Білок-білкові взаємодії в механізмах регуляції гемостазу за патологічних станів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

03.00.04-біохімія

Білок-білкові взаємодії в механізмах регуляції гемостазу за патологічних станів

САВЧУК ОЛЕКСІЙ МИКОЛАЙОВИЧ

КИЇВ -- 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у науково-дослідній лабораторії «Фізико-хімічної біології» Навчально-наукового центру «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий консультант:	доктор біологічних наук, професор Остапченко Людмила Іванівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, директор ННЦ «Інститут біології»;
Офіційні опоненти:	доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор-консультант ННЦ «Інститут біології»;
	доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Верьовка Сергій Вікторович, ДУ «Інститут отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка НАМН України», завідувач лабораторії біохімії;
	доктор медичних наук, старший науковий співробітник Дягіль Ірина Сергійовна, ДУ «Науковий центр радіаційної медицини НАМН України», завідувач відділення радіаційної онкогематології та трансплантації стовбурових клітин.

Захист відбудеться “ “ 2010 року о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, ННЦ «Інститут біології», ауд. 434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, ННЦ «Інститут біології», спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “___“ ____________ 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження молекулярних механізмів міжбілкових взаємодій в системі гемостазу є необхідною передумовою для розуміння опосередкованих ними фізіологічних та патологічних процесів [Byzova T.V., 1997]. Для нормального перебігу процесів гемостатичного каскаду необхідне злагоджене функціонування ефекторів протеолітичних ферментів плазми крові [Козинец Г.И., 1997]. Їх головна задача полягає в регуляції функціонування і взаємодії прокоагулянтної та фібринолітичної ланок гемостазу, рівновага між якими є однією з важливих умов збереження життєздатності організму [Triplett D., 2000]. Оскільки більшість ефекторів є білками, можна стверджувати про складну систему механізмів активації та інгібування на основі ліганд-рецепторних взаємодій, хімічної модифікації компонентів реакції та регуляції експресії генів [Терентьев А.А., 2009, Wu K.K., 1996].

Вплив стрептокінази на систему гемостазу полягає в утворенні плазміну, який є посередником її дії на компоненти гемостатичного каскаду. Але, можливо, існують альтернативні шляхи впливу стрептокінази на білки системи гемостазу, зокрема, на активаційну ланку системи фібринолізу, яка включає в себе активатори плазміногену та їх інгібітори. Виникнення патологічного стану, пов'язаного з гемостатичною функцією організму, призводить до появи в кровотоці певної кількості розчинних фібрин-мономерних комплексів, активованих факторів згортання та фібринолізу, продуктів розщеплення фібриногену/фібрину та інших біологічно активних сполук, які при нормальному функціонуванні усіх ланок системи гемостазу або не потрапляють до кровотоку, або швидко елімінуються відповідними системами організму. Так, накопичення продуктів деградації фібриногену/фібрину у кровотоці є показником порушення гемостатичного балансу та розвитку дисемінованого внутрисудинного згортання крові, що призводить до тяжких захворювань, які проявляються у вигляді тромбозів, тромбоемболій або геморагій. Тому інформація про структуру, функціональні властивості та вплив фрагментів фібриногену/фібрину на гемостатичні процеси має як теоретичну, так і практичну цінність. Розуміння механізму утворення та деградації фібринового згустку є основою для розробки нових лабораторних методів, необхідних для діагностики стану системи гемостазу та контролювання ефективності лікування.

Виходячи з цього, комплексне дослідження міжбілкових взаємодій компонентів системи зсідання крові та фібринолізу як за нормального функціонування організму, так і особливо при виникненні різноманітних патологічних станів, дасть змогу отримати фундаментальні дані, що становитимуть необхідну передумову для розуміння механізмів перебігу численних фізіологічних та патофізіологічних процесів та створення нових діагностичних та медикаментозних засобів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами Робота виконана у науково-дослідній лабораторії «Фізико-хімічної біології» Навчально-наукового центру «Інститут біології» (біологічний факультет) Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідної теми “Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції” (2005-2010 рр.), № д/р 0106U005750.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення білок-білкових взаємодій при порушенні регуляції функціонування коагуляційної та фібринолітичної ланок системи гемостазу.

Для досягнення мети було поставлено такі завдання:

1. Проаналізувати стан динамічної рівноваги між ланками системи гемостазу за патологій.

2. Розробити модельні системи та за їх допомогою виявити особливості процесів активації та інгібування ключових проферментів/ферментів системи гемостазу in vitro та in vivo.

3. Визначити особливості функціонування компонентів системи гемостазу при порушенні динамічної рівноваги між прокоагулянтною та фібринолітичною ланками системи гемостазу.

4. Визначити особливості взаємодії компонентів системи гемостазу за розвитку патологічних процесів.

5. Встановити взаємозв'язок між вмістом/активністю компонентів системи гемостазу та екзогенними активаторами.

Об'єкт дослідження. Функціонування системи гемостазу за норми та при патологічних станах організму.

Предмет дослідження. Білок-білкові взаємодії компонентів систем зсідання крові та фібринолізу, які беруть участь в процесах функціонування гемостатичного бар'єру організму.

Методи дослідження. В роботі застосовано хроматографічні методи отримання білків з крові ссавців. Активність ферментів гемостатичного каскаду визначали з використанням специфічних пептидних хромогенних субстратів. Оцінка коагуляційної ланки системи гемостазу проводилась за допомогою хронометричних тестів. Кількісний склад компонентів систем зсідання крові та фібринолізу визначали імуноферментним методом. Якісний склад компонентів системи гемостазу вивчали методами диск-електрофорезу та вестерн-блотингу.

Наукова новизна одержаних результатів. Проаналізовано якісний склад розчинних фібрин-мономерних комплексів за різних патологічних станів організму та змодельовано процес їх утворення в кровотоці in vivo. Виявлено можливість появи Е-фрагменту фібриногену/фібрину в кровотоці та обґрунтовано положення про можливий вплив цього фрагменту на процеси гомеостазу в організмі ссавців. За умов in vitro та in vivo встановлено формування комплексу між Е-фрагментом фібриногену/фібрину та протромбіном, що приводить до утворення активного тромбіну в кровотоці.

