Оптимізація умов культивування Chlamydia trachomatis та Chlamydophila pneumoniae на перещеплюваних лінійних культурах

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

„ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ.І.І.МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ”

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ CHLAMYDIA TRACHOMATIS ТА CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE НА ПЕРЕЩЕПЛЮВАНИХ ЛІНІЙНИХ КУЛЬТУРАХ

ДЖОРАЄВА СВІТЛАНА КАРЬЯГДИЇВНА

УДК: 579.61:579.882-093/-095

03.00.07 - мікробіологія

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державній установі „Інститут дерматології та венерології АМН України”.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Мавров Іван Іванович, ДУ „Інститут

дерматології та венерології АМН України”,

директор

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Циганенко Анатолій Якович,

Харківський національний медичний

університет МОЗ України,

завідувач кафедри мікробіології,

вірусології та імунології

доктор медичних наук,

старший науковий співробітник

Нехороших Зоя Миколаївна,

ДУ „Український протичумний

інститут МОЗ України”,

провідний науковий співробітник

Захист дисертації відбудеться « 25 » березня 2010 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

Автореферат розісланий « 23 » лютого 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01

к.мед.н., с.н.с. С. В. Бруснік

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

хламідіоз клітина бактеріологічний

Актуальність роботи. Проблема хламідіозів людей і тварин в значній мірі обумовлена довготривалим персистентним перебігом, поліорганним ураженням, суттєвими негативними медико-соціальними наслідками (Мавров І.І., 2003; Нехороших З.М., 2007). За свідченням Всесвітньої Організації охорони здоров'я у світі щорічно реєструється близько 90 млн. хламідіозів, за далеко не повними даними статистики розповсюдженість цього захворювання в Україні становить 70,2 на 100 тис. населення (Мавров Г.І., 2005). Урогенітальний хламідіоз спричиняє розвиток висхідних та екстрагенітальних ускладнень, призводить до порушень репродуктивної функції та безпліддя. Доведено також роль хламідій у патогенезі захворювань дихального тракту, опорно-рухального апарату, серцево-судинної системи тощо (Савенкова М.С., 2004; Reznik T.G. et.al., 2000).

У багатьох країнах світу проводяться дослідження, спрямовані на удосконалення підходів щодо вилучення хламідій з сечостатевого тракту та екстрагенітальних осередків ураження (Black C.M., 1997; Jackson L.A. et.al., 1997; Ramirez J.A., 1996). Культуральні методи незамінні для уточнення етіологічного діагнозу при складних формах захворювання та надійності контролю за ефектом лікування. Можливість ізоляції живих форм збудника вигідно відрізняє культуральну діагностику від інших методів дослідження. Крім високої чутливості та специфічності культуральний метод дозволяє практикам чітко означити ефективність хіміопрепаратів для раціональної терапії у кожному конкретному випадку, а науковцям - створювати різні моделі взаємодії мікробів з клітинами-господарями, що вельми важливо для дослідження механізмів персистенції інфекції та проведення випробувань нових протихламідійних засобів (Кутова В.В. та співавт., 2001). При цьому застосування вже відомих культуральних методів вилучення, ідентифікації, накопичення і подальшого вивчення хламідій являє собою вельми складний процес, не завжди однозначний за трактуванням кінцевого результату, важко відтворюваний у повному обсязі при необхідності повторення досліду, поки що малодоступний для практичних мікробіологів. Вказане обумовлено наявністю факторів, які суттєво, частіше за все негативно, впливають на якісні та кількісні результати лабораторного дослідження (стадії захворювання, специфіка осередку запалення, характер біоматеріалу, умови його забору, завідома контамінація бактеріями, мікоплазмами, найпростішими тощо). На наш погляд, вельми суттєвим є видовий тропізм хламідій щодо клітин різного походження, обумовлюючий перебіг процесів адгезії, пенетрації через клітинну стінку та цілу низку мембран. Оцінюючи культуру клітин in vitro як динамічну систему взаємодіючих складових елементів (клітин), що знаходяться на різних стадіях фізіологічного розвитку, хай навіть в оптимальних, та все ж таки не в природних умовах, слід погодитись з нагальною необхідністю удосконалення методів кооперативного культивування і клітин різного походження, і бактеріальних патогенів, володіючих цілим комплексом механізмів та засобів їх використання для реалізації загальнобіологічного явища - збереження і продовження життя індивіду (популяції) в безкінечному ряду поколінь.

Таким чином, культивування внутрішньоклітинних паразитів на перещеплюваних клітинах являє собою вельми ефективний, надійний і перспективний мікробіологічний та біотехнологічний метод діагностики захворювань мікробного ґенезу, однак, торкаючись діагностики хламідіозів, він потребує суттєвого удосконалення з урахуванням виду збудника, характеру прояву цитопатогенної дії, особливостей його продуктивного циклу тощо. Оптимізації умов культивування С. trachomatis і C.pneumoniae на стабільних перещеплюваних клітинних лініях присвячена дисертаційна робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження проведено у рамках виконання науково-дослідних робіт ДУ „Інститут дерматології та венерології АМН України”: „Вивчення розповсюдженості, особливостей проявлення, лікування та профілактики хламідійної інфекції серед новонароджених, немовлят та дітей різного віку в Україні”, № держреєстрації 0100U001041; „Вивчення способів раннього виявлення хламідійної інфекції в перинатальний період, у новонароджених та дітей раннього віку”, № держреєстрації 0102U004220; „Вивчити біологічні та морфофункціональні характеристики збудників хламідіозів людини та оптимізувати методи їх лабораторної діагностики”, № держреєстрації 0107U012802. Дисертантом особисто здійснено літературно-патентний пошук за даними НДР; проведено вилучення та вивчення збудників хламідійної інфекції, ізольованих з різних осередків ураження; написано відповідні розділи до звітів з НДР у 2002 та 2005 роках.

Тему дисертаційного дослідження було затверджено на засіданні Вченої ради ДУ „Інститут дерматології та венерології АМН України” № 15 від 29 грудня 2005 року.

Мета і завдання дослідження:

Мета дослідження - шляхом оптимізації умов культивування хламідій різного виду і походження на стабільних перещеплюваних клітинних лініях удосконалити бактеріологічну діагностику хламідіозів.

Завдання дослідження:

1. Вивчити ступінь впливу альбуциду та циклогексиміду на клітинні культури L 929, МсСоу та Нер-2.

2. Визначити оптимальну дозу біологічного матеріалу (жовтковий лантух курячих ембріонів, синовіальна рідина) для інфікування клітин моношару з метою ізоляції хламідій.

