Білок-білкові взаємодії в механізмах регуляції гемостазу за патологічних станів

Активність і концентрація ТАП значно підвищувалася через 1 годину після введення стрептокінази та досягала 2,54 ± 0,3 МО/мл та 12 ± 1,5 нг/мл, тоді як до введення стрептокінази дані параметри становили 0,7 ± 0,1 МО/мл та 5 ± 1,3 нг/мл, відповідно. Підвищення активності ТАП майже в 3,5 рази пов'язане з підвищенням його концентрації, що можна пояснити вивільненням активатора з ендотеліальних клітин. Через 4 години ці показники складали 1,05 ± 0,2 МО/мл та 8 ± 1,3 нг/мл, відповідно, а на наступних етапах наближалися до значень, які були до введення стрептокінази в кровоток.

Після введення стрептокінази активність ПАІ-1 знижувалася до 6,5 ± 0,67 МО ТАП/мл, тоді як до введення стрептокінази цей параметр становив - 12,1 ± 0,95 МО ТАП/мл. Однак концентрація ПАІ-1 після введення стрептокінази підвищувалася та досягала 16,5 ± 1,3 нг/мл, тоді як до введення цей показник становив 8,4 ± 2,3 нг/мл.

Отримані дані можуть свідчити про активацію системи фібринолізу, пов'язану з підвищенням концентрації ТАП у кровотоці, що, відповідно, приводить до посилення фібринолітичного потенціалу плазми крові. Оскільки кількість функціонально-активних молекул ПАІ-1 зменшується на тлі підвищення вмісту його комплексів, то можна зробити припущення, що відбувається активний процес інгібування підвищеної кількості ТАП. На наступних етапах активність ПАІ-1 підвищувалася та на 7-у добу становила 19,6 ± 0,75 МО ТАП/мл, що можна пояснити зниженням активності та вмісту ТАП в кровотоці.

Аналіз ензим-електрофореграм еуглобулінової фракції плазми крові кроля показав присутність білкових компонентів, які здатні активувати плазміноген у плазмін та/або самі є протеолітичними ферментами, з молекулярною масою 85, 70 та 54 кДа. Виявлені білкові зони за всіма своїми ознаками відповідають плазміну, ТАП і двохланцюговій молекулі урокінази відповідно.

На електрофореграмі через 1 годину після введення стрептокінази помітне підвищення активності плазміну, ТАП та урокінази щодо зразка еуглобулінової фракції плазми крові до введення в кровоток стрептокінази; на наступних етапах активність цих білків знижується та наближається до норми, що корелює з нашими даними по кількісному визначенні активності ТАП і плазміногену (рис. 8).

Наведені дані свідчать про активацію системи фібринолізу після введення стрептокінази, внаслідок чого відзначається накопичення розчинних фібрин-мономерних комплексів. Спостерігається тенденція підвищення вмісту фрагментів Е і ДД на 7-у добу після введення стрептокінази. Наведена динаміка змін показників активності та концентрації ТАП свідчить про значне вивільнення ТАП у русло крові з ендотеліальних клітин, які забезпечують синтез і накопичення активатора. Отримані результати дають можливість зробити припущення, що стрептокіназа безпосередньо та/або опосередковано впливає на ендотеліальні клітини і тромбоцити, внаслідок чого відбувається вивільнення ТАП і ПАІ-1. Опосередкований вплив стрептокінази може бути обумовлений дією плазміну, продуктів деградації фібриногену/фібрину та тромбіну.

Размещено на http://www.allbest.ru/

На наступному етапі досліджень на модельних системах in vivo вивчали вплив стрептокінази на систему гемостазу свиней. Дана модельна система була обрана через відсутність активаційної дії стрептокінази на плазміноген свині. Таким чином було виключено можливий опосередкований вплив на ендотелій плазміну, тромбіну та фрагментів фібриногену/фібрину. У таблиці 5 наведена динаміка основних параметрів системи фібринолізу свині після введення в її кровоток препарату стрептокінази. Результати досліджень показали, що через 1 годину після введення стрептокінази активація плазміногену не відбувається. Однак необхідно відзначити, що через 4 години була відзначена тенденція до споживання плазміногену, причиною якого може бути поява в кровотоці підвищеної кількості ТАП.

білок стрептокіназа плазміноген кров

Таблиця 5. Показники системи гемостазу свиней після введення в кровоток стрептокінази (Ск) (M±m).

	Пг, %	б2-АП, %	ТАП, МО/мл	ТАП, нг/мл	ПАІ-1, нг/мл	ПАІ-1, МО ТАП/мл
до введення Ск	100,0±5,0	100,0±5,0	0,7±0,1	6,0 ± 0,9	28,7±2,3	41,0 ±7,5
1 година після введення Ск	102,7±3,5	117,5±4,7	3,6±0,5*	16,0 ±1,5*	46,5±5,3*	17,0 ±5,3*
4 година після введення Ск	90,1±4,3	97,2±3,2	1,1±0,2	12,0 ± 1,1*	39,8±6,3*	13,5 ±1,5*
1 доба після введення Ск	96,6±3,4	89,6±2,3*	0,5±0,1	10,5 ± 0,9*	18,0±2,7*	21,7 ± 1,4*
3 доба після введення Ск	91,6±3,7	92,5±3,1	0,5±0,1	8,1 ± 1,3	28,9±2,5	24,5 ± 2,1*
7 доба після введення Ск	94,9±4,2	119,2±4,3	0,5±0,1	7,5 ± 0,6	21,0±3,5	28,3 ± 1,8*

* - Р ? 0,05 по відношенню до введення препарату стрептокінази

Активність і концентрація ТАП значно зростала через 1 годину після введення стрептокінази в кровоток і досягала 3,6 ± 0,5 МО/мл, що практично в 4 рази вище значення активності до введення стрептокінази - 0,75 ± 0,1 МО/мл. Концентрація ТАП досягала 16 ± 1,5 нг/мл через 1 годину після введення тромболітика в кровоток, тоді як до введення цей показник становив 6 ± 0,9 нг/мл.

Дослідження динаміки активності ПАІ-1 показало, що через 1 та 4 години після введення стрептокінази цей показник значно знижувався до 17 ± 5,3 МО ТАП/мл та 13,57 ± 1,5 МО ТАП/мл, відповідно, а на наступних етапах нормалізувався, що, можливо, пов'язано з функціонуванням механізмів регуляції системи фібринолізу та відповіді на підвищення її потенціалу в кровотоці.