На модельних системах in vivo продемонстрована можливість утворення потрійного комплексу: Е-фрагмент фібриногену/фібрину-протромбін-стрептокіназа.

Розроблені модельні системи in vivo, що дозволяють проводити дослідження можливих шляхів впливу стрептокінази на систему гемостазу.

Встановлено, що стрептокіназа впливає на механізми регуляції активності та взаємодії компонентів системи гемостазу. Виявлено вплив стрептокінази на динаміку білок-білкових взаємодій між тканинним активатором плазміногену та інгібітором активаторів плазміногену І типу. Вперше показано, що стрептокіназа викликає значне вивільнення ендотеліальними клітинами у кровоток одного з головних ферментів системи фібринолізу - тканинного активатора плазміногену.

Доведено, що стрептокіназа здатна впливати на судинно-тромбоцитарну ланку системи гемостазу не лише шляхом утворення активного плазміну, але й без участі плазміногену.

Вперше виявлено збільшення концентрації функціонально неактивного фактору Х системи зсідання крові в кровотоці при термічних опіках.

Встановлено, що активність тканинного активатора плазміногену та інгібітору активаторів плазміногену першого типу є ключовими показниками при визначенні фібринолітичного потенціалу плазми крові.

Показано, що у пацієнтів з гострим інфарктом міокарда однією з причин тромботичних ускладнень є дисбаланс у функціонуванні фібринолітичної системи, повязаний зі зниженням активності тканинного активатора плазміногену на фоні підвищення активності його інгібітору.

Обґрунтовано необхідність та доцільність комплексного підходу дослідження білок-білкових взаємодій в системі гемостазу. Застосування такого підходу дасть змогу виявляти приховані неспецифічні взаємодії між білковими компонентами усіх ланок системи гемостазу та особливості перебігу процесів, що лежать в основі функціонування гемостатичного балансу.

Практичне значення одержаних результатів. Аналіз системи гемостазу за різних патологічних станів організму є основою для розробки ефективних алгоритмів діагностики усіх ланок гемостатичного бар'єру при серцево-судинних захворюваннях (стабільна та нестабільна стенокардія, гострий інфаркт міокарду, тромбоемболії), цукровому діабеті, термічних опіках, нефриті, абдомінальних кровотечах, при ускладненні вагітності.

Дані, отримані в роботі, дають змогу зробити висновок про ефективність застосування комплексного підходу до оцінки стану системи гемостазу у тварин (кролі, свині). Перспективним є застосування такого підходу для діагностики патологічних проявів системи гемостазу у великої рогатої худоби, що може мати певний економічний ефект.

Запропоновано індекси оцінки ступеню дисбалансу між ланками системи гемостазу при виникненні патологічного процесу різної етіології.

Розроблено ефективний метод визначення активності тканинного активатора плазміногену, придатний для використання при аналізі різноманітних патологічних проявів в системі фібринолізу. На прикладі 15 патологічних станів організму, що пов'язані з системою гемостазу, показано його інформативність, достовірність та відтворюваність.

Запропоновано застосування методу ензим-електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН для аналізу якісного складу компонентів системи фібринолізу за умов виникнення різних патологічних станів організму.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота - завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 2001-2010 рр. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, здійснено пошук та аналіз даних літератури, проведено науковий аналіз одержаних експериментальних даних, сформульовано основні положення та висновки.

Науковий консультант брав безпосередню участь у визначенні теми дисертаційної роботи, формулюванні задач, аналізі результатів досліджень.

Дослідження параметрів системи зсідання плазми крові було проведено за безпосередньої участі д.б.н. Платонової Т.М. Дослідження параметрів системи фібринолізу було проведено за безпосередньої участі к.б.н. Краснобрижої Є.М. Плазму крові хворих надано Державним Інститутом хірургії та трансплантології імені академіка О.О. Шалімова НАМН, Українським державним НДІ реабілітації інвалідів МОЗ України. Одержання плазми крові великої рогатої худоби проведено за безпосередньої участі співробітників Білоцерковської аграрної академії.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи було представлено на IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), Першій українській конференції „Тромбози в клінічній практиці: профілактика, діагностика, лікування” (Київ 2004); 18th International Congress on Thrombosis (Ljubljana, 2004), XX Inretnational Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Sydney Convention Centre (Sydney, 2005), 18^th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (San Diego, 2006), XXI International Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, (Geneva, 2007); Міжнародній конференції «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск 2007), , XVI World Congress of the International Society on Toxinology (Recife-Pernambuco, 2009), XXII International Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, (Boston, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 38 наукових праць: 20 статей у фахових виданнях, затверджених переліком ВАК України, 1 монографія, 4 патенти та 13 тез доповідей у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 318 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, експериментальної частини, заключення, висновків, списку використаної літератури (511 найменувань), містить 22 таблиці, 60 рисунків, 262 сторінок основної текстової частини.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

В огляді літератури детально висвітлено сучасні дані про функціональні особливості компонентів згортаючої та фібринолітичної ланок системи гемостазу. Проведено аналіз літератури, що стосується функціонування системи гемостазу при виникненні різних патологічних станів організму. Описано можливі причини виникнення ДВЗ-синдрому в кровотоці при дисбалансі в системі гемостазу. Наведено дані про екзогенний активатор плазміногену - стрептокіназу та її взаємодію з компонентами системи гемостазу.

Матеріали і методи досліджень

Фібриноген виділяли з оксалатної плазми крові людини шляхом висолювання сульфатом натрію [Варецька Т.В., 1960]. Препарати плазміногену одержували з плазми крові на лізин-сефарозі [Deutsch D., 1970] з подальшою хроматографією на сефадексі G-150. Плазмін (КФ 3.4.21.7.) одержували, активуючи Глу-плазміноген на сефарозі, кон'югованой з урокіназою [Robbins K. C., 1976]. Протромбін і фактор Х отримували з плазми крові людини методом сорбування протромбінового комплексу на сірчанокислому барії з наступною хроматографією на Q-сефадексі. Додаткове очищення білків проводили на сефакрилі S-200 [Соловьев Д.А., 1996]. Для виділення фрагментів фібриногену/фібрину використовували КМ-сефадекс С-50 [Белицер В.А., 1972]. Для одержання фракції поліклональних антитіл було обрано протеїн A-сефарозу [Harlow Ed, 1988].

