеназы, 2-оксоглутаратдегидрогеназы, глицинового расщепляющего комплекса. Тогда мутация в гене LDH скажется на активности всех перечисленных ферментов.

Мутация в одном гене может подавлять мутации, происходящие в других (неаллельных) генах. Это явление называется межгеннойсупрессией.

Таблица 2. Основные виды генных мутаций

Виды мутаций	Изменения в структуре ДНК	Изменения в структуре белка
ЗАМЕНА
Без изменения смысла кодона	Замена одного нуклеотида в кодоне	Белок не изменён
С изменением смысла кодона (миссенс-мутация)		Происходит замена одной аминокислоты на другую
С образованием терминирующего кодона (нонсенс-мутация)		Синтез пептидной цепи прерывается, и образуется укороченный продукт
ВСТАВКА
Без сдвига «рамки считывания»	Вставка фрагмента ДНК из 3 нуклеотидов или с числом нуклеотидов, кратным 3	Происходит удлинение полипептидной цепи на одну или несколько аминокислот
Со сдвигом «рамки считывания»	Вставка одного или нескольких нуклеотидов, не кратных 3	Синтезируется пептид со «случайной» последовательностью аминокислот, так как изменяется смысл всех кодонов, следующих за местом мутации
ДЕЛЕЦИЯ
Без сдвига «рамки считывания»	Выпадение фрагмента ДНК из 3 нуклеотидов или с числом нуклеотидов, кратным 3	Происходит укорочение белка на одну или несколько аминокислот
Со сдвигом «рамки считывания»	Выпадение одного или нескольких нуклеотидов, не кратных 3	Синтезируется пептид со «случайной» последовательностью аминокислот, так как изменяется смысл всех кодонов, следующих за местом мутации

1.3 Методы выявления и учета генных мутаций

Сложность выявления генных мутаций связана, во-первых, с рецессивностью большинства мутаций (вероятность их фенотипического проявления ничтожно мала), а во вторых с летальностью многих из них (мутанты не выживают).

Все множество методов выявления генных мутаций можно разделить на две группы: методы генетического анализа и биохимические методы.

1. Методы генетического анализа основаны на скрещивании возможных носителей мутации с тестерными линиями (линиями-анализаторами). Самый простой метод - это скрещивание носителей предполагаемой мутации с соответствующей рецессивно-гомозиготной линией, т.е. обычное анализирующее скрещивание.

Однако этот метод не позволяет выявить неизвестные мутации, а также летальные мутации. Поэтому создаются специальные тестерные линии для учета летальных мутаций.

Например, у мушки дрозофилы синтезирована тестерная линия М-5 (Мёллер-5), которая характеризуется особой структурой X-хромосом у самок. В этих хромосомах имеются аллели с определенным фенотипическим проявлением (доминантный аллель B - полосковидные глаза; рецессивный аллель wa - абрикосовые глаза; кроме того, имеется еще один аллель - sc, контролирующий отсутствие щетинок, но он в анализе обычно не учитывается). В хромосомах М-5 изменен порядок генов: имеется одна большая инверсия и одна малая, расположенная внутри большой (инверсии будут рассмотрены ниже); такое строение хромосом исключает появление кроссоверных особей при скрещивании мушек М-5 с другими линиями.

Для выявления мутаций используются самцы дикого типа - с нормальными X-хромосомами (аллели В+ и w+ - нормальные красные глаза, sc+ - нормальные щетинки; нормальный порядок генов). Эти самцы подвергаются обработке мутагенами (факторами, повышающими частоту мутаций). В результате в их половых клетках часть X-хромосом мутирует, т.е. в них возникают мутации. Обработанные самцы скрещиваются с самками М-5. В первом поколении (F1) все самки имеют полосковидные темно-красные глаза, а самцы - абрикосовые полосковидные глаза. Кроме того, часть самок получает от отцов по нормальный X-хромосоме, а часть - по мутантной X-хромосоме. Все самцы получают от матерей М-5 только немутантные хромосомы с аллелями В и wa. В F1 рецессивные мутации у самок, даже если они есть, не дают летального эффекта, поскольку они находятся в гетерозиготном состоянии: мутантная X-хромосома дикого типа от отца сочетается с немутантной М-5-хромосомой от матери.