Визначення вмісту ПАІ-1 після введення в кровоток стрептокінази свідчить про значне підвищення вмісту інгібітору - 46,5 ± 5,3 нг/мл, у той час як до введення тромболітика цей показник був - 28,7 ± 2,3 нг/мл. Ця, майже в 2 рази, зміна вмісту ПАІ-1 може бути відповіддю системи фібринолізу на зростання активності і вмісту ТАП у кровотоці. Підвищення вмісту ПАІ-1 в кровотоці може бути пов'язане з активацією тромбоцитів стрептокіназою, внаслідок чого спостерігається секреція інгібітору в кровоток з б-гранул тромбоцитів.

Аналіз результатів ензим-електрофорезу еуглобулінової фракції плазми крові свиней показав наявність білків з молекулярними масами 85 та 70 кДа, які проявляють фібринолітичну активність. Знайдені активні зони відповідають плазміну та ТАП, відповідно. На ензим-електрофореграмі через 1 годину після введення стрептокінази зафіксовано підвищення активності ТАП відносно значення активності до введення тромболітика в кровоток і зниження цього параметра на наступних етапах дослідження (рис.9)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Тим самим на модельній системі, плазміноген якої не активується стрептокіназою, показано, що остання здатна впливати на ендотеліальні клітини та тромбоцити без участі плазміну, викликаючи значне підвищення вмісту та активності ТАП і вмісту ПАІ-1. На тлі підвищення вмісту інгібітору активаторів плазміногену 1 типу спостерігається зниження його активності, що відповідно до наших припущень, свідчить про те, що ПАІ-1 звільняється із тромбоцитів вже не в активній формі, внаслідок їх нефізіологічної активації стрептокіназою, або утворює комплексні форми з ТАП, у яких ПАІ-1 неактивний.

Можливим наслідком впливу стрептокінази на ендотеліоцити може бути ушкодження останніх. В організмі ссавців, плазміноген яких не активується стрептокіназою, її дія може бути безпосередньою, або опосередкованою тромбіном. Можна припустити, що в організмі ссавців, плазміноген яких активується стрептокіназою, відбувається комбінована дія стрептокінази (пряма та опосередкована) на систему гемостазу та судинно-тромбоцитарну ланку безпосередньо.

Вивчення функціонування фібринолітичної ланки системи гемостазу дає змогу з'ясувати особливості білок-білкових взаємодій між окремими компонентами фібринолізу. Зважаючи на те, що більшість компонентів фібринолітичного каскаду є високоспецифічними протеолітичними ферментами, їх дія може не обмежуватись тільки ключовою фізіологічною дією в підтримці гемостазу.

Параметри системи гемостазу, які характеризують процеси міжбілкової взаємодії коагуляційного каскаду. Незаперечним фактом є те, що нарівні з фібриногеном і його похідними та системою фібринолізу, для повної картини стану системи гемостазу як в нормі, так і за різних патологічних станів організму необхідно дослідити стан коагуляційної ланки системи гемостазу.

У таблицях 6 та 7 представлені показники ключових хронометричних тестів, вмісту протеїну С, антитромбіну ІІІ та фактора Х, які характеризують процеси, що відбуваються при активації коагуляційного каскаду системи гемостазу за різних патологічних станів організму. Як видно з наведених даних, відхилення показників від норми є досить значним та залежить від патології.

Таблиця 6. Показники хронометричних тестів за різних патологічних станів (M±m)

	ТЧ, с	АЧ, с	АЧТЧ, с	ПІ, %
Донори (n=65)	12,0±0,5	30,0±0,5	36,0 ± 0,5	100,0±5,0
Опіки (n=48)	17,4±0,8*	34,3±0,8*	50,0±1,0*	77,0±3,0*
Стабільна стенокардія (n=45)	11,2±1,0	не визначали	48,0±1,0*	100,0±7,0
Нестабільна стенокардія (n=45)	13,0±0,4	32,0±0,7	59,0±1,2*	74,0±2,0*
Гострий інфаркт міокарду (n=36)	11,3±0,7	28,2±0,3	33,6±0,7	92,3±4,7
Тромбоемболія (n=48)	10,8±0,5	31,0±1,0	44,4±0,5*	76,7±6,2*
Нефрит (n=32)	16,3±0,4*	51,0±0,6*	72,5±0,8*	87,9±7
Діабет (n=52)	не визначали	не визначали	35,7±0,4	95,7±1,9
Ускладнена вагітність (n=72)	10,6±0,6	28,6±0,6	32,0±1,0*	114,0±7,8
Абдомінальні кровотечі (n=68)	10,7±0,8	23,0 ± 3,0 (n=22)* 30,0 ± 2,0 (n=21) 35,0 ± 3,0 (n=25)	не визначали	75,0±4,2*

* - Р ? 0,05 по відношенню до контролю

Результати проведеного аналізу антикоагулянтного потенціалу системи зсідання крові опікових хворих свідчить про значне зниження активності антитромбіну ІІІ (у 50,1 % хворих) та протеїну С (у 54,5 %), що є фактором ризику розвитку тромбоутворення [Голота В.Я., 2000].

Таблиця 7. Показники фактора Х, АТ III і протеїну С за різних патологічних станів (M±m)

	ПС, %	АТ III, %	Фактор Х, %
Контроль (донори, n=65)	100,0 ± 5,0	100,0 ± 5,0	100,0 ± 5,0
Опіки (n=48)	58,6 ± 5,7*	57,2 ± 8,8*	145,3 ± 12,4*
Стабільна стенокардія (n=45)	100,0 ± 6,8	не визначалося	не визначалося
Нестабільна стенокардія (n=38)	55,0 ± 3,3*	67,0 ± 5,9*	74,8 ± 7,6*
Гострий інфаркт міокарду (n=36)	67,1 ± 1,9*	71,5 ± 7,4*	87,7 ± 8,2
Тромбоемболія (n=48)	77,4 ± 8,6*	87,9 ± 1,8*	не визначалося
Діабет (n=52)	85,6 ± 5,3*	не визначалося	не визначалося
Нефрит (n=32)	не визначалося	88,6 ±2,6*	не визначалося
Ускладнена вагітність (n=72)	67,1 ± 2,4*	72,5 ± 2,5*	119,5 ± 9,8
Абдомінальні кровотечі (n=68)	110,0 ± 7,5	87,719,2	не визначалося

*- Р ? 0,05 по відношенню до контролю

Показано наявність активації системи зсідання крові та послаблення антикоагулянтного потенціалу в результаті значного споживання ключових антикоагулянтів - антитромбіна ІІІ та протеїну С, дія яких спрямована на регуляцію генерації тромбіну. За даними літератури вміст антитромбіну ІІІ при опіковому сепсисі обумовлено зниженням його синтезу, підвищенням споживання, а також руйнуванням еластазою, що вивільнюється з активованих нейтрофільних гранулоцитів [Warren B.I., 2001].