Імунізацію кролів проводили білковими препаратами підшкірно шістьма щепленнями. Для підвищення титру антитіл використовували повний адьювант Фрейнда. Кров брали на 10 - 14 день після останнього щеплення. Сироватку крові ссавців отримували з цільної крові [Harlow Ed, 1988]. Кров кролів брали пункцією вушної вени, з додаванням розчину цитрату натрію (38 г/л) у кінцевому співвідношенні 9:1 та подальшим центрифугуванням при 1500 g протягом 40 хвилин при 4^оС для отримання плазми крові [Токар А.В., 1994].

Електрофорез у поліакриламідному гелі проводили за присутності додецилсульфату натрію за методом Лемлі [Laemmli K., 1970]. Електрофорез плазміногену в поліакриламідному гелі проводили за низьких значень рН згідно з методом [Panyim S., 1969].

Імуноферментний аналіз та метод вестерн-блотингу проводили за загальною методикою для розчинних білків відповідно до стандартного протоколу [Harlow Ed, 1988].

Виконання хронометричних тестів (активований частковий тромбопластиновий час (АЧТЧ), протромбіновий час (ПЧ), анцистроновий час (АЧ), тромбіновий час (ТЧ)) проводили за стандартними методиками [Меньшиков В.В., 1987]. Вміст розчинних фібрин-мономерних комплексів у плазмі крові визначали фосфатним методом, фібриногену - методом Т.В. Варецької [Варецкая Т.В., 1992]. Активність тканинного активатора плазміногену (КФ 3.4.21.68) визначали за модифікованим методом [Chmielewska J., 1983]. Активність інгібітора тканинного активатора плазміногену визначали за модифікованим методом [Eriksson E., 1988]. Визначення амідолітичної активності ферментів проводили, використовуючи хромогенні субстрати плазміну - S₂₂₅₁, тромбіну - S₂₂₃₈, фактора Ха - S₂₇₆₅, протеїну С - S₂₃₆₆ [Меньшиков В.В., 1987].

Математичну обробку та аналіз отриманих експериментальних даних проводили використовуючи комп'ютерні програми Origin 6.1 та TotalLab 2.04. До роботи включено лише результати експериментів, що є статистично достовірними за t-критерієм Стьюдента (Р?0,05).

РЕЗУЛЬТАТИ досліджень ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Фібриноген та його похідні (розчинні фібрин-мономерні комплекси та продукти розщеплення фібриногену/фібрину) за різних патологічних станів організму. Коливання вмісту фібриногену та його похідних (розчинні фібрин-мономерні комплекси, продукти розщеплення фібриногену/фібрину) в плазмі крові є маркером розвитку можливих патологічних станів в організмі або різноманітних компенсаторних механізмів, пов'язаних з адаптацією організму [Дикун Я. В., 1998, Черний В.И., 2000 Зубаиров Д.М., 2000]. Незалежно від причин зміни вмісту фібриногену, аналіз цього процесу дає певну інформацію, що може бути використана для дослідження перебігу процесів білок-білкових взаємодій в системі гемостазу.

З практичної точки зору така інформація може бути корисною для постановки більш точного та достовірного діагнозу. Проаналізовано вміст фібриногену у пацієнтів з різними патологічними станами, які у той чи інший спосіб пов'язані з системою гемостазу (рис. 1).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дослідження патологічних станів показали підвищений вміст фібриногену в плазмі крові. Представлені результати ще раз підтверджують належність фібриногену до білків гострої фази, його здатність швидко реагувати на найменший дисбаланс в організмі. Використовуючи методи виявлення розчинних фібрин-мономерних комплексів (РФМК) і продуктів розщеплення фібриногену/фібрину (ПРФ), було визначено їх вміст в кровотоці при функціональних відхиленнях фізіологічного стану організму (табл. 1).

Доцільним є аналіз співвідношення маркерів тромбінемії - розчинних фібрин-мономерних комплексів, що характеризують ступінь активації системи зсідання крові та активності тканинного активатора плазміногену - показника потенціалу системи фібринолізу [Horan J.T., 2001].

Таблиця 1. Вміст розчинних фібрин-мономерних комплексів та продуктів розщеплення фібриногену/фібрину за різних патологій (M±m)

	РФМК, г/л	ПРФ, мкг/мл
Контроль (донори, n = 65)	0	0
Тяжкі опіки (n = 48)	0,064± 0,037*	25,2 ± 4,3*
Стабільна стенокардія (n = 45)	0,1 ± 0,040*	8,7 ± 2,9*
Нестабільна стенокардія (n = 38)	0,05 ± 0,010*	11,8 ± 3,1*
Діабет (n = 52)	0,044± 0,007*	9,9 ± 2,6*
Гострий інфаркт міокарда (n = 36)	0,056 ± 0,01*	13,8 ± 1,2*
Ревматоїдний артрит (n = 25)	0,05 ± 0,005*	16,3 ± 3,2*
Тромбоемболія (n = 48)	0,04 ± 0,007*	19,8 ± 1,9*
Нефрит (n = 32)	0,05 ± 0,002*	17,9 ± 2,2*
Ускладнена вагітність (n =72)	0,09 ± 0,007*	22,3 ± 1,73*
Абдомінальні кровотечі (n =68)	0,02 ± 0,007*	12,9 ± 3,6*
Системний червоний вовчак (n = 72)	0,04 ± 0,005*	не визначали
Гіпертензія (n = 32)	0,09 ± 0,02*	4,5 ± 1,7*

* - Р ? 0,05 по відношенню до контролю

На основі наведених даних запропоновано індекс тромботичного ускладнення (ІТУ): співвідношення між параметрами фібринолітичної системи (активність ТАП) і системи зсідання крові (розчинні фібрин-мономерні комплекси). ІТУ дає змогу оцінити очікувану можливість розвитку тромботичного ускладнення в організмі. Обчислення ІТУ проводиться за формулою:

ІТУ = - РФМК_п / (ТАП_д - ТАП_п),

де ІТУ - індекс тромботичного ускладнення; РФМК_п - вміст розчинних фібрин-мономерних комплексів у досліджуваній плазмі крові; ТАП_Д - активність тканинного активатора плазміногена в плазмі крові практично здорових донорів, ТАП_П - активність тканинного активатора плазміногену в досліджуваній плазмі крові (МО/мл).