Затем гибриды первого поколения скрещиваются между собой, и потомство каждой самки выращивается отдельно. Часть самок несет немутантную X-хромосому дикого типа, и в их потомстве обнаруживаются немутантные самцы дикого типа. Однако некоторая часть самок несет мутантную X-хромосому дикого типа с летальной мутацией; соответственно их сыновья, получившие такие хромосомы, не выживают, и самцы дикого типа в потомстве самок-носительниц не обнаруживаются.

В настоящее время, кроме тестерной линии М-5 используются и другие тестерные лини мушек дрозофил и других модельных объектов. Например, существуют тест-системы, позволяющие выявлять мутации X-хромосомах самцов в первом же поколении, а также мутации в аутосомах. Применение этих линий позволяет изучать закономерности мутационного процесса, однако классический генетический анализ далеко не всегда можно использовать для выявления мутаций в популяциях человека и многих других организмов.

2. Биохимические методы выявления мутаций исключительно разнообразны и основаны на применении различных методик.

а). Методики, основанные на выявлении определенных биохимических продуктов мутантных генов. Легче всего выявлять мутации по изменению активности ферментов или по утрате какого-либо биохимического признака. Например, у микроорганизмов на селективных питательных средах выявляются ауксотрофные формы, не способные синтезировать определенные вещества (по сравнению с нормальными, прототрофными формами).

б). Методики, основанные на непосредственном выявлении измененных нуклеиновых кислот и белков с помощью гель-электрофореза в сочетании с другими методиками (блот-гибридизации, авторадиографии).

Методы учета мутаций:

Учет количества возникающих мутаций необходим при исследовании природы гена, его изменения, для понимания механизма влияния внешних условий и физиологического состояния организма на мутационный процесс.

Однако трудность подобного учета заключается в том, что часто не удается отличить мутацию от рекомбинации. Как мы видели в результате процессов расщепления и кроссинговера, в потомстве могут появляться новые наследственные признаки, которые легко принять за мутации. Такое же явление возможно при взаимодействии генов; рекомбинации могут имитировать мутации особенно в тех случаях, когда гены тесно сцеплены и редко разделяются в результате кроссинговера.

Методы обнаружения мутаций должны быть разными в зависимости от особенностей объекта -- главным образом способа размножения организма. При вегетативном и бесполом размножении многоклеточных организмов мутации учитываются в соматических тканях, дающих побег, в потомстве одной особи (по клонам). У самооплодотворяющихся растений и животных рецессивные мутации проявляются в следующем же после возникновения мутации поколении, перекрестно оплодотворяющихся организмов возникающие мутации переходят в гетерозиготное состояние в популяции особей, для выявления их необходимо применять близкородственное скрещивание (инбридинг), чтобы увеличить вероятность встречи особей, несущих в себе мутировавший ген.

Как уже говорилось выше, объективно регистрировать общее число возникающих мутаций пока практически невозможно. Однако подсчет мутаций в отдельных локусах и определенного типа мутаций вполне доступен. Некоторые видимые морфологические изменения можно учитывать довольно точно; несколько более сложным является определение физиологических и биохимических изменений у многоклеточных организмов. Последнее удается лишь при применении стандартных тестов на определенный химический состав или физиологическую реакцию организма и т. д., т. е. по ответу «да» или «нет».

Легче всего обнаруживаются видимые доминантные мутации, которые могут проявляться в гетерозиготном состоянии в первом же поколении, труднее анализировать рецессивные мутации. Для выявления последних требуется специальный генетический анализ в ряду поколений. Для того чтобы учитывать мутации, особенно рецессивные, возникшие как единичные изменения в хромосомах половых клеток, их необходимо переводить в гомозиготное состояние. Для дальнейшего анализа мутантную линию скрещивают с линией-анализатором, имеющей одну или несколько маркированных групп сцепления. Такой подход позволяет не только подтвердить ее наследование, но и сберечь время на анализ принадлежности мутации к соответствующей группе сцепления.