Аналогічна картина спостерігається для протеїну С. Підвищене споживання, знижений синтез клітинами печінки та нестабільний стан судин при опіковому сепсисі призводить до зниження вмісту/активності цього антикоагулянта.Згідно даних літератури, порушення процесу активації протеїну С може провокувати також активацію певних цитокінів, зокрема, підвищення вмісту фактору некроза пухлин (TNF-?). Антикоагулянтна властивість активованого протеїну С зменшується при низькому вмісті в плазмі крові вільного протеїну S (кофактору протеїну С). Важливу роль протеїну С в патогенезі гострого ВЗК-синдрому підкреслюється дослідниками, які показали, що введення активованого протеїну С тваринам приводить до нормалізації гемостазу та підвищення виживання [Borgel D., 2007].

Необхідно зазначити, що накопичення інгібіторів згортання може приводити до помилково завищених результатів при визначенні активності АТ III і протеїну С. У таких випадках необхідно виконувати діагностичні тести з використанням хромогенних субстратів для виключення впливу інгібіторів згортання фібрину, тому що встановленим є факт: в певних випадках при глибоких опіках значно підвищувався вміст альфа₂-макроглобуліну (2,85 г/л при нормі 1,6 г/л), що може бути причиною подовження часу згортання плазми крові в хронометричних тестах [Гамісонія М.Ш., 2001].

Аналіз стану системи гемостазу у опікових хворих дозволив виявити певні протиріччя, пов'язані з активністю фактора Ха. Визначення його функціональної активності за результатами тесту «протромбіновий час» свідчить про значне зниження активності цього фактора. Водночас визначення активності фактора Х за допомогою специфічного хромогенного субстрату показало її збільшення до 145,3 ± 12,4 % (рис. 10). В окремих випадках активність досягала 200 %.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Подібні зміни спостерігаються і за ускладненої вагітності та операції кесарів розтин. Аналіз стану системи гемостазу за ускладненої вагітності проведено у 72 жінок до та після абдомінальних пологів. Результати гемостазіологічних досліджень дали змогу зробити висновок, що напередодні пологів відбувається значна патологічна активація прокоагулянтної ланки системи гемостазу та виснаження антитромботичного резерву, спільно з тенденцією до підвищення фібринолітичної активності крові, яке варто розглядати як адаптаційну реакцію організму в умовах виникнення тромбофілічного стану в системі гемостазу. Слід особливо зазначити, що підвищення вмісту фактора Х заслуговує на певну увагу, оскільки він є ключовим як для внутрішнього, так і для зовнішнього шляхів згортання крові.

У досліджуваній групі в 61,4 % вагітних вміст фактору Х складав вище 120 %. Отримані показники даного тесту слугували контролем при проведенні профілактики низькомолекулярними гепаринами, які вибірково інгібують активований фактор Х. При цьому варто зазначити, що при даному стані організму підвищення вмісту фактора Х може бути захисною реакцією, спрямованою на запобігання значної крововтрати при пологах. На відміну від пацієнтів з численними опіками, для вагітних жінок спостерігається підвищення не лише амідолітичної активності фактора Х (яку визначають за допомогою специфічного хромогенного субстрату), але й протромбінового індексу, що характеризує функціональну активність фактора Х у каскаді згортання крові. Дані протромбінового індексу при цьому коливаються в межах 115 - 120 %.

Порівнюючи ці два випадки, можемо констатувати, що за ускладненої вагітності функціональна активність фактора Х (за даними ПІ) практично дорівнює амідолітичній активності, яка характеризує ферментативну активність самого ферменту. Ймовірно, це носить адаптаційний характер, пов'язаний із запобіганням можливих крововтрат при пологах [Chippaux J.P., 1991]; у випадку тяжких опіків фактор Х має високу ферментативну активність, але не здатний виконувати свою функцію в організмі. Можна припустити, що при даній патології відбувається одна із двох ситуацій:

1. фактора Х синтезується мало, але з аномально високою активністю;

2. фактора Х синтезується багато, але він функціонально неактивний.

Для прояснення ситуації було проведено імуноферментний аналіз вмісту фактора Х у пацієнтів з численними опіками. Отримані дані показали, що, в середньому, вміст фактора Х становить 154 % у порівнянні з 100 % у практично здорових донорів. Дані імуноферментного аналізу підтверджують друге припущення про те, що наслідки термічної травми приводять до появи білка з аномальними властивостями, який нездатний виконувати свою пряму функцію в системі гемостазу.

Отримані дані вказують на необхідність визначення не тільки ферментативної активності факторів згортання, використовуючи специфічні хромогенні субстрати, але й аналізувати прояв ними функціональних властивостей для підтримки гемостатичного балансу в організмі. Отримані дані можуть бути інформативними щодо прихованих особливостей протікання патологічного стану, пов'язанго з порушенням функції системи гемостазу.

Особливості досліджень білок-білкових взаємодій у системі гемостазу. Вивчення особливостей протікання білок-білкових взаємодій у системі гемостазу вимагає вибору адекватних методів аналізу. Це пов'язано з тим, що більшість білків, які беруть участь у гемостатичному процесі, є за своєю природою ферментами з досить подібною субстратною специфічністю, що може істотно ускладнювати проведення досліджень. Методи визначення як активності, так і вмісту більшості білків всіх ланок системи гемостазу здебільшого вже відпрацьовані та опубліковані, що в значній мірі полегшує проведення відповідних аналізів. Водночас треба відзначити удосконалення та розробку методів визначення певних компонентів гемостазу за різних патологій, що забезпечує адекватність висновків можливостям методу. Тим самим реалізується можливість не тільки одержати нові теоретичні дані про механізми функціонування системи гемостазу, але й значно полегшити розробку та впровадження нових підходів і фармакологічних препаратів при лікуванні захворювань, пов'язаних з порушенням функціонування системи гемостазу.