У нормі ІТУ дорівнює 0. Чим більше показник ІТУ відрізняється від нуля, тим більший дисбаланс у системі гемостазу хворого. Якщо ІТУ має негативний знак, це свідчить про те, що потенціал системи фібринолізу знижений і повною мірою не виконує свою функцію. У кровотоці накопичуються РФМК, внаслідок чого може бути реалізована загроза тромбоутворення. Якщо ІТУ має позитивне значення, це свідчить про високий потенціал фібринолітичної системи на фоні гіперактивації системи зсідання крові, що також свідчить про загрозу тромботичних ускладнень.

Кількісне визначення продуктів розщеплення фібриногену/фібрину в кровотоці показує наскільки ефективно діє фібринолітична система. Поява ПРФ у плазмі крові свідчить, що існуючий фібринолітичний потенціал протидіє потенційним чи наявним тромботичних ускладненням. Визначення двох ключових показників процесів утворення олігомерів фібрину (РФМК) та його розщеплення (ПРФ) може дати інформацію про загальні тенденції, що існують у цей момент у системі гемостазу.

Аналіз співвідношення РФМК та ПРФ в кровотоці дозволив запропонувати індекс ефективності фібринолізу (ІЕФ). Формулу використовують для визначення співвідношення кількості розчинних фібрин-мономерних комплексів в кровотоці до кількості продуктів розщеплення фібриногену/фібрину в руслі крові:

ІЕФ = РФМК / ПРФ,

де ІЕФ - індекс ефективності фібринолізу; РФМК - вміст розчинних фібрин-мономерних комплексів в кровотоці, мкг/мл; ПРФ - вміст продуктів розщеплення фібриногену/фібрину в кровотоці, мкг/мл.

ІЕФ показує ефективність розщеплення утворених в кровоносному руслі розчинних фібрин-мономерних комплексів активними ферментами системи фібринолізу (у першу чергу плазміном), що надає інформацію про здатність фібринолітичного потенціалу плазми крові протистояти надмірній активації зсідаючої ланки системи гемостазу. Чим менше числове значення ІЕФ, тим ефективніше працює система фібринолізу та менша ймовірність первинного або повторного тромбоутворення в судинному руслі.

Через особливу важливість і значимість визначення РФМК при виникненні дисбалансу в системі гемостазу, що призводить до гіперкоагуляції, зроблено спробу більш докладно охарактеризувати процес появи РФМК і проаналізувати їх склад при різних патологічних станах системи гемостазу.

Електрофоретичний аналіз фракцій РФМК свідчить про наявність у складі комплексів білкових компонентів з молекулярною масою 330 кДа, 270-240 кДа, 195 кДа, 100 кДа й 60 кДа, що дало можливість припустити наявність комплексів фібрину-мономеру з фрагментами фібриногену/фібрину (Х, ДД, Д, Е) (табл. 2). Використання специфічних антитіл до фрагментів фібриногену/фібрину при проведенні вестерн-блотингу даних зразків фракцій РФМК підтвердило, що до фракції РФМК входять комплекси фібрину із фрагментами ДД, Д і E.

Таблиця 2. Склад фракцій РФМК за різних патологій (M±m)

	Тромбо- емболія (n=10)	Важкі опіки (n=10)	Ускладнена вагітність (n=10)	Гострий інфаркт міокарду (n=10)	Діабет типу І (n=10)	Нестабільна стенокардія (n=10)
Фібрин, 330 кДа	54 ± 7 %	32 ± 9 %	28 ± 8 %	32 ± 3 %	23 ± 6 %	14 ± 5 %
Х, 270 кДа	-	-	10 ± 4 %	8 ± 3 %	-	-
Х, 240 кДа	-	-	5 ± 3 %	-	-	-
ДД, 195 кДа	-	18 ± 4 %	21 ± 5 %	-	15 ± 8 %	12 ± 7 %
Д, 100 кДа	-	-	-	21 ± 4 %	21 ± 5 %	16 ± 3 %
E, 60 кДа	46 ± 8 %	50 ± 6 %	36 ± 4 %	39 ± 9 %	41 ± 10 %	58 ± 9 %

Х - Х фрагмент; ДД - Д-димер; Д - Д фрагмент; Е - Е-фрагмент

Аналіз отриманих експериментальних даних дозволив зробити висновок про неоднорідність фракції РФМК у плазмі крові. Тому можна стверджувати, що вивчення якісного складу фракції РФМК спільно з визначенням вмісту розчинних фібрин-мономерних комплексів в плазмі крові хворих дасть змогу визначити ступінь дисбалансу в системі гемостазу, що важливо як для оцінки стану системи гемостазу, так і для контролю за ефективністю відповідної антитромботичної терапії.

Отримані методом вестерн-блотингу результати мають певне практичне значення ще й тому, що за деяких патологічних станах вміст РФМК істотно зростає. Відомо, що будь-яке запалення супроводжується активацією ферментних систем протеолізу, що може бути важливою складовою патогенезу ряду захворювань. Порушення рівноваги між системами зсідання крові й фібринолізу є характерною ознакою цілої низки захворювань. Поява в кровотоці значної кількості ПРФ, особливо суміші Д- і ДД-фрагментів, може сприяти геморагічним ускладненням. У зв'язку з цим є необхідною інформативна лабораторна діагностика стану системи гемостазу під час проведення тромболітичної терапії та патологіях, пов'язаних з підвищенням концентрації фібриногену в плазмі крові, дисбалансом між системами зсідання крові й фібринолізу.

Біологічна роль похідних фібриногену/фібрину не обмежується інгібуванням процесу полімеризації фібрину. Вони досить ефективно впливають на процес активації компонентів системи фібринолізу. Це зумовлює важливість досліджень впливу фрагментів фібриногену/фібрину на процеси гемокоагуляції й фібринолізу, оскільки розуміння механізмів взаємозв'язку між функціонуванням цих ланок системи гемостазу в організмі має не лише теоретичне, але й практичне значення. Насамперед інформація про механізми регулювання системи гемостазу актуальна для медичної практики, зокрема, для розробки нових методів лікування захворювань, пов'язаних з надмірним тромбоутворенням.