3. Вилучити хламідії з різних біотопів сечостатевого тракту та екстрагенітальних осередків ураження і охарактеризувати їх біологічні властивості.

4. Оптимізувати склад поживного середовища для пасивування клітин, що використовуються для виділення та довготривалого культивування хламідій.

5. Дослідити та порівняти ступінь впливу натрієвої солі бензилпеніциліну (в дозах від 50 до 250 ОД/мл) та режиму температури (в межах від 25 до 370С) на перебіг продуктивної взаємодії системи „клітина хламідія”.

6. Означити особливості впливу різних видів хламідій на життєздатність клітин моношару з урахуванням тропізму збудника до лінійних культур різного походження (L 929, Нер-2).

7. На основі встановлених біологічних та культуральних особливостей вилучених збудників розробити рекомендації щодо удосконалення бактеріологічної діагностики хламідіозів.

Об'єкт дослідження - перещеплювані клітинні лінії L 929, McCoy, Hep-2; стандартні штами Chlamydia trachomatis UGC та Chlamydophila pneumoniae К 6, біологічний матеріал від хворих; клінічні ізоляти хламідій.

Предмет дослідження - процес пасивування клітинних культур; біологічні особливості мікробів, умови культивування бактерій; мікробіологічна діагностика хламідіозів.

Методи дослідження - бактеріологічні, цитоморфологічні, молекулярно-біологічні, електронно-мікроскопічні, імунологічні, математико-статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Науково обґрунтовано та розроблено нові методичні підходи щодо вилучення, культивування та накопичення клінічних ізолятів хламідій на перещеплюваних клітинних культурах ліній L 929, McCoy, Hep-2. Доведено раціональність використання L-цистеїну-HCl у поєднанні з L-триптофаном в складі поживного середовища 199 для пасивування клітин, які застосовуються для вилучення та культивування хламідій різних видів. Кількість клітин, що містили включення збудника, для тест-штаму C.trachomatis UGC зросла до 86,6% (у контролі 35,6%; р<0,001). Розроблено та запропоновано спосіб виділення та ідентифікації хламідій при культивуванні клітин тканин в поживному середовищі 199 з додатковим внесенням до нього L-триптофану та сульфату цинку. Завдяки застосуванню даного середовища досягнуто накопичення біомаси тест-штаму C.trachomatis UGC до 75,6% (у контролі 35,0%; р<0,001). Експериментально підібрано оптимальні дози біологічного матеріалу (жовтковий лантух курячих ембріонів, синовіальна рідина), для внесення до клітин моношару ліній L 929, МсСоу та Hep-2 з метою вилучення хламідій. Розроблено, апробовано і запропоновано спосіб агрегації та елімінації клітин культур L 929 і Нер - 2 від скла з використанням альбуциду. Означено особливості впливу штамів хламідій різних видів на морфологічну структуру та життєздатність перещеплюваних клітин.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведеного мікробіологічного дослідження раціонально використовувати в практичних бактеріологічних лабораторіях медичного та ветеринарного профілю, а також у науково - дослідних закладах охорони здоров'я. Отримані дані доповнюють та оптимізують відомі методи мікробіологічної діагностики хламідіозу.

Розроблені підступи щодо стабілізації стану клітинних культур при вилученні збудників хламідійної інфекції дозволяють суттєво підвищити ефективність лабораторного дослідження (Деклараційний патент на винахід 25661 Україна МПК G 01 № 33/00, затверджено 10.08.2007, Бюл. № 12, реєстр. № u 200705527).

Оптимізовано склад поживного середовища 199 для пасивування клітин, які частіше за все використовуються для вилучення та культивування хламідій, шляхом додаткового внесення до нього L- цистеїну-HCl (2,5 мг/л) та L- триптофану (20 мг/л).

Запропоновано спосіб виділення та культивування хламідій на середовищі 199 з додаванням L-триптофану (30мг/л) та сульфату цинку (10-9 Моль/л) (Деклараційний патент на винахід 34768, Україна, МПК С 12 Р 25/00, затверджено 03.03.2008., Бюл. № 16, реєстр. № u 200802714).

Означено оптимальні дози біологічного матеріалу (синовіальна рідина, жовтковий лантух курячих ембріонів) для внесення до клітинного моношару з метою обмеження його цитотоксичної дії на клітини ліній L 929, McCoy, Hep-2.

Розроблені методичні прийоми щодо удосконалення бактеріологічної діагностики хламідій, ізольованих з різних осередків ураження, дозволяють суттєво (у 1,5 рази у порівнянні із загальноприйнятим способом) підвищити її ефективність.

Результати досліджень раціонально включені до програми циклів спеціалізації і удосконалення бактеріологів, венерологів, урологів та ортопедів-травматологів у системі післядипломної медичної освіти України, а також до програм навчання студентів медичного та ветеринарного профілю на кафедрах мікробіології, вірусології і імунології, дерматовенерології та урології.

Особистий внесок здобувача. За особистої участі дисертанта визначені тема та мета дослідження, обґрунтовано актуальність і основні напрямки роботи; окреслено задачі наукових досліджень. Автором самостійно проведено дослідження щодо використання 3% розчину альбуциду в якості агенту для відкріплення клітин ліній L 929 та Нер-2, визначено оптимальні дози біологічного матеріалу (синовіальна рідина, жовткові лантухи курячих ембріонів) для внесення до моношару клітин з метою оптимізації процесу виділення та культивування хламідій. Дисертантом розроблено методичні підходи до удосконалення поживного середовища для виділення та культивування хламідій із застосуванням у різних варіантах L - цистеїну-HCl, L-триптофану та сульфату цинку. Самостійно проведено дослідження ступеню впливу хламідій різних видів на життєздатність клітин моношару в залежності від умов культивування; визначено видову належність, особливості культивування та морфологічні відмінності хламідій, вилучених з урогенітального тракту та екстрагенітальних осередків ураження.

Здобувачем проведено науковий аналіз, статистичну обробку, інтерпретацію та узагальнення отриманих результатів; сформульовано висновки та практичні рекомендації. Основні результати досліджень здобувачем оприлюднено у наукових працях, написаних самостійно, або у співавторстві, а також у доповідях на з'їздах, конференціях, симпозіумах, наукових семінарах тощо.