Для хорошо изученных в генетическом отношении объектов (дрозофила, кукуруза, ряд микроорганизмов) с установленными группами сцепления изучение новой мутации проводить довольно легко, действуя только что указанным путем. Для этих же объектов разработаны специальные методики учета частоты мутаций, возникающих в отдельных хромосомах. Так, например, для обнаружения видимых мутаций в половой хромосоме у дрозофилы, используется методика сцепленных Х-хромосом -- уу (двойной желтый). По данной схеме скрещивания можно обнаружить отдельные видимые рецессивные сцепленные с полом мутации, возникшие в Х-хромосоме половых клеток отцовского организма и проявляющиеся у мужского пола в F1.

Наиболее объективно можно учитывать рецессивные летальные мутации, приводящие в гомозиготном состоянии к смерти несущих их особей. Для учета таких мутаций в половой хромосоме дрозофил, Г. Мёллером была разработана методика С1В.

Генетическая структура линии С1В характеризуется тем, что одна из Х-хромосом самки маркирована доминантным геном Bar (полосковидные глаза). В этой же хромосоме имеется инверсия, обозначаемая буквой С. Эта инверсия, препятствует кроссинговеру и обладает рецессивным летальным эффектом 1, т. е. зиготы, несущие две такие Х-хромосомы, погибают. Этими тремя начальными буквами (С1В) и обозначена линия-анализатор на летальные мутации в половых хромосомах дрозофилы.

В случае если в одном из спермиев анализируемого самца в Х-хромосоме возникает летальная мутация, то при оплодотворении таким спермием яйцеклетки с Х-С1В-хромосомой развивается гетерозиготная по данной летали самка. В Fl будут встречаться самки двух типов: с нормальными (круглыми) и с полосковидными глазами (Bar). Каждая из этих самок несет по одной Х-хромосоме отца. Самцы, несущие хромосому С1В, не развиваются, так как у них деталь находится в гемизиготном состоянии. Поэтому самцы в F1 встречаются только с нормальными глазами. Для дальнейшего анализа самок F1 с геном Bar скрещивают индивидуально с нормальными самцами (каждая пара в отдельной пробирке).

Если самка F1 получила Х-хромосому анализируемого самца с летальной мутацией и, следовательно, стала гетерозиготной по ней, то в потомстве F2 такой самки не появится самцов, так как все они погибнут. В результате расщепление по полу в такой культуре оказывается в отношении

29:0 (причем половина самок с нормальными глазами, а половина -- с полосковидными). Очевидно, что число исследованных на обнаружение летальных мутаций самок С1В из F1-дочерей одного исходного анализируемого самца будет соответствовать числу исследованных Х-хромосом в его сперматозоидах.

Хотя эта методика и очень удобна для количественного учета возникающих летальных мутаций, но у самок F1 между половыми хромосомами иногда может происходить двойной перекрест, что приводит к снижению истинной частоты летальных мутаций.

В настоящее время для анализа частоты возникновения летальных мутаций в Х-хромосоме самцов применяется другая методика, названная Меллер-5, или М-5. В этой методике применяется линия-анализатор. Преимущество такой линии-анализатора заключается в том, что обе Х-хромосомы самки содержат по две Инверсии, не связанные с летальным действием. В силу наличия двух инверсий перекрест между хромосомами более затруднен. Кроме того, обе хромосомы самки маркированы тремя генами: sc8, В, wa. Самцы в этой линии жизнеспособны. При анализе самца дикого типа методом М-5 мы получаем в F2 по два фенотипических класса самок и самцов. Если же в анализируемой Х-хромосоме исследуемого самца возникла летальная мутация, то в F2 будут самцы одного фенотипического класса: sc8, В, wa, а самцы дикого типа не появятся. При этом каждая индивидуальная культура F2, являющаяся потомством лишь одной самки Fl соответствует одной исследованной Х-хромосоме самца Р.