Отримані дані підштовхнули до дослідження процесу появи РФМК у кровотоці. Як модельну систему in vivo для дослідження процес появи РФМК використовували введення стрептокінази в кровоток кроля.

Аналіз параметрів коагуляційного каскаду виявив дисбаланс в системі гемостазу, про що свідчить поява РФМК після введення стрептокінази, тоді як у нормі вони відсутні. Концентрація РФМК досягала максимальних значень через 4 години після введення стрептокінази й становила 0,053 ± 0,017 г/л, поступово знижуючись на наступних етапах, що свідчило про відновлення нормального функціонування системи зсідання крові. Однак і на 7 добу після появи в кровотоці стрептокінази спостерігається значна кількість РФМК, що свідчить про нестабільність у системі гемостазу, яка може в будь-який момент привести до патологічних проявів на рівні організму вцілому. Концентрація фібриногену зменшується через 1 годину після введення стрептокінази до 1,8 ± 0,8 г/л порівняно з нормою 2,8 ± 0,1 г/л, що є показником патологічної активації системи фібринолізу, наслідком чого є розщеплення нативного фібриногену (табл. 3).

Таблиця 3. Показники гемостазу в плазмі крові кролів після введення стрептокінази (Ск) (M±m)

	Плазміноген, %	Фібриноген, г/л	РФМК г/л
До введення Ск	100 ± 5	2,8±0,2	0
1 година після введення Ск	66,6 ± 3,5*	1.8±0,2*	0,018±0,005*
4 година після введення Ск	69,5 ± 2,5*	2,15±0,3	0,053±0,017*
1 доба після введення Ск	78,6 ± 3,1*	2,7±0,2	0,032±0,007*
3 доба після введення Ск	92,3 ± 3,7	2,4±0,1	0,038±0,009*
7 доба після введення Ск	108 ± 4,3	2,5±0,1	0,047±0,015*

* - Р ? 0,05 по відношенню до введення стрептокінази

Активація плазміногену відбувається за рахунок дії стрептокінази, яка потрапляє в кровоток, що супроводжується зниженням концентрації плазміногена в руслі крові, починаючи з 1-ї години після введення стрептокінази в кровоток, до 66,6 ± 3,5 %.

Електрофоретичний аналіз фракцій РФМК плазми крові кроля показав наявність білкових зон з молекулярною масою 300-200, 110-85 та 70-50 кДа, відповідно.

Аналіз даних фракцій, проведений методом вестерн-блотингу з використанням поліклональних антитіл до фібриногену кроля, показав накопичення фібрину/фібриногену, фрагментів ДД, Д і Е різного ступеня розщеплення (рис. 2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Отримані дані показали, що фрагменти Д і Е з'являються тільки на 1 добу після введення стрептокінази в кровоток. Спостерігається тенденція до підвищення вмісту фрагментів Е и ДД на 7 добу після введення стрептокінази. Поява фрагмента Д свідчить про розщеплення нативного фібриногену в руслі крові, поява Е фрагмента може бути наслідком двох причин: розщеплення РФМК і полімерного фібрину, що утворився. Про це свідчить і поява в кровотоці фрагмента ДД, утворення якого може бути тільки в результаті розщеплення прошитого фібрину плазміном.

Причини зниження концентрації фібриногену, підвищення вмісту РФМК та появи фрагментів фібриногену/фібрина на більш пізніх термінах після введення стрептокінази, можуть бути:

1. Фрагменти Д і Е є коровими продуктами гідролізу фібриногену (у випадку фібрину це - Е і ДД-фрагменти), на появу яких у кровотоці в достатніх для їх виявлення концентраціях потрібен певний час після запуску процесу гідролізу фібриногену/фібрину.

2. Фрагменти, що утворюються, беруть участь у численних процесах гомеостазу, зв'язуючись із рецепторами, білками, ліпідами й т.п., що приводить до постійної елімінації їх з кровотоку. Також варто враховувати час циркуляції даних фрагментів у руслі крові до повної їх елімінації з кровотоку всіма існуючими системами.

3. Запуск, одночасно із процесом гідролізу фібриногену/фібрину, процесів які сприяють його гальмуванню - утворення фрагментів фібриногену/фібрину, які можуть зменшувати локальну концентрацію плазміну в кровотоці; запуск процесів інгібування виникаючого в кровотоці плазміну всіма існуючими інгібіторами серинових протеїназ, у першу чергу, б₂-антиплазміном; стабілізація полімерного фібрину фактором XIIIа; участь плазміну в розщепленні інших білків у руслі крові.

Відомо, що ПРФ беруть участь у різноманітних біологічних процесах і впливають на функціонування всіх ланок системи гемостазу: збільшують проникність стінок судин, впливають на процес агрегації тромбоцитів, синтез фібриногену, на функціонування клітин крові й тканин різних органів. Знайдено зв'язок між накопиченням Е-фрагмента фібрину й формуванням атеросклеротичних бляшок, встановлено його вплив на прискорення активації плазміногена активатором плазміногена урокіназного типу [Boisclair M.D., 1990, Скоморовская Е.В., 1991, Fischer E., 1992]. Попередні дослідження показали, що Е-фрагмент індукує амідолітичну та згортаючу активність протромбіну [Платонова Т.М., 2002], але механізм процесу їх взаємодії лишається маловивченим.

Подальші дослідження було зосереджено на вивченні процесу комплексоутворення протромбіну з Е-фрагментом фібрину. Для цього проводили розділення суміші протромбін + Е-фрагмент фібрину у співвідношенні 1:3 (інкубацію проводили при 25°С протягом 1 години) на Superose 12. В досліджуваному матеріалі виявлено два хроматографічні піки. Отриманий матеріал аналізували з використанням диск-електрофорезу в нативних умовах. Електрофоретичний аналіз показав наявність двох смуг з молекулярними масами 130 кДа та 60 кДа. Отримані зразки аналізували методом вестерн-блотингу з використанням специфічних поліклональних антитіл (рис. 3).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аналіз даних хроматографічних фракцій методом вестерн-блоту з використанням поліклональних антитіл до протромбіну та Е-фрагмента показав наступне (рис.3):

1. Отримана при розділенні суміші протромбіну та Е-фрагменту білкова фракція з молекулярною масою 130 кДа взаємодіяла з антитілами як до протромбіну, так і до Е-фрагмента.