Апробація результатів дисертаційного дослідження. Результати дисертаційного дослідження доповідались та обговорювались на різних семінарах, конференціях, симпозіумах, з'їздах, у тому числі з міжнародною участю, серед яких на:

VІІ Українському з'їзді дерматовенерологів (Київ, 1999); симпозіумі „Епідеміологія, імунопатогенез та лікування хламідіозу” (Київ, 2001); науково-практичній конференції “Сучасні аспекти етіопатогенезу, діагностики, клініки та лікування в дерматовенерології і косметології” (Донецьк, 2003); науково-практичній конференції „Актуальные проблемы дерматовенерологии и косметологии”' (Одеса, 2004); науково-практичній конференції „Розвиток дерматовенерологічної служби в нових умовах регуляторної політики і подальшої демократизації суспільства” (Харків, 2005); V з'їзді дерматологів та венерологів Республіки Білорусь (Мінськ, 2006 р); Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні досягнення молодих вчених на допомогу практичній медицині” (Харків, 2006); науково-практичній конференції „Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики” (Харків 2007, 2008); науково-практичному семінарі „Ключові проблеми лабораторної медицини в дерматовенерології” (Харків, 2008), міжнародному науковому симпозіумі „Сучасні профілактичні й реабілітаційні технології в кардіології” (Бориспіль, 2008); підсумковій науково-практичній конференції Державної санітарно-епідеміологічної служби Полтавської області „Актуальні питання гігієни, екології, епідеміології та держепіднагляду на сучасному етапі” (Полтава 2004, 2008); Республіканській науково-практичній конференції „Шпитальні інфекції: сучасний стан проблеми” (Харків, 2008) науково-практичній конференції з міжнародною участю „Сучасні аспекти медицини та фармації-2009” (Запоріжжя, 2009); Міжнародній науково-практичній конференції „Моніторинг, прогнозування, діагностика та профілактика інфекційних хвороб тварин із використанням сучасних методів епізоотології, молекулярної біології та біотехнології” (Феодосія, 2009).

Публікації: За матеріалами дисертації опубліковано 21 наукова праця (7 - у моноавторстві), у тому числі 9 статей, з них 7 у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, отримано 3 патенти України на корисну модель, видані 1 методичні рекомендації, 8 тез в матеріалах науково-практичних конференцій, з'їздів, симпозіумів.

Обсяг і структура дисертації: Дисертаційна робота викладена на 151 сторінці друкованого тексту, вміщує вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів дослідження, три розділи власних досліджень, висновки та практичні рекомендації, список використаних першоджерел (20 сторінок), з 178 посиланнями (з них 111 - українських та російськомовних, 67 - іноземних). Робота містить 27 таблиць (7 стор.) і 34 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури: В розділі представлено сучасну таксономію та біологію порядку Chlamydiales, проаналізовано дані щодо розповсюдженості хламідійних інфекцій, охарактеризовано сучасні методичні підходи до вилучення та культивування хламідій на перещеплюваних лінійних культурах.

Матеріали і методи дослідження. Дисертаційне дослідження виконано з використанням 95 клінічних зразків, отриманих від хворих з сечостатевими та екстрасечостатевими ураженнями хламідійної етіології.

Культура клітин. При проведенні експериментальних досліджень застосовували перещеплювані клітинні культури ліній L 929, McCoy, Hep-2.

Штами хламідій: стандартний тест-штам Chlamydia trachomatis UGC одержано у лабораторії мікробіології ДУ „Інститут дерматології та венерології АМН України”; стандартний тест-штам Chlamydophila pneumoniae K6 одержано з музею живих культур мікроорганізмів Науково-дослідного інституту епідеміології і мікробіології ім. почесного академіка М.Ф.Гамалеї РАМН (Росія).

При виконанні дисертаційного дослідження використовували комплекс сучасних методів дослідження:

§ культуральний - виділення хламідій в культурі клітин L929 загальноприйнятим методом (Шаткин А.А., Мавров И.И., 1983), а також за розробленими нами;

§ мікробіологічний - виділення хламідій в 6-7 денних курячих ембріонах, що розвиваються, шляхом інфікуванням біологічним матеріалом в жовтковий лантух;

§ цитоморфологічний - визначення морфологічних структур хламідій в препаратах клітинної культури, інфікованої зішкрябним матеріалом слизових оболонок сечостатевого та дихального тракту, зішкрябами з кон'юнктиви, синовіальними рідинами та кардіоваскулярними зразками при забарвленні за Май-Грюнвальд-Гімзою;

§ цитологічний - визначення стану моношару клітинних культур, що застосовуються для вилучення хламідій, при забарвленні за Романовським-Гімзою;

§ імунолюмінісцентний - визначення специфічного хламідійного антигену в інфікованих клітинних культурах за допомогою реакції прямої імунофлюоресценції (ПІФ) з застосуванням комерційних діагностикумів («РекомбиСлайдХламидия»; ХлаМоноСкрин, ЗАО „Ниармедик+”, Росія);

§ полімеразна ланцюгова реакція - для визначення ДНК збудників хламідійної інфекції з використанням діагностичних наборів (“GenePak”®DNA PCR test, Росія);

§ електронно-мікроскопічний - для вивчення структурно-морфологічних особливостей хламідій, ізольованих з різних осередків ураження;

§ статистичний - за допомогою стандартного пакету прикладних програм для медико-біологічних досліджень на персональному комп'ютері з застосуванням програм Microsoft Office для Windowsxp.

Результати роботи та їх обговорення. Стан клітинної культури, що використовується для діагностичного виділення збудника має вирішальне значення, тому необхідно використовувати культури, де є змога чітко розрізнити межі між клітинами, а самі клітини мають типову для даної лінії структуру і морфологію. Найбільш шкідливою для клітин є процедура пересіву із застосуванням хелатуючих агентів та протеолітичних ферментів, оскільки ультраструктура клітин, оброблених даними речовинами, поновлюється лише частково в першу добу культивування. Окрім того, як правило, виявляються клітини з морфологічними змінами з деформацією ядер, вакуолізацією цитоплазми, збільшенням виростів клітинної мембрани (Газирова Г.Р., 1981; Архипов В.В., 1992).

Експериментально нами доведено, що у якості відкріплюючого агенту раціонально використовувати 3% розчин альбуциду (сульфацилу натрію) самостійно, або у поєднанні з версен-трипсиновою сумішшю в залежності від виду клітинної лінії. Дезагрегація клітинних культур ліній L 929 і Нер-2 за допомогою альбуциду виявилось досить надійним прийомом. Мітотичний індекс клітин лінії L 929, що відкріплювалися з використанням альбуциду, був у 1,8 рази вище, ніж при обробці версен-трипсиновою сумішшю, клітини обох ліній дещо раніше формували суцільний моношар після зняття їх розчином альбуциду за рахунок скорочення фаз стабілізації (lag-фази) і логарифмічного росту (log-фази) (рис. 1).