Для учета летальных мутаций в аутосомах дрозофилы существует другая методика. В этом случае учет возникающих рецессивных летальных мутаций производится в F3.

Для проявления летальной рецессивной мутации в аутосоме необходимо, чтобы мутация оказалась в обеих испытываемых хромосомах, т. е. в гомозиготном состоянии. Обычно для этой цели у дрозофилы используют специальную линию, позволяющую учитывать летальные мутации во второй паре аутосом. В этой линии одна из хромосом содержит две большие инверсии -- по одной р: в каждом плече, доминантные гены Су (Curly -- загнутые крылья) i и L (Lobe -- маленькие глаза), каждый из которых в гомозиготном состоянии вызывает летальный эффект; гомологичная хромосома, также содержащая инверсию, маркирована геном Pm (Plum -- коричневатые глаза). Этот метод обнаружения мутаций иногда называют методом CyL/Pm. Испытываемого самца скрещивают с самкой из линии CyL/Pm.

В F1 все мухи CyL являются гетерозиготными по той или другой гомологичной хромосоме II анализируемого самца. Из F1 выбирают самцов CyL, поскольку у них кроссинговер подавлен. Каждого такого самца, несущего по одной анализируемой хромосоме, индивидуально скрещивают с самкой исходной линии CyL/Pm. В F2 половина мух (самцов и самок) в каждой культуре оказывается гетерозиготной по одной и той же анализируемой хромосоме. Фенотипически у этих мух проявляются только гены Су и L. Таких самок и самцов скрещивают между собой. В случае отсутствия летальной мутации в анализируемой хромосоме происходит расщепление в отношении 2CyL :lCy+L+. Данное отношение возникает в силу того, что гомозиготные мухи CyL не выживают. Если в анализируемой хромосоме имеется деталь, то в культуре F3 будут мухи одного фенотипа --CyL, а нормальные по фенотипу будут погибать в силу гомозиготного состояния рецессивной летальной мутации.

Таким методом можно учитывать частоту рецессивных летальных мутаций во второй хромосоме дрозофилы.

Вообще летальные мутации по генетической природе являются смешанным типом мутаций, к которым относятся как различного рода хромосомные перестройки, так и изменения отдельных генов.

В итоге рассмотрения общей характеристики мутационного процесса мы приходим к следующим выводам.

1. Генные мутации являются скачкообразными изменениями отдельных локусов хромосом -- генов.

2. Мутантные гены сохраняют свойство репродукции при делении ядра клетки, вследствие чего мутационные изменения наследуются.

3. Мутации могут быть прямыми и обратными.

4. Частота мутирования в обоих направлениях характерна для каждого локуса.

5. Спонтанный мутационный процесс обусловливается свойством самого гена, системой генотипа, физиологическим состоянием организма и колебанием факторов внешней среды.

6. Каждый локус -- ген может мутировать в несколько состоянии, образуя серию множественных аллелей.

7. Мутации у различных видов организмов образуют гомологические ряды наследственных изменений.



2. Классификация мутагенов и их характеристика

Мутагены (от лат. mutatio - изменение и греч. -genes-рождающий, рожденный), химические и физические факторы, вызывающие наследственные изменения - мутации.

Мутагенами могут быть различные факторы, вызывающие изменения в структуре генов, структуре и количестве хромосом.

Действие мутагенов, рассеянных в окружающей среде, вызывает увеличение частоты возникновения мутаций, что ведет к росту так называемого генетического груза, выражающегося в увеличении наследственной патологии, а также частоты онкологических заболеваний.

Еще в 1925 г. российские генетики Г.А. Надсон и Г.С. Филиппов показали, что при облучении дрожжей лучами радия возникают разнообразные новые формы, в 1927 г. Г. Меллер показал на дрозофиле, хорошо изученной к тому времени генетиками, что под действием рентгеновских лучей у дрозофил возникают мутации.

Мутагенез - возникновение мутаций - внезапных качественных изменений генетической информации. Термин «мутация» был предложен голландским ученым де Фрисом (Н. de Vries) в 1901 г.