2. Фракція з молекулярною масою 60 кДа взаємодіяла винятково з антитілами до Е-фрагмента.

3. Маркерні білки (протромбін та Е-фрагмент фібрину) взаємодіяли винятково зі «своїми» антитілами, що свідчить про відсутність перехресної взаємодії між цими антитілами та антигенами.

Проведені дослідження дозволили одержати незаперечні докази того, що між протромбіном та Е-фрагментом фібрину утворюється комплекс. Необхідно відзначити, що при проведенні диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН комплекс протромбін - Е-фрагмент втрачає стабільність і розпадається. Це свідчить про нековалентний характер взаємодії цих двох білків. Дослідження взаємодії протромбіну з Е-фрагментом проводили також методом фотон-кореляційної спектроскопії. В результаті проведених досліджень показано, що при взаємодії протромбіну та Е-фрагменту реєструється утворення комплексів, що за своїми розмірами удвічі більші за молекулу протромбіну й Е-фрагменту та відповідають їх сумі. Це також безперечно вказує на утворення комплексу між досліджуваними білками.

Для одержання додаткових доказів утворення комплексу між Е-фрагментом і протромбіном було проведено роботу з дослідження утворення антитіл до протромбіну, Е-фрагменту фібриногену та стрептокінази з плазми крові тварин, яким попередньо внутрішньовенно вводили препарат стрептокінази. За модельні системи обрано системи гемостазу свині та вівці. Вибір цих модельних систем зумовлено тим, що плазміноген вівці активується стрептокіназою, а плазміноген свині - ні.

Утворення активного плазміну в кровотоці призводить до розщеплення нативного фібриногену й появи в кровотоці Е-фрагмента. Останній взаємодіє з протромбіном і стрептокіназою, утворюючи потрійний комплекс, що циркулює певний час у кровотоці. З огляду на те, що стрептокіназа є чужорідним білком, проти нього будуть синтезуватися імуноглобуліни класу G, які можна виявити в плазмі крові. Якщо припустити утворення потрійного комплексу між протромбіном, стрептокіназою та Е-фрагментом фібриногену, то антитіла будуть утворюватися й до кожного компоненту цього комплексу.

Стрептокіназу вводили в кровоток еквівалентно дозам, що вводять хворим на гострий інфаркт міокарду. Кров брали на 10-14 добу й одержували сироватку за стандартною методикою. Для очищення антитіл обрано метод афінної хроматографії, що забезпечує високу селективність. Для перевірки наявності антитіл до відповідного білка сироватку крові піддослідної тварини (вівці або свині) наносили на три послідовно з'єднаних афінних сорбенти. Після проведення аналогічного хроматографічного процесу для іншої піддослідної тварини отримані результати порівнювали (табл. 4).

Таблиця 4. Наявність антитіл в сироватці крові свині та вівці

	антитіла до стрептокінази	антитіла до протромбіну	антитіла до Е-фрагмента
Сироватка свині	+	+	-
Сироватка вівці	+	+	+

Відсутність антитіл до Е-фрагмента в сироватці крові свині обумовлена тим фактом, що стрептокіназа не ініціює появу плазміну і як наслідок цього процесу - неможливість появи Е-фрагмента фібриногену в кровотоці.

Отримані результати дозволяють зробити припущення про утворення комплексу між стрептокіназою і протромбіном (у вівці також з Е-фрагментом фібриногену). Внаслідок формування потрійного комплексу можливі певні конформаційні перебудови в білках, що, в свою чергу, може призводити до появи на поверхні білкової молекули доступних імуногенних ділянок. На користь подібного припущення свідчить утворення антитіл до Е-фрагменту у вівці, плазміноген якої активується стрептокіназою. Утворення таких антитіл не виявлено у свині, в якої активація плазміногену не відбувається.

Наведені результати свідчать про можливість утворення нових, маловідомих, білок-білкових взаємодій між компонентами системи гемостазу. Поява в кровотоці білкових молекул та їх фрагментів може впливати на перебіг багатьох реакцій як в системі гемостазу, так і за її межами. Утворення таких „біологічно активних“ молекул призводить до запуску нефізіологічних шляхів активації/інгібування ключових білків системи гемостазу, що, в свою чергу, зумовлює формування нових активаційних каскадів на рівні цілого організму. Визначення появи в кровотоці таких молекул, як фрагменти фібриногену/фібрину, може бути інформативним при вивченні молекулярних механізмів перебігу процесів, як в системі гемостазу, так і за її межами. Вивчення особливостей функціонування основних ланок гемостатичного каскаду під впливом фрагментів фібриногену/фібрину необхідне для більш глибокого розуміння причин виникнення та перебігу захворювань серцево-судинної системи та запропонувати ефективніші ліки для їх подолання.

Роль фібринолітичної системи плазми крові в розвитку патологічних станів системи гемостазу. Потенціал системи фібринолізу забезпечується сукупністю всіх ферментів - активаторів, здатних перетворювати неактивний плазміноген у його активну форму - плазмін. В першу чергу, фібринолітичний потенціал обумовлений активністю ТАП (КФ 3.4.21.68). Від нього залежить, наскільки ефективним буде відповідь фібринолітичної системи на появу в кровотоці розчинних фібрин-мономерних комплексів. Визначення фібринолітичного потенціалу є важливим критерієм стану системи фібринолізу, її здатності запобігати тромботичним ускладненням.