Крім того, альбуцид не виявляв вираженої цитотоксичної дії щодо клітин, внаслідок чого суттєво знизилася кількість клітин з так званими морфологічними “недоліками”.



Рис. 1. Порівняльні показники культивування клітинних культур ліній L929 та Нер-2 з використанням альбуциду та трипсин-версенової суміші

При визначенні клітин даних ліній, в яких проявляються ознаки апоптозу, отримано наступні результати: кількість клітин лінії L 929 з ознаками апоптозу на 24 годину культивування становила 8,7% (13,5% при обробці трипсин-версеновою сумішшю); на 48 та 72 годину цей показник дорівнював 28,2% проти 17,3% та 70,0% проти 37,8%, відповідно (рис. 2).

Вельми схожі результати в аналогічних умовах досліду отримано при використанні клітинної лінії Нер-2: на 24 годину культивування клітини з ознаками апоптозу склали 11,2% (16,0% при обробці трипсин-версеновою сумішшю), 28,5% проти 18,5% на 48 годину; 60,1% проти 36,8% на 72 годину, відповідно.

Вказане пояснюється тим, що обмежена кількість вільного місця на поверхні культурального матрацу, з одного боку, та ступінь виснаження живильного середовища - з другого, діють двояко - лімітують ріст і розмноження та ріст клітин, вони ж і запускають механізми апоптозу у клітинах моношару. У процесі діагностичного виділення збудника хламідійної інфекцій завжди використовується циклогексимід - речовина, що пригнічує синтез білку в еукаріотичних клітинах.

Рис. 2. Ступінь впливу альбуциду та трипсин-версену на прояв апоптозу клітин ліній L929 та Нер-2 в подовженні терміну культивування до трьох діб

Тимчасове інгібування синтезу білка необхідне для забезпечення процесів адгезії, проникнення та розмноження збудника у клітинах моношару. Циклогексимід до поживного середовища вноситься в кількості 0,9-1,0 мкг/мл після 24-годинного культивування клітин (Шаткин А.А., Мавров И.И., 1983; Black C.M., 1997; Wolf K. et al., 2001). Встановлено, що обробка клітин трипсин-версеновою сумішшю та розчином альбуциду не захищають клітини від проапоптозної дії циклогексиміду. Кількість клітин з ознаками апоптозу у клітинній культурі L 929 на 48 годину культивування в наших дослідах збільшилось у 2,4 рази (з 13,5% до 32,3%) при застосуванні трипсин-версенової суміші та у 4,3 рази (з 8,7% до 39,3%) - при застосуванні розчину альбуциду. Проапоптозна дія циклогексиміду зберігалася упродовж усього періоду культивування (72 години): так кількість клітин, що мали ознаки апоптозу, становила 52,2% при пасивуванні за допомогою трипсин-версеновою суміші та 79,8% для клітин, які культивувалися із застосуванням розчину альбуциду. При культивуванні клітин лінії Нер-2 спостерігалися подібні зміни. При внесенні до ростового середовища циклогексиміду кількість клітин з ознаками апоптозу збільшилась у 2,1 рази (з 14,3% до 30,0%) при культивуванні за допомогою трипсин-версенової суміші, та у 3,2 разів (з 11,3% до 36,7%) при поєднаному використанні трипсин-версенової суміші та альбуциду на 48 годину культивування. Проапоптозна дія циклогексиміду зберігалася упродовж усього 72-годинного періоду культивування: кількість клітин, що мали ознаки апоптозу, становила 50,0% та 73,5%, відповідно.

Для виділення збудника хламідійних інфекцій достатньо суттєве значення має доза біологічного матеріалу, що вноситься до клітинної культури, оскільки біологічний матеріал сам по собі теж може володіти цитотоксичною дією на клітини моношару (Советова Г.П. и др., 1981; Мавров І.І. та співав., 2007 ). Нами експериментально доведено, що для підбору доз біологічного матеріалу раціонально застосовувати з однаковим успіхом метод дворазового розведення та метод Ріда і Менча, який використовується для визначення цитопатогенної дії збудників на клітинні культури. Розрахована концентрація біологічного матеріалу для виділення хламідій на перещеплюваних клітинних лінях: так, для клітинної культури Нер-2 доза інфікованого жовткового лантуха курячого ембріону для внесення до моношару клітин склала lg ЦТД50=0,37 (цитопатогенна доза дорівнює 100,37/ мл, що відповідає 2,3% розчину на середовищі 199); для клітинної лінії L 929 доза синовіальної рідини склала lg ЦТД50=0,5 (цитопатогенна доза дорівнює 100,5/мл, що відповідає 3,2% розчину на середовищі 199), інфікованого жовткового лантуха курячого ембріону - lg ЦТД50= 0,37 (цитопатогенна доза дорівнює 100,37/мл, що відповідає 2,3% розчину на середовищі 199); для культури клітин МсСоу доза синовіальної рідини склала lg ЦТД50= 0,29, інфікованого жовткового лантуху - lg ЦТД50=0,53 (цитопатогенна доза дорівнює 100,29/мл, що відповідає 2,0% розчину на середовищі 199 та 100,53/мл, що відповідає 3,4% розчину на середовищі 199, відповідно). З використанням методу двократного розведення біологічного матеріалу доведено, що розведення синовіальної рідини та жовткового лантуха курячого ембріону до співвідношення 1:32 призводить до загибелі 50% клітин моношару. В перерахунку на відсотки це відповідає приблизно 3,0% розчину обох типів біологічного матеріалу для висіву на живильні середовища. Вказане означено нами за оптимальну дозу інфектанту для діагностичного виділення збудника у перещеплюваних клітинних культурах ліній L929 та Нер-2.

Характер морфологічних змін в наслідок цитотоксичної дії синовіальної рідини та жовткових лантухів курячих ембріонів на клітини культур ліній МсСоу, L 929 та Нер-2 носили фактично однаковий характер. Таким чином, використання експериментально розрахованих концентрацій синовіальної рідини та жовткових мішків курячих ембріонів дозволяє оптимізувати процес вилучення хламідій шляхом інгібування цитотоксичної дії біологічного матеріалу на клітини моношару.

Пасивування синовіальної рідини та судинних зразків досить ускладнено за причини специфіки матеріалу та особливостей культивування збудника (Ramirez J.A., 1996; Мавров Г.И. и соавт., 2005; Мавров І.І. та співав., 2007). Застосування методики отримання клінічних ізолятів збудника шляхом започаткованого переносу інфікованої клітинної культури після першого пасажу до жовткових лантухів курячих ембріонів з наступним внесенням вже інфікованого матеріалу до культури клітин значно підвищує ефективність діагностичного вилучення збудника з дещо нестандартних осередків запалення.