Одним з розповсюджених підходів у вивченні складу білків системи гемостазу є використання активаторів/інгібіторів проферментів гемостатичного процесу, отриманих з отрути змій. Досліджуючи отруту змій виду Agkistrodon halys halys, було знайдено новий активатор плазміногену, який отримували за попередньо розробленою нами технологією. Для визначення основних характеристик очищений білок було проаналізовано за допомогою різноманітних біохімічних методів,. Електрофоретичний аналіз фракції, яка активувала плазміноген, показав присутність білка з молекулярною масою 32 кДа, що складався з великої 30 кДа субодиниці, до якої дисульфідними зв'язками були приєднані пептидні фрагменти загальною масою 2 кДа. Молекулярна маса білка, яка була визначена методом хроматографії, що поділяє за розміром складала 32,2 кДа. Чистота отриманого препарату становила 99%. Отриманий білок, в подальшому названий „Ahh-32”, досить ефективно активував плазміноген без участі додаткових кофакторів (рис. 11). Водночас „Ahh-32” активував протромбін і не впливав на активність фактора Ха плазми крові.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Результати ензим-електрофорезу показали, що після трьохгодинної інкубації в реакційній суміші з'являються домішки плазміну. Утворений плазмін гідролізує фібриноген, заполімеризований у гель. Місце гідролізу має вигляд білої смуги, що відповідає молекулярній масі плазміну. Додаткова біла смуга на рівні 32 кДа відповідає власне „Ahh-32”, що активує плазміноген, заполімеризований у гель разом з фібриногеном (рис. 12).

Як негативний контроль використовували плазміноген, інкубований без додавання „Ahh-32” (рис. 12, смуга 3).

Отже, отриманий білок „Ahh-32” є новим активатором плазміногену і може бути використаний як інструмент при дослідженні механізмів білок-білкових взаємодій в системі гемостазу.

В роботі представлено метод одновимірного ензим-електрофорезу в ПААГ з Дс-Na, який оптимізовано для вивчення наявності в досліджуваному зразку ферментів та активаторів системи гемостазу.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Новизна даного методу полягає в можливості достовірного визначення активаторів плазміногену, присутніх в аналізованому зразку. Відмінною рисою даного методу від методів імунодетекції, які відповідають на це ж питання, є виявлення активної форми активатора плазміногену в досліджуваному зразку. Описані на сьогоднішній день методи ензим-електрофорезу не дозволяють відповісти на дане запитання. Отримана інформація є принциповою при дослідженні дисбалансу, що виникає в системі гемостазу при різних патологічних станах організму. Другою особливістю даного методу є застосування як субстрату фібриногену та плазміногену. Використання даних білків дозволяє збільшити чутливість і специфічність методу відносно визначення ферментів системи гемостазу. Перетворення фібриногену в полімерний фібрин також збільшує чутливість методу стосовно тканинного активатора плазміногену, що іноді дозволяє визначати його залишкові кількості в досліджуваному зразку.

За основу нашого методу обрано метод, описаний Heusen С. для виявлення залишкових активностей протеолітичних ферментів при одержанні моноклональних антитіл [Heusen C., 1980]. Наша модифікація полягала у додаванні до розділяючого гелю фібриногену (у концентрації 1 мг/мл) і Глу-плазміногену (у концентрації 10 мкг/мл). Фібриноген заполімеризовували в гель для аналізу активних форм ферментів, що мають відношення до функціонування системи гемостазу. Фібриноген і плазміноген заполімеризовували в гель у тому випадку, коли хотіли показати присутність можливих активаторів плазміногену в досліджуваному біологічному об'єкті. Наступна модифікація полягала в перетворенні заполімеризованого фібриногену у фібриновий гель (для цього використовували розчин тромбіну в концентрації 1 NIH/мл). Це було необхідним для виявлення таких активаторів плазміногену, як тканинний активатор плазміногену та, частково, урокінази, які виявляють фібрин-залежну активацію плазміногену в плазмін [John J. A., 1988]. Останній розщеплює фібрин у місці знаходження цих активаторів у поліакриламідному гелі. Концентрація поділяючого гелю може становити від 11% до 15 %, що запобігає міграції білків, заполімеризованих у гелі, при електрофоретичному поділі. Методично вся процедура полягала в наступному: полімеризація ПААГ з фібриногеном і плазміногеном (за необхідності); електрофоретичний поділ аналізованих зразків у стандартних умовах [Laemmli K., 1970]; відмивання гелю в 2,5% розчині тритона Х-100 (для видалення з гелю залишків Дс-Na) впродовж 1 години на шейкері при 25⁰С; обробка гелю розчином тромбіну 1 годину, на шейкері при 37⁰С (у випадку заполімеризованих фібриногену та плазміногену), якщо в гель заполімеризовано тільки фібриноген, цей крок не роблять; пластину занурюють в 0,05 М фосфатний/Трис-HCl буфер, рН 7,4 на 10-12 годин для прояву ферментативної активності білків у досліджуваному зразку; гель фарбують відповідно до стандартного протоколу проведення диск-електрофорезу [Oacley B.R., 1980]. Чутливість методу становить ?0,01 м.о. активатора/ферменту на трек.

Метод апробовано на білках системи гемостазу людини, кроля, бика та свині. Для одержання оптимальних результатів необхідно використовувати фібриноген і плазміноген того виду ссавця, функціонування системи гемостазу якого аналізується. В процесі розробки методу було перевірено можливість для всіх перерахованих видів тварин використовувати плазміноген і фібриноген людини. Отримані дані при аналізі, показали можливість використання даної модифікації в цьому методі, що значно спрощує аналіз і дає змогу використовувати в якості маркерів білки системи гемостазу людини.

Використання даного методу ензим-електрофорезу дало змогу проаналізували якісний склад активних ферментів/активаторів плазміногену в плазмі крові мишей з карциномою Льюїс та в плазмі крові кролів та свиней при введенні в їх кровоток стрептокінази (рис. 8, 9); характеристиці отриманного активатора плазміногена (рис. 12); в інших досліджуваних об'єктах. Наведені приклади використання методу ензим-електрофорезу переконливо доводять інформативність, надійність та об'єктивність методу ензим-електрофорезу, що дає можливість використовувати даний метод для рішення завдань, пов'язаних з вивченням особливостей протікання білок-білкових взаємодій у системі гемостазу.