Мишенью действия мутагенов в клетке являются главным образом ДНК и, возможно, некоторые белки. К последним относят в основном белки, играющие структурную роль в организации генома или принимающие участие врепликации(самовоспроизведении молекулы нуклеиновых кислот), рекомбинации (перераспределении генетического материала родителей в потомстве) или репарации (восстановлении поврежденной структуры ДНК).

Для устранения первичных повреждений генетических структур, вызванных мутагенами, в клетке существует ряд систем восстановления, или репарации, генетических повреждений. В настоящее время таких систем насчитывается более десяти. Однако в ходе репарации часть первичных повреждений может остаться и привести к возникновению мутаций.

По происхождению мутагены классифицируют на эндогенные, образующиеся в процессе жизнедеятельности организма и экзогенные - все прочие факторы, в том числе и условия окружающей среды.

По природе возникновения мутагены классифицирует на физические, химические и биологические.

2.1Физические мутагены и их влияние на живые клетки

Физическими мутагенами называются любые физические воздействия на живые организмы, которые оказывают либо прямое влияние на ДНК или вирусную РНК, либо опосредованное влияние через системы репликации, репарации, рекомбинации

Первые физические мутагены, открытые учеными,- это разные виды излучений: ионизирующее излучение, радиоактивный распад, ультрафиолетовое излучение.

Первичный эффект ионизирующих и ультрафиолетовых излучений заключается в образовании одиночных или двойных разрывов в молекуле ДНК. Ультрафиолет сильно поглощается тканями и вызывает мутации лишь в поверхностно расположенных клетках многоклеточных животных, однако на одноклеточных он действует эффективно. Мутагенное действие ультрафиолета было установлено в 1931 г. А.Н. Промптовым.

Другими физическими мутагенами являются частицы разной природы, имеющие высокую энергию: это альфа- и бета-излучения радиоактивных веществ и нейтронное излучение. В случае прямого влияния на ДНК основную роль играют два параметра: величина энергии воздействующей частицы и способность биологического материала поглощать эту энергию.

Повреждения ДНК могут быть двух типов: двунитевые и однонитевые разрывы.

Мутации может вызывать также высокая или низкая температура. В 1928 г. Меллер показал, что повышение температуры на 10 градусов по С повышает частоту мутаций у дрозофил в 2-3 раза.

Зная способ действия этих мутагенов, можно было предположить, что они должны действовать на ДНК любых организмов. И действительно, вскоре было обнаружено, что например, рентгеновские лучи вызывают мутации у самых разных животных, растений и микроорганизмов.

Выяснено, что мутации, вызванные излучениями, могут затрагивать любые признаки организма, так как квант излучения или частица с высокой энергией чисто случайно может повредить любой участок ДНК. Число возникающих мутаций тем больше, чем выше интенсивность излучения, то есть чем больше квантов или частиц попало в клетку в единицу времени.

Также было показано, что физические факторы вызывают те же мутации, которые возникают и при спонтанном мутагенезе.

У высших живых существ есть вещества, ослабляющие действие излучения - фотопротекторы, а многие растения содержат алкалоиды и кумарины, они усиливают процессы, вызванные радиацией и эти вещества опасны для животных.

Физические мутагены и их действие сильно зависит от предварительной эволюции организма. К постоянно действующим мутагенам виды выработали устойчивость. Физический мутагенез может не регистрироваться из-за быстрой гибели мутантных организмов.

2.1.1 Влияние ионизирующего облучения на живой организм

Мутации при действии физических мутагенов возникают так же, как и при действии мутагенов химических. Вначале возникает первичное повреждение ДНК. Если оно не будет полностью исправлено в результате репарации, то при последующем репликативном синтезе ДНК будут возникать мутации. Специфика мутагенеза (процесса возникновениямутаций) при действии физических факторов связана с характером первичных повреждений генома, вызываемых ими.

Ионизирующее излучение - это поток заряженных или нейтральных частиц и квантов электромагнитного излучения, прохождение которых через вещество приводит к ионизации и возбуждению атомов или молекул среды.