З метою підвищення ефективності діагностики хламідіозу для виділення патогену і накопичення його біомаси нами запропоновано до поживного культурального середовища 199 вносити незамінні амінокислоти: L-цистеїн-HCl (2,5 мг/л) та L-триптофан (20 мг/л). Кількість клітин, що містили морфологічні структури хламідій, на розробленому середовищі для стандартного штаму C.trachomatis Ugс становила 86,6% (контроль - 35,6%, р<0,001). Кількість клітин, що містили включення збудника, при інфікуванні моношару синовіальною рідиною становила 76,6% (контроль - 30,3%, р<0,001), уретральним зразком - 78,6% (контроль - 31,0%, р<0,001), що у 2,5 рази більше, ніж при загальноприйнятому культивуванні. При використанні розчину L-цистеїну (2,5 мг/л) самостійно кількість клітин, що містили морфологічні структури збудника, становила 69,0% для стандартного штаму C.trachomatis Ugс (контроль - 35,6%, р<0,002), для синовіальної рідини - 59,4% (контроль - 30,3%, р<0,002) та біоматеріалу з уретри - 59,8% (контроль - 31,0%, р<0,002).

Доведена можливість застосування амінокислот для збагачення живильних середовищ клітин з метою дослідження на наявність хламідій у судинних зразках (рис. 3).

Рис. 3. Ступінь впливу амінокислот на процес культивування хламідій і накопичення їх біомаси в середовищі 199 з різними енхансерами

У такому варіанті досліду кількість клітин з включеннями збудника зросла з 18,7% (при загальноприйнятому культивуванні) до 30% (відмінності не вірогідні) при додаванні у поживне середовище L-цистеїну-HCl, при використанні L-цистеїну-HCl у поєднанні з L-триптофаном - до 55,1% (р<0,002). Таким чином, додаткове внесення амінокислот до поживного середовища позитивно впливає не тільки на процес підтримуючого культивування у перещеплюваній культурі клітин стандартного штаму, а й дозволяє інтенсивно накопичувати біомасу хламідій.

Крім того, при використанні збагаченого амінокислотами поживного середовища 199 спостерігалась нейтралізація цитотоксичної дії циклогексиміду на клітини моношару. Кількість клітин, що мали дегенеративні зміни, обумовлені застосуванням циклогексиміду, знизилась з 78,4% до 60,0% для стандартного штаму C. trachomatis UGC та з 79,1% до 60,6% для клінічних ізолятів, що в певній мірі спрощує процес підрахунку клітин з морфологічними структурами збудника.

Для поліпшення поживного середовища, що використовується для виділення збудника, додатково вносили L-триптофан та сульфат цинку. Вибір L-триптофану обумовлений тим, що це одна з головних амінокислот, яка входить до складу головного білка зовнішньої мембрани хламідій (МОМР), а іони цинку сприяють адгезії мікробів на клітинах (Sugarman B., 1985; Мавров Г.І., 2005). У результаті проведених досліджень встановлено, що найбільш ефективним культивування стало після внесення до поживного середовища L-триптофану (30 мг/л) та розчину ZnSO4x7H20 у концентрації 10-9 Моль/л. Кількість клітин, що мали включення збудника, склала 75,6%, що на 19,8% вище, ніж при використанні в аналогічних умовах 20 мг/л L-триптофану, та на 37,4% вище, ніж при використанні 10 мг/л L-триптофану. Упродовж культивування рН поживного середовища з додатковим внесенням L-триптофану (30 мг/л) у поєднанні з розчином ZnSO4x7H20 (10-9 Моль/л.) змінюється з нейтрального до різко кислого, що також опосередковано свідчить про більш інтенсивне накопичення біомаси збудника.

При внесенні до поживного середовища пеніциліну (100 ОД/мл) спостерігалася поява атипових форм хламідій з внутрішньою фрагментацією і брунькуванням ДНК, а також наявністю нуклеоїд-подібних регіонів конденсації. Антибіотик сприяв утворенню атипових форм, пригнічуючи процес диференціювання ретикулярних тілець у елементарні шляхом пригнічення продукції білків зовнішньої мембрани. На відміну від дії антибіотика фактор зниження температури культивування сам по собі не викликає порушення процесу диференціювання елементарних тілець у ретикулярні та навпаки.

Проведено апробацію запропонованого методичного підступу до діагностичного виділення хламідій з клінічного матеріалу, отриманого з урогенітального тракту та екстрагенітальных осередків ураження, на перещеплюваних клітинних культурах (рис. 4).

Рис. 4. Порівняльна характеристика ефективності способів виділення хламідій з різних осередків ураження

Застосування запропонованих нами прийомів дозволяє не тільки виявити збудник хламідійної інфекції, а й вірогідно збільшує відсоток позитивних знахідок (з 18,1% до 26,3%).Для визначення видової належності збудників, вилучених з урогенітального тракту та екстрагенітальних осередків, було проведено молекулярно-біологічне та електронно-мікроскопічне дослідження зразків біоматеріалу.

При електронно-мікроскопічному вивченні синовіальної рідини хворих на синдром Рейтера та зішкрябу з уретри хворого на сечостатевий хламідіоз доведено приналежність патогену до виду C.trachomatis. Висновок базувався на тому, що на 48 годину культивування в клітинах L 929 утворюються включення, морфологічно характерні для C.trachomatis. ЕТ має сферичну форму і середній діаметр 250-300 нм. Зовні ЕТ обмежено двома тришаровими мембранами, кожна з них товщиною 8 нм. Усередині ЕТ утримується нуклеоїд і цитоплазма. РТ - овальні або округлі структури із середніми розмірами 400-600Х800-1000 нм. Зовні РТ обмежені двома тришаровими мембранами, середня їх товщина 8 нм. Між клітинною стінкою і цитоплазматичною мембраною РТ визначається вузький плазматичний простір, що обмежує протопласт РТ, містить цитоплазму з рибосомами і нуклеоїд, представлений фібрилами ДНК.

Крім ЕТ та РТ спостерігали проміжні тільця (ПТ) (рис. 9). Після 60 годин культивування більшість клітин інфікованого моношару зберігали свою цілісність, а включення збудника містили усі форми, що завжди зустрічаються протягом циклу розвитку. Близько 72 годин культивування клітини інфікованого моношару руйнувалися, вивільняючи хламідії, розпочинаючи новий життєвий цикл з послідуючим інфікуванням сусідніх клітин (рис. 10).