Повноцінне функціонування ферментів пов'язують, насамперед, з нативною конформацією молекули. Зміна конформації призводить до повної або часткової втрати функціональних властивостей ферменту, що унеможливлює якісне та своєчасне виконання його функції. Поряд з цим, поява неспецифічних шляхів активації проферментів, яка не контролюється фізіологічними механізмами інгібування, може призводити до появи великих кількостей активного ферменту в кровотоці, що викликає запуск каскадних процесів, які в даний час не повинні активуватися. Ця активація може спричинювати появу нефізіологічних ефектів на рівні як самої системи гемостазу так і на рівні всього організму. Одним з негативних наслідків цього процесу може бути також виснаження потенціалу певного проферменту та неможливість активації достатньої кількості активного ферменту тоді, коли це необхідно для нормального функціонування системи гемостазу. Виникнення таких неспецифічних білок-білкових взаємодій в системі гемостазу та можливість появи компенсаторних механізмів, які будуть регулювати ці білок-білкові взаємодії, свідчить про виникнення певних адаптаційних механізмів в системі гемостазу для підтримки кровотоку та нормального функціонування організму вцілому. Дослідження неспецифічних шляхів активації та інгібування дозволить не тільки глибше зрозуміти молекулярні механізми перебігу більшості процесів в системі гемостазу, але може привести до отримання нового класу фармакологічних агентів, функція яких буде направлена на запуск та регулювання неспецифічних для фізіологічного стану білок-білкових взаємодій. Це, в свою чергу, буде приводити до нормалізації стану системи гемостазу та інших патологічних станів організму.

ВИСНОВКИ

1. В дисертації представлено теоретичне узагальнення та вирішення актуальної проблеми - визначення ролі білок-білкових взаємодій, які лежать в основі функціонування системи зсідання крові та фібринолізу, формують направленість процесів, що можуть призводити до патологічних порушень в системі гемостазу. Дослідження особливостей протікання цих взаємодій дає змогу до більш глибокого розуміння тих біохімічних процесів, що формують гемостатичний баланс в організмі.

2. Досліджено динаміку функціонування системи гемостазу за різних патологічних станів організму та показано виникнення неспецифічних білок-білкових взаємодій між компонентами гемостатичного каскаду.

3. Проаналізовано склад розчинних фібрин-мономерних комплексів при різних патологічних станах організму. Показано можливість появи в кровотоці значної кількості фрагменту Е фібриногену/фібрину. На модельних системах in vivo та in vitro доведено можливість утворення комплексу між протромбіном та Е-фрагментом фібриногену/фібрину.

4. Вперше показано, що стрептокіназа викликає підвищення в 3,5 рази вивільнення з ендотеліальних клітин тканинного активатора плазміногену у кровоток та підвищення секреції з б-гранул тромбоцитів інгібітору активаторів плазміногену І типу в 2 рази. Доведено, що стрептокіназа здатна впливати на судинно-тромбоцитарну ланку системи гемостазу без участі плазміногену. З'ясовано, що посередниками впливу стрептокінази на динаміку білок-білкових взаємодій між тканинним активатором плазміногену та його інгібітором І типу можуть бути плазмін, продукти деградації фібрину/фібриногену та тромбін.

5. Показано, що тканинний активатор плазміногену і інгібітора активаторів плазміногену І типу обумовлюють ключовий фібринолітичний потенціал плазми крові, який запобігає розвитку тромботичних ускладнень.

6. Доведено можливість порушення функціонування фактора Х системи зсідання крові при тяжких опіках, що спричинює появу в кровотоці великої кількості функціонально неактивного фактора Х.

7. Розроблено модифікацію методу визначення активності тканинного активатора плазміногену та показано його інформативність, точність, достовірність. Запропоновано модифікацію методу ензим-електрофорезу для дослідження ферментів та активаторів фібринолітичної ланки системи гемостазу.

8. Обґрунтовано доцільність комплексного застосування методів аналізу параметрів усіх ланок системи гемостазу та показано можливості і необхідність використання 16 тестів для дослідження гемостазу. Доведено доцільність пошуку не тільки нових тромболітиків, але й факторів, що регулюють активність тканинного активатора плазміногену у кровотоці.

9. Запропоновано два числові індекси, що дають змогу виявити причини виникнення дисбалансу в системі гемостазу та доведено їх інформативність, достовірність, необхідність застосування.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Використаний в роботі комплекс тестів для дослідження системи гемостазу може бути рекомендовано для діагностики патологічних станів хворих з гострими коронарними синдромами та для розробки алгоритмів аналізу.

2. Описані в роботі методи можуть бути рекомендовані як необхідні для характеристики фібринолітичної ланки системи гемостазу за різних патологій.

3. Представлені в роботі числові індекси можна рекомендувати для визначення дисбалансу в системі гемостазу за умов розвитку різних патологічних станів, пов'язаних з активацією системи зсідання крові та для прогнозування розвитку можливих ускладнень.

4. Використання білків-індукторів системи гемостазу з отрути змій може бути рекомендовано як інструмент, що дозволяє більш детально охарактеризувати ключові процеси гемостазу, які зазнають змін при виникненні патологічних станів систем зсідання та фібринолізу.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тромбоэмболические осложнения в акушерстве и гинекологии / [Венцковский Б.М., А.Я. Сенчук, Гарник Т.П. и др.] - К.: Маком, 2003. - 360с. (Здобувачем особисто досліджено параметри системи фібринолізу та окремі параметри системи зсідання крові за даної патології).

2. Савчук О.М. Значимість деяких показників фібринолітичної системи в оцінці стану гемостазу / О.М. Савчук, М.Ш. Гамісонія, О.І. Кізім, Т.М Платонова // Фізіологічний журнал. - 2001. - Т.47, № 3. - С. 58 - 63. (Здобувачем особисто визначено параметри системи фібринолізу та проаналізовано їх коливання при патології та в нормі).

3. Савчук О.М. Діагностика порушень системи гемостазу при глибоких опіках / О.М. Савчук, Т.М. Платонова, К.Г. Козинець, Л.М. Малинська // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2002. - № 2. - С. 44-47. (Здобувачем особисто досліджено параметри системи фібринолізу та окремі параметри системи зсідання крові за даної патології).

4. Савчук О.М. Фібринолітичний потенціал плазми крові / О.М. Савчук, Є.М. Краснобрижа, Г.Л. Волков // Медична хімія. - 2004. - Т.6, № 2. - С. 30-35. (Здобувачем особисто розроблено концепцію дослідження фібринолітичного потенціалу та проведено аналіз параметрів фібринолітичної ланки системи гемостазу).