Було проаналізовано активність плазміногену та ?₂-антиплазміна в кровотоці пацієнтів з різними патологіями за яких спостерігається дисбаланс системи гемостазу (рис. 4, 5).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аналіз отриманих даних показав, що активність як плазміногену, так і ?₂-антиплазміна не падає нижче 75-70 % від норми, що може свідчити на користь припущення про ключову роль активаторів та інгібіторів процесу фібринолізу в забезпеченні його протікання. Активності ж плазміногену цілком достатньо для забезпечення швидкої відповіді на виникнення загрози тромботичного ускладнення, а ?₂-антиплазміну - на швидку й своєчасну елімінацію плазміну, який з'явився в кровотоці у вільному стані.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Для клінічного використання було модифіковано та адаптовано методи визначення активності ТАП і ПАІ-1 [Краснобрижа Є.М., 2004]. Використовуючи ці методи, було визначено активність даних білків за різних патологічних станів (рис. 6, 7).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Як видно з наведених даних, активність цих двох компонентів фібринолітичної системи значно коливається залежно від особливостей патологічного процесу.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Значні коливання активності ТАП і ПАІ-1, причому в більшості випадків ці коливання зворотньопропорційні, свідчать про ключову роль ТАП і ПАІ-1 у забезпеченні фібринолітичного потенціалу плазми крові. З огляду на все вищевикладене, варто припустити, що доцільним є не тільки використання екзогенних тромболітичних агентів з метою відновлення прохідності кровоносних судин, а й пошук факторів (ендогенних й екзогенних), що регулюють активність ТАП у кровотоці. Це може дозволити коригувати стан системи гемостазу при захворюваннях, пов'язаних з гіперактивацією системи зсідання крові та зумовленою нею загрозою тромботичного ускладнення. Також доцільним є ретельний контроль зміни активності ТАП і ПАІ-1 при введенні в організм значної кількості лікарських речовин різної природи з метою корекції тієї або іншої системи організму людини.

Аналіз активності ПАІ-1 за різних патологій, прямо або опосердковано пов'язаних із системою гемостазу, показав тісний взаємозв'язок з активністю ТАП у плазмі крові. Не викликає сумніву той факт, що 90 % активності ПАІ-1 спрямовано на інгібування фізіологічної дії ТАП у кровотоці, тому його активність повинна змінюватись зворотньопропорційно активності ТАП. Порушення такого зв'язку може бути пов'язане з адаптаційними або компенсаторними явищами в системі гемостазу при даному патологічному (фізіологічному) стані організму [Платонова Т.М., 2000]. Отримані результати свідчать про інформативність тесту по визначенню активності ПАІ-1 у плазмі крові. Даний тест, подібно до визначення активності ТАП, простий у виконанні й може використовуватись при діагностиці та контролі при проведенні терапії за різних порушень системи гемостазу.

На наступному етапі досліджень аналізували стан системи фібринолізу у пацієнтів з гострим інфарктом міокарду, яким проводили тромболітичну терапію стрептокіназою та антитромботичну терапію одним з наступних препаратів: гепарином, фраксипарином, гірудином, які є екзогенними інгібіторами тромбіну [Collen D., 1986].

З літературних даних відомо, що у людей введення препарату стрептокінази в дозі 1,5 млн. одиниць приводить до зниження нативного фібриногену та підвищення концентрації ПРФ [Six A.J., 1987, Платонова Т.М., 2002]. Наші дослідження підтверджують значне споживання протромбіну (до 50 - 60 %), на відміну від показників пацієнтів, яких не лікували стрептокіназою, що дає змогу припускати активацію протромбіну в присутності стрептокінази та продуктів деградації фібриногену/фібрину [Вєремєєнко К.Н., 1988]. Вміст нативного плазміногену в кровотоці знижений до 17 %, б₂-антиплазміну до 21 % від їх вмісту перед лікуванням. Відзначається підвищення концентрації фізіологічних активаторів плазміногену та висувається припущення, що це ТАП. Тому викликає інтерес більш детальне дослідження змін параметрів системи фібринолізу, а особливо ПАІ-1 і ТАП, яким належить визначальна роль у процесах регуляції ферментативного лізису фібринових згустків [Lijnen H.R., 1996, Henri R., 1997, Добровольский А. Б., 2002].

Нами досліджено ключові параметри системи фібринолізу: ЗФАПК, активність ПАІ-1 і ТАП. Аналізували стан системи фібринолізу в групі 73 пацієнтів різного віку та статі, які були розподілені на 3 підгрупи: в 1-й (31 пацієнт) лікування проводили гепарином, в 2-й - фраксипарином (27 пацієнтів), а в 3-й підгрупі - гірудином (15 пацієнтів). Кров брали на наступних етапах лікування: при надходженні пацієнта на стаціонар, через 2 години після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою, на 3-ю добу (пік введення гепарина/фраксипарина/гірудина), на 7-у добу (1-а доба після скасування введення гепарина/фраксипарина/гірудина) та на 30-у добу лікування.

Аналіз отриманих даних показав, що у пацієнтів, які надійшли в лікарню з діагнозом “гострий інфаркт міокарду”, активність фібринолітичної системи значно знижено. Показник ЗФАПК у пацієнтів значно подовжений і досягає, в середньому, 5,5 годин, тоді як у нормі цей час не повинен перевищувати 2 години. Однак зважаючи на те, що даний тест може бути не зовсім адекватним, головну увагу приділяли визначенню активності ТАП і ПАІ-1.

При госпіталізації пацієнтів активність ТАП була значно знижена та становила, в середньому, 0,87 ± 0,09 МО/мл порівняно з нормою (2,05 ± 0,5 МО/мл), однак спостерігалися відхилення показника активності від вищенаведеного: при надходженні у деяких пацієнтів активність ТАП наближалася до норми (в 15 % обстежених пацієнтів виявлена підвищена активність ТАП, 3,5 ± 0,5 МО/мл, яка практично не мінялася протягом усього періоду лікування). Активність ПАІ-1 при надходженні до стаціонару була значно підвищена (63 ± 4,4 МО ТАП/мл) у порівнянні з нормою - 15 ± 7,5 МО ТАП/мл. У деяких пацієнтів відзначено надмірно високу активність ПАІ-1, що досягала в деяких випадках 78 МО ТАП/мл на тлі значно зниженої активності ТАП до 0,29 МО/мл, що безумовно свідчить про практично повну відсутність потенціалу системи фібринолізу. Проведення тромболітичної терапії стрептокіназою приводило до значного підвищення активності ТАП 7,88 ± 3,47 МО/мл через 2 години після введення стрептокінази на тлі зниження активності його інгибітору ПАІ-1 до 28,9 ± 6,5 МО ТАП/мл.