При культивуванні збудників, отриманих із сегмента аорти з атеросклеротичними ураженнями та магістральних артерій нижніх кінцівок при синдромі Леріша, встановлено, що морфологічні характеристики і тривалість циклу їх розвитку відрізнялися від аналогічних, отриманих при пасивуванні уретрального і синовіального зразків.

Подібно ЕТ представників роду Chlamydia, ЕТ Chlamydophila містять щільний нуклеоїд і цитоплазму з рибосомами, при цьому значно менші за розміром, грушоподібної форми. Така форма обумовлена, головним чином, великим периплазматичним простором, наявністю гнучкої і плейоморфної зовнішньої мембрани (рис. 11).Ретикулярні тільця цих мікроорганізмів являють собою округлі структури із середніми розмірами 400-500 х 700-900 нм. Ці морфологічні особливості характерні для представників C. рneumoniae (рис.12).

Культивування виділеного з тканин аорти мікробу показало, що цикл його розвитку складає 84-96 годин. Вказаний факт, а також морфологічні критерії дозволяюь зробити висновок, що збудник, виділений з атеросклеротичних уражень сегмента аорти, відноситься до представників виду C. pneumoniae. Не виключено, що існує зв'язок між С. рnеumоnіае і розвитком атеросклерозу.

Належність хламідій, виділених із синовіальної рідини колінного суглоба пацієнтів, до виду С. trachomatis підтверджує імовірність його гематогенного поширення з урогенітального тракту, що в подальшому призводить до розвитку хвороби Рейтера.

Ступінь життєздатності клітин прямо залежить від кількості інфекційного матеріалу та умов культивування. Виявлено, що через 24 години після інфікування кількість клітин, що мали ознаки апоптозу (конденсація хроматину, фрагментація ядер) була на 12,8-14,8% нижче у всіх дослідних групах у порівнянні з контрольною культурою. Вказане свідчить про виражену антиапоптозну дію хламідій протягом першої доби культивування. В більш пізні терміни (48 годин і довше) захист клітин від апоптозу не проявляється, а навіть навпаки - спостерігається помітна індукція апоптозу у всіх дослідних групах інфікованих культур. Вказане пов'язано з тим, що у першу добу після інфікування включення збудника переважно являють собою ретикулярні тільця - метаболічно активну форму хламідій, що максимально пристосовані до внутрішньоклітинного існування. По цьому у цей термін культивування збудник максимально розмножується і накопичується. Мікроорганізм отримує від клітини-господаря амінокислоти та інші поживні речовини, життєво необхідні для хламідій, щоб клітини залишалися життєздатними та нормально функціонували. На кінець другої доби культивування, коли цикл розвитку збудника майже завершений, йому вже немає сенсу стримувати апоптоз або цілісність клітин моношару, тим більш, що збудник повинен елімінувати з клітини і розпочати новий цикл інфікування. Таким чином, стандартний штам C.trachomatis UGC проявляє антиапоптозну активність лише у першу добу після інфікування моношару клітин незалежно від умов культивування. На відміну від представників виду C.trachomatis, C. pneumoniae гальмує апоптоз упродовж усього часу спостереження, на 96 годину культивування збудника кількість клітин з ознаками апоптозу вже становила майже 35,0% від загальної кількості в усіх варіантах експерименту.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі надано теоретичне узагальнення та мікробіологічне обґрунтування нових підступів до оптимізації технології вилучення та культивування Chlamydia trachomatis і Chlamydophila pneumoniae на стабільних перещеплюваних клітинних лініях з урахуванням біологічних властивостей збудника, циклу його розвитку, особливостей біотопу вегетування та прояву патогенної дії.

1. Значна поширеність хламідіозу, варіабельність клінічного прояву захворювання, різнобічність уражень систем і органів обумовлює нагальну необхідність удосконалення його культуральної діагностики.

Доведено, що результативним способом вилучення збудника та накопичення його біомаси виявилось застосування поживного середовища, вміщуючого L-цистеїн-HCl (2,5 мг/л) та L-триптофан (20 мг/л). Кількість клітин, що містили включення збудника, для тест-штаму C.trachomatis UGC зросла до 86,6% (у контролі 35,6%; р<0,001). Культивування хламідій на вказаному живильному середовищі вірогідно зменшує кількість дегенерованих (за рахунок дії циклогексиміду) клітин до 60% (контроль 78,4%; р<0,05).

При застосуванні поживного середовища, що містить L-триптофан (30 мг/л) та ZnSO4x7H20 (10-9 Моль/л) досягнуто накопичення біомаси тест-штаму C.trachomatis UGC до 75,6% (у контролі 35,0%; р<0,001).

2. Альбуцид у концентрації 3% максимально сприяє відкріпленню клітин ліній L 929 та Нер-2 від поверхні скла культурального флакону. З метою дезагрегації культивованої тканини та елімінації моношару клітин з скляного субстрату експериментально доведено раціональність заміни комплексу версену (трилон-Б-ЕДТА-натрієва сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти) та протеолітичного ферменту трипсину на сульфацил-натрій (пара-Амінобензолсульфацетамід-натрію) - оціфінальний препарат альбуцид. За критеріями складності конструювання розчинів, терміну елімінації клітин з субстрату, токсичного впливу на клітини, попередження контамінації бактеріями і грибами досліджені дезагреганти розміщено слідуючим чином: трипсин 0,3%> версен>0,02% > сульфацил-натрій 3%.

3. Визначено, що тест-штам C.trachomatis UGC в першу добу культивування проявляє чітку антиапоптозну дію, що обумовлено особливостями продуктивного циклу розвитку даного виду збудника (у цей час хламідії максимально користуються поживними речовинами клітини, накопичуючи біомасу); в подальшому (2-3 доби спостереження), коли цикл розвитку майже закінчений, призводить до розвитку апоптозу. Тест-штам C.pneumoniae K 6 виявляє виражений антиапоптозний вплив на клітини лінії Нер-2 упродовж чотирьох діб культивування, що пояснюється більш уповільненим циклом розвитку даного виду хламідій та меншою швидкістю виснаження живильних та енергетичних субстратів клітини.

4. Визначено оптимальну дозу біологічного матеріалу для інфікування моношару клітин. Так, для клітинної культури Нер-2 доза інфікованого жовткового лантуха курячого ембріону для внесення до моношару клітин склала lg ЦТД50=0,37 (цитопатогенна доза дорівнює 100,37/ мл, що відповідає 2,3% розчину на середовищі 199); для клітинної лінії L 929 доза синовіальної рідини склала lg ЦТД50=0,5 (цитопатогенна доза дорівнює 100,5/мл, що відповідає 3,2% розчину на середовищі 199), інфікованого жовткового лантуха курячого ембріону - lg ЦТД50= 0,37 (цитопатогенна доза дорівнює 100,37/мл, що відповідає 2,3% розчину на середовищі 199); для культури клітин МсСоу доза синовіальної рідини склала lg ЦТД50= 0,29, інфікованого жовткового лантуху - lg ЦТД50=0,53 (цитопатогенна доза дорівнює 100,29/мл, що відповідає 2,0% розчину на середовищі 199 та 100,53/мл, що відповідає 3,4% розчину на середовищі 199, відповідно).