5. Савчук О.М. Вплив стрептокінази на параметри системи гемостазу в модельних системах in vivo / О.М. Савчук, Є.М. Краснобрижа, Г.Л. Волков // Укр. біохім. журн. - 2004. - Т. 76, №3. - С.38-43. (Здобувачем особисто розроблено модельні системи для дослідження впливу стрептокінази, проведено аналіз окремих параметрів системи фібринолізу, прийнята участь в обговоренні та написанні статті).

6. Савчук О.М. Вплив стрептокінази та антикоагулянтних препаратів на стан системи фібринолізу у хворих на гострий інфаркт міокарда / О.М. Савчук, Є.М. Краснобрижа, Г.Л. Волков // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2004. - № 2. - С. 86-91. (Здобувачем особисто проаналізовано окремі параметри системи фібринолізу та прийнята участь в обговоренні отриманих результатів та написанні статті).

7. Савчук О.М. Стан системи гемостазу у хворих на системний червоний вовчак / С.В. Шевчук, Є.М. Краснобрижа, О.М. Савчук // Буковинський медичний вісник. - 2005. - Т.9, №2. - С. 265-267. (Здобувачем особисто проаналізовано окремі параметри системи фібринолізу, прийнята участь в обговоренні отриманих результатів та написанні статті).

8. Савчук О.М. Процес комплексоутворення протромбіну та Е-фрагмента фібрину / О.М. Савчук, Є.М. Краснобрижа, В.Ф. Горчев, Т.М. Чернишенко, С.П. Гаврилюк, Т.М. Платонова // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, №3. - С.99-105. (Здобувачем особисто досліджено процес комплексоутворення протромбіну та Е-фрагмента фібрину за допомогою хроматографічних та електрофоретичних методів).

9. Савчук О.М. Розчинні фібрин-мономерні комплекси - маркери розвитку внутрішньо судинного мікрозсідання крові / О.М. Савчук, Є.М. Краснобрижа, Т.М. Чернишенко, Т.М. Платонова, О.В. Бєляєв, Є.Д. Мороз, Г.Л. Волков // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2006. - № 1. - С. 57-63. (Здобувачем особисто проаналізовано склад та кількість РФМК в плазмі крові за різних патологічних станів системи гемостазу).

10. Савчук О.М. Активатор плазміногену з отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) / О.М. Савчук, М.Ю. Левків, В.Л Карбовський, О.В. Горницька, Г. Л. Волков, Ц. Бухан // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т.78, № 6. - С. 32-37. (Здобувачем особисто досліджено властивості отриманого активатора плазміногена, прийнята участь в обговоренні отриманих результатів та написанні статті).

11. Савчук О.М. Анцистрон - В_U - новий тромбіноподібний фермент з отрути щитомордника далекосхідного (Agkistrodon blomhoffii ussuriensis) / В.Л. Карбовський, О.М. Савчук, Г.Л. Волков, Т.Н. Платонова, Ц. Бухан // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2006.- № 4. - С. 27-33. (Здобувачем особисто досліджено окремі властивості отриманого тромбіноподібного ферменту, прийнята участь в обговоренні отриманих результатів та написанні статті).

12. Савчук О.М. Процес активації тромбоцитів у присутності стрептокінази / Н.К. Бурлова-Васильева, О.М. Савчук, Є.М. Краснобрижа, Г.Л. Волков // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т.79, № 6. - С. 60-64. (Здобувачем особисто проаналізовано окремі параметри процесу активації тромбоцитів, прийнята участь в обговоренні отриманих результатів та написанні статті).

13. Савчук О.М. Вплив білків з отрути щитомордника далекосхідного на тромбоцитарну ланку системи гемостазу / В.Л. Карбовський, О.М. Савчук, Г.Л. Волков, Н.В. Заїчко, Ц. Бухан // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т. 79, №4. - С.82-89. (Здобувачем особисто здійснено певні етапи аналізу впливу білків на тромбоцитарну ланку системи гемостазу, прийнята участь в обговоренні отриманих результатів та написанні статті).

14. Савчук О.М. Вплив нетоксичного 7 кДа фрагменту стрептокінази на параметри системи гемостазу / С.П. Гаврилюк, О.М. Савчук, Л.І. Остапченко // Современные проблемы токсикологии. - 2008. - № 4. - С. 52-55. (Здобувачем особисто здійснено керування дослідженнями, обговоренням отриманих результатів та написанням статті).

15. Савчук О.М. Метод отримання та характеристика нетоксичного низькомолекулярного фрагменту стрептокінази / С.П. Гаврилюк, О.М. Савчук, Л.І. Остапченко // Современные проблемы токсикологии. - 2008. - № 3. - С. 50-54. (Здобувачем особисто здійснено керування дослідженнями, обговоренням отриманих результатів та написанням статті).

16. Савчук О.М. Метод отримання та виділення 36 кДа фрагменту стрептокінази / С.П. Гаврилюк, О.М. Савчук, Л.І. Остапченко // Медична хімія.- 2009.- Т.11, № 1. - С. 93-98. (Здобувачем особисто здійснено керування дослідженнями, обговоренням отриманих результатів та написанням статті).

17. Савчук А.Н. Влияние антифосфолипидных антител на хронометрические коагуляционные тесты при системной красной волчанке / А.Н. Савчук, С.В. Шевчук, О.В.Горницкая, Т.М. Чернышенко, Т.Н. Платонова // Весці Нацыянальнай акадэміі навук Беларусі. - 2009. - № 2. - С.32-36. (Здобувачем особисто отримано досліджувані антитіла, охарактеризовано їх та проаналізовано вплив антитіл на окремі параметри коагуляцій них тестів).

18. Савчук А.Н. Стрептокиназа - индуктор возникновения неспецифических белок-белковых взаимодействий в системе гемостаза / А.Н. Савчук, Н.К. Бурлова-Васильева, Е.М. Краснобрижая, С.П. Гаврилюк, Т.Н. Платонова, Г.Л. Волков // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2009. - Т.45, №2. - С. 47-54. (Здобувачем особисто розроблено концепцію статті, досліджено коливання окремих параметрів системи гемостазу, прийнята участь в обговоренні отриманих результатів та написанні статті).

19. Савчук О.М. Вивчення білок-білкових взаємодій у системі гемостазу з використанням методу ензим-електрофорезу / О.М. Савчук // Медична хімія. - 2010. - Т.12, № 1. - С. 60-67.