Отримані дані свідчать про значну активацію системи фібринолізу, однак не можна говорити про стабілізацію або нормалізацію процесу руйнування фібринових згустків у кровотоці, незважаючи на те, що дані скринінг-теста ЗФАПК показали значне скорочення часу до 1,2 годин (що відповідає нормі).

Впродовж лікування показники активності ТАП нормалізувалися, хоча в деяких пацієнтів в цей період спостерігалася низька активність ТАП. На 30-у добу активність показника становила 2,21 ± 0,38 МО/мл.

Введення стрептокінази приводить до різкого (у кілька разів) підвищення активності ТАП, що може свідчити про прямий або опосередкований вплив стрептокінази на ендотеліальні клітини. Застосування препаратів нефракціонованого гепарину викликає поступове та значне підвищення активності ТАП на відміну від застосування препаратів фраксипарину та гірудину. Це дає змогу зробити припущення, що гепарин індукує вивільнення активатора з ендотеліальних клітин.

Аналіз показників плазми крові пацієнтів з гострим інфарктом міокарду, яким проводили тромболітичну терапію препаратами стрептокінази, виявив значні зміни активності ТАП і ПАІ-1. Тому заслуговує на увагу з'ясування та вивчення можливих механізмів дії стрептокінази на організм: опосередковано через плазмін, що утворюється, концентрація якого досить велика в кровотоці; через продукти деградації фібриногену/фібрину, що утворилися в результаті розщеплення нативного фібриногену/фібрину плазміном чи тромбіном, що може утворитися внаслідок активації протромбіну, або безпосередньо самої стрептокінази на ендотеліоцити. Для проведення досліджень було використано модельні системи in vivo: системи гемостазу кроля та свині.

Систему гемостазу кроля було обрано як зручну й доступну модель. Плазміноген кроля активується стрептокіназою, що дає змогу змоделювати процеси, що відбуваються в організмі після введення препаратів стрептокінази, та з'ясувати шляхи її дії на систему гемостазу. Для виключення можливого впливу плазміну та продуктів деградації фібриногену/фібрину на ендотеліальні клітини судин було обрано другу модельну систему - систему гемостазу свині, плазміноген якої не активується стрептокіназою. Існує припущення, згідно якого стрептокіназа здатна індукувати синтетичні процеси у ендотеліальних клітинах. Вона викликає в них активацію фосфоліпази А₂ та фосфоліпази С і таким чином стимулює активацію поліінозитолфосфатного каскаду ендотелію судин, що в свою чергу призводить до продукування речовин ендотеліальними клітинами [Kawaguchi H., 1990].

Необхідно враховувати опосередковану дію стрептокінази на ендотелій судин. Вона полягає у впливі речовин, які утворилися внаслідок дії стрептокінази у руслі крові. Це, в першу чергу плазмін, який забезпечує різноманітні фізіологічні процеси в організмі ссавців. Опубліковано дані, що продукти деградації фібрину/фібриногену, а саме - фрагмент Д підсилює секрецію активаторів плазміногена: тканинного активатора плазміногена та активатора урокіназного типу. Автори припустили, що Д-фрагмент підсилює секрецію тканинного активатора плазміногена ендотеліальними клітинами, а також прискорює перетворення плазміногена на плазмін, що, можливо, призводить до руйнування екстрацелюлярного матриксу та роз'єднання ендотеліальних клітин [Ge M., 1992].

На модельних системах in vivo (кроль (n=7), свиня (n=5)) досліджували вплив стрептокінази на основні параметри системи фібринолізу. Визначали активність плазміногену, б₂-антиплазміну, активність і концентрацію ТАП, ПАІ-1. Склад еуглобулінової фракції досліджували методом ензим-електрофорезу в ПААГ.

Препарат стрептокінази вводили в дозі відповідно схеми лікування пацієнтів з гострим інфарктом міокарду в перерахунку на масу тварин. Кров з вени, з додаванням 3,8 % цитрату натрію, відбирали поетапно: перед введенням препарату стрептокінази, через 1 годину, 4 години, 1-у добу, 3-ю добу та 7-у добу після введення тромболітика.

Результати досліджень дії стрептокінази на фібринолітичну систему кролів показали, що через 1 годину після введення стрептокінази спостерігається зниження вмісту нативного плазміногену на 30 % у порівнянні з показником до введення стрептокінази, що свідчить про його активне перетворення в плазмін. На 1-у й 3-ю добу фіксували підвищення концентрації плазміногену та нормалізацію його вмісту на 7-у добу (табл. 4). При цьому необхідно відзначити, що активність ключового інгібітору плазміногену - б₂-антиплазміну незначно знижувалася через 1 годину після введення стрептокінази та змінювалася в межах норми на наступних етапах дослідження.

Таблиця 4. Параметри системи фібринолізу в плазмі крові кролів після введення в кровоток стрептокінази (Ск) (M±m)

	Пг, %	б2-АП, %	ТАП, МО/мл	ТАП, нг/мл	ПАІ-1, нг/мл	ПАІ-1, МО ТАП/мл
до введення Ск	100,0±5,0	100,0±5,0	0,7±0,1	5,0±1,3	8,4±2,3	12,1±0,9
1 година після введення Ск	66,6±3,5*	85,0±3,1*	2,5±0,3*	12,0±1,5*	16,5±1,3*	6,5±0,6*
4 година після введення Ск	69,5±2,5*	104,0±3,5	1,1±0,2	8,0±1,3	13,0±1,5*	9,5±0,6
1 доба після введення Ск	78,6±3,1*	104,0±3,7	0,5±0,1	7,2 ± 0,6	5,8±1,7	17,1±0,7*
3 доба після введення Ск	92,3±3,7	98,0±2,5	0,6±0,1	6,9± 0,8	6,4±1,3	18,5±0,5*
7 доба після введення Ск	108,0±4,3	107,0±2,1	0,6±0,1	5,8± 1,1	8,3±1,9	19,6±0,7*

* - Р ? 0,05 по відношенню до введення стрептокінази

...