5. Вегетуючі в урогенітальному тракті хворих на сечостатевий хламідіоз та в бурсі колінного суглобу хворих з синдромом Рейтера хламідії ідентифіковано як С. trachomatis; хламідії, вегетуючі в епітелії магістральних судин та атеросклеротичних утвореннях хворих з синдромом Леріша, ідентифіковано як С. рneumoniae.

6. За комплексом розроблених методичних підступів суттєво підвищено ефективність лабораторної діагностики хламідіозу при дослідженні біоматеріалу з нетипових осередків ураження: з кон'юнктиви та носоглотки немовлят з підтвердженим діагнозом хламідіозу у матері вилучаємість хламідій зросла (від 13,3% до 19,2%; від 16,7% до 19,4%, відповідно); з синовіальної рідини хворих з синдромом Рейтера - з 33,3% до 55,6%; з епітелію магістральних судин інтими та атеросклеротичних бляшок аорти хворих з синдромом Леріша - з 28,6% до 33,3%.

7. Результати виділення збудника із синовіальної рідини на перещеплюваних лінійних культурах опосередковано свідчать про нагальну необхідність по змозі оцінити та ревізувати склад живильного середовища 199 за окремими компонентами, перш за все за амінокислотним вмістом.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. З метою оптимізації умов інтродукції та культивування хламідій на перещеплюваних клітинних культурах раціонально додаткове внесення до поживного середовища 199 L- цистеїну та L- триптофану у дозах 2,5 та 20 мг/л відповідно.

2. При вилученні хламідій з синовіальної рідини і дослідженні жовтку інфікованих курячих ембріонів слід чітко дотримуватись оптимальних об'ємів біоматеріалу, а саме: для клітинної культури Нер-2 концентрація інфікованого жовткового лантуха курячого ембріону - 2,3%; для клітинної лінії L 929 концентрація синовіальної рідини - 3,2%, інфікованого жовткового лантуха курячого ембріону - 2,3%; для культури клітин МсСоу - 2,0% і 3,4%, відповідно.

3. Для пасивування клітинної культури лінії L 929 доцільно використовувати оригінальний метод з застосуванням 3% розчину альбуциду, який не володіє вираженою цитотоксичною дією щодо перещеплюваних клітин, суттєво прискорює формування моношару, вірогідно знижує кількість клітин з морфологічними дефектами, забезпечує деконтамінацію клітинної культури. (Деклараційний патент на винахід 25661 Україна G01№33/00).

4. З метою виявлення та вилучення хламідій на клітинних культурах раціонально культивувати їх у живильному середовищі при концентрації L-триптофану 30 мг/л та при наявності сульфату цинку у концентрації 10-9Моль/л. Вказане дозволяє в 3 рази підвищити вилучаємість хламідій за рахунок активації метаболізму збудника (Деклараційний патент на винахід 34768 Україна С12Р 25/00).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кутова В. В. Досвід виділення хламідій у культурі клітин / В. В. Кутова, С. К. Джораєва // Журнал дерматології та венерології. - 2004. - № 2 (24). - С. 81 - 84. Дисертантом особисто проведено вивчення можливостей методу діагностичного вилучення збудників хламідійної інфекції з урогенітального тракту та екстрагенітальних осередків ураження на перещеплюваних клітинних культурах ліній L 929, McCoy та Нер - 2.

2. Експериментальне вивчення цитопатогенності біологічного матеріалу на клітинні лінії МсСоу та L 929 / І. І. Мавров, Г. К. Кондакова, С. К. Джораєва, В. В. Гончаренко, В. В. Кутова // Аннали Мечниковського Інституту. - 2008. - № 1. - С. 21 - 24. - Режим доступу до журн.: http://www.imiamn.org/journal.htm. Дисертантом особисто проведено підбір доз біологічного матеріалу (синовіальна рідина та жовтковий лантух курячого ембріону) для внесення до моношару клітин з метою оптимізації процесу вилучення хламідій.

3. Джораева С. К. “Некоторые методические подходы к культивированию клеток линий L 929 и Нер - 2, используемых для диагностического выделения хламидий” / С. К. Джораева // Експериментальна та клінічна медицина. - 2008. - № 1. - С. 73 - 76.

4. Методологічні підходи до виділення збудників хламідіозів / В. В. Кутова, В. В. Гончаренко, С. К. Джораєва, О. В. Щоголєва, І. В.Усік // Журнал дерматології та венерології. - 2008. - № 1. - С. 82 - 85. Дисертантом особисто проведено дослідження зі стабілізації стану моношару клітинних культур ліній L929 та Нер-2 за допомогою пасивування із застосуванням 3% розчину альбуциду; виділення збудників хламідіозів з різних осередків ураження з використанням поживного середовища з додатковим внесенням до нього розчину L-цистеїну.

5. Джораєва С. К. Досвід використання амінокислот для виділення збудників хламідіозів у перещеплюваній культурі МсСоу / С. К. Джораєва, В. В. Кутова, В. В. Гончаренко // Експериментальна та клінічна медицина. - 2008. - № 2. - С. 44 - 47. Дисертантом особисто проведено поліпшення поживного середовища 199 шляхом визначення оптимальних концентрацій внесення L-цистеїну та L-цистеїну у поєднанні з L-триптофаном та виділення збудників хламідіозів з різних осередків ураження на клітинній лінії МсСоу.

6. Электронно-микроскопическое изучение изолятов хламидий, выделенных из различных очагов поражения, в системе перевиваемых клеточных культур / И. И. Мавров, С. К. Джораева, В. В. Гончаренко, В. В. Кутовая, Н. В. Репин // Журнал дерматології та венерології. - 2008. - № 3 (41). - С. 26 - 31. Дисертантом особисто проведено виділення збудників хламідіозів з урогенітального тракту та екстрагенітальних осередків ураження на перещеплюваних клітинних культурах та попередня підготовки культуральних зразків до електронно-мікроскопічного дослідження.