20. Савчук А.Н. Роль продуктов расщепления фибриногена/фибрина и растворимых фибрин-мономерных комплексов в развитии диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови / А.Н. Савчук // Лабораторная диагностика. - 2010. - 2(52). - С.15-19.

21. Савчук А.Н. Подходы к получению рекомбинантных фармацевтических белков на примере фрагмента стрептокиназы / Л.Л. Карбовский, А.Н. Савчук, Г.Л. Волков // Биофармацевтический журнал. - 2010. - Т.2, № 2. - С. 9-14. (Здобувачем особисто розроблено концепцію статті та здійснено керування обговоренням отриманих результатів і написанням статті).

22. Пат. 2830 MN, 3814 7А61К35/58 Способ выделения активатора протеина С из яда Agkistrodon blomhoffi ussuriensis / Волков Г.Л., Савчук А.Н., Карбовский В.Л.; Пат. 2830 MN, 3814 7А61К35/58 ВИСДОМ АССЄТ ХХК, 16.08.2006 - 2 с.

23. Пат. 2828 MN, 3812 7А61К35/58 Способ выделения ингибитора агрегации тромбоцитов из яда Agkistrodon blomhoffi ussuriensis / Волков Г.Л., Савчук А.Н., Карбовский В.Л.; Пат. 2828 MN, 3812 7А61К35/58 ВИСДОМ АССЄТ ХХК, 16.08.2006 - 2 с.

24. Пат. 2826 MN, 3810 7А61К35/58 Способ выделения фибриногено/фибринолитического белка из яда Agkistrodon blomhoffi ussuriensis / Волков Г.Л., Савчук А.Н., Карбовский В.Л.; Пат. 2826 MN, 3810 7А61К35/58 ВИСДОМ АССЄТ ХХК, 16.08.2006 - 2 с.

25. Пат. 2831 MN, 3815 7А61К35/58 Способ выделения а-специфического тромбиноподобного фермента (АНЦИСТРОН-В) из яда Agkistrodon blomhoffi ussuriensis / Волков Г.Л., Савчук А.Н., Карбовский В.Л.; Пат. 2831 MN, 3815 7А61К35/58 ВИСДОМ АССЄТ ХХК, 16.08.2006 - 2 с.

26. Савчук О.М. Характеристика складу фракції розчинних фібрин-мономерних комплексів / Савчук О.М., Платонова Т.М., Чернишенко В.О. // Тромбози в клінічній практиці: профілактика, діагностика, лікування: перша українська конф., 27-28 травня 2004 р.: тези доп. - К., 2004. - С.146-148.

27. Савчук А.Н. Изменения в системе гемостаза у пациентов с венозной тромбоэмболией / Савчук А.Н., Хасянова И.В., Чернышенко Т.М., Краснобрыжая Е.Н., Платонова Т.Н., Юсова Е.И. // Тромбози в клінічній практиці: профілактика, діагностика, лікування: перша українська конф., 27-28 травня 2004 р.: тези доп. - К., 2004. - С. 214-215.

28. Savchuk O. The characteristic of the soluble fibrin-monomer complexes fraction / Savchuk O., Chernishenko V., Platonova T. // Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis: 18^th International Congress on Thrombosis., 20-24 June 2004: abstract book. - Ljubljana, 2004. - Р. 105.

29. Savchuk O. Influence of streptokinase on the fibrinolytic system components in vivo / Savchuk O., Krasnobryzha I. // XX Inretnational Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis., 6-12 August 2005: abstract book.- Sydney, 2005. - P. 0188.

30. Савчук А.Н. Стрептокиназа- индуктор возникновения неспецифических белок-белковых взаимодействий в системе гемостаза / Савчук А.Н. // IX Український біохімічний з'їзд., 24-27 жовтня 2006 р.: збірник тез. - Х., 2006. - С. 27-28.

31. Савчук О.М. Параметри інгібітора активаторів плазміногена 1 типу за умов дії стрептокінази / Савчук О.М., Бурлова-Васильєва Н.К., Краснобрижа Є.М. // IX Український біохімічний з'їзд., 24-27 жовтня 2006 р.: збірник тез. - Х., 2006. - С.103-104.

32. Savchuk O. Analysis of blood platelet plasminogen activator inhibitor under treatment by streptokinase / Savchuk O., Krasnobryzha I. // 18^th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis., 27-31 august 2006: abstract book. - San Diego., 2006. - P.164.

33. Savchuk O.M. Isolation and characterization of plasminogen-activating proteinase frome Agkistrodon Halys Halys venom / Savchuk O.M., Karbovskyy V.L. // XXI Inretnational Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis., 9-13 Jule 2007: abstract book. - Geneva, 2007. - PT395.

34. Savchuk O.M. The novel protein-protein interation in mammalian haemostasis system inducing by streptokinase / Savchuk O.M., Krasnobryzha I.M., Platonova T.M. // XXI Inretnational Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis., 9-13 Jule 2007: abstract book. - Geneva, 2007. - PT397.

35. Савчук А.Н. Влияние высокомолекулярного Е-фрагмента фибрина на процесс активации протромбина / Савчук А.Н., Платонова Т.Н., Чернышенко Т.М. // Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки: международная конференция., 25-26 октября 2007 г.: тезисы докладов - М., 2007. - С.25-26.

36. Savchuk O. The complex analysis of content of haemostasis system effectors in Agkistrogon family venoms / Sanchuk O., Krasnobryzha Ie., Volkov G., Gavrylyuk S., Karbovskiy V., Zhukova A., Burlova-Vasilieva N., Karbovskiy L., Skalka V., Gavryliuk O., Vovk T., Karbovskaya L. // XVI World Congress of the International Society on Toxinology., 2009: abstract book. - Recife-Pernambuco, 2007. - P. 435.

37. Savchuk O. The investigation of protein-protein interactions in hemostatic system using enzyme electrophoresis method / Savchuk O., Zhukova A., Krasnobryzha I., Volkov G. // XXII Congress The International Society on Thrombosis and Haemostasis., 11-16 July 2009: abstract book. - Boston, 2009. - P.367.

38. Savchuk O. The influence of streptokinase on platelet link of haemostatic system / Savchuk O., Burlova-Vasilieva N., Savchuk O., Krasnobrizha I., Volkov G. XXII Congress The International Society on Thrombosis and Haemostasis., 11-16 July 2009: abstract book. - Boston, 2009. - P. 1064.