Ионизирующее излучение может вызвать мутации - внезапные естественные или вызванные искусственно наследуемые изменения генетического материала, приводящие к изменению тех или иных признаков организма.

Радиоактивные вещества могут воздействовать на организм человека внешне и внутренне. Внешнее облучение характеризуется воздействием ионизирующего излучения извне и обусловлено различной проникающей способностью частиц. Внутреннее облучение связано с попаданием радиоактивного вещества внутрь человеческого организма с пищей, с вдыхаемым воздухом или через открытую рану.

Воздействие радиоактивного излучения на организм человека зависит от многих факторов и определяется:

- скоростью радиоактивного распада радионуклида;

- скоростью выведения РВ из организма;

- типом радиоактивного излучения;

Острые последствия проявляются в первые несколько дней (недель) после облучения. Отдаленные последствия - последствия, которые развиваются не сразу после облучения, а спустя некоторое время.

Острая лучевая болезнь возникает после тотального однократного внешнего равномерного облучения. Между величиной поглощенной дозы в организме и средней продолжительностью жизни существует строгая зависимость.

При воздействии ионизирующего излучения в дозах, не вызывающих острую или хроническую лучевую болезнь, происходит изменениях в основных регуляторных системах организма и функциональные изменения деятельности основных физиологических систем чаще всего носят полисиндромный характер. Это проявляется в развитии донозологических состояний, переходящих с ростом дозы к клинической патологии.

В структуре неврологической заболеваемости особое место занимает синдром вегетативной дистонии, повышения тревожности как устойчивой личностной черты, отмечается ускорение перехода психофизиологических расстройств в стойкие психосоматические.

При дополнительном воздействии других неблагоприятных факторов существует вероятность роста общесоматических заболеваний. Радиационный фактор выступает лишь как одно из условий этого роста.

2.1.2 Влияние ультрафиолетового излучения на живой организм

УФ-излучение - это, невидимое глазом электромагнитное излучение, занимающее спектральную область между видимым и рентгеновским излучениями в пределах длин волн l 400-10 нм.

Источниками УФ-излучения являются накалённые до 3000 К твёрдые тела. Интенсивность излучения растет с увеличением температуры. Для различных применений промышленность выпускает ртутные, водородные, ксеноновые и другие газоразрядные лампы, окна которых (либо целиком колбы) изготовляют из прозрачных для УФ -излучения материалов (чаще из кварца). Любая высокотемпературная плазма является мощным источником УФ - излучения

Естественные источники УФ-излучения-Слнце, звёзды, туманности и другие космические объекты.

При действии на живые организмы УФ-излучение поглощается верхними слоями тканей растений или кожи человека и животных. В основе биологического действия УФ-излучения лежат химические изменения молекул биополимеров..

На человека и животных малые дозы УФ-излучения оказывают благотворное действие - способствуют образованию витаминов группы D, улучшают иммунобиологические свойства организма. Характерной реакцией кожи на УФ-излучение является специфическое покраснение - эритема, которая обычно переходит в защитную пигментацию (загар). Большие дозы УФ -излучения могут вызывать повреждения глаз (фотоофтальмию) и ожог кожи. Частые и чрезмерные дозы УФ-излучения в некоторых случаях могут оказывать канцерогенное действие на кожу.

В растениях УФ-излучение изменяет активность ферментов и гормонов, влияет на синтез пигментов, интенсивность фотосинтеза и фотопериодической реакции. Большие дозы УФ-излучения неблагоприятны для растений, о чём свидетельствуют и существующие у них защитные приспособления (например, накопление определённых пигментов, клеточные механизмы восстановления от повреждений).

На микроорганизмы и культивируемые клетки высших животных и растений УФ-излучения оказывает губительное и мутагенное действие. Основная роль в действии УФ-излучения на клетки принадлежит, химическим изменениям ДНК: входящие в её состав пиримидиновые основания (главным образом тимин) при поглощении квантов УФ-излучения образуют димеры, препятствующие нормальному удвоению ДНК при подготовке клетки к делению. Это может приводить к гибели клеток или мутациям.

...