7. Мавров І. І. Регуляція апоптозу у клітинній культурі L 929, інфікованій штамом хламідій UGC, в залежності від умов культивування / І. І. Мавров, С. К. Джораєва // Експериментальна та клінічна медицина. - 2009. - № 1. - С. 53 - 57. Дисертантом особисто проведено підбір дози інфікування для внесення до моношару клітин, визначення впливу циклогексиміду на життєздатність неінфікованих клітин моношару, виявлення впливу хламідій на життєздатність клітин інфікованого моношару в залежності від складу поживного середовища.

8. Джораєва С. К. Біологічні властивості Chlamydia pneumoniae, виділеного з кардіоваскулярних зразків // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики : зб. наук. статей. - Т. 2., Вип. ХХІІ. - 2009. - С. 34 - 37.

9. Джораєва С. К. Особливості мікробіологічної діагностики хламідіозів, поєднаних з іншими гнійно-запальними захворюваннями бактерійно-вірусного ґенезу // Інфекційний контроль. - 2009. - № 4 (32). - С.34 - 35.

10. Виділення, ідентифікація та умови довгострокового зберігання Chlamydia trachomatis та Chlamydophila pneumoniae : Метод.рекомендації / Уклад.: І. І. Мавров, В. В. Кутова, В. В. Гончаренко, С. К. Джораєва. - К., 2007. - 24 с. Дисертантом особисто проведено пасивування клітинних культур різного походження (L929, McCoy та Нер-2), що використовуються для виділення хламідій, вилучення збудника з урогенітального тракту та екстрагенітальних осередків ураження з наступною ідентифікацією (за допомогою бактеріоскопічних, імунофлюоресцентних та молекулярно-біологічних методів долідження) та довготривалим культивуванням. Проведено дослідження щодо поліпшення режимів кріоконсервування мікробу у рідкому азоті.

11. Пат. 70136 А Україна МПК G 01 № 33/00. Спосіб виділення штамів хламідій / Кутова В. В., Маврова Д. І., Гончаренко В. В., Джораєва С. К., Щоголєва О. В.; заявник та патентовласник Інститут дерматології та венерології АМН України. - № 20031212636; заявл. 26.12.2003; опубл. 15.09.04, Бюл. № 9. - 4 с. Автором особисто проведено пасивування збудників хламідіозів на перещеплюваних клітинних культурах, дисертант брала участь у розробці формули винаходу.

12. Пат. 25661 Україна МПК G 01 № 33/00. Спосіб пасивування клітинної культури L 929 / Мавров І. І., Джораєва С. К., Кутова В. В, Гончаренко В. В., Щоголєва О. В.; заявник та патентовласник ДУ „Інститут дерматології та венерології АМН України”. - № u 200705527; заявл. 21.05.07; опубл. 10.08.07, Бюл. № 12. - 4 с. Автором особисто проведено підбір концентрацій альбуциду для пасивування клітинної культури L 929 та розроблена формула винаходу.

13. Пат. 34768 Україна МПК С 12 Р 25/00. Спосіб виділення та виявлення хламідій / Мавров І. І., Джораєва С. К., Кондакова Г. К., Кутова В. В., Гончаренко В. В., Щоголєва О. В.; заявник та патентовласник ДУ „Інститут дерматології та венерології АМН України”. - № u 200802714; заявл. 03.03.08.; опубл. 26.08. 08, Бюл. № 16. - 4 с. Автором особисто проведено підбір концентрацій L-триптофану та розчину цинку для внесення до поживного середовища для виділення хламідій, розроблена формула винаходу.

14. Джораєва С. К. Проблема хламідійної інфекції в Україні і нові підступи щодо її лабораторної діагностики / С. К. Джораєва // Актуальні питання гігієни, екології, епідеміології та держсанепіднагляду на сучасному етапі : матеріали VI підсумкової науково-практичної конференції Державної санітарно-епідеміологічної служби Полтавської області. - Полтава, 2004. - С. 104.

15. Джораєва С. К. Перспектива застосування культур перещеплювальних клітин для вилучення, культивування і зберігання хламідій / С. К. Джораєва // Актуальні питання гігієни, екології, епідеміології та держсанепіднагляду на сучасному етапі : матеріали VI підсумкової науково-практичної конференції Державної санітарно-епідеміологічної служби Полтавської області. - Полтава, 2004. - С. 105.

16. Оптимизация условий диагностического выделения хламидий / В. В. Кутовая, В. В. Гончаренко. С. К.Джорааева // V съезд дерматологов и венерологов республики Беларусь, 20-21 сент. 2006 г. : материалы съезда. - Минск, С. 219 - 222. Автором особисто проведено дослідження щодо оптимізації умов виділення хламідій на перещеплюваних клітинних культурах.

17. Методы диагностического выделения хламидий / С. К. Джораева, В. В. Гончаренко, В. В. Кутовая // Сучасні досягнення молодих вчених на допомогу практичній медицині : Всеукраїнська науково - практична конференція, 20 жовтня 2006 р. : тези доп. - Харків, 2006. - С. 28. Автором особисто проведено виділення хламідій з сечостатевого тракту та екстрагенітальних осередків ураження на перещеплюваних клітинних лініях L 929, МсСоу та Нер-2.

18. Вивчення способів раннього виявлення хламідійної інфекції в перинатальний період, у новонароджених та дітей раннього віку / В. В. Кутова, С. К. Джораєва, В. В. Гончаренко, О. В. Щоголєва // Вклад молодих вчених у розвиток медичної науки і практики : науково-практична конференція, 13 листопада 2007 р. : тези. доп. - Харків, 2007. - С. 64-65. Дисертантом особисто проведено виділення збудника хламідій на перещеплюваних клітинних лініях.

19. Вивчення оптимальної концентрації інфікованого біологічного матеріалу для виділення хламідій на клітинних культурах МсСоу та L 929 / С. К. Джораєва, В. В. Гончаренко, О. В. Щоголєва, І. В. Усик // Вклад молодих вчених у розвиток медичної науки і практики : науково-практична конференція, 30 жовтня 2008 р. : тези доп. - Харків, 2008. - С. 40. Дисертантом особисто проведено визначення концентрації внесення біологічного матеріалу (синовіальної рідини, жовткових лантухів курячих ембріонів) до перещеплюваних клітинних культур, що використовуються для виділення збудника хламідіозів.

20. Джораєва С. К. Перспектива конструювання живильних середовищ для культивування перещеплювальних клітин, що використовуються для вилучення хламідій / С. К. Джораєва // Актуальні питання гігієни, екології, епідеміології та держсанепіднагляду на сучасному етапі : матеріали Х підсумкової науково-практичної конференції Державної санітарно-епідеміологічної служби Полтавської області. - Полтава, 2008. - С. 151.

...