АНОТАЦІЯ

Савчук О.М. Білок-білкові взаємодії в механізмах регуляції гемостазу за патологічних станів - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченко, Київ, 2010.

Дисертація присвячена вивченню білок-білкових взаємодій за розвитку патологічних станів системи гемостазу. Показано виникнення нових білок-білкових взаємодій, нехарактерних для нативного стану систем зсідання та фібринолізу. Результати роботи підтверджують необхідність комплексного підходу для аналізу стану системи гемостазу в нормі та за патології.

Отримано вперше докази утворення комплексу між Е-фрагментом фібриногену/фібрину та протромбіном на модельних системах in vitro та iv vivo. Вперше показано, що стрептокіназа викликає значне вивільнення тканинного активатора плазміногену з ендотеліоцитів в русло крові. Доведено, що стрептокіназа впливає на ендотелій не тільки шляхом утворення плазміну, але також і без його участі.

Методологічні підходи, представлені в дисертації, дозволяють отримувати високоочищені препарати білків, поліклональних антитіл та ефекторів системи гемостазу. Можливість отримання цих інструментів дослідження особливостей протікання білок-білкових взаємодій в системі гемостазу, дозволяє більш глибше вивчити механізми, що лежать в основі функціонування систем зсідання крові та фібринолізу, що важливо не тільки з теоретичної точки зору, але також необхідне для практичного використання в медичній практиці.

Представлені в дисертаційній роботі дані важливі для розуміння динамічних особливостей перебігу білок-білкових взаємодій між окремими ланками системи гемостазу за патологічних станів. Результати роботи дозволяють разробити концепцію пошуку нових методів діагностики та направленної корекції патологій системи гемостатичного балансу.

Ключові слова: білок-білкові взаємодії, система гемостазу, патології гемостатичного каскаду, стрептокіназа.

АННОТАЦИЯ

Савчук А.Н. Белок-белковые взаимодействия в механизмах регуляции гемостаза при патологических состояниях - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2010.

Диссертация посвящена изучению белок-белковых взаимодействий при развитии патологических состояний системы гемостаза. Показано возникновение новых белок-белковых взаимодействий, нехарактерных для нативного состояния систем свертывания крови и фибринолиза. Результаты данной работы доказывают необходимость комплексного подхода для анализа состояния системы гемостаза в норме и при патологии.

Представленные в диссертации данные важны для понимания динамических особенностей протекания белок-белковых взаимодействий между отдельными звеньями системы гемостаза при патологических состояниях, природа которых может быть как связана с системой гемостаза, так и иметь совершено другое происхождение. Результаты работы позволяют разработать концепцию поиска новых методов диагностики и направленной коррекции патологий системы гемостатического баланса.

Впервые получены доказательства образования комплекса между Е-фрагментом фибриногена/фибрина и протромбином на модельных системах in vitro и iv vivo. Показана возможность появления значительных количеств этого фрагмента в кровотоке при возникновении патологических проявлений в системе гемостаза. Модельные системы iv vivo позволили показать возникновение тройного комплекса между Е-фрагментом фибриногена/фибрина, протромбином и стрептокиназой.

На разработанных моделях iv vivo проанализировано действие стрептокиназы на систему гемостаза. Обнаружено влияние стрептокиназы на динамику межбелковых взаимодействий между тканевым активатором плазминогена и ингибитором активаторов плазминогена І типа.

Впервые показано, что стрептокиназа вызывает значительный выброс тканевого активатора плазминогена из эндотелиоцитов в русло крови. Доказано, что стрептокиназа влияет на эндотелий не только путем образования плазмина, но и без его участия.

Выявлено появление значительных количеств функционально-неактивного фактора Х системы свертывания крови в кровяном русле при термических травмах.

Анализ системы гемостаза при патологиях различного происхождения, связанных с нарушением гемостатической функции организма позволил предложить два числовых индекса, которые могут оценить степень возникшего дисбаланса между системами свертывания крови и фибринолиза и прогнозировать развитие тромботического осложнения.

Приведена адаптация метода энзим-электрофореза в системе Лемли для анализа активаторов проферментов и ферментов системы фибринолиза. Данный метод позволяет выявлять в биологических образцах активные формы ферментов и их активаторов, имеющих отношение к фибринолитическому каскаду. Разработана адаптация метода определения активности тканевого активатора плазминогена для анализа этого параметра в плазме крови при патологических состояниях системы гемостаза.

Методические подходы, представленные в диссертации, позволяют получать высокоочищенные препараты белков, поликлональных антител и эффекторов системы гемостаза. Возможность получения данных инструментов исследования особенностей протекания белок-белковых взаимодействий в системе гемостаза позволяет более глубоко изучить механизмы, лежащие в основе функционирования систем свертывания крови и фибринолиза, что важно не только с теоретической точки зрения, но также и необходимо для практического использования в медицинской практике.

Ключевые слова: белок-белковые взаимодействия, система гемостаза, патологии гемостатического каскада, стрептокиназа.

SUMMARY

Savchuk O.M. Protein-protein interactions in regulating mechanisms of haemostasis under pathological states. - Manuscript.

Dissertation for the doctor of biological sciences degree in specialty 03.00.04 - biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2010.

The present study is dedicated to the investigation of protein-protein interactions under development of haemostatic system pathological states. The appearance of novel protein-protein interactions which are not distinctive for native state of blood clotting system and fibrinolytic system was shown. Results of the present work demonstrate the necessity of comprehensive approach for haemostatic system state analysis under norm and pathologies.

Presented data are essential for understanding of dynamic features course of protein-protein interactions between different haemostatic system branches under pathological states. Results of the work allow developing a strategy for the search of new diagnostics and directed correction methods of haemostatic system pathologies.

For the first the evidences of E-fragment of fibrinogen/fibrin and prothrombin complex formation were obtained using in vitro and in vivo model systems. It was established that streptokinase caused significant tissue-type plasminogen activator release from endothelial cells to blood flow. It was proved that streptokinase influence endothelium not only through plasmin formation but also without its participation.

Technical approaches presented in the dissertation allow isolation of high-purity proteins, polyclonal antibodies and haemostatic system effectors. The ability to obtain present instruments of protein-protein interactions features course investigation allow thorough study of blood clotting system and fibrinolytic system functioning mechanisms, which is essential not only as a theoretical matter but also for practical application on medical practice.

Keywords: protein-protein interactions, haemostatic system, haemostatic cascade pathologies, streptokinase.

Размещено на Allbest.ru

...